一種特異性結(jié)合新城疫病毒的核酸適配體及其篩選方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種特異性結(jié)合新城疫病毒的核酸適配體及其篩選方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

新城疫(newcastledisease,nd)是由新城疫病毒(newcastlediseasevirus,ndv)引起的一種高度接觸性、致死性的烈性傳染病，禽類感染后以呼吸道、消化道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷為主要特征。ndv屬于副黏病毒科，為單股、不分節(jié)段、有囊膜的負(fù)鏈rna病毒，基因組結(jié)構(gòu)為3′-np-p-m-f-hn-l-5′，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，目前只有一個(gè)血清型。該病呈世界性分布，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)于多數(shù)國家養(yǎng)禽業(yè)，不僅因暴發(fā)新城疫導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且控制本病成本較高。免疫接種是預(yù)防新城疫的有效手段，但需要反復(fù)監(jiān)測(cè)，成本較高。

核酸適配體，也稱適配子或適配體，作為“化學(xué)抗體”，能夠特異性識(shí)別和結(jié)合靶分子。1990年，tuerk利用體外篩選技術(shù)獲得能與t4dna聚合酶特異性結(jié)合的rna，并把該技術(shù)定義為指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)。同年，ellington發(fā)現(xiàn)了能與小分子有機(jī)染料結(jié)合的rna片段，將其命名為核酸適配體(aptamer)。適配體是一段具有特定三維構(gòu)象的單鏈寡核苷酸，長度一般在60～100nt，通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，從人工合成的隨機(jī)核苷酸序列文庫中經(jīng)過多輪篩選分離，獲得能與靶分子高特異性和高親和力結(jié)合的寡核苷酸序列。適配體是以其穩(wěn)定的三維構(gòu)象為基礎(chǔ)，主要包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)、莖、三重體、假結(jié)體和g-四聯(lián)體。通過自身構(gòu)象變化和三維折疊形成能與靶分子特異性結(jié)合的位點(diǎn)。核酸分子在儲(chǔ)存、運(yùn)輸、處理和表達(dá)遺傳信息的生物過程中發(fā)揮重要作用，而適配體因其與靶分子分子具有特異性親和識(shí)別的性質(zhì)，拓寬了人們對(duì)核酸作為傳統(tǒng)遺傳物質(zhì)的概念認(rèn)識(shí)。適配體作為“化學(xué)抗體”，可作為功能阻斷劑影響病毒的復(fù)制和翻譯等過程，進(jìn)而阻止疾病的發(fā)生；此外，適配體也可以替代抗體的特定功能，用于相關(guān)病毒病的檢測(cè)。近年來，適配體被廣泛作為理想的識(shí)別元件用于目標(biāo)分子的檢測(cè)。適配體識(shí)別靶物質(zhì)的模式與傳統(tǒng)的抗體識(shí)別模式類似，與傳統(tǒng)的抗體相比，核酸適配體具有更多的優(yōu)勢(shì)，如表1所示。

表1適配體與抗體的特點(diǎn)比較

目前，各種改進(jìn)的selex篩選方法層出不窮，至今沒有固定標(biāo)準(zhǔn)。將篩選用的文庫和靶分子按一定比率混合，并選擇合適的條件(介質(zhì)、溫度、緩沖體系、時(shí)間等進(jìn)行孵育)，該步驟雖然簡(jiǎn)單，但是不同條件會(huì)影響篩選的效率與配基的親和力。如何獲得具有更高特異性和親和力的適配體，剔除非特異性序列和特異性較差的序列，提高篩選的效率是亟待努力解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有蛋白抗體的技術(shù)不足，提供一種具有與靶分子高親和力、高特異性結(jié)合、易獲得、其過程不依賴動(dòng)物、細(xì)胞和內(nèi)環(huán)境、制備周期短，成本低、比抗體更穩(wěn)定，重復(fù)性好的特異性結(jié)合新城疫病毒的核酸適配體。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供上述核酸適配體的篩選方法。

本發(fā)明再一個(gè)目的是提供上述核酸適配體在檢測(cè)新城疫病毒中的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種特異性結(jié)合新城疫病毒的核酸適配體，所述核酸適配體的序列如seqidno.1所示。

所述核酸適配體的核苷酸序列上的兩端位置被氨基化、羧基化、巰基化或同位素化。

所述核酸適配體的核苷酸序列上結(jié)合熒光標(biāo)記物、生物素修飾、納米發(fā)光材料或酶標(biāo)記。

上述特異性結(jié)合新城疫病毒的核酸適配體的篩選方法，包括如下步驟：

s1.合成隨機(jī)核酸dna文庫和用于pcr擴(kuò)增的上游引物和上游引物：

隨機(jī)核酸文庫序列如seqidno.1所示；

上游引物f序列如seqidno.2所示；

下游引物r序列如seqidno.3所示；

生物素修飾上游引物biotin-f如seqidno.4所示；

s2.篩選核酸適配體：將步驟s1中隨機(jī)核酸文庫與靶分子進(jìn)行孵育，用硝酸纖維素濾膜進(jìn)行分離，得到與靶分子結(jié)合的寡核苷酸，即為篩選所得的特異性結(jié)合新城疫病毒的核酸適配體文庫；

s3.擴(kuò)增核酸適配體文庫：利用s1中合成的引物，將s2所得的寡核苷酸進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到雙鏈dna；

s4.制備單鏈dna文庫：以s3所得的雙鏈dna為模板，利用上游和下游引物，以s3中得到的雙鏈dna為模板，用不對(duì)稱pcr方法擴(kuò)增制備單鏈dna，通過乙醇沉淀方式回收擴(kuò)增的單鏈dna文庫；

s5.重復(fù)篩選：將步驟s4中的單鏈dna文庫替代步驟s2中的隨機(jī)文庫，并重復(fù)上述步驟s2-s4的過程至少5次；

s6.反篩：將步驟s5篩選得到的單鏈dna文庫與非靶分子15℃～37℃孵育30min，用微孔板進(jìn)行分離，得到與靶分子沒有結(jié)合的寡核苷酸；

s7.將s6得到的寡核苷酸作為模板，重復(fù)s3-s4步驟，制備下一輪篩選用的次級(jí)文庫制備；

s8.循環(huán)篩選：以步驟s7中的次級(jí)文庫替代s2中的隨機(jī)核酸文庫，重復(fù)上述步驟s2-s7至10次，得到特異性結(jié)合新城疫病毒gm株的單鏈dna文庫；以biotin-f和r為引物，每輪篩選得到的次級(jí)文庫為模板，擴(kuò)增得到生物素修飾單鏈dna，用elisa法測(cè)定單鏈dna文庫與靶分子的親和性，直至滿足親和力要求后，將所得產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序分析，最終得到核酸適配體。

優(yōu)選地，步驟s2中所述靶分子為新城疫h(yuǎn)n蛋白或新城疫病毒gm，步驟s6中所述非靶分子為禽流感病毒、spf雞胚尿囊液或牛血清白蛋白。

優(yōu)選地，步驟s2中所述孵育的時(shí)間為15～60min；步驟s6中所述孵育的時(shí)間為30min。

優(yōu)選地，步驟s3中所述制備雙鏈dna時(shí)，pcr的工藝條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸7min，擴(kuò)增9～15個(gè)循環(huán)。

優(yōu)選地，步驟s4中所述不對(duì)稱pcr制備單鏈dna時(shí)，上下游引物含量比為50～100:1。

優(yōu)選地，步驟s4中所述制備單鏈dna時(shí)，pcr的工藝條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸7min，擴(kuò)增30～40個(gè)循環(huán)。

另外，上述的核酸適配體在檢測(cè)新城疫病毒中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。適配體b53具有抑制病毒復(fù)制、血凝活性和形成蝕斑的能力，能夠特異性識(shí)別hn蛋白和新城疫病毒gm株，而對(duì)禽流感病毒、傳染性法氏囊病毒和spf雞胚尿囊液無反應(yīng)性，可用于檢測(cè)新城疫病毒。

本發(fā)明首先在體外合成總長度為81nt的ssdna文庫，兩端為用于pcr擴(kuò)增的固定序列，中間為40nt的隨機(jī)序列。利用page和變性page分析pcr條件優(yōu)化結(jié)果，進(jìn)而確定了pcr的退火溫度、循環(huán)數(shù)以及不對(duì)稱引物含量。以原核表達(dá)的新城疫h(yuǎn)n蛋白和新城疫病毒gm株為靶分子，利用硝酸纖維素膜過濾法篩選和微孔板法反篩，經(jīng)過10輪的反復(fù)篩選，獲得特異性結(jié)合hn蛋白和新城疫病毒gm株的適配體。使用dnaman軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)分析，并利用mfold預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用elisa和dotblot試驗(yàn)分析適配體的親和力和特異性，并通過血凝抑制試驗(yàn)和蝕斑抑制試驗(yàn)分析適配體生物學(xué)活性。結(jié)果表明，特異性結(jié)合新城疫病毒的核酸適配體具有與靶分子高親和力、高特異性結(jié)合、易獲得、其過程不依賴動(dòng)物、細(xì)胞和內(nèi)環(huán)境、制備周期短，成本低、比抗體更穩(wěn)定，重復(fù)性好的特點(diǎn)，可用于檢測(cè)新城疫病毒。

目前各種改進(jìn)的selex篩選方法將篩選用的文庫和靶分子按一定比率混合，并選擇合適的條件(介質(zhì)、溫度、緩沖體系、時(shí)間等進(jìn)行孵育)，該步驟雖然簡(jiǎn)單，但不同條件會(huì)影響篩選的效率與配基的親和力。本發(fā)明在硝酸纖維素濾膜方法的基礎(chǔ)上做出如下改進(jìn)：采用硝酸纖維素濾膜和微孔板結(jié)合的selex方法，通過交替使用不同孵育介質(zhì)，以獲得具有更高特異性和親和力的適配體。逐漸調(diào)整篩選條件，如減少靶分子和次級(jí)文庫的投入量，縮短孵育時(shí)間等，以獲得與靶分子結(jié)合力更強(qiáng)的寡核苷酸，比抗體更穩(wěn)定，重復(fù)性好，可有效降低實(shí)際生產(chǎn)中批次間的差異。適當(dāng)?shù)姆春Y步驟，有利于非特異性序列和特異性較差序列的剔除，提高了篩選的效率。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1.本發(fā)明采用硝酸纖維素濾膜和微孔板結(jié)合的selex篩選方法，通過交替使用不同孵育介質(zhì)，篩選獲得具有更高特異性和親和力的新城疫病毒的核酸適配體b53。該適配體b53具有抑制病毒復(fù)制的能力、血凝抑制活性和形成蝕斑的能力，能夠減少44.2％的gm株病毒蝕斑；能夠特異性識(shí)別新城疫h(yuǎn)n蛋白和新城疫病毒gm株，而對(duì)禽流感病毒、傳染性法氏囊病毒和spf雞胚尿囊液無反應(yīng)性，可用于檢測(cè)新城疫病毒。

2.本發(fā)明通過體外篩選過程進(jìn)化，其過程不依賴動(dòng)物、細(xì)胞和內(nèi)環(huán)境；制備周期短，成本低且易獲得；通過減少靶分子和次級(jí)文庫的投入量，縮短孵育時(shí)間等逐漸優(yōu)化篩選條件，以獲得與靶分子結(jié)合力更強(qiáng)的寡核苷酸。比抗體更穩(wěn)定，重復(fù)性好，可有效降低實(shí)際生產(chǎn)中批次間的差異；同時(shí)，采用增加反篩過程，也利于剔除非特異性序列和特異性較差的序列，提高了篩選的效率。篩選得到的特異性結(jié)合新城疫病毒的適配體可為新城疫病毒的檢測(cè)及治療提供一個(gè)新思路。

附圖說明

圖1是selex篩選獲得的適配體b53的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中，a圖表示適配體的一級(jí)結(jié)構(gòu)，b圖表示適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖2是每輪篩選得到的ssdna文庫親和力測(cè)定結(jié)果。

圖3是selex篩選獲得的適配體b53的elisa檢測(cè)結(jié)果，其中，a圖表示適配體對(duì)新城疫病毒不同毒株f48e9、gm和lasota的親和力；b圖表示適配體對(duì)不同病毒的親和力。

圖4是selex篩選獲得的適配體b53的dot-blot檢測(cè)結(jié)果。a圖表示適配體對(duì)新城疫病毒不同毒株f48e9、gm和lasota的結(jié)果；b圖表示適配體對(duì)不同病毒的結(jié)果。

圖5是selex篩選獲得的適配體b53的dot-blot分析結(jié)果。

圖6是selex篩選獲得的適配體b53的血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果。

圖7是selex篩選獲得的適配體b53的蝕斑抑制試驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖說明和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

實(shí)施例1.新城疫病毒核酸適配體的體外篩選

s1.構(gòu)建合成長度為81nt的隨機(jī)核酸文庫，序列如seqidno.1所示，5'-ccggaattcctaatacgactc–(n)40–tattgaaaacgcggccgcgg-3'；其中，兩端分別為20和21個(gè)堿基的固定序列，中間40個(gè)堿基為隨機(jī)序列。

合成用于pcr擴(kuò)增的上游引物f和下游引物r的序列為：

上游引物f：5'-ccggaattcctaatacgactc-3'，如seqidno.2所示；

下游引物r：5'-ccgcggccgcgttttcaata-3'，如seqidno.3所示；

生物素修飾上游引物biotin-f：5'-biotin-ccggaattcctaatacgactc-3'，如seqidno.4所示。

s2.ssdna文庫與hn蛋白的孵育與分離，取35.5μgssdna文庫加入到100μl結(jié)合緩沖液中(50mmtris-hcl，25mmnacl，5mmmgcl2，10mmdtt(dithiothreitol)，ph7.5)，95℃水浴10min后，迅速冰浴10min。為減少非特異性ssdna與膜的結(jié)合，篩選前用結(jié)合緩沖液將膜浸濕，將文庫與裝在pop-top過濾器中的硝酸纖維素膜上過濾3次，濾過的ssdna用于下一步篩選。

s3.硝酸纖維素膜篩選：將硝酸纖維素膜裝入pop-top過濾器中，并確保硝酸纖維素膜與注射器內(nèi)壁結(jié)合緊密，用結(jié)合緩沖液把膜潤濕，取上一步驟中濾過的ssdna文庫加入到hn蛋白溶液中，室溫孵育90min(每輪篩選對(duì)應(yīng)ssdna文庫量和hn蛋白量隨著篩選輪數(shù)的增加而減少)。并把核酸和蛋白孵育的溶液用過濾器過濾，然后用結(jié)合緩沖液沖洗，洗掉未與蛋白結(jié)合的寡核苷酸。

s4.反篩：在第5輪篩選時(shí)加入反篩環(huán)節(jié)，即將不相關(guān)靶分子(禽流感病毒、spf雞胚雞胚尿囊液和牛血清白蛋白)包被于酶標(biāo)板中并用bsa溶液封閉，首先將ssdna和靶分子孵育溶液加入到酶標(biāo)板中，室溫孵育30min，然后再將溶液吸出加入到hn蛋白溶液中，室溫孵育。用過濾器過濾，然后用結(jié)合緩沖液沖洗，洗掉未與蛋白結(jié)合的寡核苷酸。

s5.用乙醇共沉劑回收ssdna，通過pcr擴(kuò)增目的條帶，不對(duì)稱pcr制備ssdna。獲得的ssdna作為次級(jí)文庫，用于下一輪篩選。

s6.測(cè)定每輪獲得的ssdna次級(jí)文庫的親和性，其基本原理是將洗脫的特異性ssdna序列用pcr的方法擴(kuò)增成雙鏈，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收后作為模板，通過不對(duì)稱pcr方法，用帶生物素標(biāo)記的bio-f和r作為引物，大量擴(kuò)增，通過乙醇沉淀的方式回收合成的次級(jí)文庫，測(cè)濃度備用。標(biāo)記生物素的ssdna作為一抗，hrp標(biāo)記的鏈酶親和素作為二抗，用elisa的方法測(cè)定文庫與靶分子的親和性。具體步驟如下：

(1)包被抗原：將新城疫病毒hn蛋白包被微孔板，空白對(duì)照孔加入等量的包被液，4℃過夜；

(2)封閉：棄去微孔板中的液體，用pbst漂洗。加入1％的bsa封閉液37℃恒溫箱中封閉2h；

(3)加入biotin-ssdna文庫：棄去微孔板中的液體，用pbst漂洗。將處理好的各輪亞庫投入到微孔板中，每孔投入量為500pmol，37℃恒溫箱中孵育2h；

(4)加入“二抗”：棄去微孔板中的液體，用pbst漂洗。將1:5000稀釋的hrp標(biāo)記的鏈酶親和素作為“二抗”加入微孔板中，100μl/孔，37℃恒溫箱中孵育1h；

(5)顯色讀取數(shù)值：棄去微孔板中的液體，用pbst漂洗。加入100μl/孔tmb顯色后，加入等量終止液，讀取od450值。結(jié)果如圖2所示，觀察到隨著篩選輪數(shù)的增加，陽性比例增多，od450逐漸增大，而到了第9輪之后增大不明顯，且與第10輪沒有明顯的區(qū)別，表明篩選輪數(shù)增加不能再提高序列富集程度，篩選過程完成。

s7.將最后一輪篩選的次級(jí)文庫克隆、鑒定和測(cè)序，獲得核酸適配體序列。

實(shí)施例2.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(elisa)

將篩選獲得的核酸適配體送生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并進(jìn)行生物素修飾，應(yīng)用elisa方法測(cè)定特異性。選取不同樣品，包被量為2μl/孔，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。4℃包被過夜，用1％的bsa37℃封閉后，將不同的生物素標(biāo)記的適配體加入孔內(nèi)進(jìn)行孵育，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素進(jìn)行孵育，加入底物進(jìn)行顯色，終止顯色，用酶標(biāo)儀測(cè)od450值。

圖3為selex篩選獲得的適配體b53的elisa檢測(cè)，a圖表示適配體對(duì)新城疫病毒不同毒株f48e9、gm和lasota的親和力。如圖3所示，結(jié)果表明適配體b53均對(duì)新城疫病毒f48e9、gm和lasota株均具有親和力，其中對(duì)gm親和力最高；b圖表示適配體對(duì)不同病毒的親和力，結(jié)果表明，適配體b53均對(duì)ndvgm株表現(xiàn)出特異性親和，對(duì)aiv、ibdv和spf雞胚無反應(yīng)性。

實(shí)施例3..斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)(dot-blot)

將2μlhn蛋白(1mg/ml)、gm株純化病毒、aiv、ibv、spf雞胚雞胚尿囊液點(diǎn)至nc膜中，同時(shí)設(shè)立不滴加溶液的空白對(duì)照組；待nc膜干燥后，加入3％bsa封閉液37℃搖床封閉2h，用pbst溶液洗膜；將濃度為5pmol/μl生物素標(biāo)記的ssdna，加到nc膜上，37℃搖床孵育2h后，用pbst溶液洗膜；將nc膜加入到1:5000稀釋的streptavidin-hrp溶液中，37℃恒溫?fù)u床孵育1h后，用pbst溶液洗膜3次，每次3min；dab顯示10min后終止顯色，取出膜片，觀察膜片顯色情況。

適配體特異性分析結(jié)果如圖4所示，圖4a表示適配體對(duì)新城疫病毒不同毒株f48e9、gm和lasota的結(jié)果，b53能夠特異性結(jié)合新城疫病毒不同毒株，出現(xiàn)不同灰度的斑點(diǎn)。其中g(shù)m株灰度最強(qiáng)，說明適配體b53對(duì)gm的親和力比f48e9和lasota強(qiáng)；圖4b表示適配體對(duì)不同病毒的結(jié)果，b53能夠特異性結(jié)合hn蛋白和新城疫病毒gm株，出現(xiàn)不同亮暗程度的斑點(diǎn)，且ndv處的斑點(diǎn)比hn處淡，aiv、ibv和spf雞胚胚尿囊液處無斑點(diǎn)出現(xiàn)。說明適配體b53具有較高的特異性。結(jié)果與酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。適配體對(duì)新城疫病毒和hn蛋白親和力分析結(jié)果如圖5所示，左圖表示適配體對(duì)不同濃度hn蛋白識(shí)別結(jié)果，右圖表示適配體對(duì)不同濃度ndv識(shí)別結(jié)果。隨著hn蛋白和gm濃度減低，dab顯色的斑點(diǎn)逐漸變暗，當(dāng)hn蛋白濃度低于0.25mg/ml、gm低于16hau時(shí)，dab顯色后無斑點(diǎn)出現(xiàn)。

實(shí)施例4.血凝抑制試驗(yàn)

用結(jié)合緩沖液將適配體稀釋成50pmol/μl，95℃水浴加熱10min后立即冰浴10min，處理過后的適配體與新城疫病毒gm株室溫下孵育30min。首先取96孔微反應(yīng)板，用微量移液器在1孔～12孔每孔加入25μlpbs；然后吸取25μl適配體與病毒混合液加入到第1孔中，吹打混勻；接著從第1孔中吸取25μl混合液加入到第2孔，混勻后吸取25μl加入到第3孔，依次進(jìn)行倍比稀釋到第11孔，最后從第11孔吸取25μl棄掉，第12孔為pbs空白對(duì)照組；最后每孔加入25μl體積分?jǐn)?shù)為1％的雞紅細(xì)胞懸液，室溫下靜置15min觀察結(jié)果。同時(shí)設(shè)置病毒對(duì)照組，即用等量的結(jié)合緩沖液代替適配體與新城疫病毒室溫孵育。

如圖6所示，篩選到的優(yōu)勢(shì)適配體與gm株病毒進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，設(shè)置病毒對(duì)照組。結(jié)果表明適配體均具有不同程度的針對(duì)gm株病毒的血凝抑制活性，其中病毒對(duì)照組血凝效價(jià)為11log2，a1處理組的血凝效價(jià)為9log2，a3處理組的血凝效價(jià)為7log2，a20處理組的血凝效價(jià)為10log2，b7、b53和b60處理組的血凝效價(jià)為8log2。

實(shí)施例5.蝕斑抑制試驗(yàn)

將次代cef鋪于6孔細(xì)胞板，待細(xì)胞長滿單層后，吸出培養(yǎng)基，每孔依次加入450μl新城疫病毒gm株病毒稀釋液(使用dmem培養(yǎng)基10倍稀釋，稀釋倍數(shù)為10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6)，并設(shè)置未接毒的空白組，加入450μl的dmem。37℃培養(yǎng)1h吸出病毒液，pbs洗滌細(xì)胞1次。接著每孔覆蓋2ml固體培養(yǎng)基(dmem/2％fbs+2％低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，體積比為1:1，37℃培養(yǎng)3d后，每孔加入1ml0.1％中性紅溶液，染色20min后棄染液，37℃避光培養(yǎng)1h，即可用肉眼觀察計(jì)數(shù)空斑，以能清楚識(shí)別單個(gè)蝕斑的病毒稀釋度為最佳稀釋濃度。用結(jié)合緩沖液將適配體稀釋成100pmol/μl，95℃水浴加熱10min后立即冰浴10min，處理過后的適配體與新城疫病毒gm株室溫下孵育30min，并用dmem稀釋到最佳稀釋濃度，37℃培養(yǎng)1h吸出病毒液，pbs洗滌細(xì)胞1次。接著每孔覆蓋2ml固體培養(yǎng)基(dmem/2％fbs+2％低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，體積比為1:1，37℃培養(yǎng)3d后，每孔加入1ml0.1％中性紅溶液，染色20min后棄染液，室溫37℃避光培養(yǎng)1-5h，即可用肉眼觀察計(jì)數(shù)空斑，同時(shí)設(shè)置等體積結(jié)合緩沖液與新城疫病毒gm室溫孵育30min的病毒對(duì)照組。

如圖7所示，數(shù)值1表示空白組，無蝕斑；數(shù)值2表示病毒對(duì)照組，蝕斑數(shù)量為52；數(shù)值3表示適配體b53處理組，蝕斑數(shù)為29。結(jié)果表明，適配體能夠減少44.2％的gm株病毒蝕斑，具有較強(qiáng)的病毒蝕斑抑制能力。

本發(fā)明的上述實(shí)施例僅為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變動(dòng)。這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。