一種SMCY性別特異融合抗原及其抗體和應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種抗原，具體來說是一種SMCY性別特異融合抗原及其抗體和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

刑事案件急需我們通過快速識別現(xiàn)場物證特征，為快速偵破刑事案件提供技術(shù)支撐。目前性別鑒定主要使用核酸檢測的方法，但該檢測方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，甚至還會錯(cuò)失破案良機(jī)，因此需要現(xiàn)場快速的性別鑒定方法。

H-Y抗原是由Y染色體編碼的、雄性動物特有的組織相容性抗原，是由Eichwald和Silmser在用純系小鼠進(jìn)行異體皮膚移植試驗(yàn)時(shí)首次發(fā)現(xiàn)的。H-Y抗原屬于一類次要組織相容性復(fù)合物，區(qū)別于主要組織相容性復(fù)合物，H-Y抗原在同基因型雌雄個(gè)體之問的移植會有排斥反應(yīng)。Shapiro M等通過抗血清吸附試驗(yàn)證明，血清學(xué)檢測到的H-Y抗原的抗原決定簇是一種糖類。同時(shí)采用間接免疫熒光法發(fā)現(xiàn)，H-Y特異性熒光出現(xiàn)在細(xì)胞膜上，說明H-Y抗原為一種膜抗原，提示H-Y在哺乳動物中存在于所有含有Y染色體的雄性細(xì)胞表面。不同的發(fā)明者在對患者體內(nèi)的T淋巴毒細(xì)胞進(jìn)行發(fā)明時(shí),發(fā)現(xiàn)了一系列的H-Y抗原的候選基因。1995年Scott等對呈H-Y抗原陰性的小鼠基因進(jìn)行分析時(shí)，在Y染色體長臂發(fā)現(xiàn)一個(gè)保守的基因,具有廣泛的組織表達(dá)性,命名為SMCY。該基因與X染色體上的SMCX具有非常高的同源性，男性的SMCY產(chǎn)物可誘發(fā)女性細(xì)胞對H-Y抗原的排斥。但是，在SMCY有些氨基酸區(qū)段與SMCX中相應(yīng)區(qū)段存在較大差異，針對這些差異性肽段進(jìn)行深入發(fā)明在性別鑒定中具有非常重要的意義。

H-Y抗原(histocompatibility antigen Y)由Y染色體編碼，為雄性動物特有的組織相容性抗原，是結(jié)合在細(xì)胞表面的糖蛋白，在哺乳動物中存在于所有含有Y染色體的雄性細(xì)胞表面。在雄性個(gè)體中無組織和器官特異性。H-Y抗原屬于弱組織相容性抗原，參與器官移植、血液移植和妊娠反應(yīng)中特異性免疫反應(yīng)。有發(fā) 明結(jié)果表明，從移植抗宿主疾病的患者中分離出來的H-Y抗原肽可以與MHC分子結(jié)合，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞技術(shù)利用這一特性來鑒別不同H-Y抗原肽。國內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室利用H-Y抗血清或單抗進(jìn)行了大量的早期胚胎的性別鑒定的工作，并取得了初步的成效。SMCY(selected mouse cDNA on Y)是第一個(gè)確定的H-Y抗原候選基因，只在雄性組織中都表達(dá)，編碼1500個(gè)氨基酸序列。序列比對分析結(jié)果顯示SMCY與X染色體上的SMCX有很高的同源性，但是仍然有超過200個(gè)氨基酸與X染色體上的SMCX不同，有可能產(chǎn)生性別特異性肽段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種SMCY性別特異融合抗原及其抗體和應(yīng)用，所述的這種一種SMCY性別特異融合抗原及其抗體和應(yīng)用要解決現(xiàn)有技術(shù)中使用核酸檢測性別的方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一種重組抗原(SMCY)，其含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

進(jìn)一步的，由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列組成，所述的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列之間無連接片段，所述的EQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列之間具有一個(gè)連接片段，所述的連接片段由兩個(gè)或者三個(gè)絲氨酸組成。

本發(fā)明還提供了編碼上述重組抗原的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了一種包涵體，含有上述的重組抗原。

本發(fā)明還提供了一種載體，含有編碼上述重組抗原的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了一種多克隆抗體，由上述的重組抗原免疫產(chǎn)生。

本發(fā)明還提供了一種膠體金快速檢測性別的試紙條，含有上述的重組抗原和上述的多克隆抗體。

進(jìn)一步的，所述的膠體金快速檢測性別的試紙條包括一個(gè)背板，所述的背板的上側(cè)的一端設(shè)置有一個(gè)樣品墊，背板的上側(cè)的另外一端設(shè)置有一個(gè)吸水墊，在所述的樣品墊和吸水墊之間設(shè)置有一個(gè)纖維素膜，吸水墊和所述的纖維素膜緊密連接，在樣品墊和纖維素膜之間設(shè)置有一個(gè)金標(biāo)墊，所述的樣品墊、金標(biāo)墊和纖維素膜之間緊密連接，在纖維素膜上靠近吸水墊的一端設(shè)置質(zhì)控線，所述的質(zhì)控線上包被有上述的重組抗原，在所述的質(zhì)控線和金標(biāo)墊之間的纖維素膜上設(shè)置檢 測線，所述的檢測線上設(shè)置有上述的多克隆抗體，所述的金標(biāo)墊上設(shè)置有膠體金標(biāo)記的探針，所述的纖維素膜的一端設(shè)置在所述的金標(biāo)墊的下側(cè)，所述的金標(biāo)墊的一端設(shè)置在所述的樣品墊的下側(cè)，所述的金標(biāo)墊中的膠體金標(biāo)記探針是以上述的重組抗原作為抗原免疫兔獲得的多克隆抗體。

進(jìn)一步的，所述的纖維素膜選自硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜，所述的支持膠體金標(biāo)記探針的金標(biāo)墊選自玻璃纖維膜或聚脂膜，所述樣品墊選自濾血膜、玻璃纖維或吸水紙，所述吸水墊為吸水紙。

本發(fā)明還提供了上述的一種重組抗原在鑒定人類性別中的用途。

本發(fā)明將針對人類SMCY抗原的氨基酸序列，篩選與SMCX具有較大差異性的片段，運(yùn)用分子生物學(xué)的方法將其連接在一起，形成一個(gè)新的SMCY基因重組體，與SMCX的同源性顯著降低，從而提高SMCY性別特異融合抗原的雄性特異性。SMCY基因重組體進(jìn)行原核表達(dá)，并以純化的抗原免疫動物制備抗體，在獲得特異性抗體的基礎(chǔ)上建立雙抗體夾心ELISA檢測技術(shù)，并初步建立一種通過檢測人類生物樣本的SMCY抗原并進(jìn)行性別判定的現(xiàn)場快速檢測方法。

本發(fā)明為了建立現(xiàn)場快速性別鑒定方法，針對人類SMCY抗原的氨基酸序列，篩選出與SMCX具有較大差異性的三個(gè)片段，即片段1：256-293aa，片段2：814-845aa，片段3：1467-1560aa。運(yùn)用分子生物學(xué)的方法將其連接在一起，形成一個(gè)新的只編碼這三個(gè)片段的SMCY基因重組體，與SMCX的同源性顯著降低，從而大大提高了SMCY性別特異融合抗原的雄性特異性。然后進(jìn)行原核表達(dá)，獲得在大腸桿菌BL21(DE3)中以包涵體形式表達(dá)的SMCY性別特異融合抗原，通過鎳柱親和層析純化得到的目的蛋白純度為90％以上，并以此純化的抗原免疫純種大白兔成功制備了多克隆抗體，Western印記檢測結(jié)果顯示表達(dá)的融合蛋白可與多抗發(fā)生特異性結(jié)合，ELISA檢測500倍酶稀釋的效價(jià)為10⁶，抗原最低檢測線為1ng；1000倍酶稀釋的效價(jià)為2×10⁶，抗原最低檢測線為2ng。

本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步是顯著的。本發(fā)明建立了基于性別特異SMCY抗原的膠體金快速檢測試紙條，采用膠體金免疫層析技術(shù)的雙抗體夾心檢測方法，在金標(biāo)墊上包被膠體金標(biāo)記的SMCY兔多抗，用于定性檢測血清或血漿樣品中的SMCY蛋白。經(jīng)過對隨機(jī)男女血清樣本的檢測，本膠體金快速檢測試紙條基本可以區(qū)分男性和女性血清樣本；另外，經(jīng)過對雌雄性小鼠血清樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果無反應(yīng)，說明SMCY性別特異融合抗原具有種屬特異性，本試劑 條適用于人類樣本性別的鑒定。

附圖說明

圖1顯示了SMCY和SMCX氨基酸序列差異區(qū)段。

圖2顯示了性別特異融合抗原B細(xì)胞表位分析。

圖3顯示了pET-28a/SMCY表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。

圖4是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定圖，其中M.DL2000DNA標(biāo)志物；1.SMCY融合區(qū)段的編碼基因(516bp)。

圖5是SMCY融合抗原SDS-PAGE電泳鑒定圖，1.全菌；2.超聲破碎上清；3.超聲破碎沉淀；4.Ni柱純化抗原；M.蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)志物。

圖6.顯示了多克隆抗體制備流程。

圖7顯示了純化后的多克隆抗體，M.蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)志物；1.純化后多抗。

圖8是Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果，1.0.1mg/ml SMCY抗原；2.0.05mg/ml SMCY抗原；3.0.02mg/ml SMCY抗原。

圖9是雙抗體夾心檢測法示意圖。

圖10顯示了檢測結(jié)果。

圖11是30例男性血清樣本檢測結(jié)果。

圖12.是男性血清樣本陽性檢測結(jié)果。

圖13是20例女性血清樣本檢測結(jié)果。

圖14是小鼠血清樣本檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 SMCY序列比對與分析

如圖1所示，從NCBI上查詢并下載了SMCY和SMCX三個(gè)變體的氨基酸序列，利用序列分析軟件將SCMY(1539aa)與SMCX variant 1(1560aa)、variant2(1379aa)、variant 3(1559aa)分別進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)了三段差異片段：

片段1：256-293aa(DKTVHKKVTCPPTVTVKDEQSGGGNVSSTLLKQHLSL)；

片段2：814-845aa(RLKNCLSEVEACIAQVLGLVSGQVARMDTPQL)；

片段3：1467-1560aa(QKVDQGRNVENLVQQELQSKRAR SSGIMSQVGREEEHYQEKADRENMFLTPSTDHSPFLKGNQNSLQHKDSGSSAACPSMPLLQLSYSDEQQL)。

利用BIOSUN軟件對差異區(qū)段融合抗原進(jìn)行B細(xì)胞表位分析(圖2)，結(jié)果顯示融合抗原仍維持了原有的B細(xì)胞表位，并且具有較好的抗原性。

實(shí)施例2 SMCY基因差異區(qū)段的合成

根據(jù)三段差異片段的氨基酸序列，反推核酸序列，并進(jìn)行密碼子優(yōu)化，根據(jù)核酸序列設(shè)計(jì)引物，然后運(yùn)用分子生物學(xué)的搭橋法，通過多輪PCR，將合成的引物一步步連接起來，形成一個(gè)新的只編碼這三個(gè)片段的SMCY基因重組體：

由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列組成，所述的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列之間無連接片段，所述的EQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列之間具有一個(gè)連接片段，所述的連接片段由兩個(gè)或者三個(gè)絲氨酸組成。

與SMCX的同源性顯著降低，從而大大提高了SMCY性別特異融合抗原的雄性特異性。將該基因進(jìn)行測序，選取序列完全正確的基因作為目的基因進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

設(shè)計(jì)的引物序列如下(如SEQ ID NO.4～23)所示)

1F3：GCGGATCCGATAAAACCGTGCATAAGAAAGTTACGTGCCCGCCAACTGT

1F2：CGTGCCCGCCAACTGTGACCGTCAAAGACGAACAGAGCGGCGGTGGCAACG

1F1：AGCGGCGGTGGCAACGTTTCTTCCACTCTGTTGAAGCAACACCTGTCGTTA

1R1：CACGCTTCTACCTCGCTAAGACAATTTTTCAGACGTAACGACAGGTGTTGC

1R2：CCTGGCCACTAACGAGACCCAGCACCTGGGCAATGCACGCTTCTACCTCGC

1R3：GCTCTAGACAGTTGCGGCGTATCCATGCGCGCGACCTGGCCACTAACGAG

2F4：GCACTAGTCAGAAAGTGGATCAAGGCCGTAACGTTGAAAATCTGGTGCA

2F3：TTGAAAATCTGGTGCAGCAGGAGTTGCAAAGCAAGCGCGCGCGTTCTTCCGG

2F2：GCGCGCGTTCTTCCGGTATTATGTCGCAGGTCGGCCGCGAAGAAGAGCATTA

2F1：GCGAAGAAGAGCATTATCAGGAAAAAGCCGACCGTGAAAACATGTTTCTGAC

2R1：TTACCTTTTAAGAATGGACTGTGATCCGTGCTCGGGGTCAGAAACATGTTTT

2R2：CTGCTGCCCGAATCCTTATGCTGCAGAGAGTTTTGATTACCTTTTAAGAATG

2R3：AGCTGGAGCAGTGGCATAAGAGACGGGCATGCCGCGCTGCTGCCCGAATCCT

2R4：GCGAATTCCAGCTGTTGCTCGTCCGAGTAGGACAGCTGGAGCAGTGGCA

F1：AGCGCGCAGGATCTGCGTGGATCCGATAAAACCGT

F2：AGCGCGCAGGATCTGCGT

R1：GCTCTAGACAGCTGTTGCTCGTCCGAGTA

F3：GCACTAGTGATAAAACCGTGCATAAGAAAGT

R2：AAGGCAACAATCACAGAGGAATTCCAGCTGTTGCTCGT

R3：AAGGCAACAATCACAGAG

實(shí)施例3 SMCY融合抗原載體的構(gòu)建與表達(dá)

選取序列完全正確的融合區(qū)段抗原基因經(jīng)一次重復(fù)后用BamH1、EcoR1雙酶切，回收切下的目的片段(約516bp)，再與經(jīng)BamH1、EcoR1雙酶切的pET-28a載體用T4連接酶連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a/SMCY(圖3，圖4)。然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中，挑取陽性克隆菌落，接種含卡那霉素的LB培養(yǎng)液，待生長至對數(shù)期后，加入IPTG，37℃誘導(dǎo)過夜，收集菌液，SDS-PAGE電泳鑒定蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示SMCY性別特異融合抗原以包涵體方式表達(dá)，相對分子量約為43KD(圖5)。

實(shí)施例4 SMCY融合抗原的提取與純化

表達(dá)菌經(jīng)大樣發(fā)酵后，收集菌液，超聲波破碎法從表達(dá)菌中提取包涵體，并用溶解液(25mmol/LTE、1％β-巰基乙醇、8mol/L脲，pH8.5)將其溶解，收集樣品進(jìn)行Ni柱純化，用洗滌緩沖液(25mmol/L TE、1％β-巰基乙醇、6mol/L脲，pH8.5)洗滌柱體，SMCY樣品上樣過柱。上樣結(jié)束后用含25mmol/L咪唑的洗滌緩沖液洗脫雜蛋白，最后用含250mmol/L咪唑洗滌緩沖液洗脫并收集目的蛋白，最后SDS-PAGE電泳分析所收集的各洗脫峰及上樣前的樣品(圖5)。

實(shí)施例5 多克隆抗體制備和純化

用純化后的SMCY融合抗原免疫新西蘭大白兔，首次免疫前取血作為陰性對照，皮下多點(diǎn)注射法進(jìn)行免疫，經(jīng)過初免、二免和加強(qiáng)免疫，每次免疫間隔一個(gè)月，制備抗SMCY抗原多克隆抗體(圖6)。第三次免疫后心臟取血，離心收 集血清，利用 Antibody purification-G kit試劑盒對其進(jìn)行純化，過柱后得到純化后SMCY多克隆抗體(圖7)，經(jīng)檢測濃度為3.1mg/ml，成功制備了多克隆抗體，并可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例6 多克隆抗體特異性和反應(yīng)性鑒定

將純化的SMCY抗原(1.0mg/ml)按照10×、20×、50×進(jìn)行稀釋，使終濃度分別為0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.02mg/ml，加入3×樣品稀釋液，煮沸5min，上樣量為10ul，濃度為15％，電壓為160V，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳完畢后取出凝膠，安裝轉(zhuǎn)膜裝置，以濾紙，NC膜，凝膠，濾紙的順序逐張疊放對齊，避免產(chǎn)生氣泡。轉(zhuǎn)膜條件為4℃，300mA電轉(zhuǎn)移2h。取出NC膜，裁剪至合適大小，用含5％脫脂奶粉的TBST室溫下封閉1h；加入H-Y多克隆抗體(1:6000稀釋)，4℃振蕩孵育過夜；TBST洗膜3次，每次8min。加入對應(yīng)的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:2000稀釋)，室溫下振蕩孵育1h。TBST洗膜3次，TBS洗膜1次，每次8min，化學(xué)發(fā)光A、B液(ECL)以1:1比例混合后，將膜浸入顯色液，1min后于發(fā)光顯色儀中顯色并拍照。結(jié)果顯示所制備的多克隆抗體可以特異性識別免疫用的抗原(圖8)。

實(shí)施例7 多克隆抗體反應(yīng)效價(jià)的測定

多抗標(biāo)記HRP：取純化的SMCY抗體2mg于透析袋，pH9.6碳酸鹽緩沖液透析過夜。取2mg HRP溶于0.2mL雙蒸水中，加入新配置的0.06M NaIO₄水溶液0.2mL，混勻后避光攪拌20min。加入0.16M的乙二醇水溶液0.2mL，室溫避光放置30min，加入2mg透析好的SMCY抗體水溶液，混勻后透析6h。取出加入5mg/mL的NaBH₄溶液0.2mL，4℃放置2h，按1:1加入甘油后保存。

雙抗體夾心ELISA方法的建立(圖9)：用包被液將SMCY抗體稀釋成5μg/mL的濃度包被酶聯(lián)板，4℃包被過夜。將SMCY板洗板兩次后拍干，加110μL封閉液封閉5h，拍干后室溫風(fēng)干。加樣品稀釋液稀釋1mg/ml的SMCY抗原，稀釋倍數(shù)為：100，500，1000，2000，4000，8000，16000，32000，64000，1.282×10⁵，2.56×10⁵，5.12×10⁵，1×10⁶，2×10⁶，4×10⁶，8×10⁶，1.6×10⁷，3.2×10⁷，6.4×10⁷，1.28×10⁸，2.56×10⁸，5.12×10⁸，1×10⁹，加樣后加37℃反應(yīng)30min。洗板5次后拍干，分別加酶標(biāo)抗體，37℃反應(yīng)20min。洗板5次 后拍干，顯色劑A液B液各50μL，充分混勻，37℃避光反應(yīng)10分鐘。加入終止液50μL，10分鐘內(nèi)測定OD值，檢測雙波長為450nm/630nm。檢測結(jié)果為SMCY抗體效價(jià)分別為：500倍酶稀釋的效價(jià)為10⁶，抗原最低檢測線為1ng；1000倍酶稀釋的效價(jià)為2×10⁶，抗原最低檢測線為2ng。

實(shí)施例8 基于性別特異SMCY抗原的膠體金快速檢測試紙條的研制

雙抗體夾心檢測方法采用膠體金免疫層析技術(shù)，在金標(biāo)墊上包被膠體金標(biāo)記的SMCY兔多抗，用于定性檢測血清或血漿樣品中的SMCY蛋白。檢測男性樣品時(shí)，樣品中的SMCY蛋白與膠體金標(biāo)記的SMCY兔多抗結(jié)合，形成復(fù)合物，由于層析作用復(fù)合物及樣品在硝酸纖維素膜內(nèi)部向前流動。當(dāng)復(fù)合物經(jīng)過T線時(shí)與包被的SMCY兔多抗結(jié)合，形成“Au—兔多抗—SMCY蛋白—兔多抗”而凝集顯色，剩余的膠體金標(biāo)記SMCY兔多抗與C線中的SMCY蛋白結(jié)合而凝集顯色。檢測女性樣品時(shí)，樣品中不含SMCY蛋白，因此不能形成復(fù)合物，則只在C線處有顯色。

制備膠體金：取0.8g檸檬酸三鈉溶于5mL雙純水中；取1.2L雙純水加入圓底燒瓶中用電熱套加熱煮沸5min；取2.4mL氯金酸加入上述煮沸的雙純水中，煮沸5min；將溶解好的檸檬酸三鈉溶液一次性加入氯金酸溶液中，煮沸10min；自然冷卻至室溫。

金標(biāo)SMCY兔多抗：純化的SMCY兔多抗經(jīng)過PH9.6的CB透析48h；取制備好的膠體金溶液1mL，分別向其中加入15、20、25、30μL 0.1mol/L K₂CO₃溶液調(diào)節(jié)PH；向上述溶液中分別加入15μL 1.0mg/mL的SMCY兔多抗溶液，充分混勻靜置30min；繼續(xù)向上述溶液中加入100μL 10％BSA溶液，充分混勻后靜置20min；不同PH的金溶液分別加入100μL 10％氯化鈉溶液，觀察是否變藍(lán)而沉淀，結(jié)果選擇最優(yōu)組25μL 0.1mol/L K₂CO₃溶液調(diào)節(jié)PH；取制備好的膠體金溶液10mL，分別向其中加入250μL0.1mol/LK₂CO₃溶液調(diào)節(jié)PH；向上述溶液中分別加入150μL 1mg/mL的純化SMCY兔多抗溶液，充分混勻靜置30min；繼續(xù)向上述溶液中加入200μL 10％BSA溶液，充分混勻后靜置20min；將上述溶液4℃離心，14,000r/min離心30min；棄去上清液后加入6.0mL重懸液，超聲2min混勻；Fusion5膠體金墊上涂金后，50℃過夜烘干。

包被SMCY兔多抗：SMCY兔多抗經(jīng)過PH9.6的CB透析48h，包被條件為 PH9.6的50mM CB稀釋兔多抗包被濃度為1mg/mL；NC膜上滑膜儀的速度為1μL/cm，劃線略下，為T線。

包被質(zhì)控線：包被SMCY蛋白，蛋白經(jīng)過PH9.6的CB透析48h，包被條件為PH9.6的50mM CB稀釋蛋白包被濃度為1mg/mL；NC膜上滑膜儀的速度為1μL/cm，劃線略上，為C線。

檢測步驟：

檢驗(yàn)前準(zhǔn)備：100μL微量移液器及配套槍頭若干。

檢驗(yàn)過程：將檢測卡置于干燥的水平工作臺上，用微量移液器向檢測卡的加樣孔內(nèi)加入50μL待測血清或血漿樣品，然后加入50μL樣品稀釋液(約兩滴)，加入樣品后計(jì)時(shí)，15至20分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。

檢測過程注意事項(xiàng)：①本試劑盒與待測樣品均放置于室溫環(huán)境下至平衡后才可使用于檢測；②檢測卡開封后30分鐘內(nèi)使用；③20分鐘后觀察結(jié)果無效。

檢測結(jié)果的解釋(圖10)：C線、T線均顯色：陽性；僅C線顯色：陰性；僅T線顯色：無效；C線、T線均不顯色：無效。

實(shí)施例9 樣本檢測結(jié)果

一、人類血清樣本檢測結(jié)果

隨機(jī)選取人類血清樣本50例，其中男性30例，女性20例，按照上述檢測步驟進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示如表1、圖11、圖12和圖13。男性血清樣本反應(yīng)性明顯強(qiáng)于女性血清樣本；男性30例血清樣本中有27例呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，陽性率為90.0％；女性20例血清樣本中僅3例呈現(xiàn)可疑結(jié)果，其余均為陰性反應(yīng)。

表1.血清樣本檢測結(jié)果

二、小鼠血清樣本檢測結(jié)果

隨機(jī)選取成熟BALB/c小鼠血清樣本4例，其中雄性2例，雌性2例，按照上述檢測步驟進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示如圖14。雄性和雌性小鼠血清樣本均無反應(yīng)，說明本試劑盒適用于鑒定人類樣本的性別，與小鼠無交叉反應(yīng)。