一種大豆矮桿性狀緊密連鎖的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大豆矮桿性狀緊密連鎖的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

作物矮桿性狀的應(yīng)用實現(xiàn)了第一次綠色革命，是高產(chǎn)育種的第一個里程碑。自1967年，大豆矮稈性狀應(yīng)用于育種后，世界范圍內(nèi)不斷創(chuàng)造大豆高產(chǎn)紀(jì)錄(Cooper，1981，Cooper，1991)，因此矮桿性狀已成為大豆育種的一個重要研究內(nèi)容。然而在大豆育種中，雖然植株高矮很容易肉眼鑒別，但由于水、肥、種植密度和生育期等因素影響比較嚴(yán)重，尤其在育種早世代單株選擇時，矮桿性狀的鑒定不夠方便和準(zhǔn)確。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于作物育種，加快了作物育種的效率。分子標(biāo)記技術(shù)能夠?qū)δ繕?biāo)性狀的基因型進行鑒定，不受環(huán)境，生育時期等很多限制。大豆矮桿性狀屬于簡單質(zhì)量遺傳性狀，是由一對或兩對隱形主效基因控制的(kilen，1975；Boerma)，有的還伴若干修飾基因控制(何平，陳恒鶴，W.R.Feh)。因此，利用矮桿性狀連鎖的分子標(biāo)記進行矮桿性狀的鑒定是可行的。

目前，關(guān)于矮桿基因的遺傳定位研究，目前利用矮桿或半矮稈材料進行了較多株高性狀QTL定位。統(tǒng)計大豆數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，在A1、B1、C1、C2、D1a、D1b、E、F、G、H、I、J、L、M、N和O等16條染色體上大約有31個QTL，其中在B1(47Mb-72Mb)，C2(106Mb-131Mb)，F(xiàn)(1Mb-22.5Mb，60Mb-85Mb)，J(11Mb-28Mb)，L(8Mb-15Mb)，65Mb-93Mb)，M(17Mb-41Mb)位點，在不同遺傳群體里，發(fā)現(xiàn)了共性的QTL。但由于目前針對矮桿質(zhì)量性狀進行的基因定位研究還未見報道，因此，我們對大豆矮桿的分子遺傳和機制還不了解。

現(xiàn)有大豆矮桿性狀的鑒定技術(shù)或方法是在大豆開花后期，株高穩(wěn)定了，通過肉眼去鑒定是否為矮桿材料；鑒定受時間和生育時期的限制。另外，由于株高受栽培密度、機械損傷，田間降水等環(huán)境條件的影響，僅僅調(diào)查一株不能準(zhǔn)確判斷是高還是矮，必須群體調(diào)查準(zhǔn)確；在矮桿育種中，由于矮桿是隱性基因控制的，僅占分離群體的1/2[1-(1/2)r]，如在育種早世代進行選育，育種群體中表現(xiàn)為矮桿材料較少，因此，育種規(guī)模要比較大，才能夠篩選出優(yōu)良的矮桿育種材料，育種成本高，育種效率低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種大豆矮桿性狀緊密連鎖的SNP標(biāo)記，及其該標(biāo)記用于篩選矮桿性狀大豆材料的應(yīng)用和方法。

本發(fā)明主要通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種大豆矮桿性狀緊密連鎖的SNP標(biāo)記，根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述的SNP標(biāo)記包含：第一SNP標(biāo)記GM19_45000827和第二SNP標(biāo)記GM19_45361938，所述的第一SNP標(biāo)記GM19_45000827為大豆基因組v1.0的第19號染色體45000827位置的堿基為C或A；所述的第二SNP標(biāo)記GM19_45361938為大豆基因組v1.0的第19號染色體44902890位置的堿基為G或A。

本發(fā)明所述的GM19_45000827處堿基是C的大豆為矮桿，堿基是A的大豆為高桿；所述的GM19_45361938處堿基是G的大豆為矮桿，堿基是A的大豆為高桿。

本發(fā)明的另一個目的，本發(fā)明還提供了一種用于檢測前面所述的SNP標(biāo)記的KASP引物對，具體的所述的引物對包括：

GM19_45000827的正向引物1：ACATGCCTACCAACAAAAG，正向引物2：CGGTGTAGTTCGGGAAACAA，反向引物：CGGTGTAGTTCGGGAAACAC；

GM19_45361938的正向引物1：AGATTCCCAGGCGCAACTTG，正向引物2：AGATTCCCAGGCGCAACTTA，反向引物：TTTGTAGCTTCTGTTTATAG。

利用本發(fā)明的引物對能夠有效地對待測大豆的上述與大豆矮桿性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記所在的片段進行PCR擴增，進而通過檢測PCR產(chǎn)物的熒光信號，確定待測大豆該種SNP標(biāo)記位點的基因型，進而能夠有效預(yù)測待測大豆矮桿性狀。

本發(fā)明的另一個目的，本發(fā)明還提供了用于檢測前面所述的SNP標(biāo)記的試劑盒，該試劑盒包含前面所述的用于檢測本發(fā)明的SNP標(biāo)記的引物對，即本發(fā)明試劑盒包含具有SEQ ID NO：1-6所示的核苷酸序列的引物對。

本發(fā)明的另一個目的，本發(fā)明還提供了前面所述的本發(fā)明的SN P標(biāo)記、引物對或試劑盒在大豆矮桿性狀分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個目的，本發(fā)明還提供了一種篩選具有矮桿性狀的大豆材料的方法，其步驟如下：

1)提取待檢測大豆基因組DNA；

2)檢測：以待檢測大豆基因組DNA為模板，利用前面所述的引物進行PCR擴增反應(yīng)；

3)結(jié)果判斷：利用LightCycler 480軟件(v1.5)的Endpoint分析模塊檢測PCR擴增產(chǎn)物，根據(jù)信號表現(xiàn)區(qū)分基因型。其中，綠信號與公交9112基因型一致，是高桿基因型。藍(lán)信號與吉密豆1號基因型一致，是矮桿基因型；紅信號為雜合基因型，下代高矮桿分離；粉色和其它為基因型不確定或樣品缺失。

其中，第一標(biāo)記GM19_45000827的檢測矮桿準(zhǔn)確率為96.77％，第二標(biāo)記GM19_45361938檢測矮桿準(zhǔn)確率為93.48％。

本發(fā)明的有益效果：

1)簡化基因組法遺傳定位到2個與大豆矮桿性狀連鎖最為緊密的SNP標(biāo)記，利用這兩個SNP標(biāo)記結(jié)合KASP PCR技術(shù)，能夠從基因型上鑒定矮稈性狀，可以在大豆不同生長時期，不受環(huán)境，群體大小和生育時期等條件的限制，能夠快熟、準(zhǔn)確、規(guī)?；罔b定大豆植株矮桿性狀。

2)在大豆矮稈育種中，解決了矮桿性狀僅僅在開花后期才能調(diào)查和單一植株受環(huán)境影響性狀調(diào)查不準(zhǔn)確必須群體調(diào)查的問題；而且在矮桿育種后代材料選育中，在種子期就能夠鑒定出隱性基因控制的矮桿基因的材料。

3)在達(dá)到相同育種效果下，大大減少了田間育種面積，進而減少田間試驗材料和勞務(wù)成本。

附圖說明

圖1是本申請密豆1號×公交9112組合F2群體內(nèi)377個個體株高分布頻率曲線；

圖2是本申請大豆20個染色體上個SNP的Δ(SNP_index)擬合曲線；

圖3是本申請11個SNP在密豆1號和公交9112間的多態(tài)性檢測結(jié)果；其中，a為公交9112，b為吉密豆1號，1-12分別GM19_44412186，GM19_44546232，GM19_44595030，GM19_44622364，GM19_44779426，GM19_44815533，GM19_44902890，GM19_45000827，GM19_45361938，GM19_45423153，GM19_4549471611個SNP引物；

圖4是8個穩(wěn)定多態(tài)關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記所構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜；Dwarf為矮桿基因；

圖5是本發(fā)明實施例緊密連鎖標(biāo)記GM19_45000827對吉密豆1號和公交9112雜交后代KASP SNP PCR產(chǎn)物的檢測；

圖6是本發(fā)明實施例緊密連鎖標(biāo)記GM19_45361938對吉密豆1號和公交9112雜交后代KASP SNP PCR產(chǎn)物的檢測。

具體實施方式

以下將配合附圖及實施例來詳細(xì)說明本申請的實施方式，藉此對本申請如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。

實施例1與大豆矮桿性狀緊密連鎖的SNP標(biāo)記的獲得

1、遺傳定位矮桿性狀

(1)利用“吉密豆1號”和“公交9112”雜交獲得的377個F₂單株DNA及其F_2:3株高表現(xiàn)進行大豆矮桿性狀的遺傳定位。

(2)調(diào)查F_2:3遺傳群體各個株系的植株高度，55壟距，15厘米株距，2兩粒播種的栽培密度條件下，大于70的定義為非矮桿，小于等于70的定義為矮桿。利用X₂測驗分析F_2:3株系株高分離是否符合3:1(圖1)，如果符合3:1，則矮桿性狀為單基因控制的，視為質(zhì)量性狀。

(3)CTAB法提取其F₂單株DNA，無菌水溶解DNA，濃度要大于50ng/ul，OD_260/280＝1.8-2.1；利用0.1％瓊脂糖凝膠檢測DNA，條帶完整。

(4)選擇其F_2:3株高表現(xiàn)極端高的40F₂單株和株高極端矮的40F₂單株。等量混合40個F₂單株DNA，分別構(gòu)建矮桿基因池和非矮桿基因池。

(5)簡化基因組BSA法構(gòu)建吉密豆1號、公交9112、矮桿基因池和非矮桿基因池文庫(Sun et al，2013)并測序。

(6)Δ(SNP_index)擬合曲線關(guān)聯(lián)分析法定位矮桿性狀(Hill，2013)，并確定Δ(SNP_index)擬合回歸閾值為0.8704。在基因組區(qū)間內(nèi)，有3個或三個以上大于閾值且連續(xù)分布的SNP，這樣的基因組區(qū)間，即為與矮桿性狀關(guān)聯(lián)的區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)這樣的區(qū)間僅有一個(圖2)，位于williams 82大豆基因組(1.0版本)19號染色體44372629bp-45495014bp位置區(qū)間，區(qū)間物理距離為1.12Mb。這個區(qū)域有18個連續(xù)大于閾值的SNP標(biāo)簽(表1)，區(qū)域平均擬合回歸值為0.8796。

表1矮桿性狀關(guān)聯(lián)區(qū)域18個連續(xù)大于閾值的SNP擬合值

實施例2矮桿性狀連鎖的SNP標(biāo)記開發(fā)

(1)針對其中均勻分布的12個標(biāo)簽(Marker1098514，Marker1168024，Marker1143721，Marker1110430，Marker1120990，Marker1086045，Marker1118571，Marker11080703，Marker1093726，Marker1102167，Marker1094495，Marker1061721)中的12個SNP位點(44412186，44546232，44595030，44622364，44779426，44815533，44902890，4,5000827，45361938，45423153，45494716)，利用KASP技術(shù)(LGC生物公司)設(shè)計并合成11個SNP引物，具體引物對序列如下：

GM19_44412186引物對序列：

F1:TACTTTATTTCGTTAGGTCT

F2:TACTTTATTTCGTTAGGTCC

R:TTACCATAACATACAAAGAC

GM19_44546232引物對序列:

F1:ATGGAAACAATTTAAATGA

F2:ATGGAAACAATTTAAATGT

R:ATTGTGACTAATTAATCGTA

GM19_44595030引物對序列:

F1:TTTAACTCATTAAGGTTTAT

F2:TTTAACTCATTAAGGTTTAG

R:CATTAGCAAACAAAAAAGGA

GM19_44622364引物對序列:

F1:TTCGCTAACTGCCTTGCCCG

F2:TTCGCTAACTGCCTTGCCCA

R:CTTTTCGGACACCCTCTTAG

GM19_44779426引物對序列:

F1:TCTAGATTATTAGTATAAGT

F2:TCTAGATTATTAGTATAAGC

R:AGTGAGACCTTTAATTTACT

GM19_44815533引物對序列:

F1:TCATGTGCGGTATACTTACT

F2:TCATGTGCGGTATACTTACC

R:ACCATTATC TATTCTAGGGA

GM19_44902890引物對序列:

F1:TGGCAATCACTTGTTTTAAA

F2:TGGCAATCACTTGTTTTAAT

R:CGTTTGACACTTCAGATGTT

GM19_45000827引物對序列:

F1:CGGTGTAGTTCGGGAAACAC

F2:CGGTGTAGTTCGGGAAACAA

R:ACATGCCTACCAACAAAAGA

GM19_45361938引物對序列:

F1:AGATTCCCAGGCGCAACTTG

F2:AGATTCCCAGGCGCAACTTA

R:TTTGTAGCTTCTGTTTATAG

GM19_45422153引物對序列:

F1:GTCTTGGTCCGCCTTCGTCC

F2:GTCTTGGTCCGCCTTCGTCT

R:CACAGGTAGCAGCTTAGCAA

GM19_45494716引物對序列:

F1:ATTAGCCCTGGCTGAAGAAG

F2:ATTAGCCCTGGCTGAAGAAA

R:GCTCATGTTGGATGAGCTTT

(2)KASP SNP PCR擴增父母本，即吉密豆1號和公交9112，設(shè)置三個重復(fù)，通過檢測SNP是否在吉密豆1號和公交9112存在多態(tài)性，來驗證是否可作為SNP標(biāo)記。LightCycler 480軟件(v1.5)的Endpoint分析模塊檢測發(fā)現(xiàn)，8個SNP引物，即GM19_44412186，GM19_44546232，GM19_44595030，GM19_44779426，GM19_44902890，GM19_45000827、GM19_45361938和GM19_45494716在吉密豆1號和公交9112間，三個重復(fù)熒光顯色皆為為藍(lán)綠差異，即存在穩(wěn)定的多態(tài)性(圖3，其中d表示綠色，e表示藍(lán)色，c表示粉色)。其中，PCR反應(yīng)體系為3ul：DNA 1.5ul(5-30ng/ul)，2×KASP Master MIX緩沖液1.5ul，KASP assay 0.05ul；PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10分鐘；95℃變性20秒，65℃退火延伸1.00(每循環(huán)降0.8度)，10個循環(huán)；95℃變性20秒，65℃退火延伸1分鐘，36個循環(huán)；最后降溫到10℃。

(3)在吉密豆1號和公交9112雜交的377個F₂遺傳個體中，對8個多態(tài)SNP引物(GM1944412186，GM1944546232，GM1944595030，GM1944779426，GM1944902890，GM19_45000827、GM19_45361938和GM19_45494716)進行KASP PCR擴增，得到377個F₂個體在8個SNP位點的基因型數(shù)據(jù)。

(4)結(jié)合377個F_2:3株系株高表型數(shù)據(jù)，用JoinMap 3.0軟件進行連鎖分析，計算重組率；并利用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化成遺傳圖距，確定標(biāo)記和基因之間的排列順序，利用MapChart 2.0進行連鎖圖譜的繪制(圖4)。將矮桿基因定位到SNP標(biāo)記GM19_45000827和GM19_45361938標(biāo)記間，矮桿基因與兩個緊密連鎖標(biāo)記的遺傳距離分別為，2個SNP標(biāo)記間的物理距離約為361kb。

施例3利用KASP SNP PCR技術(shù)對大豆矮桿性狀進行基因型鑒定

(1)采用CTAB法提取用于鑒定的大豆材料的DNA，無菌水溶解并稀釋到5-30ng/ul，用于KASP PCR反應(yīng)鑒定基因型。

(2)KASP SNP PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件和基因型分析方法按照實施例2中的條件進行。

(3)利用2個標(biāo)記(GM19_45000827和GM19_45361938)的引物，對“吉密豆1號”ד公交9112”的272個雜交后代F_4:5的株系進行鑒定，LightCycler 480軟件(v1.5)的Endpoint分析模塊檢測發(fā)現(xiàn)(圖5、圖6)，

對于標(biāo)記GM19_45000827而言，共115綠色信號，93個藍(lán)色信號，40紅色信號，24個粉色信號或其它；對于GM19_45361938而言，共111綠色信號，92個藍(lán)色信號，48紅色信號，21個粉色信號或其它。其中，綠信號，與公交9112高桿親本基因型一致，為高桿基因型(D_WD_W)。藍(lán)信號，與吉密豆號基因型一致，為矮桿基因型(d_wd _w)；紅信號，雜合基因型(D_Wd_w)；粉色信號或其它，無法確定基因型或無信號(unknown或negtive)。

(4)統(tǒng)計矮桿鑒定符合率發(fā)現(xiàn)，對于GM19_45000827而言，93個表現(xiàn)藍(lán)色信號的矮桿基因型(d_wd_w)的個體中90個是矮桿品系，矮桿鑒定準(zhǔn)確率為96.77％。對于GM19_45361938而言，92個表現(xiàn)藍(lán)色信號的矮桿基因型(d_wd_w)的個體中86個是矮桿品系,矮桿鑒定準(zhǔn)確率93.48％。因此，通過對株高性狀的表現(xiàn)型測定結(jié)果和KASP SNP基因型分型結(jié)果的統(tǒng)計分析，證明這2個SNP標(biāo)記能夠高度準(zhǔn)確地對大豆矮桿和高桿進行良好分型。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進行改動。而本領(lǐng)域人員所進行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。