用解淀粉芽孢桿菌GUHP86提高豬血蛋白水解度的方法與流程

本發(fā)明涉及微生物，進一步來說，涉及解淀粉芽孢桿菌，特別涉及用解淀粉芽孢桿菌GUHP86提高豬血蛋白水解度的方法。

背景技術(shù)：

新鮮豬血傳統(tǒng)的利用辦法是蒸煮法，即直接加熱或蒸干豬血制成血塊或者血粉供人畜食用。也有將新鮮豬血蒸汽凝結(jié)后再離心脫水、通過氣流干燥制備豬血血粉的方法。這些方法存在較大的營養(yǎng)缺陷：①不易消化，一是由豬血本身的血球蛋白結(jié)構(gòu)所致，二是蒸煮法的蒸煮、干燥過程會導致豬血中蛋白質(zhì)、氨基酸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而破壞氨基酸質(zhì)量；②豬血中氨基酸組成不均衡，其中亮氨酸和異亮氨酸比例失調(diào)，影響了血粉的品質(zhì)；③適口性差，豬血本身具有的血腥味和血粉的其他異味所造成的。正因如此，豬血雖然有很高的應(yīng)用價值，但是人們對其直接應(yīng)用卻很少，大部分都是被廢棄掉了。

近年來一個研究熱點是利用微生物產(chǎn)復(fù)合酶的性質(zhì)，將產(chǎn)蛋白酶微生物接種在新鮮豬血中生長、并對豬血進行液態(tài)發(fā)酵水解豬血中蛋白質(zhì)，可以有效地降解新鮮豬血中的大分子蛋白質(zhì)，有效地分解豬血中蛋白質(zhì)變成小分子肽，大大提高豬血產(chǎn)品中氨基酸含量，豬血液態(tài)發(fā)酵后的初產(chǎn)品中還會有更多的營養(yǎng)元素如纖維素，植酸等營養(yǎng)成分，使得液態(tài)發(fā)酵豬血產(chǎn)品有更多的利用價值，也就大大提高豬血的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。而且微生物源的蛋白酶顯示出明顯優(yōu)勢：微生物繁殖速度快，在合適的條件下半小時左右就可以繁殖一代；微生物種類繁多，酶的品質(zhì)齊全，不同的生存環(huán)境會產(chǎn)生不同種類的酶，如嗜溫菌、嗜鹽菌、嗜堿菌、嗜酸菌等。

經(jīng)檢索，在中國專利數(shù)據(jù)庫中涉及豬血蛋白的申請件不多，僅有2009100679543號《一種利用豬新鮮胰酶生產(chǎn)豬血蛋白肽與血紅素的技術(shù)》、ZL2013104252308號《一種高性能的豬血蛋白粉制備裝置》和ZL2013104250035號《一種環(huán)保高效的豬血蛋白粉制備裝置》。這些方案均有一定實際應(yīng)用，但至今為止，尚無用解淀粉芽孢桿菌提高豬血蛋白水解度的申請件。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供用解淀粉芽孢桿菌GUHP86提高豬血蛋白水解度的方法，通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件來提高解淀粉芽孢桿菌GUHP86對豬血蛋白的水解度，改善豬血風味和提高其營養(yǎng)價值。

為達到上述目的，發(fā)明人提供的用解淀粉芽孢桿菌GUHP86提高豬血蛋白水解度的方法包括以下步驟：

⑴制備菌種培養(yǎng)基

按照以下物料配方制備菌種培養(yǎng)基：

取豬血粉15.0g，NaCl 5.0g，MgSO₄·7H₂O0.2g，CaCl₂0.1g，K₂HPO45.0g，pH 7.0，蒸餾水1000mL，混合均勻，于121℃下滅菌20min，得到菌種培養(yǎng)基，備用；

⑵制備發(fā)酵菌種液：

在250mL三角瓶內(nèi)，挑取2環(huán)初篩斜面將解淀粉芽孢桿菌GUHP86接入菌種培養(yǎng)基，裝液量50mL，于30℃下以轉(zhuǎn)速為180r/min搖床培養(yǎng)24h，即得發(fā)酵菌種液，備用；

⑶選取發(fā)酵培養(yǎng)基

選用新鮮豬血作為發(fā)酵培養(yǎng)基；

⑷制備發(fā)酵液

將發(fā)酵菌種液按6％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃下以轉(zhuǎn)速 為180r/min的搖床培養(yǎng)48h，然后在4℃下以轉(zhuǎn)速為10000r/min的離心分離機離心10min，得到的發(fā)酵上清液即為發(fā)酵液；

⑸催化水解豬血蛋白

將上述發(fā)酵液與新鮮豬血混合發(fā)酵，進行催化水解豬血蛋白。

上述解淀粉芽孢桿菌GUHP86(Bacillus amyloliquefaciens GUHP86)已于2016年1月4日保藏于武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，該中心地址是:中國武漢·武漢大學，郵政編碼為430072；簡稱解淀粉芽孢桿菌GUHP86，保藏編號為CCTCC NO.M 2016003，該菌株系從中國貴州貴陽生豬屠宰的屠宰場周圍土壤樣本中分離得到。

豬血蛋白水解度的計算公式如下：

(菌株水解豬血蛋白的含量/發(fā)酵培養(yǎng)基中豬血蛋白的含量)x100％

本發(fā)明的用解淀粉芽孢桿菌GUHP86提高豬血蛋白水解度的方法是一種優(yōu)化的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)方法，與傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵相比，本發(fā)明具有以下有益效果:液態(tài)發(fā)酵時，菌種與底物便于混合均勻，使其充分接觸，縮短發(fā)酵時間，提高水解效率。本發(fā)明的方法用于發(fā)酵生產(chǎn)的蛋白酶可高效催化水解豬血蛋白，使其在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，水解度達到最大，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。采用本發(fā)明優(yōu)化后的培養(yǎng)條件，該解淀粉芽孢桿菌GUHP86對豬血蛋白的水解度達28.23％，比優(yōu)化之前提高0.42倍。本發(fā)明適用于解淀粉芽孢桿菌GUHP86液態(tài)發(fā)酵豬血培養(yǎng)。

附圖說明

圖1為不同轉(zhuǎn)數(shù)對菌株GUHP86水解豬血蛋白水解度的影響；

圖2為發(fā)酵培養(yǎng)溫度對菌株GUHP86水解豬血蛋白水解度的影響；

圖3為不同接種量菌株GUHP86水解豬血蛋白水解度的影響；

圖4為發(fā)酵培養(yǎng)時間菌株GUHP86水解豬血蛋白水解度的影響；

圖5為溫度和發(fā)酵時間對豬血蛋白水解度的響應(yīng)面圖；

圖6為溫度和發(fā)酵時間對豬血蛋白水解度的等高線圖；

圖7為溫度和接種量對豬血蛋白水解度的響應(yīng)面圖；

圖8為溫度和接種量對豬血蛋白水解度的等高線圖；

圖9為溫度和轉(zhuǎn)速對豬血蛋白水解度的響應(yīng)面圖；

圖10為溫度和轉(zhuǎn)速對豬血蛋白水解度的等高線圖；

圖11為發(fā)酵時間和接種量對豬血蛋白水解度的響應(yīng)面圖；

圖12為發(fā)酵時間和接種量對豬血蛋白水解度的等高線圖；

圖13為發(fā)酵時間及轉(zhuǎn)速對豬血蛋白水解度的響應(yīng)面圖；

圖14為發(fā)酵時間及轉(zhuǎn)速對豬血蛋白水解度的等高線圖；

圖15為接種量和轉(zhuǎn)速對豬血蛋白水解度的響應(yīng)面圖；

圖16為接種量和轉(zhuǎn)速對豬血蛋白水解度的等高線圖；

圖17為解淀粉芽孢桿菌GUHP86液態(tài)發(fā)酵豬血培養(yǎng)方法流程圖。

具體實施方式

實施例1本發(fā)明所涉及到的用解淀粉芽孢桿菌GUHP86提高豬血蛋白水解度的方法

從中國貴州貴陽生豬屠宰的屠宰場周圍土壤樣本中分離得到的解淀粉芽孢桿菌GUHP86，于2016年1月5日保藏于武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO.M 2016003。

⑴制備菌種培養(yǎng)基

按照以下物料配方制備菌種培養(yǎng)基：

取豬血粉15.0g，NaCl 5.0g，MgSO₄·7H₂O0.2g，CaCl₂0.1g，K₂HPO45.0g，pH 7.0，蒸餾水1000mL，混合均勻，于121℃下滅菌20min，得到菌種培養(yǎng)基，備用；

⑵制備發(fā)酵菌種液：

在250mL三角瓶內(nèi)，挑取2環(huán)初篩斜面將解淀粉芽孢桿菌GUHP86接入菌種培養(yǎng)基，裝液量50mL，于30℃下以轉(zhuǎn)速為180r/min搖床培養(yǎng)24h， 即得發(fā)酵菌種液，備用；

⑶選取發(fā)酵培養(yǎng)基

選用新鮮豬血作為發(fā)酵培養(yǎng)基；

⑷制備發(fā)酵液

將發(fā)酵菌種液按6％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃下以轉(zhuǎn)速為180r/min的搖床培養(yǎng)48h，然后在4℃下以轉(zhuǎn)速為10000r/min的離心分離機離心10min，得到的發(fā)酵上清液即為發(fā)酵液；

⑸催化水解豬血蛋白

將上述發(fā)酵液與新鮮豬血混合發(fā)酵，進行催化水解豬血蛋白。

實施例2以不同的溫度、時間、接種量及搖床轉(zhuǎn)速分別考察解淀芽孢桿菌GUHP86水解豬血的條件，在單因素的基礎(chǔ)上，再對解淀粉芽孢桿菌GUHP86進行響應(yīng)面優(yōu)化實驗確定最佳的水解條件，每個實驗重復(fù)三次。以豬血蛋白水解度為指標確定菌株水解豬血的作用條件范圍

1單因素試驗設(shè)計

1.1發(fā)酵培養(yǎng)溫度對豬血蛋白水解度的影響

水解時間48h，接種量6％，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，溫度分別調(diào)至10、20、30、40、50℃。

1.2水解時間對豬血蛋白水解度的影響

溫度30℃，接種量6％，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，發(fā)酵培養(yǎng)時間分別取24h、36h、48h、60h、72h。

1.3接種量對豬血水解度的影響

溫度30℃，水解時間48h，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，接種量分別為2％、4％、6％、8％、10％。

1.4搖床轉(zhuǎn)速對豬血水解度的影響

溫度30℃，水解時間為48h，接種量為發(fā)酵液的6％，搖床轉(zhuǎn)速分別 為160r/min、170r/min、180r/min、190r/min、200r/min。

單因素結(jié)果見圖1-圖4。

2Box-Benhnken試驗

在上述單因素實驗的基礎(chǔ)上設(shè)計Box-Benhnken試驗，優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌GUHP86對豬血蛋白的培養(yǎng)條件。選取(X₁)、發(fā)酵時間(X₂)、接種量(X₃)及轉(zhuǎn)速(X₄)進行響應(yīng)面優(yōu)化，建立了豬血蛋白水解度的數(shù)學模型。Box-Benhnken試驗結(jié)果見圖5-10。

表1菌株GUHP86水解豬血蛋白響應(yīng)面分析因素和水平

表2菌株GUHP86水解豬血蛋白試驗結(jié)果

表3菌株GUHP86水解豬血蛋白試驗方差分析

注：“*”：P＜0.05顯著水平；“**”：P＜0.01極顯著水平

通過響應(yīng)面軟件將表2中的結(jié)果即豬血蛋白的水解度經(jīng)方差分析和擬合，就可獲得所有因子的顯著性(見表3)，獲得豬血蛋白水解度響應(yīng)值(Y)對自變量發(fā)酵液的溫度(X₁)、發(fā)酵時間(X₂)、接種量(X₃)及轉(zhuǎn)速(X₄)的二次多項回歸模型方程為：

Y＝+22.69+0.39X1+0.84X₂+0.28X₃-0.27X₄+1.39X₁X₂+0.22X₁X₃+0.36X₁X₄+0.30X₂X₃-0.27X₂X₄-0.19X₃X₄-1.98X₁₂+0.27X₂₂+0.58X₃₂-6.67X₄₂。

表3表明新建的模型P＜0.01，即極顯著，表明方程和試驗結(jié)果擬合度較好。還能得出，一次項中X₂極顯著，說明發(fā)酵時間(X₂)對豬血蛋白水解度的影響為極顯著；方程的一次項X₁X₂為顯著；方程的二次項X₁和X₄為極顯著。

采用響應(yīng)面設(shè)計軟件對模型分析，可以得到所有響應(yīng)面和其對應(yīng)的等高線圖。通過軟件繼續(xù)對二次回歸方程進行分析以取得最優(yōu)值，即發(fā)酵液的溫度(X₁)為35℃、接種量(X₃)為7％、發(fā)酵時間(X₂)為60h、搖床轉(zhuǎn)速(X₄)為179.6r/min時，響應(yīng)值水解度達到最大值為28.23％, 與優(yōu)化前相比提高0.42倍。發(fā)酵后豬血無血腥味，有發(fā)酵所特有的香味。