乙?；讞钏豈annich堿衍生物及其用途的制作方法

本發(fā)明涉及乙?；讞钏豈annich堿衍生物、合成方法及應(yīng)用，尤其涉及該類化合物在制備腫瘤治療藥物中的潛在用途。
背景技術(shù)：
：腫瘤細胞和正常細胞具有不同的氧化還原機制，腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移需要大量耗氧，所以缺氧是實體瘤微環(huán)境的一個重要特征。實體瘤細胞生存必須依賴于低氧狀態(tài)下缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(HIF-1α)。HIF-1α與細胞增殖，血管生長，侵襲，轉(zhuǎn)移，凋亡和耐藥等密切相關(guān)。加州大學(xué)和斯坦福大學(xué)提出HIF-1α將成為實體瘤治療的最有效靶點，已成為當(dāng)前抗實體瘤藥物研究的熱點。(Nature，2015，524：298-300；Cell，2015，163：1288-1288.e1；NatureReviewsCancer，2012，12：9-22；NatureReviewsCancer，2003，3：721-732；NatureMedicine，2003，9：667-84；NatureReviewsDrugDiscovery，2003，2：1-13)既往發(fā)現(xiàn)對HIF-1α有抑制活性的抗癌藥物主要有拓撲異構(gòu)酶I抑制劑(拓撲替康)，長春新堿，雷帕酶素衍生物(依維莫司)，酪氨酸激酶靶向藥物等，但是毒副作用均較大。目前還沒有一個真正有效的靶向HIF-1α靶抑制劑。因此，找高效低毒的新型HIF-1α抑制劑類抗實體瘤藥物仍然是一個全新的挑戰(zhàn)。(MolecularCancerTherapeutics，2007，6：220-226)天然黃酮類化合物廣泛存在于許多水果，蔬菜和藥材中，具有抗血栓，抗炎抗變態(tài)免疫，抗病毒，抗腫瘤等多種生物活性，是一類通過細胞內(nèi)活性氧(ROS)調(diào)控的天然HIF-1α抑制劑。(EurJMedChem，2012，49：24-40)黃酮類化合物并不直接殺傷細胞，而是利用正常細胞和腫瘤細胞的氧化還原狀態(tài)的不同機制，通過對ROS調(diào)控，激活細胞內(nèi)凋亡通路，抑制HIF-1α和VEGF，從而選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡并抑制轉(zhuǎn)移。然而，由于黃酮類化合物溶解性差，廣泛的II相代謝，導(dǎo)致口服給藥產(chǎn)生較強的“肝腸外排效應(yīng)”，體內(nèi)生物利用度較低。因此，通過對天然黃酮結(jié)構(gòu)修飾，改善成藥性，具有重要的實用價值。(EurJPharmacology，2010，630：121-130)黃芩為唇形科黃芩屬多年生草本植物ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，黃芩的有效成分為黃酮類化合物主要成分為黃芩苷，其水解產(chǎn)物黃芩素(BA)抗增殖活性更強。(CancerTreatmentReviews，2009，35：57-68)通過ROS調(diào)控的HIF-1α抑制，從而選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，而不影響正常細胞(EurJPharmacology，2010，630：121-130；NeuroscienceLetters，2008，444：264-269)。以BA為先導(dǎo)化合物進行結(jié)構(gòu)修飾當(dāng)屬黃芩素Mannich堿衍生物。CN1427003A公開了具有抑制蛋白激酶C活性的黃芩素8-位取代的甲胺類衍生物及其制備方法。CN200910140275.4和US8377895B2公開了以數(shù)十種天然黃酮苷元為先導(dǎo)化合物，經(jīng)過Mannich縮合反應(yīng)半合成出百余種黃酮Mannich堿系列衍生物。其中，黃芩素哌啶醇(BA-j)最為優(yōu)良。BA-j是一種CDK1選擇性抑制劑。BA-j與細胞毒類藥物截然不同，細胞毒類藥物在殺傷腫瘤細胞同時也傷害正常細胞。BA-j是利用正常細胞和腫瘤細胞的氧化還原狀態(tài)的不同機制，通過對ROS的調(diào)控，從而選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞和被激活的淋巴細胞凋亡，而不影響正常細胞。(ScientificReports，2015，5：13626；Anti-CancerAgentsinMedicinalChemistry，2016，16：914-924；Fitoterapia，2015，107：36-34；Bioorganic&MedicinalChemistry，2008，16：7127-7132；RSCAdvances，2015，5：89818-89826)BA-j的logP值較低，蛋白結(jié)合率較高，親合力較強，主要分布在血液中，因此對血液系統(tǒng)異常(如白血病，艾滋病以及腫瘤轉(zhuǎn)移)引起的變態(tài)免疫癥狀有良好的消除作用。白楊素也是一種具有廣泛藥理活性的天然黃酮類化合物，是蜂膠的主要成分之一，具有抗腫瘤、放療增敏、抑制芳香酶活性、抗炎、抗氧化、防治心腦血管疾病等多種藥理作用。白楊素可通過HIF-1α抑制導(dǎo)致VEGF抑制，阻止新生血管的生成，從而選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡并抑制實體瘤轉(zhuǎn)移。(MolecularCancerTherapeutics，2007，6：220-226)因此，通過對白楊素結(jié)構(gòu)進行有效修飾，以獲得高效低毒的新型候選抗實體瘤藥物具有重要意義。Flavopiridol是由Aventis公司全合成了第一個泛CDKs抑制劑，屬于白楊素有機胺衍生物，為氯代白楊素甲基哌啶醇，能顯著提高化療藥物的敏感性，同時還發(fā)現(xiàn)可阻礙艾滋病病毒HIV-1在細胞內(nèi)的增殖，顯示了良好的抗癌和艾滋病應(yīng)用前景。在化療后續(xù)應(yīng)用，能有效提高化療藥物的敏感性，給癌癥和艾滋病的治療帶來了新的理念與希望。然而，F(xiàn)lavopiridol是一種泛CDKs抑制劑。溶解度較差，靜脈點滴穩(wěn)態(tài)血漿濃度較低(0.27uM)，口服給藥易被葡萄糖醛酸化，導(dǎo)致較強的“肝腸外排效應(yīng)”，生物利用度低等問題。進入組織細胞內(nèi)的藥物轉(zhuǎn)運困難，不容易被降解,可產(chǎn)生強烈的細胞毒效應(yīng)，引起嚴(yán)重的分泌性腹瀉等不良反應(yīng)。因此，成藥性的不夠優(yōu)良，使其在應(yīng)用受到了限制。(Blood，2009，113：2637-2644；LifeSciences，1998，62：1861-1873；InvestNewDrugs，2012，30:629-638)P276-00是由NicholasPiramal公司全合成了一種CDK4，1，9的選擇性抑制劑，屬于白楊素有機胺衍生物，為白楊素甲基脯氨醇?？拱┗钚院统伤幮詢?yōu)于Flavopiridol，對正常人肺成纖維細胞WT-38和MRC-5幾乎無影響，已進入III臨床期。與Flavopiridol相比，幾乎無腹瀉等不良反應(yīng)。但是也存在類似的成藥性的不夠優(yōu)良等問題。(MolecularCancerTherapeutics，2007，6：918-925，918-925；Leukemia，2009，23：961-970)中國科學(xué)院上海有機所半合成了一種白楊素Mannich堿衍生物，為6-嗎啉亞甲基-白楊素。(Synlett，2006，(8)：1225-1229)江蘇工業(yè)學(xué)院全合成了七種8-取代白楊素Mannich堿衍生物。(沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2010，27：448-452)大連理工大學(xué)半合成了三種雙取代白楊素Mannich堿衍生物，為雙環(huán)烷仲胺醇亞甲基白楊素。(Anti-CancerAgentsinMedicinalChemistry，2016，16(2)：doi:10.2174/1871520615666150928114425)上述白楊素衍生物的抗癌活性有所提高，但是成藥性還不十分理想。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是希望通過對白楊素的全新的結(jié)構(gòu)修飾，尋找有別于現(xiàn)有技術(shù)的、高效低毒的新型HIF-1α抑制劑類抗實體瘤藥物本發(fā)明的解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案：本發(fā)明所公開的乙?；讞钏豈annich堿衍生物，具有通式I的結(jié)構(gòu)：通式I中，R1和R2各自獨立地選自乙酰基和有機仲胺亞甲基，R1與R2中有且只有一個是乙?；?。具體實施方式之一，所述的通式I中，R1是乙酰基；R2是有機仲胺亞甲基，選自二甲胺基亞甲基，吡咯烷亞甲基，哌啶亞甲基，嗎啉亞甲基，硫嗎啉亞甲基，4`-甲基哌嗪亞甲基，哌嗪亞甲基，4`-羥乙基哌嗪亞甲基，脯氨醇(+)亞甲基，4`-哌啶醇亞甲基，4`-哌啶酮亞甲基，噻吩并[3，2-c]吡咯烷亞甲基和脯氨醇(-)亞甲基。R2進一步優(yōu)選嗎啉亞甲基，硫嗎啉亞甲基，4`-甲基哌嗪亞甲基，4`-羥乙基哌嗪亞甲基，脯氨醇(+)亞甲基或4`-哌啶醇亞甲基。R2最優(yōu)選4`-哌啶醇亞甲基。另一具體的實施方式，所述的通式I中，R2是乙?；籖1是有機仲胺亞甲基，選自二甲胺基亞甲基，吡咯烷亞甲基，哌啶亞甲基，嗎啉亞甲基，硫嗎啉亞甲基，4`-甲基哌嗪亞甲基，哌嗪亞甲基，4`-羥乙基哌嗪亞甲基，脯氨醇(+)亞甲基，4`-哌啶醇亞甲基，4`-哌啶酮亞甲基，噻吩并[3，2-c]吡咯烷亞甲基和脯氨醇(-)亞甲基。R1進一步優(yōu)選嗎啉亞甲基，硫嗎啉亞甲基，4`-甲基哌嗪亞甲基，4`-羥乙基哌嗪亞甲基，脯氨醇(+)亞甲基或4`-哌啶醇亞甲基。R1最優(yōu)選4`-哌啶醇亞甲基。本發(fā)明進一步提供上述乙?；讞钏豈annich堿衍生物的合成方法，是乙?；讞钏?、有機仲胺類化合物和甲醛溶液在有機溶劑中經(jīng)Mannich縮合反應(yīng)而得；其中：所述的有機仲胺類化合物選自二甲胺，吡咯烷，哌啶，嗎啉，硫嗎啉，4-甲基哌嗪，哌嗪，4-羥乙基哌嗪，脯氨醇(+)，4-羥基哌啶，4`-哌啶酮，噻吩并[3，2-c]吡咯烷和脯氨醇(-)。所述的有機溶劑選自乙醇，乙腈，四氫呋喃，二氧六環(huán)，乙酸乙酯，乙酸丁酯，乙酰丙酮，乙酰乙酸乙酯和甲基異丁酮。具體實施方式之一，上述方法中的乙酰基白楊素是以2，4，6-三羥基苯乙酮為起始原料，與苯甲酰乙酸乙酯熱縮合得到。(J.Chem.Soc.PerkinTransI，1973，503-505)經(jīng)分離后分別的得到6-乙?；讞钏睾?-乙?；讞钏?。具體地，以6-乙?；讞钏剡哙ご?CH-j)和8-乙酰基白楊素哌啶醇(CH8-j)為代表，上述合成方法的合成路線可表示為：上述本發(fā)明的乙?；讞钏豈annich堿衍生物是一種細胞內(nèi)活性氧(ROS)調(diào)控的缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)抑制劑，利用正常細胞和腫瘤細胞內(nèi)氧化和還原的不同機制，通過捕獲細胞內(nèi)氧自由基，特異性提高腫瘤細胞內(nèi)過氧化氫水平，靶向氧化降解HIF-1α和氧化激活Caspases，激活細胞內(nèi)凋亡通路，從而選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡并抑制增殖和轉(zhuǎn)移。經(jīng)實驗證明，其中CH-j的成藥性最為優(yōu)良，具有更加優(yōu)異體內(nèi)分布特性，對實體瘤具有良好的選擇性。CH-j選擇性誘導(dǎo)腫瘤凋亡活性比BA-j強一倍，對實體瘤選擇性比BA-j更強，對血液系統(tǒng)幾乎不無影響。CH-j的藥代動力學(xué)性質(zhì)獨特，高效低毒，作用機理明確。CH-j的且全合成原料來源豐富，工藝簡捷，純度高，成本低，有望開發(fā)成為對實體瘤更有效的ROS調(diào)控的HIF-1α抑制劑類新型抗癌藥物?；诖?，本發(fā)明再一方面提供上述乙?；讞钏豈annich堿衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。尤其是在抗實體瘤藥物制備中的應(yīng)用。技術(shù)效果本發(fā)明說明書所用縮寫：6-乙?；?8-哌啶醇亞甲基-白楊素(CH-j)；對照品8-哌啶醇亞甲基-黃芩素(BA-j)。本實施例中化合物編號的規(guī)則與本說明書中其余部分保持一致，如無特別說明，當(dāng)述及“參測化合物”時，是指按照本發(fā)明的方法合成、確定結(jié)構(gòu)的參與測試的乙?；讞钏豈annich堿衍生物。對照品是8-哌啶醇亞甲基-黃芩素(BA-j)。(1)溶解度與logP篩選參測化合物溶解度與logP篩查結(jié)果見表1。其中，CH-j在37。C正辛醇/水中l(wèi)ogP為1.63(約是BA-j0.69的2倍)，在37。C正辛醇層中的溶解度2421μ421度(約是BA-j377μ377度的6倍多)，水層中的溶解度56μ6層中的(BA-j77μ7-j)。由于CH-j屬于酸堿兩性化合物，因此在pKa5.3。在37。C的0.1M鹽酸溶液(pH1.2)，0.05M醋酸鈉-醋酸緩沖溶液(pH4.5)，磷酸鹽緩沖溶液(PBSpH6.8)中穩(wěn)定。溶解度分別為574，9800，30(73μ300別為沖溶。溶出度分別為100％，100％，6.8％，屬于pH依賴快速釋放型。提示本品可制成固體劑型口服給藥。綜合分析，在參測化合物中，CH-j的溶解度與logP比較合適，推測CH-j更容易進入組織細胞內(nèi)。表1.參測的乙?；讞钏豈annich堿衍生物溶解度與logP(2)CH-j穩(wěn)定性按國家藥品食品藥品監(jiān)督管理局藥物穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則試驗，CH-j原料藥對高溫試驗，高濕度試驗，強光照射試驗下均穩(wěn)定。CH-j原料藥加速試驗和長期穩(wěn)定性試驗均穩(wěn)定。在模擬人工胃液，腸液和細胞內(nèi)液中穩(wěn)定。(3)CH-j對細胞內(nèi)H2O2水平的影響篩選體外培養(yǎng)細胞給CH-j3.5h，加入H2O2選擇性PF1熒光探針0.5h后檢測細胞內(nèi)H2O2濃度，并進行熒光呈像，結(jié)果見圖1。體外培養(yǎng)細胞給藥3.5h，加入NaOCl選擇性BODTPY熒光探針0.5h后檢測細胞內(nèi)NaOCl濃度，并進行熒光呈像，結(jié)果CH-j未呈現(xiàn)熒光，而給羥基喜樹堿對照細胞呈現(xiàn)熒光。(未附圖)圖1-1結(jié)果顯示，在參測化合物中，4-哌啶醇取代基對腫瘤細胞內(nèi)H2O2水平的影響最為顯著。據(jù)析這是由于4-哌啶醇是一種強效抗氧化劑，可捕獲3個以上的.O2-，并被氧化釋放3個H2O2。圖1-2和4結(jié)果顯示，CH-j可提高腫瘤BGC-823和HepG2細胞內(nèi)H2O2的水平，在低劑量范圍呈現(xiàn)明顯的濃度依賴關(guān)系，當(dāng)CH-j達到5-10μM后，釋放出約4倍量H2O2，達到最大值35-45μM，繼續(xù)提高CH-j劑量H2O2反而呈現(xiàn)明顯的濃度負依賴關(guān)系。推測這是因為此水平的H2O2與Fe++結(jié)合，產(chǎn)生羥基自由基(.OH-)，氧化降解HIF-1羥以解除凋亡抑制，細胞開始大量凋亡。圖1-3和4結(jié)果顯示，CH-j對人正常PBMCs和被激活的淋巴細胞內(nèi)H2O2的水平均在10μM以下，無明顯的濃度依賴關(guān)系，細胞均未凋亡和壞死。(BA-j對人正常人肝細胞Liver和PBMCs細胞內(nèi)H2O2的水平均在10μM以下，無明顯的濃度依賴關(guān)系，細胞均未凋亡和壞死。但是對被激活的淋巴細胞內(nèi)H2O2的水平呈現(xiàn)明顯的濃度依賴關(guān)系，細胞大量凋亡而未壞死。)結(jié)果顯示，在人正常PBMCs和被激活的淋巴細胞內(nèi)10μM的H2O2水平是可以耐受的。結(jié)果表明，CH-j可選擇性提高實體瘤細胞內(nèi)H2O2的水平，幾乎不影響人正常PBMCs和被激活的淋巴細胞，因此，CH-j對實體腫瘤細胞的選擇性比血液細胞更強。這是由于CH-j的logP大，與血漿蛋白結(jié)合率和結(jié)合力小，導(dǎo)致與血液細胞的結(jié)合力較弱，而與組織細胞的結(jié)合力較強。因此，CH-j更適用于實體瘤。(BA-j的logP小，與血漿蛋白結(jié)合率和結(jié)合力大，導(dǎo)致與血液細胞的結(jié)合力較強，而與組織細胞的結(jié)合力較弱，因此，相對而言BA-j更適用于血液系統(tǒng)。(4)體外抗腫瘤細胞增殖活性篩選體外人胃BGC-823抗腫瘤活性初篩(MTT，48h)結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，6種參測化合物在1.25-20μM范圍內(nèi)，均呈現(xiàn)明顯的濃度依賴關(guān)系，抗增殖活性強度類似，無顯著差異。體外CH-j對5種腫瘤細胞復(fù)篩結(jié)果見表2。CH-j抗增殖活性強度IC506.1μM(2.5μg/m1)。比白楊素IC5025μM)強4倍，比BA-jIC5012.3μM，4.7μg/m1強1倍。依據(jù)中國國家食品藥品監(jiān)督管理局《抗腫瘤藥物藥效學(xué)指導(dǎo)原則》規(guī)定，當(dāng)合成化合物或植物提取純品的IC50＜10μg/m1或植物粗提物的IC50＜20μg/m1時，視為體外具有抗腫瘤活性。表2.CH-j體外抗腫瘤細胞活性復(fù)篩(MTT，48h)IC50μMBA-jCH-jMCF-710.6±0.305.7±1.24H-46013.7±1.836.5±1.13BGC-82312.3±1.736.3±1.13PC-312.8±2.066.2±1.16HepG215.7±1.309.0±1.50(5)CH-j誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡Hoechst33258是與DNA特異結(jié)合的活性熒光染料，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)，紫外光激發(fā)時發(fā)射藍色熒光?；罴毎l(fā)出均勻熒光，凋亡細胞由于染色質(zhì)固縮，細胞核致密濃染而呈明亮的藍色熒光。用CH-j于0，2.5，5，10μM條件下處理人胃BGC-823腫瘤細胞24h，Hoechst33258熒光染色，細胞形態(tài)變化如圖3-1所示。隨著藥物濃度的增加，細胞數(shù)量明顯減少，而且出現(xiàn)細胞核發(fā)出致密熒光，核膜邊緣可見凋亡小體的凋亡細胞，凋亡細胞比例呈劑量依賴性增長。CH-j與細胞毒類藥物羥基喜樹堿完全不同，后者在低劑量時呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)，而在高劑量時腫瘤細胞呈現(xiàn)壞死狀態(tài)。結(jié)果表明，CH-j能夠顯著誘導(dǎo)BGC-823腫瘤細胞凋亡。PI特異性結(jié)合于DNA，熒光強度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系。細胞固定后用PI染色，采用流式細胞儀對細胞中的DNA含量進行定量分析。由于不同細胞周期中DNA的含量不同，可以由此判斷藥物作用于細胞后細胞周期的變化。細胞凋亡時在細胞和分子水平上發(fā)生了許多的特征性改變，其中細胞核的改變最具特征性。由于凋亡細胞核酸內(nèi)切酶活化，DNA降解，細胞DNA減少，因而可在GO/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體凋亡峰(sub-G1)，為185Da整數(shù)倍DNA裂解峰，無小于185Da的裂解峰。用CH-j處理BGC-823腫瘤細胞24h，PI熒光染色結(jié)果如圖3-2所示。CH-j能劑量依賴性地使BGC-823細胞阻滯于G1,G2期，使凋亡峰的比例呈劑量依賴性增長。另外，高濃度的藥物還可以使S期細胞比例有所減少。結(jié)果表明，CH-j夠使腫瘤細胞周期被阻滯于G1和G2/M期，并使S期的細胞數(shù)目減少，能夠顯著誘導(dǎo)BGC-823細胞凋亡。細胞發(fā)生凋亡時會有一系列的形態(tài)學(xué)特征性改變，其中，質(zhì)膜的改變是早期凋亡的特征之一。細胞發(fā)生凋亡時，胞膜磷脂酞絲氨酸(PS)從胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，暴露于細胞外表面。AnnexinV是一個Ca2+依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，它與磷脂酞絲氨酸有高度親和力，可以與細胞外暴露的磷脂酞絲氨酸特異性結(jié)合。然而，PS轉(zhuǎn)移到細胞膜外并不是凋亡所獨特的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。PI是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染色。將AnnexinV-FITC與PI匹配使用，在流式細胞儀上靈敏地檢測凋亡和壞死細胞的比率。用CH-j處理BGC-823腫瘤細胞24h，AnnexinV-FITC與PI雙熒光染色結(jié)果如圖3-3所示。CH-j能劑量依賴性地使BGC-823細胞凋亡。當(dāng)用CH-j處理24h后，早期壞死細胞無明顯變化，早期凋亡細胞的比例和晚期凋亡細胞比例明顯上升。由此可見，早期凋亡的細胞隨著藥物濃度的增加而顯著增加。晚期凋亡細胞增加的相對較少。而細胞毒類藥物HCPT是在低劑量時可誘導(dǎo)細胞凋亡，高劑量可使早期細胞發(fā)炎壞死。結(jié)果表明，與細胞毒類藥物不同，CH-j抗增殖活性主要是通過誘導(dǎo)BGC-823腫瘤細胞凋亡來實現(xiàn)的，而并不直接殺傷細胞導(dǎo)致細胞發(fā)炎壞死。Caspases為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinylaspartatespecificproteinase)，是一組存在于細胞質(zhì)中具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白酶，與細胞凋亡密切相關(guān)，并參與細胞的生長、分化與凋亡調(diào)節(jié)。Caspases是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵酶，在介導(dǎo)細胞凋亡中，幾乎所有的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上都有Caspase酶的參與，即共有途徑。Caspases活性位點為半胱氨酸巰基，是以非活性pro-Caspases狀態(tài)存在的，它對于H2O2比較敏感，當(dāng)被H2O2氧化為-S-S-二聚體形式時，就被激活轉(zhuǎn)變成有活性的Caspase-S-S-Caspase，誘導(dǎo)凋亡活性被連續(xù)激活放大。Caspase-8為誘導(dǎo)細胞凋亡的早期啟動者，caspase-3為最終晚期執(zhí)行者。如pro-caspase-9巰基游離，與磷酸化survivin結(jié)合，抑制細胞凋亡，促進分裂。當(dāng)pro-caspase-9巰基被H2O2氧化成-S-S-二聚體形式，與磷酸化survivin分離，抑制細胞分裂，誘導(dǎo)細胞凋亡。H2O2可直接氧化激活Caspas，從而選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，減少損害正常細胞。用CH-j處理BGC-823腫瘤細胞24h后，Caspase-3，8，9檢測結(jié)果見圖3-4，C。CH-j在0-10μM在范圍內(nèi)激活Caspase-3，8，9均呈劑量依賴性的上升趨勢，繼續(xù)提高CH-j劑量活性不再呈上升趨勢。結(jié)果表明，CH-j選擇性誘導(dǎo)BGC-823腫瘤凋亡與H2O2氧化激活caspase-3，8，9有關(guān)。(6)CH-j對腫瘤細胞內(nèi)HIF-1影響HIF-1α抑制主要位點有：C800Cys-SH被H2O2和.OH-氧化；P402和P564Pro-NH被PHD羥基化，或被.OH-氧化；K532和T796被磷酸化。K532被乙酰化。HIF-1被第一活性位點位于C800半胱氨酸巰基(Cys-SH)，第二不可逆以活性位點位于P402和P564脯氨酸氨基(Pro-NH)。在低氧狀態(tài)下，脯氨酸羥化酶(PHD)失活，富半胱氨酸巰基蛋白(p300-SH/CBP使HIF-1S具有活性。在正常氧狀態(tài)下，脯氨酸羥化酶將HIF-1狀P402和P564羥基化為Pro-NOH而失活。HIF-1OC800Cys-SH對于H2O2比較敏感，H2O2將Cys-SH被氧化為Cys-SOH暫時失去活性。在缺氧狀態(tài)下，Cys-SOH又可被p300-SH還原為活性Cys-SH。在高水平H2O2狀態(tài)下，H2O2與Fe2+形成的羥基自由基(.OH-)，將Pro-NH化為Pro-NOH，將Cys-SOH氧化為Cys-SO2H，形成的HON＝HIF-1α-SO2H迅速被泛素-蛋白酶途徑降解。HIF-1β不以半胱氨酸為活性中心，因此不受H2O2和.OH-影響。將人胃BGC-823腫瘤細胞用0，2.5，5，10μMCH-j處理培養(yǎng)1小時，再繼續(xù)加入0.2μM胰島素，培養(yǎng)24小時，收集細胞，裂解。用免疫印跡法測定HIF-1α，HIF-1β結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，CH-j以劑量依賴的方式抑制HIF-1α的表達，而不影響HIF-1β的表達。結(jié)果表明，CH-j是一種HIF-1α選擇性抑制劑，從而可選擇性誘導(dǎo)實體瘤細胞凋亡并抑制轉(zhuǎn)移。(7)CH-j特殊安全性按國家藥品食品藥品監(jiān)督管理局藥物特殊安全性試驗研究指導(dǎo)原則試驗，0.2％CH-j的葡萄糖注射液，按刺激性，過敏性和溶血性特殊安全性評價方法試驗，除對眼角膜有發(fā)熱刺激性外，其他均為呈陰性。符合注射或外用給藥要求。(8)CH-j蛋白結(jié)合率與可逆結(jié)合率藥物與血漿蛋白結(jié)合一般是可逆的，親和力強度是由藥物-蛋白復(fù)合物可逆結(jié)合率決定的，只有游離的藥物才能夠通過脂膜向組織擴散。通過對藥物結(jié)構(gòu)的修飾，適當(dāng)提高藥物-蛋白復(fù)合物可逆結(jié)合率，可提高靶部位藥物的作用強度。采用平衡透析法測定CH-j蛋白結(jié)合率為86％(BA-j92％)，均呈現(xiàn)非濃度依賴性。目前，藥物蛋白復(fù)合物解離常數(shù)的評價還沒有統(tǒng)一的方法。本發(fā)明用80％甲醇溶液從藥物與蛋白混合溶液中提取藥物，用提取率評價可逆結(jié)合率。將藥物血漿與甲醇按體積比1:4混合，離心，分取上清液，測定藥物提取率。測定結(jié)果如表3:CH-j藥物提取率(可逆結(jié)合率)為90％，而BA-j提取率僅為20％。表3.CH-j和BA-j蛋白結(jié)合率與可逆結(jié)合率比較多酚羥基構(gòu)成的酸性部與則白蛋白結(jié)構(gòu)中賴氨酸堿性位點結(jié)合。由于CH-jC6乙?；媪薆A-jC6位酚羥基，削弱了酸性部分與白蛋白堿性位點的親和力，使CH-j蛋白復(fù)合物可逆結(jié)合率明顯大于BA-j。表明CH-j細胞內(nèi)外滲透性良好，主要分布于全身體，因此，更容易進入組織細胞內(nèi)，將對實體瘤將更加有效。作為對比的BA-j則主要分布于血液，對血液系統(tǒng)癌癥以及免疫系統(tǒng)更加有效。(9)CH-j藥物動力學(xué)色譜條件與系統(tǒng)適用：以十八烷基鍵和硅膠為填充劑(耐酸性高柱效C18色譜柱，5譜柱，4.6*150mm)，以乙腈-甲醇-水-甲磺酸(體積比25：20：55：0.15)為流動相。紫外檢測波長為283nm，流速為1ml/min，進樣體積為20μl。理論塔板數(shù)按CH-j色譜峰計算不少于2000。樣品溶液：將獼猴用氟烷麻醉后，安插導(dǎo)尿管?？诜﨏H-j為5mg/kg，在不同時間采集尿液，冰凍保存。取尿液，按1:4(v:v)加入甲醇，離心后分取上清液測定。對照品溶液：CH-j甲醇溶液5μg/ml。結(jié)果顯示：獼猴口服CH-j(5mg/kg)尿藥濃度-時間曲線測定結(jié)果見圖5。CH-j的logP較大，脂溶性強，體內(nèi)吸收分布很快，尿藥濃度-時間曲線符合典型的二室模型。tmax11.3h，Cmax126.4μM；再分布期tmax29h，Cmax213.2μM(>IC506.1μM)，隨后尿液中的CH-j濃度隨時間緩慢下降，24h已低于3μM。消除相半衰期t1/2(β)為6.2h。曲線下面積AUC0-∞為20.4μM*h。表觀分布容積(Vd)為42L，主要分布于全身體液(BA-jVd為12.6L，主要分布于血液，見Fitoterapia，2015，107：36-34)。獼猴口服CH-j與BA-j藥物動力學(xué)參數(shù)比較結(jié)果見表5。結(jié)果表明：CH-j比BA-j更容易分布于組織細胞內(nèi)，推測對實體瘤將更加有效。表5.獼猴口服CH-j與BA-j藥物動力學(xué)參數(shù)比較藥物CH-jBA-j口服劑量mg/kg55藥物濃度達峰時間Tmaxh1.32.0消除相半率期t1/2βh6.24.2藥物最大濃度CmaxμM26.425.4曲線下面積AUC0-∞μM*h20.471.5容量因子VdL42.012.6(10)CH-j藥物代謝學(xué)CH-j在獼猴主要代謝物為M179.06和M152，其次M264.03，其他微量(<10％)。M179：將尿液加4倍量甲醇，離心，去上清液，以甲醇-水-甲酸(35：65：0.2)為流動相，用C18柱色譜HPLC-UV分離制備得到M179組分，用氨水中和，蒸出溶劑，80℃減壓干燥，得到無色結(jié)晶。MSm/z180[M+H]+,152[M+H-CO]+,136[M+H-CO2]+,178[M-H]-,187[M+Cl-HCN]-。HR-MS(API-ESI)m/z:[M+H]+180.0653(計算值180.0660)，分子式C9H9NO3，平均分子量179.06。IR(KBr,cm-1)：3146(CH3),1401(νC＝N),1239,1206,1195(νC-O),1059(νC-N),784(δPH-H),562,536。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ:7.46(s，Ph-H)，3.86(d，J＝5.2Hz,N-CH2),2.33(CH3)；此外，7.87-7.85(d，N＝CH),7.54-7.52(d，N-CH＝),7.49-7.15(d,Ph-H),2.00(m，NH)為分離后形成的烯醇互變異構(gòu)體共振峰。推測結(jié)構(gòu)為2-Methyl-3-aza-bicyclo[3.3.1]nona-1(8),2,5(9),6-tetraene-6,8,9-triol。M264：LC-MSm/z265[M+H]+,249[M+H-O]+，271[[M-O+Na]+，263[M-H]-,283[M-O+Cl]-；MSm/z263[M-H]-，167[M-H-SO4]-為M264丟失的96Da(SO4)，表明結(jié)構(gòu)中存在硫酸酯基(-OSO3H)。推測結(jié)構(gòu)為3,5-dihydroxy-2-(1-hydroxyethyl)-6-methylphenylhydrogensulfate。M152：LC-MSm/z153[M+H]+；MSm/z187和189[M+Cl]-。推測結(jié)構(gòu)為2,6-二羥基苯乙酮。主要代謝途徑：(I)堿式降解：CH-j捕獲2分子.O2-，脫去環(huán)二烯丁酮，被氧化降解為被氧化降解為氨甲基黃烷酮醇類活性中間代謝物M343，同時釋放2分之H2O2。C8-CH2NH2與CH3C＝O發(fā)生分子內(nèi)加成為希夫氏堿，再捕獲3分子.O2-，再被水解氧化重排脫去苯甲酸，同時釋放2分子H2O2和2分子CO2，降解為代謝物M179。(II)中性降解：CH-j捕獲3分子.O2-，同時釋放3分子H2O2，脫去吡啶酮-4，其中脫下的1分子H2O加成到C2-C3間的雙鍵上，被氧化降解為黃烷酮醇類活性中間代謝物M344。再捕獲4分子.O2-，再被水解氧化重排脫去苯甲酸，同時釋放2分子H2O2和3分子CO2，降解為代謝物M152。(III)酸性降解：CH-jC7位羥基成硫酸酯，并捕獲2分子.O2-，同時釋放2分子H2O2，脫去吡啶酮-4，其中脫下的1分子H2O加成到C2-C3間的雙鍵上，被降解為硫酸化甲基黃烷酮醇類活性中間代謝物M408。再捕獲2分子.O2-，再被水解氧化重排脫去苯甲酸，同時釋放1分子H2O2和2分子CO2，降解為代謝物M264。白楊素口服給藥，主要為C7-葡萄糖醛酸化代謝物和硫酸化代謝物，“肝腸外排效應(yīng)”大于95％，僅有微量進入細胞內(nèi)捕獲.O2-和釋放H2O2。白楊素有機胺衍生物Flavopiridol口服給藥，主要為C7-葡萄糖醛酸化代謝物，其次為C5-葡萄糖醛酸化代謝物，僅有少量進入組織細胞內(nèi)。而進入組織細胞內(nèi)部分由于有機胺取代基不能被代謝，因而產(chǎn)生強細胞毒性。CH-j是在白楊素結(jié)構(gòu)C6引入吸電子基團CH3C＝O，C8引入哌啶醇亞甲基形成的乙酰基白楊素Mannich堿衍生物，通過乙?；捕笠约斑哙ご紒喖谆鶎Π讞钏氐幕罨?yīng)，使口服給藥葡萄糖醛酸化“肝腸外排效應(yīng)”被顯著抑制(<1％)。白楊素是一種抗氧化劑，可捕獲.O2-，同時被氧化釋放H2O2。哌啶醇是一種強效抗氧化劑，可捕獲多分子.O2-，同時被氧化釋放多分子H2O2。因此，CH-j可捕獲多分子.O2-并同時釋放多分子H2O2的被氧化分解代謝，或被氧化硫酸化降解。由此可見，CH-j，通過增強I相代謝，抑制II相無效代謝，從而可抑制“肝腸外排效應(yīng)”，有效地提高生物利用度。CH-j的代謝途徑與CYP3A4無關(guān)。這種捕獲.O2-和釋放H2O2的代謝過程，可選擇性提高腫瘤細胞內(nèi)H2O2濃度，與誘導(dǎo)其凋亡密切相關(guān)。(ScientificReports，2015，5：13626；Fitoterapia，2015，107：36-34)(11)CH-j組織分布CH-j100mg/kg大鼠靜脈給藥(i.v.)或口服給藥(p.o.)2h時CH-j組織分布結(jié)果見圖6。CH-j在血液，尿液，膽汁和各組織中均可檢測到原型藥物和代謝物M179.06。CH-j口服給藥在胃中濃度教大，約比其他組織高1倍。表明CH-j主要在胃部吸收，并且有較高的藥物濃度，對各組織均無特殊的親和力，能夠通過血腦屏障。與靜脈給藥比較，口服給藥吸收完全，生物利用度接近100％。藥物進入血液系統(tǒng)后，由于logP較大，血漿蛋白結(jié)合率適中，滲透性較強，原形藥物很快進入各組織細胞內(nèi)，而對血液中被激活的淋巴細胞幾乎無親和性。而作為對比的BA-j僅在血液和尿液中可檢測到原型藥物，而在各組織中均檢測不到原型藥物，僅可檢測到代謝物M179。表明主要在胃腸道吸收，通過肝臟門靜脈吸收入血液循環(huán)，由于logP較小，血漿蛋白結(jié)合率太高，結(jié)合力太強，原形藥物主要分布于血液系統(tǒng)，對被激活的淋巴細胞有特殊的親和性，除吸收部位外很少進入組織細胞內(nèi)。(12)體內(nèi)抗腫瘤活性按文獻(ScientificReports，2015，5：13626)方法測定CH-j對異種移植模型的人非小細胞肺癌(H-460)的BALB/c裸鼠模型的抗腫瘤作用效果，結(jié)果見圖7。CH-j5，10mg/kg，每日分兩次灌胃給藥，連續(xù)10天。與對照組相比較，CH-j能夠明顯抑制H-460腫瘤異種移植在體內(nèi)的生長。與給藥前比較，30天時對H-460腫瘤縮小率分別為90.5±9.2％和95.2±11.6％(P<0.05)。結(jié)果表明，CH-j不但能夠明顯抑制H-460腫瘤異種移植在體內(nèi)的生長，而且可使瘤體顯著縮小。(13)CH-j作用機制分析體內(nèi)細胞通過消耗氧氣來產(chǎn)生能量。但是，如果氧含量下降，細胞進入缺氧狀態(tài)，不再生成能量，而是轉(zhuǎn)化生成氧自由基(.O2-)，激活HIF-1量，轉(zhuǎn)而關(guān)閉H2O2生成，并向炎性細胞發(fā)送信號,讓其遷移到缺氧區(qū)域(Cell，2015，163：1288-1288.e1)。在正常細胞內(nèi)95％以上.O2-可被SOD歧化為H2O2，構(gòu)成機體的第一道天然防線。過量的H2O2主要被谷胱苷肽酶(GPX)介導(dǎo)催化將還原型谷胱苷肽(GSH)氧化為氧化型GSH。部分H2O2被過氧化氫酶(CAT)介導(dǎo)催化分解為H2O和O2。因此，.O2-和H2O2被SOD和GPX控制維持在一個很低的水平，使細胞處于非增殖狀態(tài)。腫瘤細胞和正常細胞具有不同的氧化還原機制。腫瘤細胞內(nèi).O2-水平高于正常細胞，而H2O2，SOD，GSH和CAT低于正常細胞(EuropeanJournalofPharmacology,2010,630:121-130.)。腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移需要大量耗氧，所以缺氧是實體瘤微環(huán)境的一個重要特征。在低氧狀態(tài)下腫瘤細胞生存依賴于HIF-1α，HIF-1α積累促進VEGF等生長因子表達。VEGF在腫瘤血管生成中起著至關(guān)重要的作用，是腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移所必須的。因此，抗HIF-1長/VEGF血管新生療法系統(tǒng)是一個很有前景的治療癌癥的策略。(MolecularCancerTherapeutics，2007，6：220-226)在低氧狀態(tài)下腫瘤細胞HIF-1α過表達，使細胞處于增殖狀態(tài)，同時對H2O2敏感性增加。因此，在相同濃度的H2O2作用下，腫瘤細胞比正常細胞更容易發(fā)生凋亡。法國第五大學(xué)CaroleNicco課題組已證實在消除H2O2的抗氧化酶方面，GSH通路在非轉(zhuǎn)化細胞中對H2O2的產(chǎn)生控制起著主要作用，但是GSH在腫瘤細胞中對H2O2的產(chǎn)生控制是微不足道的。因此，在正常細胞中，ROS處于一個很低的水平，來自于NADPH氧化酶，H2O2的濃度由谷胱甘肽系統(tǒng)所調(diào)控。相反地，在腫瘤細胞中，更接近于細胞毒性的高水平的H2O2是通過線粒體呼吸鏈所產(chǎn)生的，H2O2濃度由CAT控制。因此，該課題組首次提出任何可以提高細胞內(nèi)H2O2水平的物質(zhì)都可以降低腫瘤的增殖并最終導(dǎo)致細胞凋亡。相反地，任何可以降低細胞內(nèi)H2O2水平的物質(zhì)都可以促進腫瘤的生長。所以，能特異性提高腫瘤細胞內(nèi)H2O2的藥物具有選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡作用。(Biomedicine&Pharmacotherapy，2005，59：169-174)西班牙Seville大學(xué)Miguel課題組提出細胞內(nèi)H2O2水平的增加在癌癥治療中是一個重要的事件。細胞內(nèi)高水平H2O2不但抑制癌細胞生存，而且誘導(dǎo)癌細胞凋亡比正常細胞更敏感。任何增加細胞內(nèi)H2O2到足夠水平的藥物或策略都可選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡并產(chǎn)生療效。提高細胞內(nèi)H2O2水平重要的是要依據(jù)藥物性質(zhì)和達到細胞內(nèi)的濃度，這是抗癌藥物療效的關(guān)鍵。(CancerLetters，2007，252：1-8)CH-j通過對通過ROS調(diào)控，捕獲細胞內(nèi).O2-，特異性提高實體瘤細胞內(nèi)的H2O2水平,靶向性氧化以半胱氨酸為活性中心的特定酶。如高水平的H2O2氧化Caspases，激活細胞內(nèi)凋亡通路，從而選擇性誘導(dǎo)實體瘤細胞凋亡。高水平的H2O2氧化降解HIF-1內(nèi)，從而抑制實體瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移。綜上所述，CH-j利用正常細胞和腫瘤細胞內(nèi)氧化和還原的不同機制，通過ROS調(diào)控，捕獲細胞內(nèi).O2-，特異性提高腫瘤細胞內(nèi)的H2O2水平，靶向氧化降解HIF-1腫和氧化激活Caspases，激活細胞內(nèi)凋亡通路，從而選擇性誘導(dǎo)實體瘤細胞凋亡并抑制增殖和轉(zhuǎn)移。CH-j還可對抗NaOCl的氧化，抑制激活細胞膜死亡受體通路，從而抑制細胞發(fā)炎和壞死。CH-j的作用機制與細胞毒類藥物截然不同，細胞毒類藥物通過提高細胞內(nèi)ROS(H2O2，.OH-，NaOCl)的水平，不但氧化激活細胞內(nèi)線粒體凋亡通路，也激活死亡受體通路，因此，在殺傷腫瘤細胞同時也傷害正常細胞。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明突出的優(yōu)點在于：本發(fā)明提供了一種ROS調(diào)控的HIF-1α抑制劑乙?；讞钏豈annich堿衍生物。其中，CH-j選擇性誘導(dǎo)腫瘤凋亡活性比BA-j強一倍，對實體瘤選擇性比BA-j更強，對血液系統(tǒng)幾乎不無影響。(BA-j對血液系統(tǒng)的選擇性強)CH-j成藥性優(yōu)良，藥代動力學(xué)性質(zhì)獨特，高效低毒，作用機理明確。CH-j全合成原料來源豐富，工藝簡捷，純度高，成本低，有望開發(fā)成為對實體瘤更有效的ROS調(diào)控的HIF-1α抑制劑類新型抗癌藥物。附圖說明本發(fā)明附圖8幅，分別是：圖1：PF1選擇性熒光探針測定乙酰基白楊素Mannich堿衍生物對細胞內(nèi)H2O2水平的影響，其中：圖1-1：乙?；讞钏豈annich堿衍生物對HepG2腫瘤細胞內(nèi)H2O2水平的影響：橫坐標(biāo)為參測化合物，測試濃度均為10μM，縱坐標(biāo)為細胞內(nèi)產(chǎn)生H2O2水平(μM)；圖1-2：CH-j/BA-j對腫瘤細胞內(nèi)H2O2水平的影響，圖中，橫坐標(biāo)為CH-j/BA-j濃度(μM)，縱坐標(biāo)為細胞內(nèi)產(chǎn)生H2O2水平(μM)；圖1-3：CH-j/BA-j對血液細胞內(nèi)H2O2水平影響，圖中，橫坐標(biāo)為CH-j/BA-j濃度(μM)，縱坐標(biāo)為細胞內(nèi)產(chǎn)生H2O2水平(μM)；圖1-4：CH-j對細胞內(nèi)H2O2水平的影響PF1熒光呈像：上圖為可見光下觀察結(jié)果，下圖為紫外光下觀察結(jié)果。圖2：乙?；讞钏豈annich堿衍生物體外對人胃BGC-823的抗腫瘤活性初篩結(jié)果(MTT，48h)，橫坐標(biāo)為給藥濃度(μM)，縱坐標(biāo)為細胞存活率(％)。圖3：以0、2.5、5、10或20μMCH-j處理人胃BGC-823腫瘤細胞24h凋亡檢測結(jié)果:圖3-1是Hoechst33258染色結(jié)果；圖3-2是PI染色結(jié)果；圖3-3是AnnexinV-FITC/PI染色結(jié)果；圖3-1、3-2和3-3中，A、B、C、D分別表示用0、2.5、5、10μMCH-j處理；圖3-4：Caspases：橫坐標(biāo)為CH-j濃度(μM)，縱坐標(biāo)為Caspases活性(％)。圖4：CH-j對人胃BGC-823腫瘤細胞HIF影響，分別以0、2.5、5和10μMCH-j處理BGC-823腫瘤細胞1h，繼而加入0.2μM胰島素培養(yǎng)24h，用免疫印跡法測定HIF-1α和HIF-1β。圖5：CH-j獼猴口服給藥(5mg/kg)的尿藥濃度-時間曲線：橫坐標(biāo)為給藥時間(h)，縱坐標(biāo)為尿液中CH-j濃度(μM)。圖6：CH-j大鼠給藥(100mg/kg)2小時組織分布：縱坐標(biāo)為CH-j濃度(μg/g)，靜脈給藥(i.v.)，口服給藥(p.o.)。圖7：CH-j體內(nèi)抗腫瘤活：雄性BALB/c裸鼠H-460腫瘤異種移植模型，每天分兩次灌胃給藥CH-j5，10mg/kg，連續(xù)10天，橫坐標(biāo)為實驗時間(天)，縱坐標(biāo)為H-460腫瘤體積(mm3)。圖8：CH-j作用機制圖示。具體實施方式下述非限制性實施例用于進一步說明本發(fā)明的乙?；讞钏豈annich堿衍生物、其制備方法和應(yīng)用，但應(yīng)當(dāng)明確，屬可替換方案的取代基并不局限于實施例中所述及的這些有機胺亞甲基，并且，這些實例也不應(yīng)理解為對本發(fā)明任何形式的限定。實施例1.6-乙?；?8哌啶醇亞甲基-白楊素(CH-j)6-乙?；讞钏?含量95.3％)50g，加入乙酸乙酯2000ml，加熱回流攪拌。按摩爾比1:1.5加入哌啶醇和甲醛溶液，繼續(xù)加熱回流攪拌3h。將析出的結(jié)晶濾出，洗滌，60℃減壓干燥，得到黃色結(jié)晶56.5g。HPLC-UV含量99.1％。重結(jié)晶，得到黃色柱狀結(jié)晶，HPLC-UV含量99.5％。本品與三氯化鐵溶液呈紫紅色。在25℃甲醇溶液中的比旋度為+2450。MS(API-ESI)m/z:[M+H]+410,[M+H-101]+309。HR-MS(API-ESI)m/z:[M-H]-408.1444(計算值408.1447),分子式C23H23NO6,平均分子量409.43。UV：1ml含5μg的甲醇溶液E1％1cm(λmax283nm)約為1044。IR(KBr,cm-1)：3513(弱νOH),2934(νCH3),1658(νC＝O),1625(C＝O),1587,1449,1379,777和687(γPh單取代)。1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)δ:8.03(d,2H,Ph-2',6'-H),7.57(m,3H,Ph-3',4',5'-H),6.83(s,1H,3-H),3.97(s,2H,C8-CH2),3.63m,1H,CH-OH),3.06-2.64(m,4H,2”,6”-CH2),2.50(COCH3),1.83-1.49(m，4H，3”,5”-CH2)。13C-NMR(DMSO-d6,500MHz)δ:204.6(C＝O),182.8(C-4),168.3(C-7),167.7(C-9),164.2(C-2),159.2(C-5),132.7(C-1'),129.9(C-4'),129.3(C-3',5'),127.0(C-2',6'),105.9(C-6),105.5(C-8),103.2(C-10),96.1(C-3)。為6-乙?；?8-哌啶醇亞甲基-白楊素[6-Acetyl-5,7-dihydroxy-8-(4-hydroxy-piperidin-1-ylmethyl)-2-phenyl-chromen-4-one]。實施例2.6-乙酰基-8-羥乙基哌嗪亞甲基-白楊素(CH-i)取6-乙?；讞钏?0g，加入500ml乙酸乙酯，加熱回流攪拌0.5h。按摩爾比1:1.5加入N-羥乙基哌嗪和甲醛溶液，繼續(xù)攪拌1.5h。將析出的結(jié)晶濾出，洗滌，60℃減壓干燥，得黃色結(jié)晶7.5g。HPLC-UV峰面積歸一化含量99.2％。本品與三氯化鐵溶液呈紫紅色。MS(API-ESI)m/z:[M+H]+439。UV：1ml含5μg的甲醇溶液E1％1cm(λmax286nm)約為1016。IR(KBr,cm-1):3486(νOH),2934(νCH3),1651(νC＝O),1624(νCH3-C＝O),1587,1446,845和773(γPh單取代)。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:8.11(d,2H,Ph-2',6'-H),7.62(m,3H,Ph-3',4',5'-H),7.05(s,1H,3-H),3.88(s,2H,8-CH2),3.47(t,J＝6.2Hz,2H,8-CH2OH),2.68-2.66(m,4H,2”,3”,4”,5”-H),2.61(s,3H,CH3),2.40(t，J＝6.1Hz,2H,7”-H)。分子式C24H26N2O6。為6-乙?；?8-羥乙基哌嗪亞甲基-白楊素。[6-Acetyl-5,7-dihydroxy-8-[4-(2-hydroxy-ethyl)-piperazin-1-ylmethyl]-2-phenyl-chromen-4-one]實施例3.6-乙?；?8-脯氨醇(+)亞甲基-白楊素(CH-h)取6-乙酰基白楊素10g，加入500ml乙酸乙酯，回流攪拌0.5h。按摩爾比1:2加入脯氨醇(+)和甲醛溶液，繼續(xù)攪拌2.5h。將析出的結(jié)晶濾出，用少量乙酸乙酯洗滌，60℃減壓干燥，得黃色結(jié)晶2.4g。重結(jié)晶，HPLC-UV峰面積歸一化含量95.5％。本品與三氯化鐵溶液呈紫紅色。MS(API-ESI)m/z:[M+H]+410,[M-H]-408。分子式C23H23NO6，平均分子量409.43。UV：1ml含5μg的甲醇溶液E1％1cm(λmax282nm)約為968。IR(KBr,cm-1):3306(νOH),2951(νCH3),1651(νC＝O)，1625(νCH3-C＝O),1589,1451,771和686(γPh單取代)。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:8.07(dd,Ph-2',6'-H),7.59(m,Ph-3',4',5'-H),6.82(s,1H,3-H),4.41-4.25(dd,J＝13.4Hz,2H,8-CH2,不對稱同碳偶合),3.71-3.63(dd,J＝11.7,5.3Hz,2H,6”-H),3.53(H2O),3.40(m,1H,5”-H),3.19(m,1H,2”-H),2.95(m,1H,2”-H),2.46(s,3H,COCH3),2.06(m,1H,4”-H),1.88(m,1H,3”-H),1.75(m,2H,3”,4”-H)。分子式C23H23NO6.H2O。為6-乙?；?8-脯氨醇(+)亞甲基-白楊素一水合物。[6-Acetyl-5,7-dihydroxy-8-(2-hydroxymethyl-pyrrolidin-1-ylmethyl)-2-phenyl-chromen-4-one]實施例4.6-乙?；?8-嗎啉亞甲基-白楊素(CH-d)取6-乙?；讞钏?0g，加入200ml二氧六環(huán)，95℃加熱攪拌0.5h。按摩爾比1:1.5加入嗎啉和甲醛溶液，繼續(xù)攪拌2.5h。將析出的結(jié)晶濾出，洗滌，60℃減壓干燥，得橙黃色結(jié)晶9.2g。重結(jié)晶，HPLC-UV峰面積歸一化含量99.8％。本品與三氯化鐵溶液呈紫紅色。MS(API-ESI)m/z:[M+H]+396。UV：1ml含5μg的甲醇溶液E1％1cm(λmax286nm)約為1129。IR(KBr,cm-1):3307(νOH),2953(νCH3),1647(νC＝O),1630(νCH3-C＝O),1587,1451,771和694(γPh單取代)。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:8.14(d,Ph-2',6'-H),7.64(m,Ph-3',4',5'-H),7.15(s,1H,3-H),3.79(s,2H,8-CH2),3.57(m,2H,3”,5”-H),2.69(s,3H,COCH3),2.55(m,2H，2”,6”-H)。分子式C22H21NO6。為6-乙酰基-8-嗎啉亞甲基-白楊素。[6-Acetyl-5,7-dihydroxy-8-morpholin-4-ylmethyl-2-phenyl-chromen-4-one]實施例5.6-乙酰基-8-硫嗎啉亞甲基-白楊素(CH-e)取6-乙?；讞钏?0g，加入200ml乙酰丙酮，95℃加熱攪拌0.5h。按1：2M加入硫嗎啉和甲醛溶液，繼續(xù)攪拌2.5h。將析出的結(jié)晶濾出，洗滌，60℃減壓干燥，得橙黃色結(jié)晶10.3g。HPLC-UV峰面積歸一化含量95.4％。本品與三氯化鐵溶液呈紫紅色。MS(API-ESI)m/z:[M+H]+412。UV：1ml含5μg的甲醇溶液E1％1cm(λmax286nm)約為1133。IR(KBr,cm-1):3467(νOH)，2908(νCH3),1647(νC＝O),1626(νCH3-C＝O),1587,1441,777和688(γPh單取代)。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:8.13(m,Ph-2',6'-H,),7.64(m,Ph-3',4',5'-H),7.14(s,1H,3-H),3.82(s,2H,8-CH2),2.82(m,2H,2”,6”-H),2.68(s,3H,CH3),2.62(m,2H,3”,5”-H)。分子式C22H21NO5S。為6-乙酰基-8-硫嗎啉亞甲基-白楊素。[6-Acetyl-5,7-dihydroxy-2-phenyl-8-thiomorpholin-4-ylmethyl-chromen-4-one]實施例6.6-乙?；?8-甲基哌嗪亞甲基-白楊素(CH-f)取6-乙?；讞钏?0g，加入500ml乙酸乙酯，加熱回流攪拌0.5h。按1：1.5M加入N-甲基哌嗪和甲醛溶液，繼續(xù)攪拌1.5h。將析出的結(jié)晶濾出，洗滌，60℃減壓干燥，得黃色針結(jié)晶7.1g。HPLC-UV峰面積歸一化含量99.8％。本品與三氯化鐵溶液呈紫紅色。MS(API-ESI)m/z:[M+H]+409,[M-H]-407。本品在乙酸乙酯中與2M甲磺酸成鹽，80℃減壓干燥，得黃色結(jié)晶。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:8.21(m,Ph-2',6'-H),7.66(m，Ph-3',4'，5'-H)，7.31(s,1H,3-H),4.47(s,2H,8-CH2),3.65-3.24(m,8H,CH22”,3”,4”,5”-H),2.86(s,3H,N-CH3),2.78(s,3H,COCH3),2.35(s,6H,2MCH3SO3H)。為6-乙?；?8-甲基哌嗪亞甲基-白楊素[6-Acetyl-5,7-dihydroxy-8-((4-methylpiperazin-1-yl)methyl)-2-phenyl-4H-chromen-4-one]。實施例7.6-乙?；?8-哌啶亞甲基-白楊素(CH-c)取6-乙酰基白楊素10g，加入500ml乙酸乙酯，加熱回流攪拌0.5h。按1：1.5M加入哌啶和甲醛溶液，繼續(xù)回流攪拌1.5h。將析出的結(jié)晶濾出，洗滌，60℃減壓干燥，得黃色結(jié)晶9.2g。HPLC-UV含量99.5％。本品與三氯化鐵溶液呈紫紅色。MS(API-ESI)m/z:[M+H]+394,[M-H]-392。1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)δ:8.07(d,2H,Ph-2',6'-H),7.60(m,3H,Ph-3',4',5'-H),6.89(s,1H,3-H),4.14,(s,2H,C8-CH2),2.95(s,2H,COCH3),1.64-1.23(m,10H,2”,3”,4”，5”,6”-CH2)。為6-乙?；?8-哌啶亞甲基-白楊素[6-Acetyl-5,7-dihydroxy-2-phenyl-8-piperidin-1-ylmethyl-chromen-4-one]。實施例8.8-乙?；?6-哌啶醇亞甲基-白楊素(CH8-j)將8-乙酰基白楊素13g(含量60％)，加入乙酸乙酯500ml，加熱回流攪拌溶解成紅色溶液。按1：1.5M加入哌啶和甲醛溶液，繼續(xù)回流攪拌1h。將析出的結(jié)晶分離，洗滌，60℃減壓干燥，得黃色結(jié)晶性粉末5.3g。(含量82.5％)。多次重結(jié)晶，得到淺黃色結(jié)晶，HPLC-UV含量97.0％。本品與三氯化鐵溶液呈三氯化鐵溶液呈橙紅色。25℃甲醇溶液比旋度為+2450。MS(API-ESI)m/z:[M+H]+410,[M+H-101]+309,[M-H]-408。HR-MS(API-ESI)m/z:[M-H]-408.1444(計算值408.1447),分子式C23H23NO6，平均分子量409.43。UV：1ml含5μg的甲醇溶液E1％1cm(λmax255nm)為878。IR(KBr,cm-1)：3349(寬強νOH),2953(νCH3),1646(寬強νC＝O，CH3-C＝O)，1599,1578,1549,769和682(γPh單取代)。1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)δ:8.12(d,2H,Ph-2',6'-H),7.56(m,3H,Ph-3',4',5'-H),6.88(s,1H,3-H),4.07,(s,2H,C6-CH2),3.77(m,1H，CH-OH),2.99-3.25(m,4H,2”,6”-CH2),2.57(s,3H,COCH3),1.65-1.95(m,4H,3”,5”-CH2)。13C-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:198.1(C＝O),180.3(C-4),175.6(C-7),161.3(C-5),161.2(C-2),157.0(C-9),131.5(C-1'),131.0(C-4'),128.9(C-3',5'),126.2(C-2',6'),109.4(C-8),104.4(C-6),102.3(C-3),98.6(C-10)。UVλmax255nm比CH-j紫移28nm；13C-NMR104.4(C-6)和109.4(C-8)，而CH-j105.9(C-6)和105.5(C-8)。因此，為化合物CH8-j，即8-乙?；?6-哌啶醇亞甲基白楊素。[8-Acetyl-5,7-dihydroxy-6-(4-hydroxy-piperidin-1-ylmethyl)-2-phenyl-chromen-4-one]實施例9.6-乙?；讞钏?CH)取2，4，6-三羥基苯乙酮一水合物150g，按文獻法合成乙?；讞钏豙CN200410008987.8]，得到淺橙黃色針狀結(jié)晶155g(含量95.3％)。用DMF重結(jié)晶，得淺黃色絲狀結(jié)晶，HPLC-UV含量99.3％。本品與三氯化鐵溶液呈紫紅色。MS(API-ESI)m/z:[M+H]+297，[M-H]-295。UV：1ml含5μg的甲醇溶液E1％1cm(λmax283nm)為1532。IR(KBr,cm-1)：3063(νCH3)，1646(C＝O)，1586(νCH3-C＝O)，1452，1379，1178，767和682(γPh單取代)。1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)δ:8.03(d,2H,Ar-2',6'-H),7.62(m,3H,Ar-3',4',5'-H),7.10(s,1H,3-H),6.63(s,1H,8-H)，2.74(s,CH3)。分子式C17H12O5，平均分子量296.27。為6-乙?；讞钏亍6-Acetyl-5,7-dihydroxy-2-phenyl-4H-chromen-4-one]實施例10.8-乙?；讞钏?CH8)將分離6-乙?；讞钏睾蟮南匆?，蒸餾回收部分溶劑，將析出的結(jié)晶濾出，得到淺橙黃色結(jié)晶(含8-乙?；讞钏?0％)。以石油醚-乙酸乙酯-氯仿(40：15:3)為流動相，經(jīng)硅膠閃色譜分離，得到類白色結(jié)晶，HPLC-UV含量95.0％。本品與三氯化鐵溶液呈橙紅色。MS(API-ESI)m/z:[M+H]+297，[M-H]-295。UV：甲醇溶液λmax276nm。IR(KBr,cm-1)：1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)δ:8.08(d,Ar-2H,2',6'-H),7.63(m,Ar-3H,3',4',5'-H),7.13(s,1H,3-H),6.36(s,1H,6-H),2.77(s,CH3)。分子式C17H12O5，平均分子量296.27。為8-乙?；讞钏?。[8-Acetyl-5,7-dihydroxy-2-phenyl-4H-chromen-4-one]。當(dāng)前第1頁1 2 3