具有聚集誘導熒光增強特性的β?半乳糖苷酶傳感器的合成及應用的制作方法

本發(fā)明屬于生物化學材料領域，涉及一種β-半乳糖苷酶熒光傳感器、合成方法及應用。

背景技術：

β-半乳糖苷酶是一種常用的檢測轉錄效率和基因轉染效率的酶，也是細胞衰老和原發(fā)性卵巢癌的一種重要生物標記物。β-半乳糖苷酶的缺乏會導致β-半乳糖唾液酸沉積癥及Morquio B綜合征。并且，近年來，β-半乳糖苷酶被廣泛應用于乳糖不耐癥的替代療法研究。β-半乳糖苷酶的重要生理作用激發(fā)了科學家們對其檢測方法的研究，比如目前常用的檢測β-半乳糖苷酶的方法有：生物化學發(fā)光法、磁共振法、單光子發(fā)射計算機斷層掃描法(SPECT)、正電子發(fā)射計算機斷層顯像法(PET)、比色法及熒光法等。在這些檢測方法中，熒光傳感器由于具有操作簡單、靈敏度高、檢測限低、可應用于細胞內或活體成像等優(yōu)點受到了科學家們的廣泛關注。目前，檢測β-半乳糖苷酶的熒光傳感器還較少，并且，大部分的β-半乳糖苷酶熒光傳感器所采用的熒光分子在高濃度時極易發(fā)生熒光猝滅，即聚集誘導熒光猝滅現(xiàn)象(aggregation caused quenching，ACQ)。這種現(xiàn)象迫使研究人員在檢測過程中只能使用稀溶液，導致檢測信噪比低，限制了這些β-半乳糖苷酶熒光傳感器的實際應用。

2001年，唐本忠等人發(fā)現(xiàn)了一種在溶液狀態(tài)下呈現(xiàn)無熒光或弱熒光，但是在聚集態(tài)呈現(xiàn)強熒光的特殊熒光分子，并將這種特殊的發(fā)光現(xiàn)象稱為聚集誘導熒光(aggregation induced emission,AIE)效應。具有AIE效應的熒光分子由于具有高熒光量子產率、強抗漂白性、無需低濃度下檢測等優(yōu)點，為Turn-on型的熒光傳感器分子的設計提出了新的思路。其中四苯乙烯類分子(tetraphenylethylene,TPE)更是設計AIE類熒光傳感器的熱門分子。本發(fā)明利用TPE分子的AIE特性，通過調節(jié)TPE分子的聚集/解聚過程，設計一種基于TPE分子的β-半乳糖苷酶熒光傳感器，具有選擇性強、靈敏度高、抗漂白能力強、能夠在活細胞中檢測β-半乳糖苷酶的特點。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的內容是一種具有聚集誘導熒光增強特性的β-半乳糖苷酶熒光傳感器、合成方法及其應用。實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術解決方案是：一種β-半乳糖苷酶熒光傳感器，具有如下結構：

該目標化合物具有聚集誘導熒光增強特性，即在溶液狀態(tài)下具有弱熒光，聚集狀態(tài)下具有強熒光。

一種β-半乳糖苷酶熒光傳感器的合成方法，合成路線如下：

第一步：4-溴二苯甲酮與4,4’-二甲氧基二苯甲酮在四氯化鈦作用下發(fā)生McMurry反應，生成具有聚集誘導熒光增強特性的化合物2；

第二步：化合物2與4-吡啶硼酸在[1,1’-雙(二苯基磷)二茂鐵]二氯化鈀的催化作用下發(fā)生Suzuki偶聯(lián)反應，生成化合物3；

第三步：化合物4與對羥基苯甲醛在NaOH作用下反應生成化合物5；

第四步：化合物5和還原劑硼氫化鈉反應生成化合物6；

第五步：化合物6與三溴化磷作用，生成化合物7；

第六步：化合物7與化合物3在甲苯中回流得到化合物8；

第七步：化合物8在碳酸鉀的作用下生成目標化合物1，利用乙酸乙酯、石油醚和二氯甲烷為混合溶劑重結晶提純后，目標化合物1的結構經¹H NMR、¹³C NMR和高分辨質譜鑒定。

一種β-半乳糖苷酶熒光傳感器的應用：

在目標化合物1中含有一個吡啶鹽結構和一個β-吡喃半乳糖苷結構，賦予了該化合物一定的水溶性，因此，該傳感器可以用于水樣檢測，簡單實用。在本發(fā)明中，用于檢測β-半乳糖苷酶的溶劑為PBS緩沖溶液(5mM,pH 7.4，含1％的DMSO，目標化合物1的濃度為10μM)，向溶液中加入8.0U/mL的β-半乳糖苷酶，在37℃下孵化，檢測溶液熒光強度隨時間的變化情況，結果表明，在37℃下孵化10min后，溶液的熒光強度基本達到飽和。

在10μM的目標化合物1的PBS溶液中加入不同濃度的β-半乳糖苷酶，在37℃下孵化10min后，測定目標化合物1的熒光強度隨β-半乳糖苷酶濃度的變化情況。在0.8至4.8U/mLβ-半乳糖苷酶濃度范圍內目標化合物1的熒光強度呈現(xiàn)良好的線性關系。

向目標化合物1的溶液中加入β-半乳糖苷酶后，目標化合物1中的β-吡喃半乳糖苷結構被酶水解發(fā)生鍵的斷裂，并進一步發(fā)生消除反應生成化合物3。而化合物3的水溶性較差，在水溶液中更傾向于生成聚集態(tài)，因而溶液熒光大大增強。為了了解目標化合物1對β-半乳糖苷酶的選擇性，本發(fā)明對常見生物分子如ATP、ADP、AMP、磷脂酰膽堿(PC)、脂多糖(LPS)、牛血清白蛋白(BSA)、酪氨酸(Try)、谷胱甘肽(GSH)及維生素C(Vc)與目標化合物1反應前后的熒光強度也進行了測定，結果表明，除β-半乳糖苷酶外其他生物分子與目標化合物1反應前后的熒光強度均沒有明顯增強。

人卵巢癌細胞(OVCAR3)β-半乳糖苷酶熒光成像：文獻報道β-半乳糖苷酶在OVCAR3細胞中過表達，在HeLa細胞中不表達。本發(fā)明分別測定了目標化合物1在OVCAR3細胞和HeLa細胞中的熒光成像情況，進一步說明目標化合物1在細胞內β-半乳糖苷酶熒光成像方面的特異性和應用潛力。目標化合物1用二甲基亞砜(DMSO)溶解準確配制成1mM的母液，然后再用培養(yǎng)基稀釋成5μM的稀釋液。移取200μL的稀釋液分別加入到OVCAR3細胞和HeLa細胞培養(yǎng)皿中，于室溫下孵育40min，用PBS緩沖溶液沖洗細胞培養(yǎng)皿洗去多余染料分子。在405nm激發(fā)下用共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞的熒光成像情況，采集450-550nm的熒光信號進行熒光成像。結果表明，目標化合物1僅在β-半乳糖苷酶過表達的OVCAR3細胞中呈現(xiàn)強的熒光信號，而同樣條件下，在不表達β-半乳糖苷酶的HeLa細胞中熒光較弱，說明目標化合物1對細胞內β-半乳糖苷酶成像具有特異性。

發(fā)明人通過簡單的設計與合成，將目標化合物1成功用于β-半乳糖苷酶檢測。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明合成步驟簡單，較易大規(guī)模生產和應用，克服了傳統(tǒng)染料分子易漂白、僅能在稀溶液中檢測的缺點。

附圖說明

圖1(a)在10μM化合物1的PBS緩沖溶液中加入不同濃度的β-半乳糖苷酶，37℃孵化10min后熒光發(fā)射光譜的變化；(b)10μM化合物1在512nm處熒光強度與β-半乳糖苷酶濃度的關系及線性擬合曲線圖。

圖2在10μM化合物1的PBS緩沖溶液中分別加入100μM的ATP、ADP、AMP、Vc、PC、LPS，或100μg/mL的BSA、Try、GSH或12.8U/mL的β-半乳糖苷酶，在512nm處熒光強度變化的柱狀圖。

圖3化合物1與OVCAR3細胞或HeLa細胞37℃下孵化40min后的激光共聚焦顯微成像照片。(a)化合物1與HeLa細胞在37℃下孵化40min后的明場照片；(b)化合物1與HeLa細胞在37℃下孵化40min后的熒光照片；(c)為(a)與(b)的疊加圖；(d)化合物1與OVCAR3細胞在37℃下孵化40min后的明場照片；(e)化合物1與OVCAR3細胞在37℃下孵化40min后的熒光照片；(f)為(d)與(e)的疊加圖。

具體實施方式

本實施例中所用的原料均為已知化合物，可以由商業(yè)途徑獲得，或可按相關文獻設計方法合成。

實施例1

目標化合物1的合成

(1)化合物2的合成：將鋅粉(1.56g,24mmol)、4-溴二苯甲酮(313mg,1.2mmol)4,4’-二甲氧基二苯甲酮(242mg,1.0mmol)加入無水四氫呋喃中，將懸浮液在攪拌下冷卻到0℃。然后用注射器緩慢滴入四氯化鈦(2.276g,12mmol)，0℃下繼續(xù)攪拌30min后，混合液回流4h。冷卻，攪拌下滴入碳酸鈉溶液直至無氣泡產生為止。加入二氯甲烷和飽和食鹽水分液、萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌三次，有機相用無水硫酸鈉干燥、濃縮、柱層析分離后得到化合物2，產率為29％。核磁表征數據為：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.21(d,J＝4.6Hz,2H),7.20(m,3H),7.00(m,2H),6.95–6.87(m,6H),6.67–6.61(m,4H),3.76(s,3H),3.75(s,3H).

(2)化合物3的合成：將化合物2(236mg,0.50mmol)、4-吡啶苯硼酸(90mg,0.73mmol)、Pd(dppf)Cl₂(80mg,0.10mmol)、CH₂Cl₂(1mL)、Bu₄NI(25mg,0.07mmol)和碳酸鉀水溶液(2M,10mL)加入甲苯(20mL)中，將混合液在氮氣保護條件下回流16h。冷卻，加入二氯甲烷和飽和食鹽水分液、萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌三次，有機相用無水硫酸鈉干燥、濃縮、柱層析分離后得到化合物3，產率63％。核磁表征數據為：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.62(d,J＝5.9Hz,2H),7.48(d,J＝6.1Hz,2H),7.41(d,J＝8.3Hz,2H),7.14–7.12(m,5H),7.06–7.04(m,2H),7.00–6.94(m,4H),6.67–6.63(m,4H),3.75(s,6H)。

(3)化合物5、6、7按照文獻報道方法(Nat.Protoc.,2014,9,27；Synthesis,2010,13,2201)合成。

(4)化合物8的合成：將化合物3(20.0mg,0.043mmol)和化合物7(24.2mg,0.047mmol)溶于甲苯中，80℃下反應過夜。反應液冷卻后進行柱層析分離得到化合物8，產率87％。核磁表征數據為：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.92(br,2H),8.29(br,2H),7.75(br,2H),7.52(br,2H),7.38–6.86(m,14H),6.66(br,3H),5.74(br,2H),5.46–5.25(m,4H),4.33(br,1H),4.16(br,2H),3.71(s,6H),2.16(s,3H),2.02(s,6H),1.98(s,3H).¹³C NMR(101MHz,MeOD)δ170.60,170.51,170.04,169.85,158.85,158.70,157.89,156.16,149.48,143.97,143.53,142.66,137.73,135.60,135.50,132.57,132.38,132.27,131.08,130.83,130.56,129.91,128.31,128.25,128.19,127.95,127.91,127.79,127.68,127.21,126.31,124.37,124.27,117.25,113.01,112.78,98.24,70.82,70.77,68.70,67.25,62.73,61.13,54.27,19.57,19.30,19.18,13.13.高分辨質譜表征數據為：HRMS:906.34871,[M]⁺。

(5)化合物1的合成：將化合物8(15mg,0.015mmol)溶于3mL甲醇中，加入碳酸鉀(8.4mg,0.061mmol)于室溫下攪拌1h，之后加入氯仿?；旌衔镉蔑柡褪雏}水洗三次，有機相用無水硫酸鈉干燥后濃縮，用乙酸乙酯、石油醚和二氯甲烷為混合溶劑重結晶，產率92％。核磁表征數據為：¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ9.14(d,J＝6.3Hz,2H),8.43(d,J＝5.5Hz,2H),7.87(d,J＝7.8Hz,2H),7.51(d,J＝7.2Hz,3H),7.28–6.81(m,13H),6.70(t,J＝8.6Hz,3H),5.72(s,2H),5.31(s,1H),4.83–4.81(m,3H),3.67(s,6H),3.55–3.52(m,3H).¹³C NMR(101MHz,d₆-DMSO)δ158.61,158.46,154.64,150.64,148.70,144.86,143.70,142.15,138.02,135.67,135.65,132.58,132.49,132.46,132.42,132.04,131.25,130.76,129.21,128.74,128.64,128.53,128.41,128.30,128.14,127.93,127.05,126.55,124.76,121.21,117.20,116.90,113.90,113.68,101.21,100.85,76.02,73.82,70.71,68.42,62.35,60.73,55.42.高分辨質譜表征數據為：HRMS:738.30674,[M]⁺。

實施例2

β-半乳糖苷酶傳感器性能測試

(1)β-半乳糖苷酶傳感器響應時間測定：取20μL化合物1的DMSO溶液(1mM)于2mL PBS緩沖溶液中，加入8.0U/mL的β-半乳糖苷酶，混合液在37℃下孵化不同的時間，測定混合溶液的熒光強度隨孵化時間的變化，結果表明，10min后，熒光強度基本達到飽和。

(2)β-半乳糖苷酶傳感器熒光滴定測試：取20μL化合物1的DMSO溶液(1mM)于2mL PBS緩沖溶液中，然后加入不同量的β-半乳糖苷酶的PBS溶液，混合溶液在37℃下孵化10min后，測定加入不同濃度β-半乳糖苷酶后溶液的熒光發(fā)射光譜(E_x＝344nm)，在0.8U/mL至4.8U/mL β-半乳糖苷酶濃度范圍內混合液的熒光強度呈現(xiàn)良好的線性關系(如圖1所示)。

(3)β-半乳糖苷酶傳感器的選擇性測試：取20μL化合物1的DMSO溶液(1mM)于2mL PBS緩沖溶液中，然后分別加入100μM的ATP、ADP、AMP、Vc、PC、LPS,或100μg/mL的BSA、Try、GSH或12.8U/mL的β-半乳糖苷酶，混合溶液在37℃下孵化10min，然后測定溶液的熒光發(fā)射光譜(E_x＝344nm)。結果表明，除β-半乳糖苷酶外的其他生物分子與目標化合物1反應前后的熒光強度均沒有明顯增強(如圖2所示)，說明該熒光傳感器可以選擇性識別β-半乳糖苷酶。

實施例3

人卵巢癌細胞(OVCAR3)β-半乳糖苷酶熒光成像：OVCAR3細胞經過復蘇接種于含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。HeLa細胞經過復蘇接種于含10％胎牛血清的DEME培養(yǎng)基中。兩種細胞在37℃、5％CO₂、100％飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后在18mm蓋玻片上培養(yǎng)24h，待用。

將兩種細胞分別浸入含5μM化合物1的培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO₂、100％飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40min后，倒出培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基清洗細胞3遍。分別在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察，并對其進行明場和暗場下拍照(如圖3所示)。結果表明，目標化合物1僅在β-半乳糖苷酶過表達的OVCAR3細胞中呈現(xiàn)強的熒光信號，而同樣條件下，在不表達β-半乳糖苷酶的HeLa細胞中熒光較弱，說明目標化合物1對細胞內β-半乳糖苷酶成像具有特異性。