一種比率式檢測(cè)肼的熒光探針及其合成方法與應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于化學(xué)分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種比率式熒光法檢測(cè)肼的分子探針及其制備方法和在檢測(cè)肼方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肼(N₂H₄)是一種具有高反應(yīng)活性的物質(zhì)，在化學(xué)與制藥合成工業(yè)中有這廣泛的應(yīng)用，同時(shí)不可避免地會(huì)排放到環(huán)境中。美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局認(rèn)定肼為一種潛在致癌物，規(guī)定其安全限量值為10 ppb (0.3μmol·L^-1)。肼排放到環(huán)境中，由于極易溶于水，容易通過(guò)皮膚和呼吸等途徑被人體攝入，導(dǎo)致肝、肺、腎及神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。肼的排放不僅嚴(yán)重污染環(huán)境，而且影響人們的健康。所以開(kāi)發(fā)高靈敏、高選擇檢測(cè)肼的方法對(duì)環(huán)境檢測(cè)與保護(hù)是非常必要的。

傳統(tǒng)的檢測(cè)肼的方法主要有滴定測(cè)量（Malone H.E. Anal. Chem. 1961, 33, 575.）、電化學(xué)方法（Stetter J.R., Blurton K.F., Valentine A.M. J. Electrochem. Soc. 1978, 125, 1804；Channon R.B., Joseph M.B., Bitziou E. Anal. Chem. 2015, 87, 10064.）及色譜法（Gyllenhaal O., Gr?nberg L., Vessman J. J. Chromatogr. A 1990, 511, 303；Sun M., Bai L., Liu D.Q. J. Pharm. Biomed. Anal. 2009, 49, 529.）等。但這些方法一般都耗時(shí)較長(zhǎng)、涉及復(fù)雜繁瑣的樣品處理過(guò)程或需要昂貴的精密儀器等。而利用分子探針熒光法檢測(cè)肼具有樣品處理簡(jiǎn)潔、成本低廉及操作簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)得到了發(fā)展與利用。但目前開(kāi)發(fā)的用于檢測(cè)肼的探針?lè)肿拥捻憫?yīng)原理大都是單波長(zhǎng)熒光強(qiáng)度依耐性的，這類探針測(cè)試結(jié)果容易受樣品基質(zhì)及探針濃度的影響。而比率式的熒光探針(用兩個(gè)波長(zhǎng)處的熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值來(lái)定量)能克服上述問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

對(duì)于上述情況，本發(fā)明目的是提供一種新的易于制備、性能穩(wěn)定的比率式熒光分子探針，并提供該探針的合成方法，還在此基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)出對(duì)肼進(jìn)行高選擇性和高靈敏度的檢測(cè)方法。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明利用肼具有較強(qiáng)的親電性，能對(duì)缺電子分子或基團(tuán)進(jìn)行親電取代反應(yīng)。而溴代脂肪酸在一定的溶液環(huán)境中溴能選擇性的被肼取代。另一方面萘酰亞胺熒光骨架具有良好的熒光特性且通過(guò)在4位引入不同的官能團(tuán)會(huì)使其產(chǎn)生比率式的熒光相應(yīng)?；诖?，設(shè)計(jì)了一種溴代脂肪酸為響應(yīng)基團(tuán)，萘酰亞胺骨架作為發(fā)光團(tuán)的用于檢測(cè)肼的熒光分子探針。

所述檢測(cè)肼的熒光分子探針，其特征在于，結(jié)構(gòu)通式如下：

其中R選自具有1至18個(gè)碳原子的烷基鏈中的任一種；n為2、3或4；X為Cl或Br。優(yōu)選：R選自具有1至6個(gè)碳原子的烷基鏈中的任一種；n為2、3或4；X為Cl或Br。優(yōu)選：R選自具有1至4個(gè)碳原子的直鏈烷基鏈中的任一種；n為2或3；X為Cl或Br。

進(jìn)一步優(yōu)選為：

化合物1

其合成方法具體如下：

將取代的4- 羥基-1,8-萘酰亞胺與鹵代脂肪酸在有機(jī)溶劑中溶解后，加入催化劑在室溫下偶聯(lián)反應(yīng)，分離純化后得到探針?lè)肿踊衔铩?/p>

4- 羥基-1,8-萘酰亞胺骨架中的酰亞胺N取代基選自1至18個(gè)碳原子的烷基鏈中的任一種，優(yōu)選為1-6個(gè)碳原子中的任一種。更優(yōu)選1至4個(gè)碳原子的直鏈烷基鏈中的任一種。

鹵代脂肪酸為：

其中：n為具為2、3或4；X為Cl或Br；n優(yōu)選為2或3，X優(yōu)選為Br。

所述反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮。

所述催化劑選4-二甲氨基吡啶，二環(huán)己基碳二亞胺，N,N-二異丙基碳二亞胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺中的一種或兩種。

上述方法中反應(yīng)溫度為室溫。

上述方法中反應(yīng)時(shí)間為12-24 h。

優(yōu)選其制備方法如下：

將取代的4- 羥基-1,8-萘酰亞胺與鹵代脂肪酸溶于二氯甲烷，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺與N-甲基吡咯烷酮后室溫反應(yīng)12h，減壓蒸餾除去溶劑，柱層析住分離得到純的探針化合物。

化合物1合成方法如下：

將N-丁基-4- 羥基-1,8-萘酰亞胺與4-溴丁酸在有機(jī)溶劑中溶解后，加入催化劑在室溫下偶聯(lián)反應(yīng)，分離純化后得到探針?lè)肿踊衔?。反應(yīng)流程如下：

利用該分子探針對(duì)肼進(jìn)行定性和定量測(cè)定，用于水體、土壤或生物體系中肼的檢測(cè)。

采用比色法檢測(cè)時(shí)，溶液從無(wú)色變?yōu)辄S色，實(shí)現(xiàn)待測(cè)樣品中肼的定性檢測(cè)；

采用熒光檢測(cè)時(shí)，將所述分子探針溶解于水與二甲基亞砜的混合緩沖體系中，加入含不同濃度肼溶液，測(cè)試其在550 nm和420 nm處熒光強(qiáng)度，然后以溶液在550 nm和420 nm處熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值對(duì)肼的濃度作標(biāo)準(zhǔn)圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)圖，定量檢測(cè)待測(cè)肼溶液含量。

采用比色法或熒光法檢測(cè)時(shí)，所述熒光分子探針對(duì)肼的檢測(cè)濃度為1 – 30 μmol·L^-1，檢測(cè)限為0.27 μmol·L^-1。

本發(fā)明所述檢測(cè)肼的分子探針另一種應(yīng)用方式是通過(guò)將薄層色譜板在含本發(fā)明所述分子探針的二氯甲烷溶液中浸泡后干燥，制備得到肼監(jiān)測(cè)硅膠板，利用該硅膠板定性檢測(cè)氣態(tài)肼。

本發(fā)明所述熒光法檢測(cè)肼的分子探針，優(yōu)選采用N-丁基-4- 羥基-1,8-萘酰亞胺與4-溴丁酸通過(guò)酯化偶聯(lián)反應(yīng)合成得到，萘酰亞胺為熒光基團(tuán)；4-溴丁酸酯為肼的響應(yīng)基團(tuán)。

在本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例中更詳細(xì)地說(shuō)明了該探針的合成和檢測(cè)方法。將本發(fā)明熒光分子探針溶解于水與二甲基亞砜(DMSO) 的混合緩沖溶液中，室溫下便可以對(duì)肼進(jìn)行測(cè)試。當(dāng)加入肼后，肼能親核取代溴原子，并進(jìn)一步通過(guò)成環(huán)脫除反應(yīng)，使萘酰亞胺4位的羥基游離出來(lái)形成氧負(fù)離子的結(jié)構(gòu)。反應(yīng)后探針?lè)肿拥孽啺窞榇螃泄曹椀奈娮踊鶊F(tuán)，反應(yīng)后形成的4位的氧負(fù)離子為給電子基團(tuán)。從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT) 效應(yīng)，使探針溶液的吸收光譜與發(fā)射光譜都呈現(xiàn)出顯著地紅移。

本發(fā)明熒光法檢測(cè)肼的探針的具體特征如下：

該熒光探針?lè)肿泳哂辛己玫姆€(wěn)定性和光學(xué)性質(zhì)，反應(yīng)前最大吸收波長(zhǎng)為~350 nm，單獨(dú)溶液呈無(wú)色，發(fā)射波長(zhǎng)在~420處，為藍(lán)色發(fā)射；隨著肼的加入，探針?lè)肿釉谧贤馕辗寮t移至~450 nm，溶液呈黃色，熒光發(fā)射峰紅移至~550 nm，為黃綠色發(fā)射。

本發(fā)明所述的探針?lè)肿釉弦椎茫铣僧a(chǎn)率較高，光學(xué)性能穩(wěn)定（探針溶液能在室內(nèi)穩(wěn)定存放一個(gè)月以上，其光譜性質(zhì)保持不變），靈敏度較高，對(duì)肼識(shí)別能力強(qiáng)，響應(yīng)速度較快，響應(yīng)范圍為1.0 – 30 μmol·L^-1，檢測(cè)限低（0.27 μM），因此該類型探針可用于水體、土壤以及生物體系及氣態(tài)肼的檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明合成的分子探針的核磁共振氫譜；

圖2 為本發(fā)明分子探針與肼反應(yīng)前后的紫外譜圖A與熒光光譜圖B，其中，A圖中，1-反應(yīng)前，2-反應(yīng)后；B圖中，1-反應(yīng)前，2-反應(yīng)后；

圖3為本發(fā)明5 μmol·L^-1分子探針在加入不同濃度肼后熒光發(fā)射光譜圖，從a至s，肼濃度分別為0、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、 60、 70、 80、 90、 100 μmol·L^-1，溶液體系為水與二甲基亞砜的混合緩沖溶液（H₂O/DMSO=9/1, v/v, 10 mM HEPES, pH 7.4），橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。

圖4為肼的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，即5 μmol·L^-1分子探針，反應(yīng)前后在550 nm和420 nm處熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值（I₅₅₀/I₄₂₀）和肼濃度的線性關(guān)系；橫坐標(biāo)為肼的濃度，縱坐標(biāo)為I₅₅₀/I₄₂₀。

圖5為本發(fā)明分子探針對(duì)肼選擇性；即5 μM本發(fā)明分子探針，加入100 μmol·L^-1不同離子(Ag⁺、 Al³⁺、 Ca²⁺、 Cd²⁺、Fe²⁺、 Fe³⁺、 K⁺、 Li⁺、Mg²⁺、 Mn²⁺、 Pb²⁺、Zn²⁺、 AcO^-、 Br^-、CO₃^2-、 Cl^-、F^-、HPO₄^2-、 I^-、N₃^-、 NO₂^-、NO₃^-、 SO₄^2-)后，在550 nm和420 nm處熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值（I₅₅₀/I₄₂₀）的變化；橫坐標(biāo)為測(cè)試的干擾離子，縱坐標(biāo)為I₅₅₀/I₄₂₀。

圖6為本發(fā)明肼硅膠板檢測(cè)氣態(tài)肼的實(shí)驗(yàn)圖；即本發(fā)明制備的薄層硅膠板在不同濃度肼水溶的密閉容器氣氛中處理后的光學(xué)照片（上）和紫外燈下的照片圖（下）。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例 1：熒光分子探針的合成

將N-丁基-4- 羥基-1,8-萘酰亞胺(0.27 g, 1.0 mmol)與4-溴丁酸(181 mg, 1.1 mmol)溶于二氯甲烷(10 mL)，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(170 mg, 1.1 mmol)與N-甲基吡咯烷酮(8.5 mg, 0.1 mmol)后室溫反應(yīng)12h。待反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去溶劑，柱層析住分離（洗脫劑為二氯甲烷/甲醇=4/1的混合溶液）得到產(chǎn)物白色固體320mg (收率：76%)。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式如下:

¹H NMR (400 Hz, CDCl₃): δ 8.56 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.53 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.19 (t, J = 10.3 Hz, 1H), 7.76 – 7.65 (m, 1H), 7.53 – 7.43 (m, 1H), 4.19 – 4.02 (m, 2H), 1.64 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 1.55 (s, 2H), 1.38 (dd, J = 14.8, 7.3 Hz, 2H), 1.27 – 1.21 (m, 2H), 1.15 – 1.06 (m, 2H), 0.91 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS [ESI]: m/z, calcd for [M+H]⁺ 418.0654; found 418.0648.

實(shí)施例2

將N-丁基-4- 羥基-1,8-萘酰亞胺270 mg (1.0 mmol)與4-溴丁酸181 mg (1.1 mmol)在二氯甲烷(10 mL)中溶解后加入4-二甲氨基吡啶與二環(huán)己基碳二亞胺，室溫下反應(yīng)過(guò)夜，待反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去溶劑，柱層析住分離（洗脫劑為二氯甲烷/甲醇=4/1的混合溶液）得到產(chǎn)物白色固體,(收率：79%)。

實(shí)施例 3：探針對(duì)肼的熒光檢測(cè)

將上述制得分子探針溶解于水與二甲基亞砜的混合緩沖溶液（H₂O/DMSO=9/1, v/v, 10 mM HEPES, pH 7.4)），配制成5 μmol·L^-1的探針溶液。在3 mL的比色皿中加入2mL配制的5 μmol·L^-1 的探針溶液，然后分別加入不同濃度的肼后均勻混合，測(cè)試其熒光光譜，結(jié)果如圖3所示。以溶液在550 nm和420 nm處熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值對(duì)肼的濃度作圖，肼濃度在1.0 – 30 μmol·L^-1范圍內(nèi)時(shí)，兩者之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖4)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)圖，實(shí)現(xiàn)該濃度范圍內(nèi)待測(cè)樣品中肼的定量檢測(cè)，而且溶液從無(wú)色變?yōu)辄S色，也適用于裸眼檢測(cè)。并且此探針不受其它一些常見(jiàn)離子的影響，如：Ag⁺、 Al³⁺、 Ca²⁺、 Cd²⁺、Fe²⁺、 Fe³⁺、 K⁺、 Li⁺、Mg²⁺、 Mn²⁺、 Pb²⁺、Zn²⁺、 AcO^-、 Br^-、CO₃^2-、 Cl^-、F^-、 HPO₄^2-、 I^-、N₃^-、 NO₂^-、NO₃^-、 SO₄^2-。在上述干擾離子存在的條件下，探針對(duì)含肼仍具有良好的選擇性和靈敏度(圖5)。

通過(guò)將薄層色譜板在含1 mmol·L^-1 探針的二氯甲烷溶液中浸泡后干燥，制備得到了肼監(jiān)測(cè)硅膠板。將制備的薄層硅膠板在不同濃度肼水溶（體積分?jǐn)?shù)分別為：0，0.1%，1%，5%，10%，15%，20%，30%，40%）的密閉容器氣氛中處理1h，可以明顯地觀測(cè)到硅膠板逐漸由無(wú)色變?yōu)辄S色。在手持紫外燈下發(fā)射的熒光由藍(lán)色逐漸變?yōu)辄S綠色(圖6)。

可以看出，本發(fā)明能實(shí)現(xiàn)對(duì)肼的定性、定量檢測(cè)，靈敏度高，檢測(cè)限達(dá)0.27μmol·L^-1，且抗干擾強(qiáng)。