本發(fā)明屬于醫(yī)藥化工領(lǐng)域，具體涉及一類新的具有抗腫瘤活性的取代吲哚或吲唑嘧啶類衍生物及其制備方法，所述取代吲哚或吲唑嘧啶類衍生物具有有效的酪氨酸激酶抑制作用，具有制備用于治療或輔助治療哺乳動物(包括人)的由受體酪氨酸激酶介導(dǎo)的腫瘤或受體酪氨酸激酶驅(qū)動的腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移的藥物方面的用途。
背景技術(shù)：
：who發(fā)布的全球癌癥報(bào)告(2014)中指出，2012年全球死于癌癥的人數(shù)達(dá)820萬。由于生存環(huán)境和生活習(xí)性的改變，在不良環(huán)境和一些不利因素的作用下，腫瘤的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢。據(jù)who的報(bào)告預(yù)測，全球癌癥新增病例將由2012年的1400萬人，逐年遞增至2025年的1900萬人，到2035年將達(dá)到2400萬人。以往對腫瘤的治療是通過發(fā)現(xiàn)腫瘤并破壞來實(shí)現(xiàn)的，現(xiàn)在隨著對細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑研究的不斷深入，人們對腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的癌基因及抗癌基因的作用了解的越來越深入，針對腫瘤的特異性分子靶點(diǎn)設(shè)計(jì)新的抗腫瘤藥物越來越受到關(guān)注，成為研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，而靶向抗腫瘤藥物作為一種新的治療方法也已經(jīng)應(yīng)用于臨床，并在短短幾年內(nèi)得到了顯著的進(jìn)展?，F(xiàn)在已知，蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinases，ptk)信號通路與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡有密切關(guān)系(lisun，etal.，drugdiscovtoday，2000，5，344-353)，利用蛋白酪氨酸激酶抑制劑干擾或阻斷蛋白酪氨酸激酶通路可以用于腫瘤治療(fabbrod.，etal.，curropinpharmacol，2002，2，374-381)；也可用于治療白血病、多發(fā)性骨髓瘤或淋巴瘤等。近年來，人們致力于抑制細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以開發(fā)新型靶點(diǎn)抗腫瘤藥物。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑下調(diào)腫瘤的生存和增殖信號，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而不是通過細(xì)胞毒作用，因此選擇性較高、毒副作用較小。目前已有十幾種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑應(yīng)用于腫瘤的臨床治療，主要為蛋白酪氨酸激酶抑制劑類抗腫瘤藥物，其中4-(取代苯氨基)喹唑啉結(jié)構(gòu)類型的化合物開發(fā)的比較成熟，如針對egfr酪氨酸激酶靶點(diǎn)的小分子抑制劑吉非替尼、埃羅替尼和拉帕替尼等。此外，專利申請wo96/33977、wo97/30035、wo98/13354、wo00/55141、wo02/41882、wo03/82290和ep837063等公開了在4-位上攜帶苯氨基取代和在6-和/或7-位上攜帶取代基的某些喹唑啉衍生物，它們具有受體酪氨酸激酶活性。然而隨著激酶變異以及腫瘤耐藥性的出現(xiàn)，第二代針對egfr家族靶點(diǎn)的不可逆抑制劑應(yīng)運(yùn)而生。不可逆抑制劑有許多優(yōu)點(diǎn)，如與atp結(jié)合位點(diǎn)共價鍵結(jié)合，因此結(jié)合牢固， 不需要維持較高的細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，可以降低用藥量，延長給藥時間，降低耐藥性等。目前已經(jīng)處于臨床iii期的不可逆抑制劑有hki-272、dacomitinib和afatinib。作為第二代針對egfr靶點(diǎn)的不可逆抑制劑中的優(yōu)良品種，afatinib目前已經(jīng)上市。然而第二代不可逆抑制劑盡管臨床前研究顯示良好的抗耐藥腫瘤效果，但臨床對耐藥腫瘤并沒有顯示明顯療效。究其原因在于對野生型egfr的過強(qiáng)抑制引起的毒性反應(yīng)限制了其臨床用藥劑量，達(dá)不到體內(nèi)對耐藥腫瘤的有效暴露量。第三代選擇性不可逆抑制劑如co-1686、azd-9291等具有對突變激活egfr及egfr-t790m具有較高抑制活性，而對野生型egfr較弱的特點(diǎn)，以良好的安全性在臨床研究中表現(xiàn)突出，針對耐藥非小細(xì)胞肺癌目前在后期臨床研究中。小分子酪氨酸激酶抑制劑作為新的靶向抗腫瘤藥物，為腫瘤的治療和預(yù)防打開了一扇新窗口，而且其副作用輕微，有良好的耐受性。雖然目前已有10多個小分子酪氨酸激酶抑制劑為臨床腫瘤治療作出了很大貢獻(xiàn)，但仍然需要發(fā)現(xiàn)一些較之現(xiàn)有的酪氨酸激酶抑制劑具有更好的體內(nèi)活性和/或改良的藥理學(xué)特性的另外的化合物，或者發(fā)現(xiàn)一些強(qiáng)大的或針對變異激酶仍然有效的抑制劑如不可逆抑制劑等。因此開發(fā)新的改進(jìn)的或更高效的酪氨酸激酶抑制劑，更深入地了解該類藥物與已知靶蛋白之間的關(guān)系以及其發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)理對腫瘤臨床治療具有重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明人通過深入研究意外地發(fā)現(xiàn)，具有式i結(jié)構(gòu)的取代吲哚或吲唑嘧啶類衍生物具有有效的酪氨酸激酶不可逆抑制作用和/或具有良好的體內(nèi)藥物動力學(xué)行為，且體外研究顯示，本發(fā)明化合物對h1975腫瘤細(xì)胞(egfr-t-790突變耐藥腫瘤)具有顯著的抑制作用，而對egfr-wt抑制作用較弱，顯示出較好的選擇性?？紤]到這類化合物可以降低因egfr-wt靶點(diǎn)過度抑制而引起的毒副作用(如皮膚痤瘡、腹瀉等)，能夠更適合于用于腫瘤治療。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。本發(fā)明第一方面提供式i所示化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物：其中，r1選自氫、c1-4烷基、c1-4烷氧基、鹵代的c1-4烷基、鹵代的c1-4烷氧基、 c1-4雜環(huán)烷氧基、鹵素；優(yōu)選氫、甲氧基、乙氧基、甲基、乙基、異丙基、二氟甲氧基、氟、氯、溴；更優(yōu)選甲氧基、乙氧基、二氟甲氧基；r2選自氫、c1-3烷基、c1-3烷氧基、c1-3烷巰基、鹵代的c1-3烷基、鹵素、烯基、氰基、炔基、酰胺基、磺酰胺基、胺磺?；?；優(yōu)選氫、甲基、乙基、異丙基、三氟甲基、烯基、氰基、炔基、氟、氯、溴，更優(yōu)選氫、甲基、氟、氯，最優(yōu)選氫、氟；r3選自烷基、鹵素、-n(ch3)ch2r6、-n(ch3)ch2ch2-nh-ch3、-n(ch3)ch2ch2-n(ch3)2、-n(ch3)ch2ch2n(boc)ch3、-n(ch3)ch2ch2ch2-n(ch3)2、-n(ch3)ch2ch2-n(ch2ch3)2、-n(ch3)ch2ch2-n(ch2ch3)ch3、-n(ch2ch3)ch2ch2-n(ch3)2；優(yōu)選-n(ch3)ch2ch2-nh-ch3、-n(ch3)ch2ch2-n(ch3)2、-n(ch3)ch2ch2n(boc)ch3；更優(yōu)選-n(ch3)ch2ch2-nh-ch3、-n(ch3)ch2ch2-n(ch3)2；x選自cr4或n；y選自cr5；r4、r5、r6各自獨(dú)立地選自h、c1-3烷基、c1-3烷氧基或c1-3鹵代烷基、鹵素、氰基、羧基或胺?；籸7選自氫、c1-3烷基、c1-3烷氧乙基；當(dāng)且僅當(dāng)x為ch或n，且y選自ch、c-cl、c-f、c-cf3、c-chf2、c-ch3、c-cn時，r2不為氫；在本發(fā)明的一個技術(shù)方案中，r1選自氫、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、異丙氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、氟、氯、溴；更優(yōu)選甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、二氟甲氧基、三氟甲基，最優(yōu)選甲氧基、乙氧基、；r2選自氫、c1-3烷基、c1-3烷氧基、c1-3烷巰基、鹵代的c1-3烷基、鹵素，磺酰胺基、酰胺基、磺?；?、烯基、氰基、炔基；優(yōu)選氫、甲基、乙基、異丙基、三氟甲基、烯基、氰基、炔基、氟、氯、溴；更優(yōu)選氫、甲基、氟、氯，最優(yōu)選氫、氟；r3選自-n(ch3)ch2ch2-nh-ch3、-n(ch3)ch2ch2-n(ch3)2、-n(ch3)ch2ch2n(boc)ch3；更優(yōu)選-n(ch3)ch2ch2-nh-ch3、-n(ch3)ch2ch2-n(ch3)2；x選自ch、c-ch3、n，優(yōu)選ch、c-ch3；y選自ch、c-cl、c-f、c-cf3、c-ch3、c-cn、ccooh、cconh2；優(yōu)選ch、c-cf3、c-ch3、ccooh、cconh2；更優(yōu)選ch、c-ch3；r7選自氫、甲基、乙基、甲氧乙基；當(dāng)且僅當(dāng)x為ch時或n時，且y選自ch、c-cl、c-f、c-cf3、c-ch3、c-cn時，r2不為氫；在本發(fā)明的另一個技術(shù)方案中，r1選自甲氧基、乙氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基， 優(yōu)選甲氧基、乙氧基；r2選自氫、甲基、氟、氯；最優(yōu)選氫、氟；r3選自-n(ch3)ch2ch2-nh-ch3、-n(ch3)ch2ch2-n(ch3)2；x選自ch、cch3；y選自ch、c-ch3、c-cf3、c-cn、ccooh、cconh2；優(yōu)選ch，c-ch3；r7選自氫、甲基、乙基、甲氧乙基；當(dāng)且僅當(dāng)x為ch，且y選自ch、c-ch3、c-cf3、c-cn時，r2不為氫；在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的技術(shù)方案中，r1選自甲氧基、乙氧基；r2選自氫、氟；r3選自-n(ch3)ch2ch2-nh-ch3、-n(ch3)ch2ch2-n(ch3)2；x選自ch、cch3；y選自ch、c-ch3、ccooh、cconh2；優(yōu)選ch，c-ch3；r7選自氫、甲基、乙基、甲氧乙基；當(dāng)且僅當(dāng)x為ch，且y選自ch、c-ch3時，r2不為氫；在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，r1選自甲氧基、乙氧基；r2選自氫、氟；r3選自-n(ch3)ch2ch2-nh-ch3、-n(ch3)ch2ch2-n(ch3)2；x選自ch、cch3；y選自ch，c-ch3；r7選自氫、甲基、乙基、甲氧乙基；當(dāng)且僅當(dāng)x為ch，且y選自ch、c-ch3時，r2為氟；在本發(fā)明第一方面中，所述鹵素或鹵原子選自氟、氯或溴，在一個實(shí)施方案中優(yōu)選氟；所述的烷基是指碳原子之間、以及碳原子與氫原子之間均以單鍵相連的烴基，其包括直鏈烷基、支鏈烷基、環(huán)烷基；優(yōu)選c1-6或者c1-4的烷基，具體地，所述的直鏈或支鏈烷基選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基；所述鹵代烷烴是指被一個或多個鹵原子取代的烷基，鹵代烷基的實(shí)例包括三氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、二氯甲基；所述環(huán)烷基是指具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的烷基，優(yōu)選c3-7、c4-6或c3-5的環(huán)烷基，環(huán)烷基的實(shí)例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基；所述雜環(huán)烷基是指環(huán)狀碳架結(jié)構(gòu)中的碳原子被1-2個雜原子取代的環(huán)烷基，其雜原子可以選自n、o、s，雜環(huán)烷基的實(shí)例包括氮雜環(huán)乙基、四氫噻吩基、四氫呋喃基、四氫吡咯基、六氫吡啶基、哌啶基；所述四氫呋喃-3-基包括(s)-四氫呋喃-3-基、(r)-四氫呋喃-3-基；所述四氫呋喃-3-基氧基包括(s)-四氫呋喃-3-基氧基、(r)-四氫呋喃-3-基氧基；所述“boc”是指叔丁氧基羰基(英文全稱為：t-butyloxycarbonyl)。根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的式i化合物，其選自如下結(jié)構(gòu)化合物：本發(fā)明第二方面提供了本發(fā)明第一方面所述式i化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法，其包括以下步驟：(1)在路易斯酸存在下，由式ii所示化合物與式iii所示化合物在高沸點(diǎn)無水溶劑中反應(yīng)得到中間體iv：(2)中間體iv在適宜條件下與化合物v得到中間體vi，中間體vi在適宜堿作用下反應(yīng)，再經(jīng)還原劑還原得中間體vii：(3)中間體vii與丙烯酰氯或丙烯酸酐反應(yīng)得到式i化合物：或者中間體vii與3-氯丙酰氯反應(yīng)，再經(jīng)消除得式i化合物：以及任選地，(4)式i化合物與相應(yīng)的酸反應(yīng)得到式i化合物的藥學(xué)上可接受的鹽，或者經(jīng)過調(diào)堿得到相應(yīng)式i的堿基；其中，r1-r3及r7、x、y具有本發(fā)明第一方面相同的含義。步驟(1)中，所述高沸點(diǎn)無水溶劑選自乙二醇二甲醚、二甲苯；所述路易斯酸選自無水a(chǎn)lcl3、fecl3；所述催化劑為鈀催化劑，優(yōu)選四(三苯基膦)鈀；步驟(2)中，所述的適宜酸選自對甲苯磺酸、鹽酸、氫溴酸，優(yōu)選對甲苯磺酸；所述的適宜堿選自有機(jī)堿或無機(jī)堿，優(yōu)選三乙胺、二異丙基乙基胺、氫化鈉、氫化鉀和氫化鈣；所述還原劑選自sncl2濃鹽酸、zn粉醋酸、fe粉醋酸、鐵粉氯化銨、pd-c催化加氫；優(yōu)選pd-c催化加氫、fe粉氯化銨。對于本發(fā)明第二方面所述的制備方法，在必要情況下，為防止有些基團(tuán)(如氨基、羥基等)發(fā)生不希望的反應(yīng)，需要對相應(yīng)基團(tuán)予以保護(hù)，同時，在適當(dāng)?shù)臅r候予以去除保護(hù)基。這些實(shí)例不勝枚舉，沒有具體提及的保護(hù)基的使用和脫保護(hù)的方法也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在本發(fā)明第二方面所述的制備方法中，反應(yīng)所用的各種原材料是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)已有知識可以制備得到的，或者是可以通過文獻(xiàn)公知的方法制得的，或者是可以通過商業(yè)購得的。以上反應(yīng)方案中所用的中間體、原材料、試劑、反應(yīng)條件等均可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已有知識可以作適當(dāng)改變的?；蛘?，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)本發(fā)明的制備方法方法合成本發(fā)明未具體列舉的其它式i化合物。本發(fā)明中，式ii所示的起始原料2，4-二氯嘧啶以及式iii所述的吲哚或吲唑可以從上海贏瑞化學(xué)科技有限公司、天津希恩思生化科技有限公司、上海畢得醫(yī)藥有限公司、上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司、阿法埃莎(中國)化學(xué)有限公司、梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司等購買或如實(shí)施例中所述方法制備。本發(fā)明中，式v所示的起始原料取代芳胺可以根據(jù)常規(guī)方法制備得到，或市場購買得到如5-氟-2-硝基苯酚購買自天津希恩思生化科技有限公司，經(jīng)文中制備方法得到相應(yīng)取代芳胺，2-甲氧基-4-氟-5-硝基苯胺購自上海瀚鴻化工科技有限公司。其它常用試劑或溶劑如非特別說明，均直接購買，未經(jīng)處理直接使用。如n，n，n’-三甲基乙二胺鹽酸鹽或單boc保護(hù)的n，n’-二甲基乙二胺購自九鼎化學(xué)(上海)科技有限公司；丙烯酸酐、丙烯酰氯或3-氯丙酰氯購自常州清源化學(xué)有限公司。本發(fā)明第三方面涉及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明第一方面所述的式i化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，以及任選的一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明第四方面提供本發(fā)明第一方面式i所示的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物在用于治療或/和預(yù)防哺乳動物(包括人)與受體酪氨酸激酶相關(guān)的疾病或病癥的藥物中的用途。本發(fā)明第五方面提供本發(fā)明第三方面所述藥物組合物在用于治療或/和預(yù)防哺乳動物(包括人)與受體酪氨酸激酶相關(guān)的疾病或病癥的藥物中的用途。本發(fā)明第六方面提供一種用于在有需要的哺乳動物(包括人)中治療和/或預(yù)防與受體酪氨酸激酶相關(guān)的疾病或病癥的方法，該方法包括給有需要的哺乳動物施用治療有效量的本發(fā)明式i所示化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物、或者有效劑量的本發(fā)明第三方面所述的藥物組合物。本發(fā)明人通過生物學(xué)試驗(yàn)表明，本發(fā)明第一方面所述的式i所示的化合物對egfr突變(egfr-dele746-a750)細(xì)胞株(hcc827)和egfr-t790m耐藥突變細(xì)胞株h1975都顯示了強(qiáng)大的抑制活性，而對野生型egfr高表達(dá)細(xì)胞株a431抑制作用較弱，因此可以預(yù)期本發(fā)明化合物及其藥物組合物可用于egfr突變和egfr-t790m耐藥受體酪氨酸激酶單獨(dú)或部分介導(dǎo)的疾病的治療，且避免了或降低了因?yàn)閷gfr野生型激酶過度抑制而產(chǎn)生 的較大毒副作用(如皮膚痤瘡、腹瀉、嘔吐等)。本發(fā)明化合物主要通過抑制一種或多種egfr家族酪氨酸激酶突變，或通過抑制突變激酶的活性產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞增殖、遷移或促腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。本發(fā)明中，特別是在本發(fā)明第四、五方面所述的用途和第六方面所述的方法中，所述“與受體酪氨酸激酶相關(guān)的疾病或病癥”優(yōu)選“由受體酪氨酸激酶介導(dǎo)的腫瘤”、“由受體酪氨酸激酶驅(qū)動的腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移”、或者“egfr受體酪氨酸激酶敏感腫瘤。其中，所述“egfr受體酪氨酸激酶敏感癌癥”優(yōu)選egfr家族高表達(dá)及egf驅(qū)動的腫瘤，包括但不限于由egfrl858r突變體和/或egfr-t790m突變體和/或exon19缺失激活突變體和/或egfr-dele746-a750突變體介導(dǎo)的腫瘤、或者對egfr抑制劑如吉非替尼(gefitinib)或厄羅替尼(erlotinib)等耐藥的腫瘤，具體包括實(shí)體腫瘤，如膽管、骨、膀胱、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(如腦)、乳房、結(jié)直腸、胃、頭和頸、肝、肺(尤其是非小細(xì)胞肺癌)、神經(jīng)元、食道、卵巢、胰腺、前列腺、腎臟、皮膚、睪丸、甲狀腺、子宮(如子宮內(nèi)膜癌)和外陰等的癌癥，和非實(shí)體腫瘤，如白血病、多發(fā)性骨髓瘤或淋巴瘤等。本發(fā)明所用的術(shù)語“組合物”意指包括包含指定量的各指定成分的產(chǎn)品，以及直接或間接從指定量的各指定成分的組合產(chǎn)生的任何產(chǎn)品。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過改變本發(fā)明藥物組合物中各活性成分的實(shí)際劑量水平，以便所得的活性化合物量能有效針對具體患者、組合物和給藥方式得到所需的治療反應(yīng)。劑量水平需根據(jù)具體化合物的活性、給藥途徑、所治療病況的嚴(yán)重程度以及待治療患者的病況和既往病史來選定。但是，本領(lǐng)域的做法是，化合物的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。在本發(fā)明中，所述藥物組合物可特別專門配制成以固體或液體形式供口服給藥、供胃腸外注射或供直腸給藥。術(shù)語“治療和/或預(yù)防有效量”的本發(fā)明所述的式i所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽指以適用于任何醫(yī)學(xué)治療和/或預(yù)防的合理效果/風(fēng)險比治療障礙的足夠量的化合物。但應(yīng)認(rèn)識到，本發(fā)明式i所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和組合物的總?cè)沼昧宽氂芍髟\醫(yī)師在可靠的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)作出決定。對于任何具體的患者，具體的治療有效劑量水平須根據(jù)多種因素而定，所述因素包括所治療的障礙和該障礙的嚴(yán)重程度；所采用的具體化合物的活性；所采用的具體組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；所采用的具體化合物的給藥時間、給藥途徑和排泄率；治療持續(xù)時間；與所采用的具體化合物組合使用或同時使用的藥物；及醫(yī)療領(lǐng)域公知的類似因素。例如，本領(lǐng)域的做法是，化合物的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。一般說來，本發(fā)明式i所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽用于哺乳動物特別是人的劑量可以介于0.001～1000mg/kg體重/天，例如介于0.01～100mg/kg體重/天，例如介于 0.01～10mg/kg體重/天。本發(fā)明的式i所示的化合物可以與其它藥物活性成分組合使用，只要它不產(chǎn)生其他不利作用，例如過敏反應(yīng)。本發(fā)明式i所示的化合物可以單獨(dú)作為抗癌藥物使用，或者可以與一種或多種其他抗腫瘤藥物聯(lián)合使用。聯(lián)合治療通過將各個治療組分同時、順序或隔開給藥來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的化合物可以以衍生自無機(jī)酸或有機(jī)酸的藥學(xué)上可接受的鹽的形式使用。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”指在可靠的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，適合用于與人類和低等動物的組織接觸而不出現(xiàn)過度的毒性、刺激、過敏反應(yīng)等，且與合理的效果/風(fēng)險比相稱的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽是本領(lǐng)域公知的。所述鹽可通過使本發(fā)明化合物的游離堿官能度與合適的有機(jī)酸反應(yīng)，在本發(fā)明化合物的最終分離和純化過程中原位制備或者單獨(dú)制備。本發(fā)明式i化合物還包括其異構(gòu)體、消旋體、對映體、非對映體、對映體富集物、溶劑合物和酯，本發(fā)明式i化合物以及它的異構(gòu)體、消旋體、對映體、非對映體、對映體富集物、溶劑合物和酯還可以形成溶劑合物，例如水合物、醇合物等。上述化合物還可以是前藥或可在體內(nèi)代謝變化后釋放出所述活性成分的形式。選擇和制備適當(dāng)?shù)那八幯苌锸潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知技術(shù)。一般來說，對于本發(fā)明的目的，與藥學(xué)上可接受的溶劑如水、乙醇等的溶劑合物形式與非溶劑合物形式相當(dāng)。具體實(shí)施方式下面通過具體的制備實(shí)施例和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但是，應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)僅僅是用于具體地說明之用，而不應(yīng)將其理解為用于以任何形式限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，在下文中，如果未特別說明，所用的材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的。除非另外說明，其中：(i)溫度以攝氏度(℃)表示，操作在室溫下進(jìn)行，所述室溫一般指15-35℃，優(yōu)選20-30℃，更優(yōu)選20-25℃；(ii)有機(jī)溶劑用無水硫酸鈉干燥，溶劑的去除采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)，浴溫不高于60℃；(iii)反應(yīng)過程用薄層色譜(tlc)跟蹤；(iv)終產(chǎn)物具有滿意的氫核磁共振光譜(1h-nmr)、碳核磁共振光譜(13c-nmr)和質(zhì)譜(ms)數(shù)據(jù)。實(shí)施例1：2-((2-丙烯酰胺基-4-(4-(5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)5-甲氧基苯基)(甲基)胺基)乙基(甲基)胺基甲酸叔丁酯(化合物1)的合成:a.3-(2-氯-5-甲基嘧啶-4-基)-5-氟-1-甲基-1h-吲哚的合成將原料5-氟吲哚(10g，1eq)加入到圓底燒瓶中，加入150mldmf，降溫至-10攝氏度左右加入60％氫化鈉(6g，2eq)，攪拌約20分鐘后滴入碘甲烷(15.7g，1.5eq)，畢升溫至室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，tlc檢測反應(yīng)完畢后，將體系倒入1l水中，等量二氯甲烷萃取2次，有機(jī)層無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得中間體5-氟-1-甲基-1h-吲哚11g。將2，4-二氯-5-甲基嘧啶(12g，1.1eq)加入圓底燒瓶中，加入150ml乙二醇二甲醚，升溫至60攝氏度，一次性加入無水三氯化鐵(13g，1.1eq)，加入5-氟-1-甲基-1h-吲哚(11g，1.1eq)繼續(xù)攪拌反應(yīng)，tlc檢測反應(yīng)完畢后，將體系降至室溫，加入甲醇/水＝2/1的混合溶劑500ml，析出固體，過濾，固體用甲醇打漿洗滌，干燥得3-(2-氯-5-甲基嘧啶-4-基)-5-氟-1-甲基-1h-吲哚12g。b.2-((4-(4-(5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)5-甲氧基-2-硝基苯基)(甲基)胺基)乙基(甲基)胺基甲酸叔丁酯的合成:將3-(2-氯-5-甲基嘧啶-4-基)-5-氟-1-甲基-1h-吲哚(6g，1.0eq)，2-甲氧基-4-氟-5-硝基苯胺(4.45g，1.1eq)和對甲苯磺酸(4.1g，1.1eq)加入到250ml的單口瓶中， 加入60ml1,4-二氧六環(huán)，攪拌均勻后升溫至回流反應(yīng)，tlc及液質(zhì)跟蹤監(jiān)測至反應(yīng)完畢，自然降溫，析出大量固體，過濾，濾餅用少量甲醇洗滌，干燥得目標(biāo)中間體n-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-4-(5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-胺(7g，收率76％)。將n-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-4-(5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-胺(4.25g，1.0eq)，單boc保護(hù)的-n，n’-二甲基乙二胺(3g)，二異丙基乙基胺(3ml)，三氟乙醇50ml加入到封管中，100℃反應(yīng)約12小時，tlc顯示反應(yīng)完全，減壓蒸干溶劑，快速柱層析，二氯甲烷/甲醇100/1洗脫得2-((4-(4-(5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)5-甲氧基-2-硝基苯基)(甲基)胺基)乙基(甲基)胺基甲酸叔丁酯(5.46g，收率92％)。c.2-((2-丙烯酰胺基-4-(4-(5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)5-甲氧基苯基)(甲基)胺基)乙基(甲基)胺基甲酸叔丁酯(化合物1)的合成：取2-((4-(4-(5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)5-甲氧基-2-硝基苯基)(甲基)胺基)乙基(甲基)胺基甲酸叔丁酯(5.46g)加入到500ml的單口瓶中，加入無水甲醇(300ml)，氮?dú)庵脫Q，加入10％pd/c(400mg)，氫氣置換數(shù)次，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8h，tlc監(jiān)測反應(yīng)完成后，抽率，濾液減壓濃縮移除溶劑得到中間體胺。將所得中間體胺溶于50ml二氯甲烷中，向其中加入三乙胺(3.6g)，降溫至0攝氏度以下，向其中緩慢滴加丙烯酸酐(3.7g)，滴畢自然升至室溫反應(yīng)約1h，tlc監(jiān)測反應(yīng)完全，加入100ml水，等量二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮快速柱層析，二氯甲烷/甲醇50/1洗脫得得目標(biāo)產(chǎn)物2-((2-丙烯酰胺基-4-(4-(5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)5-甲氧基苯基)(甲基)胺基)乙基(甲基)胺基甲酸叔丁酯(化合物1)(2.39g，收率42％)。ms(m/z):[m+h]+618.4。實(shí)施例2：n-(5-(4-(5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)-4-甲氧基-2-(甲基(2-(甲胺基)乙基)胺基)苯基)丙烯酰胺(化合物2)的合成:將實(shí)施例1中所得化合物1(2.0g)溶于8ml二氯甲烷中，加入三氟乙酸4ml，室溫?cái)嚢?h，tlc檢測原料反應(yīng)完全，降溫至0攝氏度以下，加入80ml飽和碳酸氫鈉和80ml二氯甲烷，攪拌30分鐘，分液，水相用等量二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得目標(biāo)產(chǎn)物(化合物2)(1.53g，收率91％)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：10.38(s,1h),9.90(s,1h),9.63(s,1h),8.62(s,1h),8.15(s,2h),7.59(m,1h),7.30(m,1h),7.16(s,1h),7.00(s,1h),6.18(d,1h,j＝16.8hz),5.78(s,1h),5.66(d,1h,j＝8.8hz),3.97(s,3h),3.79(s,3h),3.37(s,2h),3.17(s,3h),3.12(s,2h),2.65(s,3h),2.45(s,3h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：167.2,164.0,160.7,158.3,152.1,151.3,144.6,143.9,140.7,134.2,133.2,127.9,127.8,126.4,122.4,116.5,112.4,112.3,112.2,111.9,111.8,109.6,109.3,105.7,56.5,50.9,45.9,42.7,34.3,32.8,18.6；ms(m/z):[m+h]+518.2。實(shí)施例3：n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-5-(4-(5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)-4-甲氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物3)的合成:a.n1-(2-(二甲胺基)乙基)-n4-(4-(5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)-5-甲氧基-n1-甲基苯-1,2,4三胺的合成：將n-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-4-(5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-胺(合成方法見實(shí)施例1)(7g，1eq)，三甲基乙二胺雙鹽酸鹽(5.7g，2eq)，三乙胺(8.3g，5eq)，三氟乙醇(100ml)加入到封管中，升溫至100攝氏度，隨反應(yīng)進(jìn)行體系逐漸溶解，約8h后tlc及液質(zhì)監(jiān)測反應(yīng)完畢，減壓濃縮至干，得粗品7.5g，未經(jīng)純化直接用于下一步反應(yīng)。將所得粗品(7.5g)和100ml甲醇加入到圓底燒瓶中，氮?dú)庵脫Q，加入10％鈀碳(750mg)后，氫氣置換3次，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，tlc跟蹤約10h反應(yīng)完畢，過濾，濾液減壓濃縮至干得5g粗品胺，未經(jīng)純化直接用于下一步。b.n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-5-(4-(5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)-4-甲氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物3)的合成:將粗品胺(5g，1eq)，碳酸鉀(2.9g，2eq)和150ml丙酮加入到圓底燒瓶中，體系降溫至-10攝氏度左右，滴入3-氯丙酰氯(2g，1.5eq)，立即有固體生成，滴畢，自然升至室溫?cái)嚢?，tlc監(jiān)測反應(yīng)完畢后，過濾得到濾餅5g。將該濾餅，三乙胺(4ml)和100ml乙腈加入到圓底燒瓶中，混合均勻后升溫至85攝氏度攪拌反應(yīng)，液質(zhì)監(jiān)測約7h后反應(yīng)完畢，體系自然降至室溫，向其中滴入水65ml，逐漸有大量固體析出，過濾并干燥得目標(biāo)產(chǎn)物n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-5-(4-(5-氟-1-甲基 -1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)-4-甲氧基-苯基)丙烯酰胺(1.8g，97.2％純度)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：10.09(s,1h),8.66(s,1h),8.19(s,1h),8.13(s,1h),8.10(m,1h),8.07(s,1h),7.48(m,1h),7.05(m,1h),7.01(s,1h),6.34(m,1h),6.15(dd,1h,j＝16.8hz,j＝5.2hz),5.70(m,1h),3.89(s,3h),3.79(s,3h),2.87(m,2h),2.72(s,3h),2.36(s,3h),2.32(m,2h),2.21(s,6h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：162.8,160.6,159.8,159.5,159.3,157.2,148.6,139.3,135.6,133.8,132.8,128.0,127.7,127.6,126.4,125.7,116.9,116.3,112.7,111.3,111.2,110.9,110.6,108.8,108.6,106.1,57.4,56.2,45.7,42.7,33.7,18.3；ms(m/z):[m+h]+532.2。實(shí)施例4：n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-5-(4-(5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)-4-乙氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物4)的合成:a.2-乙氧基-4-氟-5-硝基苯胺的合成將5-氟-2-硝基苯酚(120g，1eq)，碳酸鉀(316g，3eq)混懸于2ldmf中，滴入溴乙烷(166g，2eq)，升溫至37℃攪拌反應(yīng)，tlc檢測反應(yīng)完畢后，將體系倒入冰水中，產(chǎn)物析出，過濾水洗得5-氟-2-硝基苯乙醚(138.6g，收率98％)。將5-氟-2-硝基苯乙醚(68g)溶于1l甲醇中，氮?dú)庵脫Q，加入鈀碳(5g)后，氫氣置換2次，室溫?cái)嚢杓託?，約4h后tlc檢測反應(yīng)完畢后，過濾，濾液減壓蒸出溶劑得4-氟-2-乙氧基苯胺(56g)。-10℃以下，將4-氟-2-乙氧基苯胺(30g)溶于30ml濃硫酸中，將硝酸鉀(22g)分批加入體系中，然后自然升至室溫?cái)嚢?，tlc監(jiān)測反應(yīng)完畢后，將體系緩慢倒入600ml冰水中，滴入濃氨水調(diào)ph至7-8，加入二氯甲烷萃取數(shù)次，有機(jī)相無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后柱層析得2-乙氧基-4-氟-5-硝基苯胺(16.3g，收率42％)。b.n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-5-(4-(5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)-4-乙氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物4)的合成:與實(shí)施例3類似的方法，以4-氟-2-乙氧基-5-硝基苯胺為原料可以得到n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-5-(4-(5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)-4-乙氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物4)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：10.08(s,1h),8.77(s,3h),8.21(s,1h),8.14(s,2h),7.97(s,1h),7.48(m,1h),7.04(m,1h),7.00(s,1h),6.34(m,1h),6.14(d,1h,j＝16.8hz),5.69(d,1h,j＝9.6hz),4.06(m,2h),3.89(s,3h),2.86(m,2h),2.70(s,3h),2.37(s,3h),2.30(m,2h),2.20(s,6h),1.27(m,3h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：162.7，160.6,159.6,159.5,159.3,157.2,147.1,138.8,135.6,133.8,132.8,128.2,127.7,127.6,126.3,126.2,116.5,115.9,112.7,112.6,111.4,111.3,110.9,110.6,108.8,108.5,107.3,64.6,57.4,56.4,45.7,42.8,33.7,18.2,15.2；ms(m/z):[m+h]+546.2。實(shí)施例5：n-(5-(4-(1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-乙氧基苯基)丙烯酰胺(化合物5)的合成:a.n-(2-乙氧基-4-氟-5-硝基苯基)-4-(1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-胺的合成將2，4-二氯嘧啶(17.9g，1.1eq)加入圓底燒瓶中，加入100ml乙二醇二甲醚和無水三氯化鐵(21.1g，1.2eq)，氮?dú)庵脫Q后升溫至60攝氏度，滴加1h-吲哚(12.7g，1eq)，滴畢繼續(xù)攪拌反應(yīng)，tlc檢測反應(yīng)完畢后，將體系降至室溫，加入水150ml，無固體析出，等量乙酸乙酯萃取3次，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后柱層析得中間體3-(2-氯嘧啶-4-基)-1h-吲哚(8.8g，收率25％)。將3-(2-氯嘧啶-4-基)-1h-吲哚(2.78g，1eq)和2-乙氧基-4-氟-5-硝基苯胺(2.7g，1.2eq) 混懸于70ml正丁醇中，加入對甲苯磺酸(2.71g,1.3eq)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下升溫至105攝氏度反應(yīng)約5h，tlc顯示反應(yīng)完全，停止加熱，自然降至室溫析出大量固體，抽率，濾餅真空干燥得目標(biāo)中間體n-(2-乙氧基-4-氟-5-硝基苯基)-4-(1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-胺(3.1g,65％收率)。b.n-(5-(4-(1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-乙氧基苯基)丙烯酰胺(化合物5)的合成:與實(shí)施例3類似的方法，以n-(2-乙氧基-4-氟-5-硝基苯基)-4-(1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-胺和4-氟-2-乙氧基-5-硝基苯胺為原料可以得到n-(5-(4-(1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-乙氧基苯基)丙烯酰胺(化合物5)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：11.83(s,1h),10.19(s,1h),9.08(s,1h),8.57(s,1h),8.32(m,2h),7.92(s,1h),7.46(m,1h),7.28(d,1h,j＝3.6hz),7.15(m,1h),7.09(m,1h),7.01(s,1h),6.43(m,1h),6.30(d,1h,j＝16.8hz)，5.76(d,1h,j＝9.6hz),4.10(m,2h),2.87(m,2h),2.71(s,3h),2.29(m,2h),2.20(s,6h),1.34(m,3h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：162.9,162.8,160.6,157.8,146.0,138.2,137.7,132.7,130.1,128.2,126.7,126.1,125.5,122.4,122.0,121.0,114.7,114.0,112.5,107.8,106.9，64.7,57.4,56.3,45.7,43.1,15.2；ms(m/z):[m+h]+500.3。實(shí)施例6：n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-乙氧基-5-(4-(5-氟-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-苯基)丙烯酰胺(化合物6)的合成:與實(shí)施例5類似的方法，以5-氟-1h-吲哚為原料可以得到n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-乙氧基-5-(4-(5-氟-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-苯基)丙烯酰胺(化合物6)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：10.15(s,1h),9.93(s,1h),8.55(s,1h),8.29(d,1h,j＝4.8hz),8.05(m,2h),7.47(m,1h),7.24(d,1h,j＝5.2hz),6.99(m,2h),6.39(m,1h),6.24(d,1h,j＝16.8hz),5.73(d,1h,j＝9.6hz),4.08(m,2h),2.87(m,2h),2.71(s,3h),2.31(m,2h),2.21(s,6h),1.30(m,3h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：162.8,162.5,160.8,159.4,157.6,157.1,146.8,138.6,134.4,132.8,131.7,128.2,126.5,126.1,126.0,125.9,115.4,114.0,113.5,113.4,110.6,110.4,107.5,107.3,107.2,64.6,57.4,56.4,45.7,42.9,15.2；ms(m/z):[m+h]+518.3。實(shí)施例7：n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-乙氧基-5-(5-甲基-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-苯基)丙烯酰胺(化合物7)的合成:與實(shí)施例4類似的方法，以1-甲基-1h-吲哚為原料可以得到n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-乙氧基-5-(5-甲基-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-苯基)丙烯酰胺(化合物7)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：10.10(s,1h),8.83(s,1h),8.35(d,1h,j＝7.2hz),8.23(s,1h),8.07(s,1h),7.84(s,1h),7.47(d,1h,j＝8.0hz),7.20(m,2h),7.04(m,1h),6.99(s,1h),6.39(m,1h),6.18(d,1h,j＝16.8hz)，5.71(d,1h,j＝10.0hz),4.07(m,2h),3.89(s,3h),2.86(m,2h),2.70(s,3h),2.36(s,3h),2.29(m,2h),2.20(s,6h),1.30(m,3h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：162.8,161.0,159.4,159.2,146.7,138.6,137.1,134.0,132.8,128.0,127.2,126.4,126.3,123.5,122.5,120.8,116.9,115.8,112.7,110.3,107.0,64.6,57.4,56.3,45.7,43.0,33.4,18.2,15.2；ms(m/z):[m+h]+528.2。實(shí)施例8：2-((2-丙烯酰胺基-5-(二氟甲氧基)-4-(5-甲基-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)苯基)(甲基)胺基)乙基(甲基)胺基甲酸叔丁酯(化合物8)的合成:a.2-二氟甲氧基-4-氟-5-硝基苯胺的合成：將5-氟-2-硝基苯酚(50g，1eq)，碳酸鉀(66g，1.5eq)和一氯二氟乙酸鈉(72g)混懸于800mldmf中，90℃攪拌反應(yīng)，tlc檢測反應(yīng)完畢后，100℃減壓蒸出溶劑，加入800ml水，等量二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)層，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后柱層析得4-氟-2-二氟甲氧基硝基苯(34.3g，收率52％)。將4-氟-2-二氟甲氧基硝基苯(31g)溶于600ml甲醇中，氮?dú)庵脫Q后，加入鈀碳(2.4g)后，氫氣置換2次，室溫?cái)嚢杓託?，tlc監(jiān)測約7h反應(yīng)完畢，過濾，濾液減壓濃縮至干得4-氟-2-二氟甲氧基苯胺(26.3g)。-10℃下，將4-氟-2-二氟甲氧基苯胺(26g)溶于50ml濃硫酸中，分批加入硝酸鉀(20g)，完全加畢，自然回復(fù)至室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，tlc監(jiān)測約2h反應(yīng)完畢，將體系緩慢倒入1l飽和nahco3冰水中，有固體析出，抽濾，濾液加入等量二氯甲烷萃取3次，濾餅溶于二氯甲烷萃取液后再次過濾，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后柱層析得2-二氟甲氧基-4-氟-5-硝基苯胺(22.8g，收率70％)。b.2-((2-丙烯酰胺基-5-(二氟甲氧基)-4-(5-甲基-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)苯基)(甲基)胺基)乙基(甲基)胺基甲酸叔丁酯(化合物8)的合成:與實(shí)施例1類似的方法，以2-二氟甲氧基-4-氟-5-硝基苯胺為原料可以得到2-((2-丙烯酰胺基-5-(二氟甲氧基)-4-(5-甲基-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)苯基)(甲基)胺基)乙基(甲基)胺基甲酸叔丁酯(化合物8)。ms(m/z):[m+h]+636.3。實(shí)施例9：n-(4-二氟甲氧基)-2-(甲基(2-(甲胺基)乙基)胺基)-5-(5-甲基-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-苯基)丙烯酰胺(化合物9)的合成:與實(shí)施例2類似的方法，將實(shí)施例8中所得化合物8脫去boc可以得到n-(4-二氟甲氧基)-2-(甲基(2-(甲胺基)乙基)胺基)-5-(5-甲基-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-苯基)丙烯酰胺(化合物9)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：10.34(s,1h),10.11(s,1h),9.52(s,1h),8.55(s,2h),8.36(s,1h),8.20(m,1h),7.56(d,1h,j＝6.8hz),7.30(m,2h),7.20(s,1h),7.13(m,1h),6.20(d,1h,j＝16.8hz)，5.70(d,1h,j＝9.2hz),3.95(s,3h),3.15(m,2h),2.67(s,3h),2.55(m,5h),2.46(s,3h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：167.3,164.3,152.2,144.5,144.4,142.9,139.6,137.5,132.8,130.9,127.1,124.1,123.9,123.0,119.7,117.1,114.5,112.7,111.9,111.1,50.9,45.8,42.5,34.0,32.8,18.6；esi-ms(m/z):[m+h]+536.2實(shí)施例10：n-(5-(4-(1,2-二甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)-2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-甲氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物10)的合成:與實(shí)施例3類似的方法，以1,2二甲基-1h-吲哚為原料可以得到n-(5-(4-(1,2-二甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)-2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-甲氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物10)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：10.05(s,1h),8.86(s,1h),8.36(s,1h),7.83(s,1h),7.47(d,1h,j＝7.6hz),7.29(m,1h),7.11(m,1h),7.02(m,1h),6.95(s,1h),6.37(m,1h),6.22(d,1h,j＝16.8hz)，5.73(d,1h,j＝8.8hz),3.83(s,3h),3.73(s,3h),2.84(m,2h),2.67(s,3h),2.41(s,3h),2.27(m,2h),2.18(s,6h),2.05(s,3h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：162.8,162.2,159.5,159.1,146.8,138.4,137.6,136.6,132.8,127.8,126.4,126.3,125.8,121.1,120.1,119.9,119.4,114.9,111.1,110.0,105.5,57.3,56.4,45.6,42.9,30.0,15.9,11.7；ms(m/z):[m+h]+528.3。實(shí)施例11：n-(5-(4-(1,2-二甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)-2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-乙氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物11)的合成:與實(shí)施例4類似的方法，以1,2二甲基-1h-吲哚為原料可以得到n-(5-(4-(1,2-二甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)-2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-乙氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物11)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：10.04(s,1h),8.92(s,1h),8.37(s,1h),7.76(s,1h),7.48(d,1h,j＝7.6hz),7.28(m,1h),7.12(m,1h),7.03(m,1h),6.94(s,1h),6.34(m,1h),6.21(d,1h,j＝16.4hz)，5.73(d,1h,j＝8.8hz),4.08(m,2h),3.74(s,3h),2.83(m,2h),2.66(s,3h),2.42(s,3h),2.25(m,2h),2.17(s,6h),2.05(s,3h),1.34(m,3h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：162.8,162.3,159.5,159.0,145.5,138.1,137.6,136.6,132.8,128.0,126.4,126.2,121.1,120.1,119.3,114.3,111.1,110.0,106.6,64.7,57.3,56.1,45.6,43.0,30.0,15.9,15.2,11.7；ms(m/z):[m+h]+542.2。實(shí)施例12：n-(5-(4-(1,2-二甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-甲氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物12)的合成:與實(shí)施例3類似的方法，以1,2二甲基-1h-吲哚和2,4-二氯嘧啶為原料可以得到n-(5-(4-(1,2-二甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-甲氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物12)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：10.11(s,1h),8.77(s,1h),8.37(d,1h,j＝7.2hz),8.04(s,1h),7.98(d,1h,j＝8.0hz),7.47(d,1h,j＝8.0hz),7.15(m,1h),7.07(m,1h),7.02(m,1h),6.99(s,1h),6.36(m,1h),6.20(dd,1h，j＝16.4hz,j＝2.0hz)，5.73(m,1h),3.83(s,3h),3.71(s,3h),2.89(m,2h),2.71(s,3h),2.65(s,3h),2.30(m,2h),2.21(s,6h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：163.0,162.9,161.0,157.9,148.1,140.1,139.3,137.0,132.8,127.8,126.5,126.2,125.4,121.7,120.9,120.1,116.8,110.6,110.5,110.1,105.7,57.4,56.4,45.6,42.9,30.0,12.4；ms(m/z):[m+h]+514.3實(shí)施例13：n-(5-(4-(1,2-二甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-乙氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物13)的合成:與實(shí)施例4類似的方法，以1,2二甲基-1h-吲哚和2，4-二氯嘧啶為原料可以得到n-(5-(4-(1,2-二甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-乙氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物13)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：10.10(s,1h),8.81(s,1h),8.38(d,1h，j＝5.2hz),7.97(m,2h),7.49(d,1h,j＝8.0hz),7.15(m,1h),7.07(m,1h),7.02(m,1h),6.99(s,1h),6.37(m,1h),6.20(dd,1h,j＝16.4hz,j＝1.6hz),5.73(m,1h),4.09(m,2h),3.73(s,3h),2.87(m,2h),2.70(s,3h),2.67(s,3h),2.30(m,2h),2.21(s,6h),1.31(m,3h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：162.9,160.9,157.9,146.8,140.2,139.0,137.0,132.8,127.9,126.5,126.1,125.8,121.7,120.9,120.0,116.2,110.7,110.5,110.2,106.9,64.7,57.3,56.1,45.6,30.0,15.2,12.4；ms(m/z):[m+h]+528.3實(shí)施例14：n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-5-(4-(5-氟-1,2-二甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)-4-甲氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物14)的合成:與實(shí)施例3類似的方法，以5-氟-1,2-二甲基-1h-吲哚為原料可以得到n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-5-(4-(5-氟-1,2-二甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)-4-甲氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物14)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：10.05(s,1h),8.84(s,1h),8.36(s,1h),7.88(s,2h),7.50(m,1h),6.95-7.04(m,3h),6.34(m,1h),6.20(dd,1h,j＝16.8hz,j＝2.0hz),5.72(m,1h),3.84(s,3h),3.74(s,3h),2.85(m,2h),2.68(s,3h),2.41(s,3h),2.28(m,2h),2.19(s,6h),2.05(s,3h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：162.8,161.7,159.7,159.2,159.1,156.8,147.1,139.5,138.5,133.4,132.8,127.9,126.6,126.5,126.3,125.8,119.8,115.1，111.3,111.1,111.0,109.1,108.9,105.6,104.3,104.1,57.4,56.4,45.6,42.9,30.2,15.8,12.0；ms(m/z):[m+h]+546.3。實(shí)施例15：n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-乙氧基-5-(4-(5-氟-1,2-二甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-苯基)丙烯酰胺(化合物15)的合成:與實(shí)施例4類似的方法，以5-氟-1,2-二甲基-1h-吲哚和2,4-二氯嘧啶為原料可以得到n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-乙氧基-5-(4-(5-氟-1,2-二甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-苯基)丙烯酰胺(化合物15)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：10.07(s,1h),8.77(s,1h),8.37(d,1h，j＝5.2hz),8.04(s,1h),7.75(m,1h),7.50(m,1h),6.95-7.02(m,3h),6.34(m,1h),6.16(m,1h),5.72(d,1h,j＝9.6hz),4.08(m,2h),3.74(s,3h),2.86(m,2h),2.70(s,3h),2.67(s,3h),2.30(m,2h),2.20(s,6h),1.30(m,3h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：162.8,162.5,161.0,159.6,158.0,157.3,177.2,141.8,139.1,133.7,132.8,128.0,126.6,126.5,126.4,125.8,116.4,111.2,111.1,110.7,110.1,109.7,109.4,107.1,105.7,105.5,64.6,57.4,56.3,45.7,42.9,30.3,15.2,12.7；ms(m/z):[m+h]+546.2。實(shí)施例16：n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-5-(4-(5-氟-1-(2-甲氧基乙基)-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(化合物16)的合成:a.5-氟-1-(2-甲氧基乙基)-1h-吲哚的合成：將原料5-氟吲哚(5.0g,1eq)加入到圓底燒瓶中，加入50mldmf，體系置于0攝氏度低溫加入氫化鈉，攪拌20分鐘后滴入氯乙基甲基醚(5.2g,1.5eq)，滴畢，自然升溫至室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，tlc監(jiān)測至反應(yīng)完畢，將體系倒入400ml水中，等量二氯甲烷萃取3次，有機(jī)層無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后得產(chǎn)物6g，收率82％。b.n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-5-(4-(5-氟-1-(2-甲氧基乙基)-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(化合物16)的合成：與實(shí)施例3類似的方法，以5-氟-1-(2-甲氧基乙基)-1h-吲哚和2,4-二氯嘧啶為原料可以得到n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-5-(4-(5-氟-1-(2-甲氧基乙基)-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(化合物16)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：10.18(s,1h),8.95(s,1h),8.61(s,1h),8.30(d,1h,j＝5.2hz),8.10(s,1h),8.03(m,1h),7.60(m,1h),7.19(d,1h,j＝5.2hz),7.00-7.08(m,2h),6.37(m,1h),6.22(m,1h),5.74(m,1h),4.54(m,2h),3.84(s,3h),3.72(m,2h),3.22(s,3h),2.89(m,2h),2.73(s,3h),2.33(m,2h),2.23(s,6h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：162.9,161.9,160.7,159.7,158.0,157.4,147.5,138.6,134.9,134.3,132.8,128.2,126.4,126.2,125.6,115.2,113.2,112.3,112.0,110.6,110.4,107.4,107.3,106.0,71.1,58.6,57.4,56.4,46.6,45.7,42.9；ms(m/z):[m+h]+562.3。實(shí)施例17：n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-乙氧基-5-(4-(5-氟-1,2-二甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)-苯基)丙烯酰胺(化合物17)的合成:與實(shí)施例4類似的方法，以5-氟-1,2-二甲基-1h-吲哚為原料可以得到n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-乙氧基-5-(4-(5-氟-1,2-二甲基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)-苯基)丙烯酰胺(化合物17)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：10.04(s,1h),8.91(s,1h),8.38(s,1h),7.80(s,1h),7.50(m,1h),6.95-7.03(m,3h),6.34(m,1h),6.19(m,1h),5.72(m,1h),4.09(m,2h),3.75(s,3h),2.83(m,2h),2.66(s,3h),2.42(s,3h),2.27(m,2h),2.19(s,6h),2.05(s,3h),1.34(m,3h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：162.8,161.7,159.7,159.1,159.0,156.8,145.7,139.6,138.1,133.4,132.8,127.9,126.6,126.5,126.4,126.2,119.9,114.4,111.2,111.1,109.1,108.9,106.7,104.3,104.0,64.7,57.3,45.6,42.9,30.3,15.8,15.2,12.0；ms(m/z):[m+h]+560.4。實(shí)施例18：n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-甲氧基-5-(4-(2-甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)苯基)丙烯酰胺(化合物18)的合成:與實(shí)施例3類似的方法，以2二甲基-1h-吲哚和2,4-二氯嘧啶為原料可以得到n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-甲氧基-5-(4-(2-甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)苯基)丙烯酰胺(化合物18)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：11.56(s,1h),10.14(s,1h),8.75(s,1h),8.35(d,1h,j＝5.2hz),8.01-8.06(s,2h),7.33(d,1h,j＝8.0hz),7.01-7.09(m,4h),6.38(m,1h),6.20(dd,1h,j＝16.8hz,j＝2.8hz)，5.73(m,1h),3.83(s,3h),2.88(m,2h),2.72(s,3h),2.64(s,3h),2.29(m,2h),2.21(s,6h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：163.2,162.9,161.0,157.7,148.2,139.5,139.3,135.6,132.8,127.9,127.1,126.5,125.5,121.6,120.7,120.6,117.0,111.3,110.1,119.7,105.8,57.4,56.4,56.2,45.7,43.0,14.8；ms(m/z):[m+h]+500.1實(shí)施例19：n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-5-(4-(5-氟-1,2-二甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-4-甲氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物19)的合成:與實(shí)施例3類似的方法，以5-氟-1,2-二甲基-1h-吲哚和2,4二氯嘧啶為原料可以得到n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-5-(4-(5-氟-1,2-二甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-4-甲氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物19)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：10.12(s,1h),8.68(s,1h),8.35(d,1h,j＝5.2hz),8.17(s,1h),7.75(m,1h),7.49(m,1h),6.97-7.01(m,3h),6.36(m,1h),6.16(m,1h),5.72(m,1h),3.82(s,3h),3.73(s,3h),2.87(m,2h),2.72(s,3h),2.66(s,3h),2.30(m,2h),2.20(s,6h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：162.8,162.5,161.2,159.6,158.0,157.2,148.6,141.8,139.6,133.7,132.7,127.9,126.6,126.5,126.4,125.3,117.2,111.2,111.1,110.7,110.0,109.7,109.4,105.9,105.8,105.5,57.4,56.3,45.7,42.8,30.3,12.8；ms(m/z):[m+h]+532.2。實(shí)施例20：n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-5-(4-(1-乙基-5-氟-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(化合物20)的合成:a.5-氟-1-乙基-1h-吲哚的合成：將原料5-氟吲哚(5.0g,1eq)加入到圓底燒瓶中，加入50mldmf，體系置于0攝氏度低溫加入60％氫化鈉(3.0g,2eq)，攪拌20分鐘后滴入溴乙烷(6.0g,1.5eq)，滴畢，自然升溫至室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，tlc監(jiān)測至反應(yīng)完畢，將體系倒入400ml水中，等量二氯甲烷萃取3次，有機(jī)層無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后得產(chǎn)物5.5g，收率91％。b.n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-5-(4-(1-乙基-5-氟-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(化合物20)的合成：與實(shí)施例3類似的方法，以5-氟-1-乙基-1h-吲哚和2,4-二氯嘧啶為原料可以得到n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-5-(4-(5-氟-1-(2-甲氧基乙基)-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(化合物20)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：10.14(s,1h),8.97(s,1h),8.67(s,1h),8.30(d,1h,j＝5.2hz),8.09(s,1h),8.03(m,1h),7.58(m,1h),7.20(d,1h,j＝5.2hz),7.07(m,1h),7.04(s,1h),6.47(m,1h),6.23(m,1h)，5.75(m,1h),4.32(m,2h),3.84(s,3h),2.93(m,2h),2.71(s,3h),2.40(m,2h),2.27(s,6h),1.42(m,3h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：163.0,161.9,160.7,159.7,158.0,157.4，147.3,138.6,134.0,133.8,132.9,128.0,126.4,126.3,126.2,125.7,115.2,113.2,112.1,112.0,110.7,110.4,107.5,107.3,105.9,57.0,56.4,45.4,43.0,15.8；ms(m/z):[m+h]+532.3。實(shí)施例21：n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-甲氧基-5-(4-(5-氟-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-苯基)丙烯酰胺(化合物21)的合成:與實(shí)施例5類似的方法，以5-氟-1h-吲哚和2-甲氧基-4-氟-5-硝基苯胺為原料可以得 到n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-4-甲氧基-5-(4-(5-氟-1h-吲哚-3-基)嘧啶-2-基胺基)-苯基)丙烯酰胺(化合物21)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：11.88(s,1h),10.15(s,1h),8.86(s,1h),8.51(s,1h),8.27(m,1h),8.16(s,1h),8.05(m,1h),7.43(m,1h),7.22(m,1h),7.10(m,1h),7.02(m,2h),6.37(m,1h),6.24(d,1h,j＝16.8hz)，5.74(d,1h,j＝9.2hz),3.82(s,3h),2.89(m,2h),2.73(s,3h),2.32(m,2h),2.22(s,6h)；13c-nmr(100mhz,dmso-d6,δppm)：162.8,162.6,161.0,159.5,157.6,157.2，148.0,139.0,134.2,132.8,131.3,128.1,126.5,126.1,126.0,125.5,116.1,114.2,114.1,113.3,113.2,110.7,110.5，107.6，107.4,107.2，106.0，57.4,56.4,56.3,45.7,42.8；ms(m/z):[m+h]+504.2。實(shí)施例22：n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-5-(4-(5-氟-1-乙基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)-4-甲氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物22)的合成:與實(shí)施例3類似的方法，以5-氟-1-乙基-1h-吲哚為原料可以得到n-(2-((2-(二甲胺基)乙基)(甲基)胺基)-5-(4-(5-氟-1-乙基-1h-吲哚-3-基)-5-甲基嘧啶-2-基胺基)-4-甲氧基-苯基)丙烯酰胺(化合物22)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6,δppm)：10.10(s,1h),8.91(s,1h),8.67(s,1h),8.30(d,1h,j＝5.2hz),8.09(s,1h),8.03(m,1h),7.58(m,1h),7.20(d,1h,j＝5.2hz),7.07(m,1h),7.04(s,1h),6.47(m,1h),6.23(m,1h)，5.75(m,1h),4.32(m,2h),3.84(s,3h),3.79(s,3h),2.93(m,2h),2.71(s,3h),2.40(m,2h),2.27(s,6h),1.42(m,3h)；ms(m/z):[m+h]+546.3。以下化合物也可以通過上述實(shí)施例中的類似合成方法獲得：生物學(xué)實(shí)驗(yàn)1)癌細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)：可以使用以下試驗(yàn)來測定本發(fā)明所述部分化合物對人鱗狀表皮癌a431(egfr-wt高表達(dá))、人非小細(xì)胞肺癌nci-h1975(egfrt790m突變)和hcc827人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(egfre746-a750del)的增殖抑制作用。a)本發(fā)明化合物對egfr-wt高表達(dá)a431細(xì)胞增殖抑制作用分析本發(fā)明化合物對egfr高表達(dá)人鱗狀表皮癌a431(購自atcc)的增殖抑制測定采用srb方法，srb(磺酰羅丹明b)是一種粉紅色陰離子染料，在酸性條件下可特異性地與細(xì)胞內(nèi)組成蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合，在540nm波長下產(chǎn)生吸收峰，吸光值與細(xì)胞量成線性正相關(guān)。a431細(xì)胞在含10％胎牛血清、2mm谷氨酰胺和非必需氨基酸的高糖dmem培養(yǎng)基中，37℃、5％co2的條件下培養(yǎng)，應(yīng)用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(edta)從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中收獲細(xì)胞。細(xì)胞以3000/孔(100μl培養(yǎng)基)加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)過夜，加入不同濃度待測化合物的新鮮培養(yǎng)基(100μl)，dmso的最終濃度為0.2％，將細(xì)胞培養(yǎng)板在37℃，5％的co2條件下溫育72h，去除培養(yǎng)液，然后加入4℃預(yù)冷的tca(即三氯乙酸)溶液(10％，w/v)，靜置5min移入4℃冰箱中固定1h，取出用去離子水沖洗5遍，室溫晾干。待96孔板室溫下晾干后，每孔加入0.4％(w/v)的srb染液(1％的乙酸配制)50μl，染色30min后倒掉染液，用1％(v/v)乙酸沖洗5次，去除未結(jié)合的染料，室溫晾干。用100μl非緩沖tris-base堿液(10mm，ph＝10.5)溶解與細(xì)胞蛋白結(jié)合的染料，水平搖床上振蕩20min，采用酶標(biāo)儀540nm處測定光吸收值，采用graphpadprism4分析數(shù)據(jù)，求ic50，結(jié)果如表1所示。表1：本發(fā)明化合物對a431細(xì)胞增殖的抑制作用注：陽性對照藥物：azd-9291。b)本發(fā)明化合物對耐藥細(xì)胞株nci-h1975的增殖抑制作用分析本發(fā)明化合物對耐藥細(xì)胞株nci-h1975(該細(xì)胞是egfrt90m突變的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，對吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼等egfr酪氨酸激酶抑制劑耐藥)(購自上海細(xì)胞所)的增殖抑制活性采用srb方法進(jìn)行測定。nci-h1975在含10％胎牛血清、2mm谷氨酰胺和非必需氨基酸的rpmi1640培養(yǎng)基中，37℃、5％co2的條件下培養(yǎng)，應(yīng)用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(edta)從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中收獲細(xì)胞。細(xì)胞以5000/孔(100μl培養(yǎng)基)加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)過夜，加入不同濃度待測化合物的新鮮培養(yǎng)基(100μl)，dmso的最終濃度為0.25％，將細(xì)胞培養(yǎng)板在37℃，5％的co2條件下溫育72h，去除培養(yǎng)液，然后加入4℃預(yù)冷的tca(即三氯乙酸)溶液(10％，w/v)，靜置5min移入4℃冰箱中固定1h，取出用去離子水沖洗5遍，室溫晾干。待96孔板室溫下晾干后，每孔加入0.4％(w/v)的srb染液(1％的乙酸配制)50μl，染色30min后倒掉染液，用1％(v/v)乙酸沖洗4次，去除未結(jié)合的染料，室溫晾干。用100μl非緩沖tris-base堿液(10mm，ph＝10.5)溶解與細(xì)胞蛋白結(jié)合的染料，水平搖床上振蕩20min，采用酶標(biāo)儀540nm處測定光吸收值，采用graphpadprism4分析數(shù)據(jù)，求ic50，結(jié)果如表2所示。表2：本發(fā)明化合物對nci-h1975細(xì)胞的增殖抑制作用測試物ic50(nm)selectivitya化合物25.85265.91化合物32.36889.15化合物43.151208.0化合物53.35921.24化合物63.0273.218化合物72.91189.25化合物94.47247.27化合物1065.544---化合物11104.723---化合物122.134194.9化合物135.04680.9化合物1437.921---化合物155.017〉200化合物161.021170.4化合物1782.531---化合物181.74364.8化合物192.217〉454化合物202.031171.4化合物211.5380.1168化合物23〉200---化合物26〉200---化合物28〉200---化合物41102.5---化合物424.32280化合物46〉200---陽性對照b2.563.3注：a,selectivity為化合物對egfr-wt高表達(dá)a431細(xì)胞抑制活性(ic50)與對egfr-t790m突變耐藥nci-h1975細(xì)胞抑制活性(ic50)的比值，該比值代表著對egfr-t790m耐藥突變的選擇性，比值越大，選擇性越好，針對耐藥突變同等有效劑量下對egfr-wt激酶抑制作用越弱，因此可以降低因egfr-wt激酶過強(qiáng)抑制而引起的毒副作用；b,陽性對照藥物：azd-9291。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看到，本發(fā)明化合物對egfrt790m突變耐藥細(xì)胞株h1975細(xì)胞的增殖具有較強(qiáng)的抑制活性，其在納摩爾(nmol/l)濃度下就能有效抑制egfr-t790m高表達(dá)h1975細(xì)胞的增殖，其中化合物3、12、16、18、19、20、21等對egfrt790m突變耐藥細(xì)胞株h1975細(xì)胞的增殖抑制活性優(yōu)于對照藥物azd-9291。本發(fā)明化合物對egfr-wt高表達(dá)a431腫瘤細(xì)胞也有一定的抑制作用，但活性低于對egfrt790m突變耐藥細(xì)胞的抑制活性。此外，大部分本發(fā)明化合物如化合物2、3、4、7、12、13、15、16、18、19、20等針對egfr-t790m耐藥表現(xiàn)出比azd-9291更高的選擇性。2)部分化合物在不同種屬血漿中的穩(wěn)定性測試選擇藥效及選擇性均較好的受試化合物進(jìn)行人、sd大鼠、beagle犬和裸小鼠血漿中的穩(wěn)定性測試：配制總體積為300μl的含藥血漿溶液，包括介質(zhì)為285μl的空白血漿，15μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，終濃度以各化合物計(jì)為100ng/ml。渦旋混勻后，分取90μl進(jìn)入0.5ml的ep管，37℃孵育1.0h。反應(yīng)結(jié)束后，加入400μl冰冷乙腈終止反應(yīng)。取反應(yīng)終止液，渦旋1min，12000rpm下離心10min；取上清液100μl，加入200μl乙腈-水(50/50，v/v)，渦旋1min，12000rpm下離心10min，取上清液2.0μl進(jìn)樣分析。采用lc/ms/ms方法檢測待測藥物的剩余含量，結(jié)果如表3。表3：本發(fā)明化合物在不同種屬血漿中的穩(wěn)定性注：陽性對照藥物：azd-9291。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看到，本發(fā)明大多數(shù)化合物如化合物2、3、4、7、13、15、16、18、20等在人血漿中穩(wěn)定性均顯著優(yōu)于azd-9291，提示可能在人體上會有更優(yōu)的藥效。當(dāng)前第1頁12