構(gòu)建在海馬體區(qū)域特異性敲除IKKα基因的小鼠模型的方法及打靶載體和試劑盒與流程

本發(fā)明屬于影像學(xué)、病理學(xué)、生理學(xué)，遺傳學(xué)，分子生物學(xué)以及行為學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及構(gòu)建在海馬體區(qū)域特異性敲除IKKα基因的小鼠模型的方法及打靶載體和試劑盒。

背景技術(shù)：

IKKα是組成IKK復(fù)合物的調(diào)節(jié)亞基，IKK復(fù)合物能夠影響NF-κB信號通路的活化。在膠質(zhì)瘤(一種發(fā)生在腦部的腫瘤)研究中表明，NF-κB等與炎癥相關(guān)的信號通路處于異常活化狀態(tài)，目前關(guān)于IKKα在腦部腫瘤中的機制研究并不清楚，其敲除后是否會影響腦部腫瘤的發(fā)生發(fā)展尚不明確，同時其作為炎癥相關(guān)分子，在正常哺乳動物海馬體區(qū)域完全敲除后是否會影響其行為學(xué)功能并不清楚。因此，利用動物模型研究腦部IKKα異?；罨l(fā)的疾病，可以為人類腦部腫瘤及可能伴隨的異常行為學(xué)功能的診斷，治療提供理論基礎(chǔ)。

IKK復(fù)合物主要有三種亞基組成，分子量大小為700-900KD，三種亞基分別為IKKα(85KD)，IKKβ(87KD)，IKKγ(48KD)，其中IKKα和IKKβ為催化亞基，IKKγ為結(jié)構(gòu)亞基。IKKα和IKKβ的基因結(jié)構(gòu)相似，但具有不同的生物學(xué)活性。IKKα蛋白可與TNFα受體家族成員中的NF-κB受體激活蛋白作用，進(jìn)而影響NF-κB蛋白與DNA的結(jié)合活性。而IKKβ蛋白主要與炎癥相關(guān)。IKK復(fù)合物的活化主要與能引起IKK復(fù)合物磷酸化修飾的生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，NF-κB的抗凋亡，促增殖和免疫激活功能是致使正常細(xì)胞癌變的重要因素。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，NF-κB處于異常活化和持續(xù)激活狀態(tài)。正常細(xì)胞中，NF-κB參與的炎癥反應(yīng)對于維持機體正常防御外界因素感染以及修復(fù)機制有重要作用。完全敲除IKKα基因，會導(dǎo)致小鼠胚胎致死。

Cre-LoxP系統(tǒng)是由一個單一的Cre重組酶和被稱為LoxP序列的靶向基因敲除序列組成。Cre重組酶有70％的重組效率，不借助任何輔助因子，可作用于多種結(jié)構(gòu)的DNA底物，如線形、環(huán)狀甚至超螺旋DNA。它是一種位點特異性重組酶，能介導(dǎo)兩個LoxP位點(序列)之間的特異性重組，使LoxP位點間的基因序列被刪除或重組。Cre-Lox重組系統(tǒng)在目前存在的轉(zhuǎn)基因動物模型的表型和基因型之間的聯(lián)系實現(xiàn)最佳的實驗控制Cre重組酶可以識別LoxP序列，通過DNA重組的原理，可以將兩個LoxP序列之間的片斷，即DNA片斷去除。如果是沒有Cre，LoxP只是在特定的基因片段兩側(cè)，不影響基因片段的活性。一旦Cre酶有活性，就可以把LoxP中間所夾的序列去除，即條件性基因敲除。Cre重組酶介導(dǎo)兩個LoxP位點間的重組是一個動態(tài)、可逆的過程，可以分成三種情況：

1、如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點間的序列；

2、如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導(dǎo)致兩個LoxP位點間的序列倒位；

3、如果兩個LoxP位點分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶能介導(dǎo)兩條DNA鏈的交換或染色體易位。

目前，國內(nèi)、外實驗動物成像的主要手段包括結(jié)構(gòu)成像(解剖成像)及功能成像(分子成像)?；铙w光學(xué)成像與micro-CT、MRI(magnetic resonance imaging)、ultrasound等結(jié)構(gòu)成像手段結(jié)合，能為動物實驗提供更客觀的數(shù)據(jù)、更確切的分子生物特性。活體成像技術(shù)可以從影響基因表達(dá)的各個不同的層面進(jìn)行基因研究，可應(yīng)用于某種疾病的基因表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動物實驗以及基因治療等，可將靶基因進(jìn)行熒光素酶標(biāo)記后轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)，形成研究所需的各種小動物疾病模型，包括腫瘤，免疫系統(tǒng)疾病，感染性疾病等。近紅外光的最大吸收波長和發(fā)射波長為650-900nm，活體成像時，哺乳動物組織因其透光性和深度組織的背景干擾，普通的熒光標(biāo)簽不能很好的反應(yīng)其生理功能，近紅外熒光是近年來在影像學(xué)研究中較為熱門的研究之一，因其可減少自發(fā)熒光和低光散射使其可作為穿透深度組織的優(yōu)選標(biāo)簽。iRFP720是一種近紅外熒光蛋白基因，從細(xì)菌的感光細(xì)胞中分離得到，可用于基因工程編輯構(gòu)建打靶載體的標(biāo)簽，目前對于iRFP720作為一種近紅外紅色熒光標(biāo)簽構(gòu)建動物模型的研究較為缺乏。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供構(gòu)建在海馬體區(qū)域特異性敲除IKKα基因的小鼠模型的方法及打靶載體和試劑盒。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

所述構(gòu)建在海馬體區(qū)域特異性敲除IKKα基因的小鼠模型的方法包括如下步驟：

(1)構(gòu)建打靶載體pBR322-MCS-2S-Chuk-KI，所述打靶載體pBR322-MCS-2S-Chuk-KI的序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)將iRFP720紅色熒光蛋白基因連接至打靶載體，然后導(dǎo)入小鼠，構(gòu)建攜帶有iRFP720基因的IKKα基因knock in雜合型小鼠；

(3)將IKKα基因knock in雜合型轉(zhuǎn)基因小鼠與CamKIIalpha-cre T29-1轉(zhuǎn)基因小鼠分別與C57野生型小鼠擴大繁殖，然后將IKKα基因knock in雜合型轉(zhuǎn)基因小鼠與CamKIIalpha-cre T29-1轉(zhuǎn)基因小鼠交配獲得雜合IKKα^F/+·Camk2α.Cre-LoxP小鼠，再利用雜合型小鼠自交獲得純合型IKKα^F/F·Camk2α.Cre-LoxP小鼠；通過小動物活體成像儀分別觀察雜合型及純合型Cre-LoxP小鼠的紅色熒光，選擇可以檢測到iRFP720紅色熒光蛋白表達(dá)的小鼠，即為在海馬體區(qū)域特異性敲除IKKα基因的小鼠模型。

構(gòu)建打靶載體pBR322-MCS-2S-Chuk-KI的試劑盒中包括如下引物：

Chuk-A-F：ACGCGTCGACGAACACTTTTCTAAGGCTG(SEQ ID NO.2)；

Chuk A-R：CGGGGTACCCACTTCCTTTTGAAATTAG(SEQ ID NO.3)；

Chuk-B-F：CGGGGTACCTATTTTAGACCGTCAGTC(SEQ ID NO.4)；

Chuk-B-R：CGCGGATCCTTGGCCAAGCCATGGCG(SEQ ID NO.5)；

RFP720-F：AATATGGCCACACGGTCGCCACCATGGCG(SEQ ID NO.6)；

RFP720-R：AGGGAATCTACACAGTCGCGGCCGCTCACTC(SEQ ID NO.7)；

En2SA-F：GACTGTGGCCATATTATCATCG(SEQ ID NO.8)；

BGH-R：CTGTGTAGATTCCCTGGGACC(SEQ ID NO.9)。

下面對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：

本發(fā)明的詳細(xì)步驟如下：

(一)打靶載體的構(gòu)建

從Ensembl數(shù)據(jù)庫中(http://www.ensembl.org/index.html)獲得Chuk基因組序列，根據(jù)基因組序列設(shè)計打靶載體。小鼠Chuk-001轉(zhuǎn)錄本共有21個外顯子，根據(jù)生物信息學(xué)分析，knockin元件、neo、frt等元件插入第1～2內(nèi)含子。運用ET克隆的方法構(gòu)建Chuk基因1～2內(nèi)含子插入knockin元件的打靶載體。大致過程如下：以BAC質(zhì)粒為模板DNA，PCR擴增A、B、C、D四個小同源臂。A臂和B臂克隆至pBR322-2S的SalI、BamHI的位點，該質(zhì)粒經(jīng)KpnI單酶切后，獲得retrieve質(zhì)粒；通過同源重組方式，經(jīng)氨芐青霉素篩選，獲得克隆了BAC的A區(qū)域到B區(qū)域之間DNA序列的質(zhì)粒，該序列包含5’和3’同源臂；通過PCR和酶切克隆，將knockin序列l(wèi)ox2272-loxp-TRE-(pA-iRFP670-IRES-En2SA-lox2272-loxp)(Rv)構(gòu)建完成，將Chuk的C臂和knockin元件克隆至PL451的KpnI、EcoRI的位點，將Chuk的D臂克隆至PL451的BamHI、NotI的位點，該重組質(zhì)粒經(jīng)KpnI/NotI雙酶切后，分離獲得含C-KI-Neo-D片斷，然后經(jīng)過同源重組knock in到上述獲得的含Retrieve質(zhì)粒中，構(gòu)建載體pBR322-MCS-2S-Chuk-KI，并用限制性內(nèi)切酶及測序鑒定。酶切結(jié)果如圖1所示。

(二)建立IKKα基因konck in小鼠模型

本部分實驗性動物小鼠購自上海南方生物科技發(fā)展有限公司，根據(jù)本研究團(tuán)隊要求公司將iRFP720紅色熒光蛋白連接至打靶載體，該載體只有在與Cre-LoxP建立穩(wěn)定系統(tǒng)后，iRFP720紅色熒光蛋白會發(fā)生反轉(zhuǎn)錄，紅色熒光蛋白才會得以表達(dá)，在動物成像系統(tǒng)中看到紅色熒光，公司提供攜帶有iRFP720基因的IKKα基因knock in雜合型小鼠。打靶載體結(jié)構(gòu)圖和序列如圖2所示。

(三)嵌合體小鼠育種及PCR鑒定cre-LoxP小鼠模型

我們將IKKα基因knock in雜合型轉(zhuǎn)基因小鼠與CamKIIalpha-cre T29-1(CamK2a.Cre)轉(zhuǎn)基因小鼠分別與C57野生型小鼠擴大繁殖，然后將IKKα基因knock in雜合型轉(zhuǎn)基因小鼠與CamKIIalpha-cre T29-1轉(zhuǎn)基因小鼠交配獲得雜合IKKα^F/+·Camk2α.Cre小鼠，再利用雜合型小鼠自交獲得純合型IKKα^F/F·Camk2α.Cre小鼠，通過小動物活體成像儀分別觀察雜合型及純合型Cre-LoxP小鼠的紅色熒光，發(fā)現(xiàn)雜合型與純合型小鼠，當(dāng)Cre重組酶在雜合型或純合型小鼠整合至染色體上時，都可以檢測到紅色熒光iRFP720的表達(dá)。PCR引物鑒定序列如表1所示。

表1

Cre-Loxp系統(tǒng)雜交策略

a.IKKαknock in雜合型轉(zhuǎn)基因小鼠育種策略

b.CamKIIalpha-cre小鼠育種策略

c.IKKα^F/F·Camk2α.Cre系統(tǒng)構(gòu)建策略

(四)動物成像儀檢測小動物活體成像熒光。

iRFP720最大激發(fā)光波長為702nm，發(fā)射光波長為720nm。因此，我們選定iRFP720作為打靶基因載體的標(biāo)簽，構(gòu)建動物模型，以便在后續(xù)動物成像中得以做到實時監(jiān)測小動物生理學(xué)變化，iRFP720可穿透皮膚和骨骼組織，在活體成像儀的近紅外區(qū)檢測到紅色熒光。

CamKIIalpha-cre T29-1轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶有鼠鈣/鈣調(diào)蛋白激酶IIalpha(Camk2α)啟動子序列，可在小鼠前腦，特別是在海馬體CA1椎體細(xì)胞層表達(dá)Cre重組酶活性。當(dāng)與攜帶有LoxP位點序列的小鼠雜交后，Cre介導(dǎo)的重組發(fā)生在子代海馬體椎體細(xì)胞層。CaMKIIalpha-cre T29-1純合轉(zhuǎn)基因小鼠，體型肥碩，大小正常，無明顯身體異?；蛐袨楫惓！Ｔ撧D(zhuǎn)基因小鼠載體含有8.5kbp序列，包括編碼鼠鈣/鈣調(diào)蛋白激酶IIalpha(Camk2α)啟動子序列，Cre重組酶序列，SV40多聚腺苷酸化位點序列，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠時將載體顯微注射至BCF1的卵細(xì)胞中，與C57BL/6小鼠雜交，并回交至10代以上獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。

本發(fā)明通過動物活體成像監(jiān)測小鼠海馬體區(qū)域特異性敲除IKKα基因后，對小動物活體成像的近紅外光進(jìn)行實時監(jiān)測并研究其對腦部腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響，所涉及解決的技術(shù)問題主要有打靶載體的構(gòu)建，嵌合體小鼠育種及PCR鑒定小鼠基因型，Cre-LoxP系統(tǒng)的建立和動物活體成像觀察純合Cre-LoxP小鼠iRFP720紅色熒光信號。提供了一種可以從近紅外動物成像儀中監(jiān)測小鼠海馬體區(qū)域特異性敲除IKKα基因的可視化小鼠模型。

本發(fā)明利用Cre-LoxP重組系統(tǒng)構(gòu)建在特定小鼠組織中敲除IKKα基因，從而建立IKKα基因敲除的的轉(zhuǎn)基因小鼠，以便在動物的整體水平研究NF-κB信號通路與疾病尤其是腫瘤的作用機制。同時，為便于確定和監(jiān)測IKKα基因在海馬體區(qū)域的特異性敲除是否會對小鼠行為學(xué)造成影響，在本發(fā)明中利用紅色熒光素酶RFP720連接至轉(zhuǎn)基因載體中。即，本發(fā)明通過基因打靶技術(shù)，基于iRFP720近紅外熒光蛋白和Cre-LoxP基因敲除系統(tǒng)降低小鼠海馬體區(qū)域內(nèi)源性IKKα基因的表達(dá)，進(jìn)而通過動物成像系統(tǒng)監(jiān)測轉(zhuǎn)基因小鼠的活體成像。

附圖說明

圖1：打靶載體用EcoRV酶酶切后的電泳圖；M：1kb DNA ladder；1：1號質(zhì)粒；2：2號質(zhì)粒；

圖2：靶載體圖譜；

圖3：IKKαknock in轉(zhuǎn)基因小鼠PCR鑒定基因型結(jié)果圖

圖4：CamK2α小鼠PCR鑒定基因型結(jié)果圖

圖5：IKKα^F/F·Camk2α.Cre小鼠PCR鑒定基因型結(jié)果圖

具體實施方式

(一)轉(zhuǎn)基因小鼠IKKα和CamK2α的PCR鑒定

小鼠出生三周后，置于1.5ml EP管中，加500μl裂解液和20μl蛋白酶K，放入1.5ml EP管中，60℃條件下，在恒溫金屬浴中過夜孵育，次日500g離心吸取上清液，測量得到的粗提gDNA濃度，并將gDNA濃度稀釋至30ng/μl，以便后續(xù)PCR反應(yīng)驗證。按照上述引物進(jìn)行PCR驗證，PCR產(chǎn)物為643bp表明IKKαknock in已經(jīng)整合至小鼠的染色體基因組中，純合型只有單純643bp條帶，雜合型則有299bp和643bp兩條帶型，野生型小鼠則只有299bp，為陰性小鼠。PCR產(chǎn)物若檢測到<100bp條帶，表明CamK2α已經(jīng)整合至小鼠染色體基因組中，該小鼠為CamK2α轉(zhuǎn)基因小鼠，通過普通PCR鑒定不能區(qū)分CamK2α小鼠的純合型與雜合型，但只要可檢測出<100bp的條帶，則可視為CamK2α轉(zhuǎn)基因小鼠。隨后再將新生的子代與野生型小鼠交配2代，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因小鼠。結(jié)果見圖3和圖4。

(二)Cre-LoxP系統(tǒng)的構(gòu)建

在獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因型小鼠IKKα和CamK2α后，將轉(zhuǎn)基因小鼠IKKα和CamK2α合籠，以便獲得子代為雜合型IKKα^F/+·Camk2α.Cre小鼠，抽提鼠尾gDNA通過普通PCR方法鑒定基因型。按照上述引物進(jìn)行PCR驗證，PCR產(chǎn)物為643bp和<100bp，并能檢測出299bp或324bp的小鼠即為陽性雜合型IKKα^F/+·Camk2α.Cre小鼠。出生的陽性小鼠通過與陽性之間進(jìn)行自交，即雜合型與雜合型小鼠配種，獲得純合型IKKα^F/F·Camk2α.Cre小鼠，PCR鑒定若小鼠可檢測出643bp,759bp和<100bp條帶則為純合型IKKα^F/F·Camk2α.Cre，759bp條帶表明Cre重組酶與IKKαknock in已整合至小鼠的同意染色體基因組中。結(jié)果見圖5。

(三)小動物活體成像

利用小動物活體成像儀，將參數(shù)設(shè)置成激發(fā)光波長為680nm或715nm，只要攜帶有759bp帶型即可看到紅色熒光，759bp表示Cre與knock in元件在同一染色體上，可以反轉(zhuǎn)iRFP720的表達(dá)，小動物成像儀可見紅色熒光。