用于防治花生根腐病的菌株WXX?2及菌劑的制作方法

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及用于防治花生根腐病害的菌株及其菌劑。
背景技術(shù)：
：花生是我國(guó)的重要油料作物，常年播種面積占油料作物總播種面積的35％左右。南方紅壤丘陵區(qū)是我國(guó)的花生主產(chǎn)區(qū)之一，但連作現(xiàn)象普遍?；ㄉB作重茬往往導(dǎo)致土傳真菌性病害加劇，其中根腐病是紅壤地區(qū)花生連作地發(fā)病最為嚴(yán)重的病害，是制約當(dāng)?shù)鼗ㄉa(chǎn)的重要因素。目前常用的治理方法為施用化學(xué)殺菌劑。化學(xué)菌劑或高效熏蒸劑可以有效殺滅土壤病原菌基數(shù)，暫時(shí)減輕病害發(fā)生，但同時(shí)也抑制了土壤有益菌，從長(zhǎng)遠(yuǎn)角度來(lái)看，化學(xué)滅菌將進(jìn)一步惡化土壤生態(tài)功能，不利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。目前針對(duì)土傳病害的生物防治方法的研究已有大量報(bào)道，生防菌劑的篩選主要從代謝產(chǎn)物促生、營(yíng)養(yǎng)位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)等角度開(kāi)展。但土傳病害的發(fā)生與病原菌的數(shù)量密切相關(guān)，因此降低土壤病原菌基數(shù)是抑制土傳病害發(fā)生的關(guān)鍵。因此，一般的生防菌劑只是從植物促生、微生物競(jìng)爭(zhēng)的角度控制土傳病害的發(fā)生，往往效果不穩(wěn)定。對(duì)此，理想的生防細(xì)菌劑型應(yīng)當(dāng)根據(jù)土傳病害的特點(diǎn)，從化學(xué)生態(tài)的角度對(duì)土壤病原菌持續(xù)進(jìn)行壓制，以達(dá)到防治病害效果。花生根腐病由半知菌亞門(mén)的鐮刀菌中的多個(gè)病原菌侵染所引起，包括尖鐮孢菌、茄類(lèi)鐮孢菌、粉紅色鐮孢菌等菌種。上述病原真菌的細(xì)胞壁是由有幾丁質(zhì)構(gòu)成。因此，針對(duì)這些病原菌的共性特點(diǎn)，研發(fā)有效菌劑，才能從根本上防治花生根腐病的發(fā)生。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種用于防治由鐮刀菌屬引起的花生根腐病的生防菌劑有效制備方法，從而有效降低花生根際鐮刀菌屬病原基數(shù)，達(dá)到抑制根腐鐮刀菌侵染花生根部的目的，本發(fā)明方法專(zhuān)化性強(qiáng)，效果穩(wěn)定。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)WXX-2，保藏編號(hào)為CGMCCNo.11540，所述菌株為革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌，菌株的16srDNA堿基序列如SEQIDNo：1所示。本發(fā)明還公開(kāi)了所述的菌株WXX-2在防治花生根腐病中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了菌株WXX-2在制備防治花生根腐病菌劑中的應(yīng)用。一種防治花生根腐病的菌劑，是所述短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)WXX-2菌株經(jīng)真菌菌絲體誘導(dǎo)強(qiáng)化，定殖于蘑菇粉中而制得，菌劑中WXX-2含量為1×109cfu/g以上。菌劑田間適用性強(qiáng)，可應(yīng)用于防治南方紅壤花生根腐病病害發(fā)生。本發(fā)明提供短小芽孢桿菌WXX-2菌劑制備技術(shù)為：1)滅活腐生真菌菌絲誘導(dǎo)體獲得：配置PD培養(yǎng)液(馬鈴薯20％(g/ml)，葡萄糖1.5％(g/ml)，蒸餾水1000ml)，并滅菌處理；然后接種被孢霉(Mortierellasp.)，置于恒溫?fù)u床黑暗培養(yǎng)(28℃、120rpm)，7d后，濾紙過(guò)濾獲得菌絲，蒸餾水洗滌2次，抽濾后高溫滅菌(121℃，20min)備用。2)配置抑菌性強(qiáng)化培養(yǎng)基：牛肉膏3％(g/ml)，蛋白胨8％(g/ml)，滅活腐生真菌菌絲體3％(g/ml)；3)菌株穩(wěn)定性強(qiáng)化：將所述菌株加入上述培養(yǎng)基中，發(fā)酵通氣量10L/m，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值5.5-6.5，發(fā)酵溫度為26℃，發(fā)酵時(shí)間72h，測(cè)得菌液OD值為1.0左右；4)所述菌劑制備：以無(wú)菌的蘑菇粉為基質(zhì)，將上述WXX-2抑菌性強(qiáng)化發(fā)酵液按5％比例接種到上述基質(zhì)，添加NaCl3％(g/ml)，放置恒溫箱(28℃)培養(yǎng)7d；經(jīng)過(guò)第二步對(duì)所述菌株對(duì)真菌菌絲寄生的強(qiáng)化，所述菌劑可高效定殖于含有蘑菇粉基質(zhì)中，所述菌量達(dá)到1×109cfu/g。最后獲得WXX-2抑菌性能強(qiáng)化的固體菌劑。本發(fā)明所述的菌劑的施用方法，是將所述菌劑與花生種子混拌，劑量10-15公斤/畝；或者是所述菌劑與有機(jī)糞肥混合，比例為1:10-1:15(重量比)。一起播于預(yù)先開(kāi)好的播種溝中；這樣一方面所述菌株可有效定殖于花生根際，另一方面可有效在花生根圈附近形成防護(hù)墻，達(dá)到抑制土傳病原菌侵染花生根部的目的。本發(fā)明可有效防治紅壤花生根腐病發(fā)生，防效達(dá)60％以上，具有田間防治效果穩(wěn)定、抑菌譜廣。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：菌株WXX-2產(chǎn)幾丁質(zhì)酶(降解鐮刀菌菌絲細(xì)胞壁)活性高，對(duì)尖孢鐮刀菌、茄腐鐮刀菌、枯萎病菌、絲核菌等引起花生根部病害的病原菌均有顯著降解能力；是用于防治花生根腐病病害的生防細(xì)菌，菌劑用量少、成本低、增產(chǎn)效果顯著?；ㄉ∈腔ㄉB作地中出現(xiàn)的主要病害，可引起花生根部腐爛、枯萎死亡，減產(chǎn)嚴(yán)重。如果把按上述方法制備的菌劑施入花生根際，可有效在花生根部形成抑制病原菌侵染的防護(hù)墻，降低花生根圍根腐病原菌基數(shù)，達(dá)到有效防治花生根腐病害的目的。附圖說(shuō)明圖1為短小芽孢桿菌WXX-2在培養(yǎng)基(含2％的幾丁質(zhì))上的生長(zhǎng)及透明圈。圖2為短小芽孢桿菌WXX-2對(duì)尖孢鐮刀菌的實(shí)驗(yàn)效果圖。注：圖中1為尖孢鐮刀菌，2為短小芽孢桿菌WXX-2圖3為短小芽孢桿菌WXX-2對(duì)茄腐鐮刀菌的實(shí)驗(yàn)效果圖。注：圖中1為茄腐鐮刀菌，2為短小芽孢桿菌WXX-2圖4為短小芽孢桿菌WXX-2對(duì)立枯絲核菌的實(shí)驗(yàn)效果圖。注：圖中1為立枯絲核菌，2為短小芽孢桿菌WXX-2圖5為短小芽孢桿菌WXX-2對(duì)病原菌真菌菌絲破壞的電鏡圖。本發(fā)明中的菌株WXX-2，所述菌株的分類(lèi)命名為：短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.11540，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏單位地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2015年10月26日。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例1：采集紅壤地區(qū)一塊連作花生地的花生根際土壤進(jìn)行相關(guān)的試驗(yàn)，其具體步驟為：(1)土樣處理：準(zhǔn)備滅菌的富集培養(yǎng)基(成份：細(xì)粉幾丁質(zhì)2.5g，MgSO4·7H2O0.5g，K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，蒸餾水1000ml)，分裝20ml于無(wú)菌三角瓶中，并取1.0g新鮮土樣加入三角瓶中，混勻，室溫下150r/min培養(yǎng)48h，得到富集的培養(yǎng)液。(2)涂布分離：吸取1mL濾液加入9.0mL無(wú)菌水，連續(xù)稀釋3次獲得稀釋度為10-4的樣品液，進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)寥老♂屢?.02mL涂布于平板分離培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4-7d，觀察、挑取產(chǎn)透明圈的細(xì)菌菌株。(3)培養(yǎng)與純化：挑取單個(gè)菌落在平板分離培養(yǎng)基上畫(huà)線純化培養(yǎng)，純化培養(yǎng)后得到的菌株作為供試菌株，接種到牛肉膏蛋白胨斜面暫時(shí)保藏。(4)活性篩選：采用搖瓶復(fù)篩方法進(jìn)行活性篩選，將分離的菌株接入培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基成分：細(xì)粉幾丁質(zhì)10g，蛋白胨5g，酵母膏5g，K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，MgSO4·7H2O0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，ZnSO40.01g，蒸餾水1000ml)，28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)3-4d，發(fā)酵液離心得到粗酶液，測(cè)定酶活力，然后選取產(chǎn)酶活力高的菌株進(jìn)行復(fù)篩(圖1)。復(fù)篩方法同上，測(cè)定酶活力，進(jìn)一步選取產(chǎn)酶活力高的菌株。(5)活性檢驗(yàn)：用分離純化的高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的細(xì)菌，以供試根腐病原菌為標(biāo)靶，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法直接測(cè)定菌株對(duì)病原真菌的抑制率。方法是首先將待篩選菌株活化，在PDA平板中心先接種病原真菌，用直徑5mm的打孔器在病原菌菌落邊緣打孔制成菌餅，并接到PDA平板中央，然后在培養(yǎng)皿四周距病原菌2.5cm左右接種待測(cè)的細(xì)菌菌株，每株細(xì)菌三個(gè)重復(fù)，28℃培養(yǎng)一周，觀察是否產(chǎn)生抑菌圈，用十字交叉法測(cè)定病原真菌菌落直徑，計(jì)算抑制率。(6)分類(lèi)地位的確定：提取供試菌株的DNA，進(jìn)行16SrRNA測(cè)序確定菌株的分類(lèi)地位。(7)通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)篩選出抗菌效果較好的一株菌株(WXX-2)，并擴(kuò)大培養(yǎng)，提取其DNA，通過(guò)16SrNA克隆測(cè)序確定了分類(lèi)地位，該菌株隸屬于厚壁菌門(mén)-芽孢桿菌綱-芽孢桿菌目-芽孢桿菌科-芽孢桿菌屬。并于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏時(shí)間為2015年10月26日，保藏編號(hào)為CGMCCNo.11540。保藏號(hào)為：CGMCCNO.11540的菌株的生物學(xué)特征為：該菌為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，需氧型，桿狀，微黃，細(xì)菌的大小范圍：2-3μm；該菌最適合生長(zhǎng)溫度為25-28℃，pH為5.5-8.5。實(shí)施例2：對(duì)各種根腐病原菌的抑菌實(shí)驗(yàn)利用保藏編號(hào)為CGMCCNO.11540的菌株進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)：首先將所述菌株活化，在PDA平板中心先接種病原真菌，用直徑5mm的打孔器在病原菌菌落邊緣打孔制成菌餅，并接到PDA平板中央，然后在培養(yǎng)皿四周距病原菌2.5cm左右接種待測(cè)的細(xì)菌菌株，每株細(xì)菌三個(gè)重復(fù)，28℃培養(yǎng)一周，觀察是否產(chǎn)生抑菌圈，用十字交叉法測(cè)定病原真菌菌落直徑，計(jì)算抑制率。所選病原菌為：立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.diath)，如圖2—圖4，發(fā)現(xiàn)所述菌株對(duì)上述土傳病原真菌均具有很好的抑菌作用(表1)。然后通過(guò)掃描電鏡對(duì)真菌菌絲進(jìn)行顯微觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲細(xì)胞原生質(zhì)收縮，出現(xiàn)空泡；菌絲畸形膨大成球狀；菌絲細(xì)胞壁破損、消解，原生質(zhì)外溢(圖5)。表1菌株離體抑菌率的測(cè)定實(shí)施例3：溫室活體防治實(shí)驗(yàn)在PDA培養(yǎng)基中活化花生根腐病原菌(茄腐鐮刀菌)28℃下培養(yǎng)7d，用無(wú)菌水分別沖洗培養(yǎng)基上病原菌孢子，菌液用已滅菌的濾紙過(guò)濾以除去菌絲，病原菌將濾液加適當(dāng)蒸餾水稀釋成孢子濃度為1×107個(gè)/mL的懸浮液，備用。將供試生防菌株加入不含真菌菌絲誘導(dǎo)體培養(yǎng)液(牛肉膏3％，蛋白胨8％)進(jìn)行液體發(fā)酵(26℃、72h、200rpm)，然后再以按5％比例接種滅菌的蘑菇粉基質(zhì)，放置恒溫箱(28℃)培養(yǎng)5d，作為菌劑A備用。同時(shí)按上述同樣方法，只是在液體培養(yǎng)基中添加滅活真菌菌絲誘導(dǎo)體(3％)進(jìn)行抑菌強(qiáng)化液體發(fā)酵，制備的菌劑B備用。采集的紅壤旱地農(nóng)田土壤，粉碎過(guò)篩后，與121℃，濕熱滅菌3h，以制備無(wú)菌土。按5％比例添加病原菌孢子液與無(wú)菌土拌勻，裝盆。然后按1:1比例將花生種子和菌劑A/B進(jìn)行混勻，待用。實(shí)驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理：CK1，滅菌土壤，不含病原菌和菌劑；CK2，向滅菌土壤添加茄腐鐮刀菌，獲得帶菌土壤；A，含有茄腐鐮刀菌的土壤+菌劑A；B，含有茄腐鐮刀菌的土壤+菌劑B。每處理10盆，栽種后定時(shí)澆水觀察發(fā)病情況。30d后調(diào)查花生根部發(fā)病程度。花生根腐病病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)可見(jiàn)癥狀；1級(jí)，黑腐面積占整個(gè)主根面積的5％以下；2級(jí)，黑腐面積占整個(gè)主根面積5％～25％；3級(jí)，黑腐面積占整個(gè)主根面積的25％～50％；4級(jí)，黑腐面積占整個(gè)主根面積的50％～75％；5級(jí)，黑腐面積占整個(gè)主根面積的75％以上。表2菌株WXX-2不同菌劑類(lèi)型處理對(duì)土傳病害的防治效果處理類(lèi)型病情指數(shù)防治效果(與CK2相比)CK10/CK266.40A31.253.0％B15.976.1％不同菌劑對(duì)花生生長(zhǎng)都具有很好的促進(jìn)作用，株高及根系發(fā)達(dá)程度均顯著高于對(duì)照組。防效測(cè)定結(jié)果表明，制備的2種菌劑針對(duì)花生根腐病的活體防效分別為53.0％、76.1％，其中菌劑B對(duì)土傳病菌的防效最好，顯著降低了腐爛褐變，防效非常顯著。實(shí)施例4：田間連作花生地實(shí)驗(yàn)將保藏編號(hào)為CGMCCNO.11540的菌株轉(zhuǎn)為連作花生田間試驗(yàn)，連續(xù)3年在田間自然栽培條件下驗(yàn)證該菌株制備的菌劑對(duì)連作花生土傳真菌性病害的抑制效果，具體如下：(1)供試土壤基本情況：試驗(yàn)安排于江西余江縣紅壤旱地花生種植區(qū)的連作障礙土壤，試驗(yàn)區(qū)常年根腐發(fā)病率在40％－70％，并隨連作年限延長(zhǎng)發(fā)病率不斷攀升，有的片區(qū)土壤已不能耕種，發(fā)病率高達(dá)80％以上。2012年試驗(yàn)選用了區(qū)域已連作5年的紅壤花生田塊進(jìn)行效果驗(yàn)證，2013年選用了已連作7年的花生田塊進(jìn)行效果驗(yàn)證，2014年選用了已連作4年的花生田塊進(jìn)行效果驗(yàn)證，每年分別設(shè)置4組對(duì)比試驗(yàn)，除試驗(yàn)處理差異外，保持試驗(yàn)區(qū)土壤條件及栽培管理技術(shù)統(tǒng)一。(2)試驗(yàn)處理與方法：試驗(yàn)共設(shè)12個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)長(zhǎng)10m，寬5m小區(qū)之間設(shè)1m溝距，隨機(jī)區(qū)組排列花生株距為18-20cm，行距為45-50cm，每穴播2粒種子。設(shè)4組實(shí)驗(yàn)，分別：CK:常規(guī)NPK施肥，在播種前基施尿素150kghm-2、氯化鉀225kghm-2、鈣鎂磷1125kghm-2；A:用含菌絲誘導(dǎo)體制備的菌劑B與花生種子拌勻(1:1)，常規(guī)NPK施肥量同CK處理；B：用含菌絲誘導(dǎo)體制備的菌劑B與腐熟豬糞按1:10混合，放置5d。使用量3000kghm-2，去除生物有機(jī)肥所含NPK量，補(bǔ)加常規(guī)化肥，施肥量同CK處理。C：50％多菌靈可濕性粉劑800倍，常規(guī)NPK施肥量同CK處理。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。(3)試驗(yàn)結(jié)果：連續(xù)3年對(duì)不同連作花生田塊的防效試驗(yàn)結(jié)果表明(表3)：WXX-2生防菌劑對(duì)連作花生地中的土傳真菌病害均具有較好的防治效果，其中本發(fā)明制備菌劑采用與花生拌種及與有機(jī)肥混施均對(duì)花生根腐病具有顯著防治效果。2012至2014年的對(duì)根腐病防效分別為63.2～70.2％、68.7～75.0％、50.9～70.3％，其防病和增產(chǎn)效果均明顯好于50％多菌靈可濕性粉劑處理?？傊景l(fā)明以保藏編號(hào)為CGMCCNO.11540的菌株制備的菌劑對(duì)抑制紅壤花生根腐病害的發(fā)生及蔓延具有較好的作用功效，且防治效果穩(wěn)定，是南方紅壤區(qū)花生根腐病的生物修復(fù)產(chǎn)品。表3WXX-2生防菌不同菌劑防治紅壤花生根腐病的田間防效及增產(chǎn)分析(2012年-2014年)當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3