本發(fā)明涉及植物提取技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種牡丹花中提取香草酸乙酯的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肥胖癥(obesity)是指在一定程度上有明顯超重或脂肪層過厚的病癥，通常是由于體內(nèi)脂肪，特別是甘油三酯積累過多而導(dǎo)致的。經(jīng)研究，吃入的食物中所含的脂肪都被水解成單酰甘油和游離脂肪酸，單酰甘油和游離脂肪酸在腸道中被人體吸收，并且在人體中重新合成脂肪，若食入的脂肪過多，則會在體內(nèi)形成大量的合成脂肪，從而造成脂肪的堆積，最終導(dǎo)致肥胖。人體腸道中脂肪消化和吸收時所必需的酶是脂肪酶，脂肪酶主要來自于胰腺，同時也還來自于胃，因此，食物中脂肪的消化吸收明顯與脂肪酶的活性有關(guān)，也就是說，是否肥胖與脂肪酶的活性有關(guān)。
在目前的減肥產(chǎn)品中，脂肪酶抑制劑是常見的減肥藥物，脂肪酶抑制劑能夠有效的抑制脂肪酶的活性，從而減少脂肪的合成，達到治療肥胖的效果，因此，發(fā)現(xiàn)并運用有效的脂肪酶抑制劑是當(dāng)今研究肥胖治療的熱點，而從天然產(chǎn)物中尋找安全、有效的脂肪酶抑制劑，有重要的社會效益和巨大的經(jīng)濟效益。
牡丹(Paeonia suffruticosa Andrews)是原產(chǎn)于我國的一種名貴花卉，具有較高的觀賞價值和藥用價值。在藥用價值方面，牡丹具有和血、生血、涼血及清熱解毒等的功效，能夠用于治療血中伏火、煩熱等。同時，現(xiàn)代藥理學(xué)研究還表明，牡丹中含有紫云英苷、丹皮花苷、締紋天竺苷以及多種人體必需的氨基酸、微量元素和維生素等。牡丹由其所具有的觀賞價值能夠在花期時帶來一定的經(jīng)濟效益，但花期過后大量的牡丹枯萎、衰敗，僅有牡丹的根部作為中藥材而帶來一定的經(jīng)濟效益。當(dāng)然也有將牡丹花做成食品類的副業(yè)，但由于深加工技術(shù)的落后，僅有少量的牡丹花被加工利用，因此，為提高牡丹的利用率，越來越多的人研究牡丹的成分及應(yīng)用，但是，從牡丹中提取香草酸乙酯的方法未見報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種牡丹花中提取香草酸乙酯的方法及應(yīng)用，從而實現(xiàn)從牡丹花中提取香草酸乙酯，本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)成本低，提取效率高，且對環(huán)境無嚴重污染，適用于大范圍的推廣與應(yīng)用。
本發(fā)明提供一種牡丹花中提取香草酸乙酯的方法，所述方法包括：
摘取牡丹花瓣，洗凈、瀝干；
將瀝干后的所述牡丹花瓣加入到濃度為75％的乙醇溶液中搗爛成漿，得到牡丹花漿液，其中，所述牡丹花瓣與所述乙醇的質(zhì)量/體積比為1g：2-4ml；
將所述牡丹花漿液加入到濃度為75％的乙醇溶液中加熱回流，得到回流液，其中，所述牡丹花漿液與所述乙醇的體積比為1:4-6；
將所述回流液過濾得到牡丹花提取液；
將所述牡丹花提取液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)，得到固體物質(zhì)和乙醇，所述乙醇回收待用；
向所述固體物質(zhì)中加入蒸餾水，50-70℃下加熱溶解，得到混合物，其中，所述固體物質(zhì)與所述蒸餾水的體積比為1:2-5；
向所述混合物中加入正己烷進行萃取，收集水相萃取物，其中，所述混合物與所述正己烷的體積比為1:1-1.5；
將所述水相萃取物進行減壓濃縮，得到濃縮物；
將所述濃縮物用蒸餾水進行大孔樹脂柱層析，直至下柱液洗脫至無色；
所述下柱液洗脫至無色后，分別用濃度為40％、70％、90％和純乙醇溶液依次對所述濃縮物再次進行大孔樹脂柱層析，直至下柱液洗脫至無色，收集此步驟中的所有洗脫液a，備用；
所述洗脫液a合并、濃縮；
依次用石油醚和體積比為15:1的石油醚和乙酸乙酯對濃縮后的所述洗脫液a進行硅膠柱層析，直至下柱液洗脫至無色；
所述下柱液洗脫至無色后，用體積比為10:1的石油醚和乙酸乙酯對所述洗脫液a再次進行硅膠柱層析，直至下柱液洗脫至無色，收集此步驟中的洗脫液b，備用；
所述洗脫液b合并后濃縮，濃縮后的產(chǎn)物冷卻、抽濾結(jié)晶，并用石油醚洗滌得到結(jié)晶化合物；
所述結(jié)晶化合物真空低溫干燥得到香草酸乙酯。
優(yōu)選地，所述加熱回流的條件為：加熱溫度為50-70℃，回流次數(shù)為2-3次，每次回流時間為2-4h。
優(yōu)選地，所述大孔樹脂為Amberlite XAD7HP樹脂。
優(yōu)選地，所述洗脫液a合并、濃縮為所述洗脫液a合并后濃縮至無乙醇味；所述洗脫液b合并后濃縮為所述洗脫液b合并后濃縮至無煤油味。
優(yōu)選地，所述牡丹花瓣為太平紅牡丹或丹鳳白牡丹的花瓣。
一種香草酸乙酯的應(yīng)用，所述香草酸乙酯按照牡丹花中提取香草酸乙酯的方法制備，所述香草酸乙酯用于制備減肥藥或包括抑制脂肪酶活性的藥物。
本發(fā)明的實施例提供的技術(shù)方案可以包括以下有益效果：
本發(fā)明提供了一種牡丹花中提取香草酸乙酯的方法，該提取方法包括：摘取牡丹花瓣，洗凈、瀝干；將瀝干后的所述牡丹花瓣加入到濃度為75％的乙醇溶液中搗爛成漿，得到牡丹花漿液，其中，所述牡丹花瓣與所述乙醇的質(zhì)量/體積比為1g：2-4ml；將所述牡丹花漿液加入到濃度為75％的乙醇溶液中加熱回流，得到回流液，其中，所述牡丹花漿液與所述乙醇的體積比為1:4-6；將所述回流液過濾得到牡丹花提取液；將所述牡丹花提取液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)，得到固體物質(zhì)和乙醇，所述乙醇回收待用；向所述固體物質(zhì)中加入蒸餾水，50-70℃下加熱溶解，得到混合物，其中，所述固體物質(zhì)與所述蒸餾水的體積比為1:2-5；向所述混合物中加入正己烷進行萃取，收集水相萃取物，其中，所述混合物與所述正己烷的體積比為1:1-1.5；將所述水相萃取物進行減壓濃縮，得到濃縮物；將所述濃縮物用蒸餾水進行大孔樹脂柱層析，直至下柱液洗脫至無色；所述下柱液洗脫至無色后，分別用濃度為40％、70％、90％和純乙醇溶液依次對所述濃縮物再次進行大孔樹脂柱層析，直至下柱液洗脫至無色，收集此步驟中的所有洗脫液a，備用；所述洗脫液a合并、濃縮；依次用石油醚和體積比為15:1的石油醚和乙酸乙酯對濃縮后的所述洗脫液a進行硅膠柱層析，直至下柱液洗脫至無色；所述下柱液洗脫至無色后，用體積比為10:1的石油醚和乙酸乙酯對所述洗脫液a再次進行硅膠柱層析，直至下柱液洗脫至無色，收集此步驟中的洗脫液b，備用；所述洗脫液b合并后濃縮，濃縮后的產(chǎn)物冷卻、抽濾結(jié)晶，并用石油醚洗滌得到結(jié)晶化合物；所述結(jié)晶化合物真空低溫干燥得到香草酸乙酯。使用本發(fā)明提供的牡丹花中提取香草酸乙酯的方法能夠得到純度較高的香草酸乙酯，且其純度可達95％以上。在香草酸乙酯提取的過程中，所使用的藥品均為常見藥品，生產(chǎn)成本低；同時，乙醇等有機溶劑和層析柱中的大孔樹脂均可重復(fù)使用，不污染環(huán)境，進一步降低生產(chǎn)成本，適用于大范圍的推廣與應(yīng)用。通過本發(fā)明提供的方法所提取的香草酸乙酯具有比奧利司他更強的活性，能夠應(yīng)用于制備減肥藥或包括抑制脂肪酶活性的藥物。
應(yīng)當(dāng)理解的是，以上的一般描述和后文的細節(jié)描述僅是示例性和解釋性的，并不能限制本發(fā)明。
附圖說明
此處的附圖被并入說明書中并構(gòu)成本說明書的一部分，示出了符合本發(fā)明的實施例，并與說明書一起用于解釋本發(fā)明的原理。
為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
圖1為本發(fā)明實施例提供的牡丹花中提取香草酸乙酯的方法流程示意圖。
具體實施方式
這里將詳細地對示例性實施例進行說明，其示例表示在附圖中。下面的描述涉及附圖時，除非另有表示，不同附圖中的相同數(shù)字表示相同或相似的要素。以下示例性實施例中所描述的實施方式并不代表與本發(fā)明相一致的所有實施方式。相反，它們僅是與如所附權(quán)利要求書中所詳述的、本發(fā)明的一些方面相一致的裝置和方法的例子。
請參考附圖1，附圖1示出了本發(fā)明實施例提供的牡丹花中提取香草酸乙酯的方法流程示意圖，以下具體實施例的描述均以附圖1為基礎(chǔ)。
實施例1
S101：摘取盛開后期新鮮的牡丹花瓣，洗凈、瀝干；
S102：將瀝干后的牡丹花瓣加入到濃度為75％的乙醇溶液中室溫下?lián)v爛成漿，得到牡丹花漿液，其中，牡丹花瓣與乙醇的質(zhì)量/體積比為1g：2ml；
S103：將牡丹花漿液加入到濃度為75％的乙醇溶液中加熱回流，加熱溫度為50℃，回流次數(shù)為2次，每次回流時間為2h，得到回流液，其中，牡丹花漿液與乙醇的體積比為1:4；
S104：將回流液過濾得到牡丹花提取液；
S105：將牡丹花提取液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)旋干乙醇，得到固體物質(zhì)和乙醇，乙醇回收待用；
S106：向固體物質(zhì)中加入蒸餾水，50℃下加熱溶解，得到混合物，其中，固體物質(zhì)與蒸餾水的體積比為1:2；
S107：向混合物中加入正己烷進行萃取，收集水相萃取物，其中，混合物與正己烷的體積比為1:1；
S108：將水相萃取物進行減壓濃縮，得到濃縮物；
S109：將濃縮物用蒸餾水進行大孔樹脂柱層析，直至下柱液洗脫至無色；
S110：所述下柱液洗脫至無色后，分別用濃度為40％、70％、90％和純乙醇溶液依次對所述濃縮物再次進行大孔樹脂柱層析，直至下柱液洗脫至無色，收集此步驟中的所有洗脫液a，備用；
S111：所述洗脫液a合并、濃縮；
S112：依次用石油醚和體積比為15:1的石油醚和乙酸乙酯對濃縮后的所述洗脫液a進行硅膠柱層析，直至下柱液洗脫至無色；
S113：所述下柱液洗脫至無色后，用體積比為10:1的石油醚和乙酸乙酯對所述洗脫液a再次進行硅膠柱層析，直至下柱液洗脫至無色，收集此步驟中的洗脫液b，備用；
S114：所述洗脫液b合并后濃縮，濃縮后的產(chǎn)物冷卻、抽濾結(jié)晶，并用石油醚洗滌得到結(jié)晶化合物；
S115：所述結(jié)晶化合物真空低溫干燥得到香草酸乙酯。
實施例2
S201：摘取盛開后期新鮮的太平紅牡丹花瓣，洗凈、瀝干；
S202：將瀝干后的牡丹花瓣加入到濃度為75％的乙醇溶液中室溫下?lián)v爛成漿，得到牡丹花漿液，其中，牡丹花瓣與乙醇的質(zhì)量/體積比為1g：4ml；
S203：將牡丹花漿液加入到濃度為75％的乙醇溶液中加熱回流，加熱溫度為70℃，回流次數(shù)為3次，每次回流時間為4h，得到回流液，其中，牡丹花漿液與乙醇的體積比為1:6；
S204：將回流液過濾得到牡丹花提取液；
S205：將牡丹花提取液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)旋干乙醇，得到固體物質(zhì)和乙醇，乙醇回收待用；
S206：向固體物質(zhì)中加入蒸餾水，70℃下加熱溶解，得到混合物，其中，固體物質(zhì)與所述蒸餾水的體積比為1:5；
S207：向混合物中加入正己烷進行萃取，收集水相萃取物，其中，混合物與正己烷的體積比為1:1.5；
S208：將水相萃取物進行減壓濃縮，得到濃縮物；
S209：將濃縮物用蒸餾水進行大孔樹脂柱層析，直至下柱液洗脫至無色；
S210：所述下柱液洗脫至無色后，分別用濃度為40％、70％、90％和純乙醇溶液依次對所述濃縮物再次進行大孔樹脂柱層析，直至下柱液洗脫至無色，收集此步驟中的所有洗脫液a，備用；
S211：所述洗脫液a合并、濃縮；
S212：依次用石油醚和體積比為15:1的石油醚和乙酸乙酯對濃縮后的所述洗脫液a進行硅膠柱層析，直至下柱液洗脫至無色；
S213：所述下柱液洗脫至無色后，用體積比為10:1的石油醚和乙酸乙酯對所述洗脫液a再次進行硅膠柱層析，直至下柱液洗脫至無色，收集此步驟中的洗脫液b，備用；
S214：所述洗脫液b合并后濃縮，濃縮后的產(chǎn)物冷卻、抽濾結(jié)晶，并用石油醚洗滌得到結(jié)晶化合物；
S215：所述結(jié)晶化合物真空低溫干燥得到香草酸乙酯。
實施例3
S301：摘取盛開后期新鮮的丹鳳白牡丹花瓣，洗凈、瀝干；
S302：將瀝干后的牡丹花瓣加入到濃度為75％的乙醇溶液中室溫下?lián)v爛成漿，得到牡丹花漿液，其中，牡丹花瓣與乙醇的質(zhì)量/體積比為1g：3ml；
S303：將牡丹花漿液加入到濃度為75％的乙醇溶液中加熱回流，加熱溫度為60℃，回流次數(shù)為3次，每次回流時間為3h，得到回流液，其中，牡丹花漿液與乙醇的體積比為1:5；
S304：將回流液過濾得到牡丹花提取液；
S305：將牡丹花提取液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)旋干乙醇，得到固體物質(zhì)和乙醇，乙醇回收待用；
S306：向固體物質(zhì)中加入蒸餾水，60℃下加熱溶解，得到混合物，其中，固體物質(zhì)與蒸餾水的體積比為1:4；
S307：向混合物中加入正己烷進行萃取，收集水相萃取物，其中，混合物與正己烷的體積比為1:1；
S308：將水相萃取物進行減壓濃縮，得到濃縮物；
S309：將濃縮物用蒸餾水進行大孔樹脂柱層析，直至下柱液洗脫至無色；
S310：所述下柱液洗脫至無色后，分別用濃度為40％、70％、90％和純乙醇溶液依次對所述濃縮物再次進行大孔樹脂柱層析，直至下柱液洗脫至無色，收集此步驟中的所有洗脫液a，備用；
S311：所述洗脫液a合并、濃縮；
S312：依次用石油醚和體積比為15:1的石油醚和乙酸乙酯對濃縮后的所述洗脫液a進行硅膠柱層析，直至下柱液洗脫至無色；
S313：所述下柱液洗脫至無色后，用體積比為10:1的石油醚和乙酸乙酯對所述洗脫液a再次進行硅膠柱層析，直至下柱液洗脫至無色，收集此步驟中的洗脫液b，備用；
S314：所述洗脫液b合并后濃縮，濃縮后的產(chǎn)物冷卻、抽濾結(jié)晶，并用石油醚洗滌得到結(jié)晶化合物；
S315：所述結(jié)晶化合物真空低溫干燥得到香草酸乙酯。
本發(fā)明實施例對由實施例2所提取的化合物進行GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer，即氣相色譜-質(zhì)譜)分析，其中，色譜柱條件為：Rtx-5MS石英毛細管柱(0.25mm×30m，0.25μm)；進樣口溫度為230℃，程序升溫，升溫程序為60℃保持3min，以3℃/min升至90℃，以10℃/min升至250℃，保持15min；載氣：He；流速：1mL/min；壓力：57.5kPa；進樣量：1μL；分流比：50:1。質(zhì)譜條件為EI電離源；檢測靜電壓1.2kv；離子源溫度200℃；接口溫度250℃；溶劑延遲時間：2min；ACQ方式：Scan；掃描速度：1668/s；質(zhì)量掃描范圍：m/z 50～500amu。通過與香草酸乙酯的NIST(National Institute of Standards and Technology，即美國國家標準與技術(shù)研究院)標準圖譜初步對比分析得知，本發(fā)明實施例提供的方法所提取的化合物與NIST的香草酸乙酯相對應(yīng)，進一步將化合物與標準樣品的色譜圖和質(zhì)譜圖比較證實本發(fā)明實施例提供的方法所提取的化合物為香草酸乙酯。
為探究通過本發(fā)明實施例提供的從牡丹花中提取香草酸乙酯的方法所提取的香草酸乙酯能夠抑制酪氨酸酶的活性，本發(fā)明實施例提供了香草酸乙酯與奧利司他對酪氨酸酶活性抑制的評價方法，具體的評價方法為：
一、實驗試劑的配制
(1)濃度為0.01mol/L的鹽酸溶液的配制
量取濃度為11.9mol/L的濃鹽酸2.1ml并置于容量瓶中，向容量瓶中加入蒸餾水稀釋至250ml，即得到濃度為0.01mol/L的鹽酸溶液。
(2)濃度為0.01mol/L，pH＝8.2的Tris-HCl(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，即三(羥甲基)氨基甲烷)緩沖溶液的配制
①稱取12.11g Tris(三羥甲基氨基甲烷)置于燒杯中；
②在燒杯中加入800ml蒸餾水，搖勻；
③加入22.9ml(1)中已配置好的濃度為0.01mol/L的鹽酸溶液，并調(diào)節(jié)溶液pH為8.2；
④將溶液定容至1L，即得到濃度為0.01mol/L，pH＝8.2的Tris-HCl緩沖溶液。
(3)胰脂肪酶的配制
稱取15mg胰脂肪酶加入到4ml PBS(phosphate buffer saline，磷酸緩沖鹽溶液)中形成混合溶液，所形成的混合溶液振蕩5min后在轉(zhuǎn)速為9000r/min的條件下離心5min，留取上清液，上清液為配置的胰脂肪酶溶液。
(4)濃度為5mol/L，pH＝5的乙酸鈉溶液的配制
用電子天平稱取68mg乙酸鈉溶于70ml水中，用乙酸調(diào)節(jié)乙酸鈉溶液的pH為5.0后定容至100ml，則得到濃度為5mol/L，pH＝5的乙酸鈉溶液。
(5)質(zhì)量濃度為0.1％的對硝基苯基月桂酸酯溶液的配制
取99ml上述(4)中濃度為5mol/L，pH＝5的乙酸鈉溶液，將1ml的TritonX-100(2-(2-[4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenoxy]ethoxy)ethanol，即聚乙二醇辛基苯基醚)加入到乙酸鈉溶液中，并在沸水中加熱2min；加熱完畢后，取上液10ml，將10mg的對硝基苯基月桂酸酯加入到上液中，得到質(zhì)量濃度為0.1％的對硝基苯基月桂酸酯溶液。
(6)香草酸乙酯和奧利司他溶液的配制：
按照體積比為1:1配置二甲亞砜和去離子水，形成二甲亞砜水溶液，分別向二甲亞砜水溶液加入香草酸乙酯和奧利司他，配制成濃度均為0.5mg/ml的香草酸乙酯溶液和奧利司他溶液。
(7)空白對照的配制
空白對照為上述(6)配置好的二甲亞砜水溶液。
二、胰脂肪酶抑制試驗
分別在三個相同的體積為1.5ml的EP(Ethylene propylene，即環(huán)氧樹脂)管中分別加入100μl的空白對照、香草酸乙酯溶液和奧利司他溶液，并分別在上述溶液中均依次加入150μl胰脂肪酶，200μl濃度為0.01mol/L，pH＝8.2的Tris-HCl緩沖溶液和250μl質(zhì)量濃度為0.1％的對硝基苯基月桂酸酯溶液，從而分別形成空白對照液、體外胰脂肪酶活性檢測液和由奧利司他配置的活性檢測液。將空白對照液、體外胰脂肪酶活性檢測液和由奧利司他配置的活性檢測液均放在37℃的恒溫烘箱中反應(yīng)2小時，反應(yīng)結(jié)束后用酶標儀在波長為475nm光下分別測定空白對照、體外胰脂肪酶活性檢測液和由奧利司他配置的活性檢測液的吸光度，平行測定3次，計算胰脂肪酶活性的IC50(half maximal inhibitory concentration，即半抑制濃度)，計算公式為：
I＝[1-(C-D)/(A-B)]×100％，其中，I為抑制率；A為沒有抑制劑(即無香草酸乙酯或無奧利司他)存在時的吸光度值；B為僅有對硝基苯基月桂酸酯溶液時的吸光度值；C為胰脂肪酶與對硝基苯基月桂酸酯溶液在抑制劑(香草酸乙酯或奧利司他)存在時的吸光度值；D為沒有胰脂肪酶存在時的吸光度值。
通過上述公式計算得知，0.5mg/mL的香草酸乙酯溶液對胰脂肪酶的IC50值為27.9±1.3％，0.5mg/mL的奧利司他對胰脂肪酶的IC50值為38.2±1.1％，由此能夠說明，在濃度為0.5mg/mL的條件下，香草酸乙酯對胰脂肪酶活性的抑制明顯大于奧利司他對胰脂肪酶活性的抑制。
奧利司他是一種長效的特異性胃腸道脂肪酶抑制劑，能夠阻止甘油三酯水解為可吸收的游離脂肪酸和單酰基甘油，使其不被吸收，從而減少熱量攝入，控制體重，而本發(fā)明實施例提供的牡丹花中提取香草酸乙酯的方法所制備的香草酸乙酯具有比奧利司他更顯著的抑制胰脂肪酶活性的特點，因此，本發(fā)明實施例所制備的香草酸乙酯同樣具有阻止甘油三酯水解為可吸收的游離脂肪酸和單?；视偷淖饔?。進一步，本發(fā)明實施例所制備的香草酸乙酯具有減肥的功效，能夠應(yīng)用于制備減肥藥或包括抑制脂肪酶活性的藥物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮說明書及實踐這里發(fā)明的公開后，將容易想到本發(fā)明的其它實施方案。本申請旨在涵蓋本發(fā)明的任何變型、用途或者適應(yīng)性變化，這些變型、用途或者適應(yīng)性變化遵循本發(fā)明的一般性原理并包括本發(fā)明未公開的本技術(shù)領(lǐng)域中的公知常識或慣用技術(shù)手段。說明書和實施例僅被視為示例性的，本發(fā)明的真正范圍和精神由下面的權(quán)利要求指出。
應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明并不局限于上面已經(jīng)描述并在附圖中示出的精確結(jié)構(gòu)，并且可以在不脫離其范圍進行各種修改和改變。本發(fā)明的范圍僅由所附的權(quán)利要求來限制。