用于精準(zhǔn)鑒定兩代大豆產(chǎn)品轉(zhuǎn)epsps基因的引物組和探針及其鑒定方法與流程

本發(fā)明涉及生物技術(shù)分析方法領(lǐng)域，具體涉及實時鑒定兩代大豆產(chǎn)品轉(zhuǎn)epsps基因的引物組和探針以及檢測大豆產(chǎn)品是否含轉(zhuǎn)epsps基因的方法。

背景技術(shù)：

第一代轉(zhuǎn)epsps基因大豆(GTS40-3-2)于90年代研發(fā)成功并商業(yè)化種植，我國從2004年至今批準(zhǔn)該大豆進(jìn)口用作原材料加工；第二代轉(zhuǎn)epsps基因大豆(MON89788)于2008年至今被我國批準(zhǔn)進(jìn)口用作原材料加工。第一、二代轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品中epsps基因序列不完全相同，只有81％的同源性。采用以前的方法或標(biāo)準(zhǔn)只能鑒定第一代轉(zhuǎn)epsps基因大豆而不能鑒定第二代轉(zhuǎn)epsps基因大豆。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供一種實時鑒定兩代大豆產(chǎn)品轉(zhuǎn)epsps基因的引物組和探針以及檢測大豆產(chǎn)品是否含轉(zhuǎn)epsps基因的方法，主要解決現(xiàn)有技術(shù)不能實時鑒定大豆產(chǎn)品中第二代轉(zhuǎn)epsps基因的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

實時鑒定大豆產(chǎn)品轉(zhuǎn)epsps基因的引物組和探針，所述探針的序列為：5’-FAM-TCATCGAGCCGATCATGACGCG-TAMARA-3’；

所述引物組包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的序列分別如下：

上游引物：5'-ACACGCCCGGCATCAC-3'；

下游引物：5'-CTGCAGCATCTTTTCCGTATGA-3'。

在上述基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供了利用鑒定大豆產(chǎn)品轉(zhuǎn)epsps基因的引物組和探針檢測大豆產(chǎn)品中是否含轉(zhuǎn)epsps基因的方法，包括以下步驟：

(1)準(zhǔn)備鑒定試劑：25.0μL PCR反應(yīng)體系、含量為25ng/μL的被測大豆DNA稀釋液2μl，所述25.0μL PCR反應(yīng)體系包括：2×Taqman Master mix 12.5 μL、含量均為10.0μmol/L的上流引物和下流引物各1.0μl、含量為10.0μmol/L的探針0.5μL、10μL無菌蒸餾水；

(2)將2μl含量為25ng/μL的被測大豆DNA稀釋液加入到25.0μL PCR反應(yīng)體系的熒光定量PCR儀器上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

進(jìn)一步地，所述擴(kuò)增反應(yīng)包括以下步驟：

(a)在95℃條件下進(jìn)行DNA預(yù)變性反應(yīng)，時長為10min；

(b)在95℃條件下進(jìn)行DNA變性反應(yīng)，時長為15s；

(c)在60℃條件下退火60s；

(d)循環(huán)步驟(b)～(c)45次。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明流程簡單，檢測方式科學(xué)合理，操作簡便。

(2)本發(fā)明所設(shè)計的引物組和探針在本發(fā)明設(shè)定的檢測方法下能夠準(zhǔn)確實時地鑒定大豆制品中是否含有第一代或第二代轉(zhuǎn)epsps基因，填補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)只能低準(zhǔn)確度地鑒定大豆產(chǎn)品中是否含有第一代轉(zhuǎn)epsps基因，而不能實時鑒定大豆產(chǎn)品中是否含有第二代轉(zhuǎn)epsps基因的空白，為消費者對轉(zhuǎn)epsps基因大豆產(chǎn)品所享有的知情權(quán)和選擇權(quán)提供了有力保障。

(3)本發(fā)明在熒光定量PCR儀器上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時，其結(jié)果顯示，只有第一代或第二代轉(zhuǎn)epsps基因大豆樣品能檢測到熒光信號，而空白對照和其他樣品中均不能收集到熒光信號，顯示本發(fā)明設(shè)計的引物組和探針序列的特異性非常高。

(4)本發(fā)明在進(jìn)行靈敏度測定時，其結(jié)果顯示，在100％的置信水平下，5個拷貝的epsps基因片段均能被檢出，充分顯示本發(fā)明在100％置信水平下具有極高的靈敏度。

附圖說明

圖1為本發(fā)明檢測大豆產(chǎn)品中是否含轉(zhuǎn)epsps基因方法的框圖。

圖2為采用本發(fā)明設(shè)計的引物組和探針檢測轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因水稻、第 一代和第二代轉(zhuǎn)epsps基因大豆、轉(zhuǎn)基因油菜以及非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、油菜、大豆試驗材料的結(jié)果示意圖。

圖3為采用本發(fā)明檢測體系中5個拷貝的epsps基因DNA片段結(jié)果示意圖。

圖4為采用本發(fā)明在100％置信水平下重復(fù)40次進(jìn)行靈敏度實驗的結(jié)果示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖說明和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，本發(fā)明的方式包括但不僅限于以下實施例。

實施例

如圖1所示，本發(fā)明主要針對大豆產(chǎn)品中第一代和第二代轉(zhuǎn)epsps基因進(jìn)行檢測，具體方法如下：

首先，本發(fā)明設(shè)計了一組引物組和探針，以用于在熒光定量PCR儀器上對大豆產(chǎn)品中DNA進(jìn)行擴(kuò)增。所述的探針序列為：5’-FAM-TCATCGAGCCGATCATGACGCG-TAMARA-3’；

所述引物組包括上游引物和下游引物，二者的序列分別如下：

上游引物：5'-ACACGCCCGGCATCAC-3'；

下游引物：5'-CTGCAGCATCTTTTCCGTATGA-3'。

接著，在需要檢測大豆產(chǎn)品中是否含轉(zhuǎn)epsps基因時，主要分為兩個步驟，具體如下：

(1)準(zhǔn)備鑒定試劑：25.0μL PCR反應(yīng)體系、含量為25ng/μL的被測大豆DNA稀釋液2μl，所述25.0μL PCR反應(yīng)體系包括：2×Taqman Master mix 12.5μL、含量均為10.0μmol/L的上游引物和下游引物各1.0μl、含量為10.0μmol/L的探針0.5μL、10μL無菌蒸餾水；

(2)將2μl含量為25ng/μL的被測大豆DNA稀釋液加入到25.0μL PCR反應(yīng)體系的熒光定量PCR儀器上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，所述的擴(kuò)增反應(yīng)包括以下步驟：

(a)在95℃條件下進(jìn)行DNA預(yù)變性反應(yīng)，時長為10min；

(b)在95℃條件下進(jìn)行DNA變性反應(yīng)，時長為15s；

(c)在60℃條件下退火60s；

(d)循環(huán)步驟(b)～(c)45次。

為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，現(xiàn)用以下實例做進(jìn)一步闡述：

實例1

如圖2所示，采用本發(fā)明所設(shè)計的引物組和探針對已知的轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因水稻、第一代和第二代轉(zhuǎn)epsps基因大豆、轉(zhuǎn)基因油菜樣品以及非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、油菜、大豆樣品進(jìn)行檢測，根據(jù)圖2所示結(jié)果可知，本發(fā)明所設(shè)計的引物組和探針只能檢測出大豆產(chǎn)品中第一代和第二代轉(zhuǎn)epsps基因，特異性極高。

實例2

如圖3和4所示，采用本發(fā)明對體系中含有的5個拷貝epsps基因DNA片段進(jìn)行測試，測試數(shù)據(jù)如表1所示；在100％置信水平下重復(fù)40次采用本發(fā)明對反應(yīng)體系中含有的5個拷貝epsps基因DNA片段進(jìn)行測試，測試數(shù)據(jù)如表2所示。根據(jù)圖3所示結(jié)果可知，對體系中含有5個拷貝的epsps基因DNA片段，運用本發(fā)明均能準(zhǔn)確的鑒定出，根據(jù)圖4所示結(jié)果可知，對40次重復(fù)試驗共40次檢測出epsps基因DNA片段。

表1本發(fā)明方法的靈敏度測試結(jié)果

表2 100％置信水平下本發(fā)明方法的靈敏度(檢測下限5copies)測試數(shù)據(jù)

本發(fā)明還利用所設(shè)計的引物組和探針，并采用本發(fā)明對已知結(jié)果的100個 樣品進(jìn)行實時鑒定。鑒定數(shù)據(jù)及結(jié)果表3所示：

表3采用本發(fā)明實時鑒定已知結(jié)果的100個樣品(表中陽性為樣品中檢測出第一代或第二代epsps基因)

本發(fā)明在熒光定量PCR儀器上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時，運用本發(fā)明設(shè)計的引物組和探針進(jìn)行特異性檢測，只有第一代和第二代轉(zhuǎn)基因大豆樣品的epsps基因能檢測到熒光信號，而空白對照和其他樣品中均不能收集到熒光信號，顯示本發(fā)明的引物組和探針序列特異性非常高。采用本方法能夠精準(zhǔn)檢測到第一代和第二代轉(zhuǎn)基因大豆中epsps基因。本方法靈敏度測定結(jié)果表明，在100％的置信水平下，5個拷貝的epsps基因片段均能被檢出，充分顯示本發(fā)明在100％置信水平下具有極高的靈敏度。因此，本發(fā)明具備突出的實質(zhì)性特點和顯著進(jìn)步。

上述實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式之一，不應(yīng)當(dāng)用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，但凡在本發(fā)明的主體設(shè)計思想和精神上作出的毫無實質(zhì)意義的改動或潤色，其所解決的技術(shù)問題仍然與本發(fā)明一致的，均應(yīng)當(dāng)包含在本發(fā)明的保護(hù) 范圍之內(nèi)。