取代羅丹明B酰胺基硫脲類熒光探針化合物及其制備方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于熒光探針化合物的合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種取代羅丹明B酰胺基硫脲類熒光探針化合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

汞是一種重金屬，俗稱水銀。離子形態(tài)的Hg²⁺具有較高的化學(xué)活性，是造成環(huán)境污染的主要重金屬離子之一，在濃度很低時對生物體就表現(xiàn)出極強(qiáng)的生理毒性。無機(jī)汞對人類的危害主要在腎臟方面，而通過環(huán)境中的微生物轉(zhuǎn)化生成的甲基汞則會對人類造成多種心腦血管方面的疾病，且這兩種形態(tài)下的汞都會經(jīng)生物富集作用最終轉(zhuǎn)移到人類體內(nèi)，并且無法通過自身代謝作用將汞排出體外，嚴(yán)重危害人類的身體健康。因此，對生物體和環(huán)境中汞的分析檢測一直是人們非常關(guān)注的問題，建立快速、高效的汞離子檢測方法在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域中具有重大意義。

傳統(tǒng)的汞離子測定方法有：紫外分光光度法、原子吸收/發(fā)射法、生物傳感器法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法和電化學(xué)法等，上述幾種傳統(tǒng)的檢測方法雖然可以完成對不同體系樣品的汞含量檢測，但它們對儀器的設(shè)備要求很高，價格昂貴，并要求有大量的待測樣品，而且不允許連續(xù)檢測，這些方法的自身局限性制約著對各種待測樣品特別是生物體內(nèi)的即時檢測與痕量分析。

熒光分析法在汞的痕量檢測中發(fā)揮著極大的作用，利用探針分子的熒光信號來表示熒光受體與分析對象發(fā)生作用后的光化學(xué)信息變化來判斷某一特定物質(zhì)是否存在，其通常以激發(fā)光譜和發(fā)射光譜為重要參數(shù)，具有高靈敏度、高選擇性、快速以及檢測便捷等優(yōu)點。因此，近年來熒光分子探針成為在重金屬離子和過渡金屬離子識別檢測研究領(lǐng)域的熱點，廣泛應(yīng)用于環(huán)境分析和生物細(xì)胞成像研究。熒光分子探針分為絡(luò)合型和反應(yīng)型兩種，絡(luò)合型熒光探針基于非共價鍵的超分子相互作用，主要是配位鍵和氫鍵作用；反應(yīng)型熒光探針直接與檢測對象發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成不同結(jié)構(gòu)的光活性化合物，使熒光分子探針的光譜性質(zhì)發(fā)生變化，從而實現(xiàn)光學(xué)傳感。

羅丹明類化合物具有光穩(wěn)定性好，熒光量子產(chǎn)率高等光物理性質(zhì)使其被廣泛應(yīng)用為熒光發(fā)色基團(tuán)，其在氫離子或某些金屬陽離子作用下可以開環(huán)，熒光顯著增強(qiáng)且伴隨著顏色的變化，因此，基于羅丹明螺環(huán)“off-on”機(jī)理的反應(yīng)型金屬離子熒光探針成為近年來研究的重點與熱點。由于Hg²⁺具有嗜硫性，它可以促進(jìn)硫羰基化合物發(fā)生脫硫反應(yīng)，生成相應(yīng)的羰基化合物及硫化汞沉淀，例如Hg²⁺誘導(dǎo)硫脲類衍生物脫硫化生成胍。這使得設(shè)計含硫羅丹明類熒光探針有了理論依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了一種取代羅丹明B酰胺基硫脲類熒光探針化合物，該化合物由于其結(jié)構(gòu)的特殊性可以與重金屬汞離子發(fā)生相互作用，最終實現(xiàn)檢測痕量重金屬汞離子的目的。

本發(fā)明解決的另一個技術(shù)問題是提供了一種工藝流程簡單且成本相對低廉的取代羅丹明B酰胺基硫脲類熒光探針化合物的制備方法。

本發(fā)明還解決的技術(shù)問題是該取代羅丹明B酰胺基硫脲類熒光探針化合物在作為檢測重金屬汞離子有機(jī)分子熒光探針中的應(yīng)用。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案，取代羅丹明B酰胺基硫脲類熒光探針化合物，其特征在于化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：，其中R為Cl、OMe或CF₃。

本發(fā)明所述的取代羅丹明B酰胺基硫脲類熒光探針化合物的制備方法，其特征在于具體步驟為：

步驟（1），在反應(yīng)容器中將羅丹明B溶于乙醇中，再加入水合肼水溶液，于85℃的油浴中回流反應(yīng)，TLC監(jiān)控原料反應(yīng)完全后加入蒸餾水淬滅反應(yīng)，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)體系，收集有機(jī)相后減壓蒸餾得到羅丹明B酰肼化合物；

步驟（2），在反應(yīng)容器中加入2-取代苯異硫氰酸酯類化合物和步驟（1）得到的羅丹明B酰肼化合物，再加入異丙醇，于85℃的油浴中攪拌回流反應(yīng)，TLC監(jiān)控原料反應(yīng)完全后降至室溫，減壓蒸餾除去溶劑并加入中性氧化鋁對其干法拌樣，使用中性氧化鋁作為固定相進(jìn)行柱層析分離純化得到取代羅丹明B酰胺基硫脲類熒光探針化合物。

進(jìn)一步優(yōu)選，步驟（1）中所述水合肼水溶液的質(zhì)量濃度為80%，水合肼與羅丹明B的摩爾比為20:3。

進(jìn)一步優(yōu)選，步驟（2）中所述2-取代苯異硫氰酸酯類化合物與羅丹明B酰肼化合物的摩爾比為1.5:1。

本發(fā)明所述的取代羅丹明B酰胺基硫脲類熒光探針化合物在作為檢測重金屬汞離子有機(jī)分子熒光探針中的應(yīng)用。

本發(fā)明的取代羅丹明B酰胺基硫脲類熒光探針化合物表現(xiàn)出較好的抗干擾能力，能夠較為準(zhǔn)確地檢測痕量重金屬汞離子，并且選擇性和靈敏度較好。

附圖說明

圖1是鄰氯基羅丹明探針RBS1對不同金屬離子的選擇性識別曲線；

圖2是鄰甲氧基羅丹明探針RBS2對不同金屬離子的選擇性識別曲線；

圖3是鄰三氟甲基羅丹明探針RBS3對不同金屬離子的選擇性識別曲線；

圖4是共存離子對鄰氯基羅丹明探針RBS1檢測汞離子的影響圖；

圖5是共存離子對鄰甲氧基羅丹明探針RBS2檢測汞離子的影響圖；

圖6是共存離子對鄰三氟甲基羅丹明探針RBS3檢測汞離子的影響圖；

圖7是鄰氯基羅丹明探針RBS1對汞離子的熒光測試曲線；

圖8是鄰甲氧基羅丹明探針RBS2對汞離子的熒光測試曲線；

圖9是鄰三氟甲基羅丹明探針RBS3對汞離子的熒光測試曲線；

圖10是鄰氯基羅丹明探針RBS1對汞離子絡(luò)合的工作曲線；

圖11是鄰甲氧基羅丹明探針RBS2對汞離子絡(luò)合的工作曲線；

圖12是鄰三氟甲基羅丹明探針RBS3對汞離子絡(luò)合的工作曲線。

具體實施方式

以下通過實施例對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

實施例1

羅丹明B酰肼化合物的合成

取羅丹明B 1.443 g(3 mmol)移入100 mL的圓底燒瓶內(nèi)，用50 mL乙醇溶解，然后用移液槍移取水合肼水溶液3 mL(80wt%，20 mmol)，此時反應(yīng)體系呈深酒紅色，于85℃的油浴中進(jìn)行回流反應(yīng)，薄層色譜檢測法(TLC)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)度，展開劑為體積比1:1的石油醚與乙酸乙酯混合溶液，反應(yīng)6小時后點板發(fā)現(xiàn)薄層板上原料點基本消失，比移值在約0.5位置出現(xiàn)羅丹明酰肼產(chǎn)物點，微熱后產(chǎn)物點呈玫紅色，此時反應(yīng)體系由深酒紅色變?yōu)橥咙S色，加100 mL蒸餾水淬滅反應(yīng)，用乙酸乙酯萃取體系，收集有機(jī)相后減壓蒸餾得羅丹明酰肼化合物1.2537 g，收率91%。

實施例2

鄰氯基羅丹明探針RBS1的合成

取2-氯苯異硫氰酸酯0.1260 g(0.75 mmol)和羅丹明酰肼化合物0.2292 g(0.5 mmol)并轉(zhuǎn)移至25 mL的圓底燒瓶內(nèi)，然后加入5 mL干燥的異丙醇，于85℃的油浴中磁力攪拌回流反應(yīng)，反應(yīng)5 min后對其進(jìn)行TLC監(jiān)測反應(yīng)，展開劑為體積比為1:1的石油醚與乙酸乙酯混合溶液，10 h后原料點消失，停止反應(yīng)，體系降至室溫后，減壓蒸餾除去溶劑并加入中性氧化鋁對其干法拌樣，使用中性氧化鋁作為固定相進(jìn)行柱層析（石油醚：乙酸乙酯=10:2，v/v）分離純化，產(chǎn)品為白色蓬松狀粉末鄰氯基羅丹明探針RBS1（收率80%）。

實施例3

鄰甲氧基羅丹明探針RBS2的合成

取2-甲氧基苯異硫氰酸酯0.1238 g(0.75 mmol)和羅丹明酰肼化合物0.2292 g(0.5 mmol)并轉(zhuǎn)移至25 mL的圓底燒瓶內(nèi)，然后加入5 mL干燥的異丙醇，于85℃的油浴中磁力攪拌回流反應(yīng)，反應(yīng)5 min后對其進(jìn)行TLC監(jiān)測反應(yīng)，展開劑為體積比為1:1的石油醚與乙酸乙酯混合溶液，10 h后原料點消失，停止反應(yīng)，體系降至室溫后，減壓蒸餾除去溶劑并加入中性氧化鋁對其干法拌樣，使用中性氧化鋁作為固定相進(jìn)行柱層析（石油醚：乙酸乙酯=10:2，v/v）分離純化，產(chǎn)品為白色蓬松狀粉末鄰甲氧基羅丹明探針RBS2（收率82%）。

實施例4

鄰三氟甲基羅丹明探針RBS3的合成

取2-三氟甲基異硫氰酸酯0.1524 g(0.75 mmol)和羅丹明酰肼化合物0.2292 g(0.5 mmol)并轉(zhuǎn)移至25 mL的圓底燒瓶內(nèi)，然后加入5 mL干燥的異丙醇，于85℃的油浴中磁力攪拌回流反應(yīng)，反應(yīng)5 min后對其進(jìn)行TLC監(jiān)測反應(yīng)，展開劑為體積比為1:1的石油醚與乙酸乙酯混合溶液，10 h后原料點消失，停止反應(yīng)，體系降至室溫后，減壓蒸餾除去溶劑并加入中性氧化鋁對其干法拌樣，使用中性氧化鋁作為固定相進(jìn)行柱層析（石油醚：乙酸乙酯=10:2，v/v）分離純化，產(chǎn)品為白色蓬松狀粉末鄰三氟甲基羅丹明探針RBS3（收率67%）。

實施例5

熒光光譜的測定

1、熒光光譜測定條件

激發(fā)狹縫寬度5.0 nm，發(fā)射狹縫寬度3.0 nm，激發(fā)波長λex為566 nm或568 nm，響應(yīng)時間1 s，波長范圍500-700 nm，靈敏度為medium，樣品池選擇1 cm×1 cm×4 cm的四通石英比色皿。

準(zhǔn)確稱取0.0125 g RBS1、0.0122 g RBS2和0.0132 g RBS3，分別用二甲亞砜溶液(DMSO)溶解于10 mL容量瓶中并定容，摩爾濃度均為2×10^-3 mol/L。取0.5 mL母液于另一支10 mL容量瓶中用DMSO定容，此時熒光探針化合物摩爾濃度為1×10^-4 mol/L。再用HEPES緩沖溶液配制1×10^-3 mol/L的多種金屬鹽溶液，同樣稀釋至1×10^-4 mol/L。

其中RBS1和RBS3的測試條件為Ex=5 nm，Em=3 nm，靈敏度為中，RBS2的測試條件為Ex=3 nm，Em=3 nm，靈敏度為高。測試條件的區(qū)別初步表明鄰位為供電子取代基團(tuán)的熒光探針化合物RBS2相對熒光強(qiáng)度較弱。

2、吸電子效應(yīng)不同造成對汞離子的選擇性識別的影響

（1）熒光探針化合物對不同金屬離子的選擇性識別

為了測定三種熒光探針化合物對不同金屬離子的識別性能，分別選擇過渡金屬(Fe³⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Cd²⁺、Ag⁺)、堿金屬(K⁺、Na⁺)和堿土金屬(Ba²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺)為識別對象。如圖1-3所示，除細(xì)胞內(nèi)濃度較大的Na⁺、Mg²⁺和Ca²⁺的摩爾濃度為20 μM外，其余金屬離子及熒光探針化合物的摩爾濃度均為1 μM。結(jié)果顯示在分別加入空白熒光探針化合物溶液以及K⁺、Na⁺、Ag⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺離子時，體系在最大發(fā)射波長589 nm處幾乎沒有熒光，溶液無色，表明此時熒光探針化合物主要以螺環(huán)的形式存在，而在加入Hg²⁺后，體系在最大發(fā)射波長589 nm處熒光明顯增強(qiáng)，溶液顏色由無色變?yōu)樘壹t色，說明Hg²⁺能夠誘導(dǎo)熒光探針化合物中的電子發(fā)生轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致螺環(huán)結(jié)構(gòu)打開。實驗結(jié)果表明三種熒光探針化合物RBS1、RBS2和RBS3均對Hg²⁺有較高的識別能力。

（2）共存離子對三種熒光探針化合物檢測重金屬汞離子的影響

本實驗考察了其它金屬離子和Hg²⁺共存時對Hg²⁺測定的干擾，令三種熒光探針化合物的摩爾濃度均為10 μM，除Ca²⁺、Mg²⁺和Na⁺的摩爾濃度為0.50 mM(50 equiv)外，其它金屬離子的摩爾濃度均為0.1 mM(10equiv)，如圖4-6所示，黑色柱狀圖表示在探針分子與不同的競爭離子分別共存情況下的熒光強(qiáng)度，灰色柱狀圖表示分別加入1 equiv Hg²⁺后各體系內(nèi)的熒光強(qiáng)度。從圖表數(shù)據(jù)可以看出在共存離子(尤其是Ca²⁺、Mg²⁺和Na⁺的摩爾濃度為Hg²⁺摩爾濃度的50倍)存在的條件下，三種熒光探針化合物RBS1、RBS2和RBS3對其它金屬離子均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗干擾能力。因此，熒光探針化合物RBS1、RBS2和RBS3都是對Hg²⁺有較高選擇性的熒光增強(qiáng)型探針。

（3）三種熒光探針化合物檢測限的測定

不同Hg²⁺濃度條件下三種熒光探針化合物的發(fā)射光譜如圖7-9所示，在三種熒光探針化合物的最大發(fā)射波長(589 nm)處，隨著Hg²⁺濃度的逐漸增大，其最大熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，表明熒光探針化合物RBS1、RBS2和RBS3與Hg²⁺之間均存在良好的作用關(guān)系。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，如圖10-12所示，Hg²⁺濃度在1×10^-7-1×10^-6 mol/L范圍內(nèi)與熒光探針化合物RBS1、RBS2和RBS3的熒光強(qiáng)度均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，對應(yīng)的曲線方程式分別為y=60.297x+1.067、y=50.873x+12.201和y=20.036x-9.600，這表明三種熒光探針化合物可以在一定范圍內(nèi)定量檢測重金屬Hg²⁺的含量。

由公式LOD=3σ/K(σ為標(biāo)準(zhǔn)方差，n=6)可以算出其檢測限依次為0.6x10^-7 mol/L、0.76x10^-7 mol/L和1.65x10^-7 mol/L，由此可知苯環(huán)上鄰位取代基為供電子取代基時熒光探針對汞離子識別的靈敏度較差，苯環(huán)上鄰位取代基為吸電子取代基時熒光探針對汞離子識別的靈敏度較好，其靈敏度隨著吸電子強(qiáng)度增大而增高。

以上實施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)均落入本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。