乳酸桿菌益生菌CGMCCNO.12422及在制備降脂藥物中的應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及一種益生菌及其應(yīng)用，屬于微生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

人體血清膽固醇含量和冠心病、動脈硬化、高脂血癥等心血管疾病密切相關(guān)，高脂血癥主要癥狀表現(xiàn)在血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯等含量過高。如何控制降低人體血清膽固醇水平已成為促進(jìn)健康的重要問題，很多降血脂藥物有很好的降脂效果，但長期服用所致的副作用也越來越多被研究證實，尋求新的副作用小，又能夠調(diào)節(jié)降低血脂的研究成為新的需求。

益生菌(Probiotics)被定義為“一類活的微生物，以合適的數(shù)量被攝入后能給機(jī)體帶來益處”。目前普遍認(rèn)為可作為益生菌制品的細(xì)菌應(yīng)具備以下條件：(1)對宿主有益；(2)無毒性作用和致病作用；(3)能在消化道內(nèi)存活；(4)能適應(yīng)胃酸和膽鹽；(5)能在消化道表面定植；(6)能產(chǎn)生有用的脂類和代謝物；(7)在加工和儲藏過程中能保持活性；(8)具有良好的感官特性。1963年非洲部落由于大量食用乳酸菌發(fā)酵制品而使體內(nèi)血清膽固醇含量較低的發(fā)現(xiàn)引起了科學(xué)界對益生菌降低膽固醇功效的關(guān)注。乳酸桿菌在體外環(huán)境下降低膽固醇的機(jī)理主要包括共沉淀機(jī)制，菌體吸收和代謝機(jī)制，膜鑲嵌機(jī)制。國內(nèi)外已經(jīng)有許多關(guān)于乳酸菌降膽固醇作用的文獻(xiàn)報道，但具體的乳酸菌篩選指標(biāo)、調(diào)節(jié)血脂的體內(nèi)效果和機(jī)理等尚不明確，而且乳酸菌降膽固醇的效果還難以達(dá)到令人滿意的效果。動物和植物飲食會促進(jìn)不同的腸道菌群生長，本發(fā)明旨在從只攝食植物的青海野生旱獺糞便中分離篩選具有良好降膽固醇功能的乳酸菌株，并進(jìn)一步開發(fā)其在制備降脂藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于上述發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供了一種乳酸桿菌益生菌菌株，所述益生菌菌株的保藏編號為CGMCC NO.12422，保藏日期為2016年5月6日，保藏分類命名為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101。

本發(fā)明還提供了一種乳酸桿菌益生菌菌株，所述菌株的16S rRNA的序列如SEQ ID NO：2所示。

本發(fā)明還提供了上述菌株在制備降脂藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述菌株在制備食品和/或保健品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了含有上述菌株的組合物，所述菌株的保藏號為CGMCC NO.12422。

在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述組合物被制備為膠囊、凍干粉或者菌液制劑。

本發(fā)明是從野生旱獺糞便中分離純化得到具有益生菌特性的乳酸桿菌，實驗證明分離得到的乳酸菌對動物無害，且經(jīng)動物實驗確證具有調(diào)節(jié)血脂的功效。CGMCC NO.12422菌株能顯著降低低密度脂蛋白，總膽固醇，甘油三酯，升高高密度脂蛋白，和辛伐他丁有相似的調(diào)節(jié)血脂功效。攝入CGMCC NO.12422菌株的大鼠體征正常，攝入四周結(jié)束實驗后取胃腸肝脾做病理未見異常。無菌組織做細(xì)菌檢測未見乳酸菌異位定植。

附圖說明

圖1.CGMCC NO.12421菌株生化鑒定結(jié)果圖；

圖2.CGMCC NO.12422菌株生化鑒定結(jié)果圖；

圖3.核心基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹圖；

圖4.CGMCC NO.12421菌株和CGMCC NO.12422菌株膽鹽耐受能力示意圖；

圖5.CGMCC NO.12421菌株和CGMCC NO.12422菌株體外降脂效果示意圖

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。

實施例1.乳酸菌的分離、篩選和鑒定

1.乳酸桿菌的分離

1)從保菌管中取出標(biāo)本100μL，加入到預(yù)裝900μL無菌PBS的EP管中，依次對樣本進(jìn)行梯度稀釋，旱獺糞便標(biāo)本濃度稀釋至10^-6倍；

2)取不同稀釋度的樣品100μL涂布于MRS培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱中；

3)在37℃，0.5％CO₂環(huán)境中培養(yǎng)48h；

4)取出培養(yǎng)皿，用無菌接種環(huán)挑取不同形態(tài)特征的菌落，轉(zhuǎn)接至新的MRS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行純化，37℃厭氧培養(yǎng)48h，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，將純化菌株在pH＝3.5的液體MRS中培養(yǎng)，篩選耐酸生長優(yōu)良的菌株可用于實驗或冷凍保藏。

2.菌種保藏

本實驗室用含25％甘油的MRS培養(yǎng)基作為保菌液進(jìn)行菌種的冷凍保藏，方法如下：

1)將容量為2mL的保菌管經(jīng)121℃，15min高壓滅菌處理后以備使用；

2)乳酸桿菌在MRS固體培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接3次后，向培養(yǎng)皿上加入1.5ml的無菌保菌液；

3)用L棒對培養(yǎng)皿進(jìn)行刮涂，使菌落充分融入保菌液中；

4)將菌液轉(zhuǎn)移到保菌管中，混勻后-80℃保藏。

3.菌落外觀和菌體形態(tài)觀察

乳酸桿菌屬兼性厭氧菌，在厭氧條件下生長良好，菌落呈乳白色、表面光滑；在有氧條件下，乳酸桿菌亦可生長，大部分菌種菌落表面較粗糙，菌落顏色多為乳白色。鏡下觀察乳酸桿菌細(xì)胞形態(tài)為多形性，多呈細(xì)長桿狀、較粗桿狀、球桿狀等，排列呈柵欄狀、鏈狀等。

4.細(xì)菌總DNA的提取

將單個菌落接種于BHI培養(yǎng)基上，37℃厭氧過夜培養(yǎng)，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)說明書操作，提取DNA。

5.菌株的生化鑒定方法

本研究采用法國梅里埃公司生產(chǎn)的“BioMerieux”細(xì)菌系統(tǒng)生化鑒定卡API50 CHL。

結(jié)果：根據(jù)生化鑒定，獲得了一株生化特征為植物乳桿菌的菌株，菌株保藏號為CGMCC NO.12422(生化鑒定結(jié)果見圖2)，發(fā)明人還同時獲得了一株生化特征為發(fā)酵乳桿菌的菌株，菌株保藏編號為CGMCC NO.12421(生化鑒定結(jié)果見圖1)，保藏日期為2016年5月6日，保藏分類命名為羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101。

6.細(xì)菌通用引物16S rRNA PCR擴(kuò)增

細(xì)菌16S rRNA鑒定：提取細(xì)菌基因組DNA，擴(kuò)增乳酸桿菌通用引物16S rDNA PCR產(chǎn)物測序，序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，進(jìn)行初步鑒定。

本實驗所用的細(xì)菌16S rRNA PCR擴(kuò)增的引物以及PCR反應(yīng)的條件如下所述，實驗全部用50μL的PCR體系。通過對待測乳酸桿菌通用引物16S rRNA PCR產(chǎn)物測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，鑒定。挑選具有代表性的樣本PCR產(chǎn)物測序。測序結(jié)果根據(jù)BLAST的比對完成對乳酸桿菌的初步鑒定。結(jié)果顯示CGMCC NO.12421菌株為羅氏乳桿菌(SEQ ID NO:1)，CGMCC NO.12422菌株為植物乳桿菌(SEQ ID NO:2)。

通用引物16S rRNA PCR擴(kuò)增條件

引物序列：

27F， 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'

1492R 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'

反應(yīng)體系(50μl)

擴(kuò)增條件

針對CGMCC NO.12421菌株的生化反應(yīng)和16S rRNA序列的鑒定結(jié)果不一致，進(jìn)一步做基因組測序后，對核心(core-pan)基因組做了系統(tǒng)進(jìn)化樹(參見圖3)，通過系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出CGMCC NO.12421菌株和CGMCC NO.12422菌株與其他乳酸桿菌的進(jìn)化關(guān)系，確認(rèn)了16S rRNA序列的鑒定結(jié)果，CGMCC NO.12421菌株為羅氏乳桿菌，而不是生化特征相似的發(fā)酵乳桿菌。

7.菌株的耐酸、耐膽鹽篩選方法

1)待活化三代的實驗菌株生長飽和后，以1×10⁶或1×10⁷CFU/mL的接種量接種于pH＝2.0的MRS培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱；

2)在37℃環(huán)境中培養(yǎng)2h后，進(jìn)行10倍梯度稀釋，以適宜濃度滴種于MRS固體平板培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱；

3)經(jīng)37℃培養(yǎng)48h后，對平皿上的菌落進(jìn)行計數(shù)，計算出細(xì)菌的存活數(shù)；

4)選擇耐酸效果較好的菌株接種到含有0.3％牛膽汁鹽的MRS培養(yǎng)基中；

5)在37℃環(huán)境中培養(yǎng)4h后，進(jìn)行10倍梯度稀釋，以適宜濃度滴種于MRS固體平板培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱；

6)經(jīng)37℃培養(yǎng)48h后，對平皿上的菌落進(jìn)行計數(shù)，計算出細(xì)菌的存活數(shù)。

結(jié)果：本實驗?zāi)M人體腸道環(huán)境來考察菌株在pH＝2.0和0.3％膽鹽的MRS培養(yǎng)基中的存活情況，來評價菌株對胃腸道的耐受能力。結(jié)果顯示兩株菌的耐酸和耐膽鹽能力良好，和鼠李糖LGG菌株的耐酸耐膽鹽功能接近(參見表1)。

表1備選菌株的耐酸、耐膽鹽情況

實施例二、乳酸菌的降脂功能評價

1.降脂功能體外評價

(1)含膽固醇培養(yǎng)基的配置

1)含0.1％膽鹽的MRS培養(yǎng)基：按0.1％秤取膽鹽粉末，加入到400ml配置好的MRS液體培養(yǎng)基中，充分混勻后經(jīng)121℃，15min高壓蒸汽滅菌以備使用。

2)MRS—CHOL(高膽固醇MRS培養(yǎng)基)：精確稱取膽固醇0.5g，用少量無水乙醇溶解并定容至50mL，終濃度10.0mg/mL，用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾除菌后，按照5％的量加入到已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基(或含0.1％膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基)中，使MRS液體培養(yǎng)基中膽固醇終濃度為500μg/mL。

(2)DAOS法檢測膽固醇含量

1)原理

膽固醇被氧化的同時會產(chǎn)生過氧化氫。這些過氧化氫會使試劑內(nèi)的DAOS和4-氨基安替比林氧化，并且被過氧化物酶(HRP)冷凝，并產(chǎn)生一種藍(lán)色顏料。通過與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對，從而使樣品中的總膽固醇含量可以通過吸光度來進(jìn)行定量。

2)膽固醇檢測試劑盒(Cholesterol E-test，Wako公司，日本)操作步驟：

1.1)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品需要稀釋7個濃度，濃度由高到低，逐級對半稀釋。取7個1.5mL的EP管，編號1-7，先往2-7號管中各加50μL的超純水。1號管為用膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品原液100μL(2000μg/mL)，震蕩混勻后，取50μL加到2號管中，依此類推。

1.2)加樣品——取稀釋好標(biāo)準(zhǔn)品和被測液2μL精確加到96孔板板底，設(shè)復(fù)孔。

1.3)加顯色劑——每孔加150μL配置好的顯色劑溶液(將1瓶顯色劑干粉加入到150mL緩沖液中，充分溶解混勻)，37℃條件下避光放置5min。

1.4)終止——5min后，將96孔板取出，用針頭刺破氣泡，防止影響OD值。

1.5)讀數(shù)——放入酶標(biāo)儀讀取600nm處OD值。

(3)結(jié)果：在含膽固醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，三種菌株的膽固醇去除率的比較見圖4。圖4中，1為LGG，2為CGMCC NO.12421菌株，3為CGMCC NO.12422菌株，結(jié)果顯示CGMCC NO.12421菌株和CGMCC NO.12422菌株在無膽鹽條件下，降低膽固醇功能和LGG接近。在含有膽鹽條件下，植物乳桿菌CGMCC NO.12422菌株降膽固醇能力高于另兩個菌株。

2降脂功能體內(nèi)評價

將40只約200克體重的雌性SD大鼠和40只約20克BALB/c雌性大鼠分別隨機(jī)分四組，給予高脂飼料(膽固醇1％，豬油10％，0.2膽酸鹽，10％蛋黃粉)共五周終止實驗檢測血清各項血脂水平，高脂喂食一周后一組經(jīng)口給予10⁹CFU CGMCC NO.12421乳酸桿菌菌液，一組給予CGMCC NO.12422菌株,一組給予生理鹽水，一組在實驗終止前兩周給予20mg/kg體重的辛伐他丁，觀察藥物或乳酸菌對脂代謝紊亂模型發(fā)生的預(yù)防干預(yù)效果。

圖5為實驗菌株對大鼠模型的降脂效果柱狀圖，其中，1為CGMCC NO.12422菌株組，2為CGMCC NO.12421菌株組，3為辛伐他丁組，對照組以PBS為對照。從圖5可以看出，CGMCC NO.12421菌株和CGMCC NO.12422菌株組的低密度脂蛋白(LDL)平均分別是3.534mmol/L和3.341mmol/L，均顯著低于模型對照組3.969mmol/L(p<0.05)。CGMCC NO.12421菌株和CGMCC NO.12422菌株組的高密度度脂蛋白(HDL)平均分別是1.542mmol/L和1.5761mmol/L，均顯著高于模型對照組1.115mmol/L(p<0.05)。CGMCC NO.12421菌株和CGMCC NO.12422菌株組的血清總膽固醇(TG)分別是4.387mmol/L和4.390mmol/L)均顯著低于模型對照組5.774mmol/L(p<0.05)。CGMCC NO.12421菌株和CGMCC NO.12422菌株組的甘油三脂(TC)平均分別是3.47mmol/L和3.288mmol/L，均顯著低于模型對照組3.853mmol/L(p<0.05)。上述菌株具有顯著降低總膽固醇，甘油三酯，升高高密度脂蛋白，和辛伐他丁有相似的降低血脂功效。

攝入兩種乳酸菌的大鼠表現(xiàn)正常，攝入四周結(jié)束實驗后取胃腸肝脾做病理未見異常。無菌組織做細(xì)菌檢測未見乳酸菌異位定植。