一株防治植物根結(jié)線蟲(chóng)的木糖氧化無(wú)色桿菌及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于植物病害生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種防治植物線蟲(chóng)病害的無(wú)色桿菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

根結(jié)線蟲(chóng)因其世界范圍性的地理分布以及廣泛的寄主范圍，對(duì)許多重要的經(jīng)濟(jì)作物造成嚴(yán)重危害，被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)最重要的病原物之一。據(jù)估計(jì)，最常見(jiàn)的種可以侵染超過(guò)5500種植物。根結(jié)線蟲(chóng)的寄主遍及糧食、油料、蔬菜、果樹(shù)等作物，例如番茄、生菜、黃瓜、花生、煙草、柑橘等植物都可被根結(jié)線蟲(chóng)侵染。植物根系發(fā)病后多個(gè)根結(jié)連在一起,形成大小不一的腫瘤，發(fā)病晚期根變得粗糙且容易腐爛。根部畸形導(dǎo)致整個(gè)植物運(yùn)輸系統(tǒng)受損，從而導(dǎo)致植株地上部分出現(xiàn)發(fā)育不良、矮化、黃化以及果實(shí)畸形等癥狀，更加嚴(yán)重時(shí)則導(dǎo)致植株死亡。

線蟲(chóng)病害在生產(chǎn)上已成為一類重要的頑固性病害，控制該病害的發(fā)生與蔓延是確保作物產(chǎn)量與品質(zhì)而急需解決的問(wèn)題。目前根結(jié)線蟲(chóng)病的防治主要有以下3種方法，即農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治。

種植抗性品種是一種重要的控制線蟲(chóng)病害發(fā)生的農(nóng)業(yè)措施，而抗病品種的缺乏限制了它的發(fā)展，而且部分抗性品種并沒(méi)有很全面的應(yīng)用。部分番茄抗性品種的種植與其它防治手段的聯(lián)合使用雖然已經(jīng)取得了一定的效果，但是因?yàn)橛行┢贩N在一些國(guó)家當(dāng)?shù)禺a(chǎn)量低，所以推行后并沒(méi)有受到種植者們的歡迎。

長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)農(nóng)作物的病蟲(chóng)害防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，現(xiàn)階段防治根結(jié)線蟲(chóng)的主要方法還是依賴于化學(xué)藥劑?；瘜W(xué)藥劑高效，易使用，但是由于農(nóng)藥污染較為嚴(yán)重，食品中農(nóng)藥檢出率高達(dá)90％以上，這嚴(yán)重危害了消費(fèi)者的身體健康。同時(shí)，由于食品農(nóng)藥殘留問(wèn)題導(dǎo)致我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品出口受阻，這對(duì)我國(guó)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重影響。因此，農(nóng)藥殘留已成為食品安全生產(chǎn)中急需解決的問(wèn)題。相比化學(xué)農(nóng)藥，生物農(nóng)藥具有安全、環(huán)保和無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)。注重低毒、高效和選擇性強(qiáng)的生物農(nóng)藥開(kāi)發(fā)已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。

目前，許多研究者提倡并在重點(diǎn)研究開(kāi)發(fā)利用生物防治技術(shù)來(lái)控制線蟲(chóng)病害。生物防治措施既對(duì)環(huán)境友好，對(duì)人畜安全，又能有效控制病害的發(fā)生與蔓延所以頗受青睞。目前已經(jīng)報(bào)道過(guò)的生防真菌有淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)、厚垣輪枝菌(Verticillium chlamydosporium)、被毛孢(Hissutella spp.)、綠色木霉(Trichoderma viride)等，殺線效果較好的生防細(xì)菌有巴氏桿菌(Pasteuria spp.)、芽孢桿菌(Bacillus spp.)和假單胞菌(Pseudomonas spp.)、除蟲(chóng)鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)等。

迄今為止，利用細(xì)菌防治線蟲(chóng)病害的報(bào)道不少，但是關(guān)于利用木糖氧化無(wú)色桿菌防治植物線蟲(chóng)病害研究尚未被報(bào)道過(guò)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種木糖氧化無(wú)色桿菌Achromobacter xylosoxidans AH-5(本發(fā)明或稱為AH-5菌株)，該菌株對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)病有較強(qiáng)的防治效果。該菌株已于2016年9月5日送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：Achromobacter xylosoxidans AH-5；保藏編號(hào)：CCTCC NO：M 2016458；地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是在于提供了一種Achromobacter xylosoxidans AH-5在制備防治根結(jié)線蟲(chóng)病生物制劑藥物中的應(yīng)用，特別適合于根結(jié)線蟲(chóng)病的防治。

本發(fā)明最后一個(gè)目的在于提供了一種Achromobacter xylosoxidans AH-5在促進(jìn)豌豆生長(zhǎng)中的應(yīng)用。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

一種Achromobacter xylosoxidans AH-5，通過(guò)以下方式獲得：

申請(qǐng)人從中國(guó)安徽省土壤土樣中分離、篩選得到一株對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)具有較強(qiáng)防治效果的菌株，將其命名為AH-5。通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化測(cè)定及分子生物學(xué)的鑒定，鑒定為木糖氧化無(wú)色桿菌Achromobacter xylosoxidans。

該菌株已于2016年9月5日送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：Achromobacter xylosoxidans AH-5；保藏編號(hào)：CCTCC NO：M 2016458；地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)。

Achromobacter xylosoxidans AH-5菌株菌落特征：菌落圓形，淺黃色，半透明，菌落凸起，革蘭氏染色后菌體呈現(xiàn)紅色，為陰性菌。

平板培養(yǎng)Achromobacter xylosoxidans AH-5使用的是NA培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基組分及配方如下：蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，牛肉膏3g，瓊脂20g，補(bǔ)充蒸餾水至1000mL，調(diào)pH至7.0，在121℃高壓蒸汽滅菌30min；35℃，暗培養(yǎng)。

一種木糖氧化無(wú)色桿菌AH-5在制備防治根結(jié)線蟲(chóng)病生物制劑藥物中的應(yīng)用，包括利用該菌株作為唯一有效成分或有效成分之一制備成防治植物線蟲(chóng)病害的藥物。

本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容還包括木糖氧化無(wú)色桿菌AH-5在制備生物殺線蟲(chóng)劑的應(yīng)用。

一種木糖氧化無(wú)色桿菌AH-5在促進(jìn)豌豆生長(zhǎng)中的應(yīng)用，包括所述的木糖氧化無(wú)色桿菌AH-5發(fā)酵液用于制備豌豆促生長(zhǎng)制劑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明篩選出一株防治根結(jié)線蟲(chóng)病的新菌株AH-5，該菌株是一種木糖氧化無(wú)色桿菌，目前沒(méi)有關(guān)于該菌株防治根結(jié)線蟲(chóng)病的相關(guān)報(bào)道。

2.利用該菌的發(fā)酵菌液，能有效地控制線蟲(chóng)病害的發(fā)生和危害。本發(fā)明篩選出的AH-5菌株對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)在室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn)中，AH-5發(fā)酵上清液對(duì)二齡幼蟲(chóng)24h的致死率可達(dá)到92.4％；室內(nèi)盆栽試驗(yàn)結(jié)果表顯示，AH-5發(fā)酵菌液處理組的豌豆根系根結(jié)數(shù)明顯減少，40天后防效可達(dá)72.29％，60天后防效為41.75％。在豌豆根結(jié)線蟲(chóng)病的大田試驗(yàn)中，120天后AH-5處理組的豌豆根系根結(jié)數(shù)明顯減少，對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)病的防效高達(dá)43.59％。

3.在盆栽試驗(yàn)、田間試驗(yàn)中，AH-5菌株對(duì)豌豆有較好的促生作用，在株高、根長(zhǎng)、根部鮮重方面均與對(duì)照組存在顯著差異(P≤5％)。

4.本發(fā)明使用的菌株對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)病防效較高，對(duì)人畜無(wú)毒；成本低。

5.本發(fā)明利用木糖氧化無(wú)色桿菌AH-5菌株的發(fā)酵菌液直接防治根結(jié)線蟲(chóng)病，生產(chǎn)和使用均十分簡(jiǎn)單，生產(chǎn)中沒(méi)有用到有機(jī)溶劑，降低了生產(chǎn)過(guò)程中和產(chǎn)品中的污染，也不會(huì)產(chǎn)生溶劑中毒，具有生物農(nóng)藥對(duì)人畜安全的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為菌株AH-5在牛肉膏蛋白胨平板上的菌落形態(tài)、革蘭氏染色圖片。

圖2為盆栽試驗(yàn)中AH-5處理組與清水對(duì)照組60天豌豆根系圖片。

圖3為盆栽試驗(yàn)中AH-5處理組與清水對(duì)照組60天豌豆植株圖片。

圖4為田間試驗(yàn)中AH-5處理組與清水對(duì)照組120天豌豆植株圖片。

圖5為田間試驗(yàn)中AH-5處理組與清水對(duì)照組120天豌豆根系圖片。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。本發(fā)明所用試劑或材料，如未特別說(shuō)明，均來(lái)源于商業(yè)渠道。

實(shí)施例1：

AH-5菌株的分離及鑒定

1.1AH-5菌株的分離

申請(qǐng)人從中國(guó)安徽省土壤土樣中分離、篩選得到一株對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)具有較強(qiáng)防治效果的菌株，將其命名為AH-5。本發(fā)明的AH-5菌株的分離和純化采用稀釋涂布平板法、平板劃線法、生物測(cè)定法等方法。

1.2菌株的鑒定

1.2.1菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

通過(guò)觀察菌落的顏色、形態(tài)、邊緣、透明度、光澤度、培養(yǎng)基的顏色等，并通過(guò)革蘭氏染色觀察個(gè)體形態(tài)特征。

將AH-5菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，從圖1中可以看到：AH-5菌落淺黃色、半透明、菌落凸起、無(wú)光澤、邊緣略整齊，無(wú)色素產(chǎn)生。鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體呈桿狀，無(wú)芽孢，革蘭氏染色呈紅色，為陰性菌。

1.2.2菌株生理生化特征檢測(cè)

采用酶試驗(yàn)、藥物敏感試驗(yàn)、氨基酸水解試驗(yàn)、6.5％NaCl生長(zhǎng)耐受試驗(yàn)、產(chǎn)H₂S試驗(yàn)、尿素水解試驗(yàn)等生理生化實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

AH-5部分生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。結(jié)果表明，細(xì)菌菌株AH-5生理生化特征與無(wú)色桿菌屬生理生化特征基本相似。

表1AH-5部分生理生化特征

注：“+”表示陽(yáng)性，“—”表示陰性。

1.2.3菌株AH-5的分子鑒定

將AH-5無(wú)菌操作臺(tái)中用接種環(huán)挑取單菌落于分裝好的NA液體培養(yǎng)基中，35℃，180rpm條件下震蕩培養(yǎng)12h，并利用細(xì)菌鑒定常用的細(xì)菌16SrDNA區(qū)通用引物：27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492r(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃30s、55℃30s、72℃45s，30個(gè)循環(huán)，72℃10min，4℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)合格后送生工公司測(cè)序。

經(jīng)測(cè)序獲得菌株AH-5的16S rDNA序列大小為1437bp(其序列為SEQ ID NO.1所示)，通過(guò)Blast分析，選取與之同源性較高的菌株，利用軟件MEGA5.20進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析、NJ法構(gòu)建菌株的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明AH-5與Achromobacter xylosoxidans聚在一個(gè)分支上，同源性為99％，結(jié)合菌株形態(tài)特征和生理生化實(shí)驗(yàn)，將AH-5鑒定為木糖氧化無(wú)色桿菌。

該菌株已于2016年9月5日送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：Achromobacter xylosoxidans AH-5；保藏編號(hào)：CCTCC NO：M 2016458；地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)。

培養(yǎng)AH-5菌株使用的是NA培養(yǎng)液，其組分及配方如下：蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，牛肉膏3g，補(bǔ)充蒸餾水至1000mL，調(diào)pH至7.0，在121℃高壓蒸汽滅菌30min。

搖瓶發(fā)酵參數(shù)條件：用挑針挑取細(xì)菌單個(gè)菌落，接種于裝有150mL NA培養(yǎng)液的三角瓶中，35℃，160rpm，搖培72h。將細(xì)菌菌液分裝入離心管中，8000r/min離心3min，將菌體與上清液分開(kāi)，上清液過(guò)0.22μm的細(xì)菌過(guò)濾器，收集至另一離心管中。用于實(shí)施例2和實(shí)施例3。

實(shí)施例2：

AH-5菌株發(fā)酵上清液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵孵化的影響

24孔板的每孔加入AH-5的上清液700μL，同時(shí)每孔中加入100個(gè)根結(jié)線蟲(chóng)卵與細(xì)菌上清液均勻混合，重復(fù)三次，設(shè)置無(wú)菌水為對(duì)照；將裝有根結(jié)線蟲(chóng)卵和AH-5上清液的24孔板放置在25℃恒溫箱中，7天后于體式顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)，并計(jì)算根結(jié)線蟲(chóng)卵孵化率與相對(duì)抑制率。

表2AH-5發(fā)酵上清液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵孵化的影響(7d，25℃)

注：表中字母不同表示差異顯著(SPSS 17.0t檢驗(yàn)，P≤0.05)

AH-5菌株發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵孵化的結(jié)果顯示：以ddH₂O為對(duì)照組的CK在7天后卵的孵化率達(dá)到了86.5％，經(jīng)AH-5發(fā)酵液處理的卵孵化率為77.4％，對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵的孵化無(wú)明顯的抑制作用(P≤0.05)，相對(duì)抑制率僅為10.5％(表2)，說(shuō)明AH-5菌株發(fā)酵液不能夠有效的抑制根結(jié)線蟲(chóng)卵的孵化。

實(shí)施例3：

AH-5菌株發(fā)酵上清液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)的影響

24孔板的每孔加入AH-5的上清液700μL，每孔中加入100條根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)與上清液均勻混合，重復(fù)三次，同時(shí)設(shè)置無(wú)菌水作為對(duì)照參考，將裝有根結(jié)線蟲(chóng)卵和AH-5上清液的24孔板放置在25℃恒溫箱中，分別在12h與24h后于體式顯微鏡下觀察，并記錄結(jié)果。

表3AH-5發(fā)酵上清液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)的影響(25℃)

注：表中字母不同表示差異顯著(SPSS 17.0t檢驗(yàn)，P≤0.05)

AH-5菌株發(fā)酵上清液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)過(guò)ddH2O處理后12h，24h的二齡幼蟲(chóng)均無(wú)死亡，AH-5菌株發(fā)酵上清液處理組在處理后12h和24h后，對(duì)二齡幼蟲(chóng)致死的死亡率分別為77.9％和92.4％(表3)。實(shí)驗(yàn)證明AH-5菌株發(fā)酵上清液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)致死率具有顯著效果(P≤0.05)。

實(shí)施例4：

AH-5菌株防治豌豆根結(jié)線蟲(chóng)的溫室盆栽試驗(yàn)

供試材料和方法：

豌豆：中豌六號(hào)

線蟲(chóng)：南方根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogyne incognita

豌豆種子浸泡7-8個(gè)小時(shí)后播種于口徑為18cm、高為11cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，每營(yíng)養(yǎng)缽1.5kg無(wú)線蟲(chóng)土壤，出苗后每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽留一棵豌豆苗。

AH-5液體發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(溶劑為水，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，牛肉膏3g，補(bǔ)充蒸餾水至1000mL，調(diào)pH至7.0，在121℃高壓蒸汽滅菌30min。)。挑取AH-5單菌落接種到裝有150mL NA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，35℃，160rpm，搖培72h，得到AH-5發(fā)酵液。該AH-5發(fā)酵液中，AH-5的含量為2×10⁹cfu/mL。

試驗(yàn)設(shè)如下兩個(gè)處理：

AH-5處理組：待豌豆幼苗長(zhǎng)出4片真葉后接種南方根結(jié)線蟲(chóng)：將孵化的南方根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)配制成100條/mL的線蟲(chóng)懸浮液，取10mL均勻加入在植株根系周圍。同時(shí)在當(dāng)天進(jìn)行發(fā)酵液處理，用2×10⁹cfu/mL的AH-5發(fā)酵液10mL灌根處理豌豆幼苗。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)處理8株豌豆幼苗。然后放置在溫室中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)30天后補(bǔ)施一次發(fā)酵液，正常田間管理。

對(duì)照組：將AH-5發(fā)酵液替換為等量的清水，其它實(shí)驗(yàn)操作與AH-5處理組相同。

病害調(diào)查：分別距離第一次施藥40d和60d進(jìn)行病害調(diào)查，拍照記錄。①豌豆生長(zhǎng)情況的調(diào)查：測(cè)量并統(tǒng)計(jì)株高、地上部分鮮重(不含果實(shí))、根部長(zhǎng)度、根部鮮重等數(shù)據(jù)。②豌豆根結(jié)線蟲(chóng)病發(fā)病情況調(diào)查：將豌豆植株的根剪下，將每組各處理的根收集在一起，剪碎并在榨汁機(jī)中打漿2次，第1次10s，第2次20s，先后用200目、325目的篩子過(guò)濾，蒸餾水沖洗篩子，收集留在325目篩子上的線蟲(chóng)和卵；各處理每組各取1mL的懸液，置于自制的雙層玻片中觀察，對(duì)其中的根結(jié)線蟲(chóng)與根結(jié)線蟲(chóng)卵進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算每棵豌豆根部中根結(jié)線蟲(chóng)和根結(jié)線蟲(chóng)卵的數(shù)量。

防治效果＝(對(duì)照組根結(jié)數(shù)—處理組根結(jié)數(shù))/對(duì)照組根結(jié)數(shù)×100％

表4AH-5發(fā)酵液對(duì)豌豆生長(zhǎng)情況的影響(40d)

注：表中字母不同表示差異顯著(SPSS 17.0t檢驗(yàn)，P≤0.05)

表5AH-5發(fā)酵液對(duì)豌豆生長(zhǎng)情況的影響(60d)

注：表中字母不同表示差異顯著(SPSS 17.0t檢驗(yàn)，P≤0.05)

豌豆生長(zhǎng)情況的調(diào)查結(jié)果表明：在第一次藥劑處理后40天進(jìn)行豌豆幼苗的生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)豌豆株高、地上部分鮮重、根長(zhǎng)經(jīng)AH-5發(fā)酵液處理后相對(duì)清水處理組CK在0.05水平上具有顯著性差異，但是AH-5處理組的根重與CK組無(wú)顯著性差異(表4)；在60天時(shí)對(duì)豌豆幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)AH-5處理組的株高、地上部分鮮重均高于與CK組，并且在0.05水平上存在顯著性差異，而AH-5組的根長(zhǎng)、根重指標(biāo)高于CK組，但在0.05水平上無(wú)顯著性差異(表5)。實(shí)驗(yàn)證明AH-5發(fā)酵液在豌豆生長(zhǎng)有顯著地促進(jìn)作用。

表6盆栽試驗(yàn)中AH-5對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的防治效果(40d)

注：表中字母不同表示差異顯著(SPSS 17.0t檢驗(yàn)，P≤0.05)

表7盆栽試驗(yàn)中AH-5對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的防治效果(60d)

注：表中字母不同表示差異顯著(SPSS 17.0t檢驗(yàn)，P≤0.05)

AH-5發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的防治效果證明：AH-5液體發(fā)酵培養(yǎng)物在沒(méi)有任何助劑填加的條件下，施用2次，40天時(shí)對(duì)豌豆根結(jié)線蟲(chóng)病防效達(dá)72.29％(表6)，60天后對(duì)豌豆根結(jié)線蟲(chóng)病防效仍達(dá)41.75％(表7)。經(jīng)AH-5處理后的豌豆苗根系發(fā)達(dá)，根結(jié)少，植株生長(zhǎng)正常，未發(fā)現(xiàn)明顯的藥害，對(duì)豌豆安全，具有良好的應(yīng)用價(jià)值，該濃度已經(jīng)達(dá)到產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)利用的濃度要求。

實(shí)施例5：

AH-5菌株防治豌豆根結(jié)線蟲(chóng)的田間試驗(yàn)

供試材料和方法：

豌豆：中豌六號(hào)

線蟲(chóng)：南方根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogyne incognita

豌豆種子播種于線蟲(chóng)病害較為嚴(yán)重的溫室大棚，每隴3行，每行6穴。出苗10d后間苗，每穴留一株豌豆幼苗。

AH-5液體發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(溶劑為水，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，牛肉膏3g，補(bǔ)充蒸餾水至1000mL，調(diào)pH至7.0，在121℃高壓蒸汽滅菌30min)。挑取AH-5單菌落接種到裝有150mL NA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，35℃，160rpm，搖培72h，得到AH-5發(fā)酵液。該AH-5發(fā)酵液中，AH-5的含量為2×10⁹cfu/mL。

實(shí)驗(yàn)設(shè)如下兩個(gè)處理：

AH-5處理組：播種豌豆種子30d后，進(jìn)行藥劑處理，用10⁹cfu/mL的AH-5發(fā)酵液10mL灌根處理豌豆幼苗。1隴即一個(gè)重復(fù)，每隴共18株豌豆，實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)處理1隴豌豆幼苗，保持正常田間管理。

清水對(duì)照組(CK)：將AH-5發(fā)酵液替換為等量的清水，其它實(shí)驗(yàn)操作與AH-5處理組相同。病害調(diào)查：120d后，對(duì)豌豆生長(zhǎng)情況和發(fā)病狀況進(jìn)行調(diào)查和拍照記錄，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。①豌豆生長(zhǎng)情況的調(diào)查：測(cè)量并統(tǒng)計(jì)株高、地上部分鮮重(含果實(shí))、根部長(zhǎng)度、根部鮮重等數(shù)據(jù)。②豌豆根結(jié)線蟲(chóng)病發(fā)病情況調(diào)查：將豌豆根系用清水輕輕沖洗干凈后，觀察根系發(fā)病情況，對(duì)病害進(jìn)行分級(jí)。

0級(jí)：無(wú)根結(jié)；

1級(jí)：有少數(shù)根結(jié)，占全根系1％-25％；

2級(jí)：根系根結(jié)數(shù)量中等，占全根系的26％-50％；

3級(jí)：根系根結(jié)數(shù)量多，占全根的51％-75％；

4級(jí)：根系根結(jié)數(shù)量很多，占全根系76％-100％

防治效果＝(對(duì)照組根結(jié)級(jí)數(shù)—處理組根結(jié)級(jí)數(shù))/對(duì)照組根結(jié)級(jí)數(shù)×100％

表8田間試驗(yàn)中AH-5發(fā)酵液對(duì)豌豆地上部分生長(zhǎng)的影響(120d)

注：表中字母不同表示差異顯著(SPSS 17.0t檢驗(yàn)，P≤0.05)

豌豆地上部分生長(zhǎng)情況的調(diào)查證明：通過(guò)調(diào)查120d后豌豆植株的生理指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，AH-5處理組豌豆植株的地上部分鮮重(含果實(shí))為37.00g、株高為41.95mm、單株豆莢數(shù)為1.53個(gè)、單株豆莢重為2.10g，而CK組的地上部分鮮重(含果實(shí))為21.34g、株高為32.11mm、單株豆莢數(shù)為1.13個(gè)、單株豆莢重為1.64g。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，AH-5處理組的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)均明顯高于清水處理組(CK)，并且在0.05水平上存在顯著性差異(表8)，也證明AH-5發(fā)酵液在豌豆生長(zhǎng)有顯著地促進(jìn)作用。

表9AH-5發(fā)酵液對(duì)豌豆根結(jié)線蟲(chóng)的田間防治效果(120d)

注：表中字母不同表示差異顯著(SPSS 17.0t檢驗(yàn)，P≤0.05)

AH-5發(fā)酵液對(duì)豌豆根結(jié)線蟲(chóng)的田間防治效果證明：120d后對(duì)豌豆地下部分鮮重和根長(zhǎng)測(cè)量統(tǒng)計(jì)，并對(duì)根結(jié)進(jìn)行病害分級(jí)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，AH-5處理組的地下部分鮮重為1.31g高于CK組的0.77g，并且在0.05水平上存在顯著性差異；AH-5處理組的單株根結(jié)病害級(jí)數(shù)僅為0.73，相對(duì)于CK組的1.30也顯著下降，AH-5發(fā)酵液對(duì)于豌豆根結(jié)線蟲(chóng)的防治效果可達(dá)到43.59％(表9)。經(jīng)AH-5處理后的豌豆苗根系發(fā)達(dá)，根結(jié)少，植株生長(zhǎng)正常，未發(fā)現(xiàn)明顯的藥害(圖4，圖5)，對(duì)豌豆安全，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

SEQUENCE LISTING

<110> 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一株防治植物根結(jié)線蟲(chóng)的木糖氧化無(wú)色桿菌及其應(yīng)用

<130> 一株防治植物根結(jié)線蟲(chóng)的木糖氧化無(wú)色桿菌及其應(yīng)用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1437

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcccaatgcg gagcttacac atgcagtcga acggcagcac ggacttcggt ctggtggcga 60

gtggcgaacg ggtgagtaat gtatcggaac gtgcccagta gcgggggata actacgcgaa 120

agcgtagcta ataccgcata cgccctacgg gggaaagcag gggatcgcaa gaccttgcac 180

tattggagcg gccgatatcg gattagctag ttggtggggt aacggctcac caaggcgacg 240

atccgtagct ggtttgagag gacgaccagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300

ctacgggagg cagcagtggg gaattttgga caatggggga aaccctgatc cagccatccc 360

gcgtgtgcga tgaaggcctt cgggttgtaa agcacttttg gcaggaaaga aacgtcgtgg 420

gttaataccc cgcgaaactg acggtacctg cagaataagc accggctaac tacgtgccag 480

cagccgcggt aatacgtagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgtgcg 540

caggcggttc ggaaagaaag atgtgaaatc ccagagctta actttggaac tgcattttta 600

actaccgggc tagagtgtgt cagagggagg tggaattccg cgtgtagcag tgaaatgcgt 660

agatatgcgg aggaacaccg atggcgaagg cagcctcctg ggataacact gacgctcatg 720

cacgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc ctaaacgatg 780

tcaactagct gttggggcct tcgggccttg gtagcgcagc taacgcgtga agttgaccgc 840

ctggggagta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg 900

tggatgatgt ggattaattc gatgcaacgc gaaaaacctt acctaccctt gacatgtctg 960

gaatgccgaa gagatttggt agtgctcgca agagaaccgg aacacaggtg ctgcatggct 1020

gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtca 1080

ttagttgcta cgaaagggca ctctaatgag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg 1140

gatgacgtca agtcctcatg gcccttatgg gtagggcttc acacgtcata caatggtcgg 1200

gacagagggt cgccaacccg cgagggggag ccaatcccag aaacccgatc gtagtccgga 1260

tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgt 1320

cgcggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttt 1380

taccagaagt agttagccta accgcaaggg gggcgatacc acgtagaatc agggtct 1437