一種截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶，其核苷酸序列及應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域。涉及虎眼萬(wàn)年青中的截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶，其編碼基因及其在催化底物尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸為尿苷-5’-二磷酸木糖反應(yīng)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶(UXS)是生物體內(nèi)生成尿苷-5’-二磷酸木糖(UDP-木糖)的關(guān)鍵酶。UXS能將尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-葡萄糖醛酸)脫去羧基而形成UDP-木糖(圖1)。UDP-木糖是一個(gè)在糖蛋白、多糖和各種經(jīng)過(guò)糖基修飾的次生代謝產(chǎn)物，如黃酮苷、三萜皂苷、甾體皂苷等生物合成中重要的糖基供體，它廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌中。許多糖基化的化合物與其苷元相比具有更好的水溶性，可以使化合物的成藥性增加。但UDP-木糖含量低，合成困難，導(dǎo)致價(jià)格昂貴，不利于木糖苷的合成，給創(chuàng)新藥物的研制帶來(lái)了很大的困難。通過(guò)UXS對(duì)UDP-葡萄糖醛酸的催化，一步反應(yīng)就能將UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)化為UDP-木糖，從而可以給天然產(chǎn)物的糖苷化提供穩(wěn)定而廉價(jià)的糖基供體，這可以帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)利益。因此，克隆UXS基因并對(duì)其進(jìn)行功能鑒定對(duì)于酶催化合成UDP-木糖這一化合物或者通過(guò)合成生物學(xué)技術(shù)規(guī)?；苽淠咎擒仗烊划a(chǎn)物，減少由于化學(xué)合成以及植物提取木糖苷類(lèi)天然產(chǎn)物等傳統(tǒng)方法對(duì)環(huán)境和物種造成的壓力，從而促進(jìn)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展具有很重要的意義。UXS在植物中以多基因家族存在，在UXS基因家族中存在膜結(jié)合型和細(xì)胞質(zhì)溶型兩種類(lèi)別。細(xì)胞質(zhì)溶型的UXS在原核系統(tǒng)中容易以可溶性蛋白表達(dá)，而膜結(jié)合型的UXS在原核系統(tǒng)中難以可溶性表達(dá)，通常不表達(dá)或表達(dá)成包涵體的形式。所以本發(fā)明，采取截短蛋白質(zhì)N末端氨基酸序列的方法去除膜結(jié)合型UXS的跨膜區(qū)，使得原核細(xì)胞能產(chǎn)生可溶性UXS，獲得具備功能的截短型UXS。迄今為止，已在植物如十字花科植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)，禾本科植物大麥(Hordeumvulgare)，細(xì)菌如草木樨中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)中發(fā)現(xiàn)并克隆得到UDP-木糖合成酶基因，而尚沒(méi)有從天門(mén)冬科科植物虎眼萬(wàn)年青(Ornithogalumcaudatum)中分離得到該蛋白的報(bào)道。通過(guò)提取虎眼萬(wàn)年青RNA，利用RT-PCR，從虎眼萬(wàn)年青無(wú)菌鱗莖中克隆得到OsaUXS3基因，并對(duì)其進(jìn)行了功能鑒定，這是首次從虎眼萬(wàn)年青植物中克隆得到這個(gè)基因。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種來(lái)源于虎眼萬(wàn)年青的截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成 酶、編碼該酶的核苷酸序列、含有該核苷酸序列的表達(dá)載體、含有該核苷酸序列或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，以及其在催化底物尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸反應(yīng)中的應(yīng)用。為解決本發(fā)明的技術(shù)問(wèn)題，采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明技術(shù)方案的第一方面提供了一種來(lái)源于虎眼萬(wàn)年青的截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶，其特征在于：a)SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；b)SEQIDNO.1所示的氨基酸序列經(jīng)替換，缺失或添加1-37個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。以上所述的截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶，其特征在于，在截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶上可進(jìn)行常規(guī)修飾；或者在截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶上還連接有用于檢測(cè)或純化的標(biāo)簽。其中，所述的常規(guī)修飾包括乙?；Ⅴ０坊h(huán)化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、熒光基團(tuán)修飾、聚乙二醇PEG修飾、固定化修飾；所述的標(biāo)簽包括His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、ProfinityeXact。本發(fā)明技術(shù)方案的第二方面提供了一種編碼第一方面所述截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶的核酸分子，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本發(fā)明技術(shù)方案的第三方面提供了一種含有第二方面所述核酸分子的表達(dá)載體。本發(fā)明技術(shù)方案的第四方面提供了一種含有第三方面所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞優(yōu)選大腸桿菌，釀酒酵母，畢赤酵母，鏈霉菌和植物細(xì)胞，更優(yōu)選的宿主細(xì)胞選自大腸桿菌。本發(fā)明技術(shù)方案的第五方面提供了第一方面所述的截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶或第二方面所述核酸分子或第三方面所述表達(dá)載體或第四方面所述宿主細(xì)胞在催化底物尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸反應(yīng)中的應(yīng)用，其中的催化底物為尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸，產(chǎn)物為尿苷-5’-二磷酸木糖。有益技術(shù)效果UDP-木糖在生物體中含量低，合成困難，導(dǎo)致價(jià)格昂貴，不利于木糖苷的合成，給創(chuàng)新藥物的研制帶來(lái)了很大的困難。通過(guò)UXS3對(duì)UDP-葡萄糖醛酸的催化，一步反應(yīng)就能將UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)化為UDP-木糖，從而可以給天然產(chǎn)物的糖苷化提供穩(wěn)定而廉價(jià)的糖基供體，這可以帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)利益。對(duì)于膜結(jié)合型的UXS3，在經(jīng)過(guò)對(duì)核苷酸序列截短處理之后，更容易表達(dá)形成可溶性的酶，有利于UDP-木糖的生物合成。附圖說(shuō)明圖1：尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶所參與的催化反應(yīng)。圖2：OsaUXS3基因的PCR分析結(jié)果，其中M是DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1是OsaUXS3基因PCR結(jié)果。圖3：OsaUXS3蛋白的多序列比對(duì)結(jié)果。圖4：OsaUXS3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果。圖5：重組質(zhì)粒pET28a-OsaUXS3示意圖。圖6：截短型OsaUXS3重組蛋白SDS-PAGE分析銀染結(jié)果，其中M為蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；1為OsaUXS3；2為空載體對(duì)照。圖7：截短型OsaUXS3重組蛋白免疫印跡結(jié)果，其中CK為對(duì)照；1為OsaUXS3。圖8：截短型OsaUXS3重組酶催化UDP-葡萄糖醛酸HPLC-UV檢測(cè)結(jié)果，其中A為實(shí)驗(yàn)組；B為對(duì)照組(滅活的酶)；C為不加NAD+的實(shí)驗(yàn)組；D為不加NAD+的對(duì)照組。圖9：截短型OsaUXS3重組酶催化UDP-葡萄糖醛酸產(chǎn)物1HNMR圖。圖10：溫度對(duì)截短型OsaUXS3催化UDP-葡萄糖醛酸活性的影響。圖11：pH對(duì)截短型OsaUXS3催化UDP-葡萄糖醛酸活性的影響。圖12：截短型OsaUXS3催化UDP-葡萄糖醛酸酶活曲線(xiàn)圖。圖13：截短型OsaUXS3催化UDP-葡萄糖醛酸Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明通過(guò)如下實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明性的，而不是以任何方式限制本發(fā)明權(quán)利要求的范圍。實(shí)施例1虎眼萬(wàn)年青轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及序列分析提取虎眼萬(wàn)年青無(wú)菌鱗莖總RNA后，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物(randomhexamers)合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第二條cDNA鏈，在經(jīng)過(guò)QiaQuickPCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加poly(A)并連接測(cè)序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建好的測(cè)序文庫(kù)用IlluminaHiSeqTM2000進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)basecalling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，即rawdata或rawreads。對(duì)rawreads進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾，去掉帶接頭的，重復(fù)的，測(cè)序質(zhì)量很低的reads，得到cleanreads。使用短reads組裝軟件Trinity將具有一定長(zhǎng)度overlap的cleanreads連成更長(zhǎng)的片段，即Contig。然后，將cleanreads比對(duì)回Contig，通過(guò)paired-endreads能確定來(lái)自同一轉(zhuǎn)錄本的不同Contig以及這些Contig之間的距離，Trinity將這些Contig連在一起，得到兩端不能再延長(zhǎng)的序列，這些序列稱(chēng)之為Unigene。通過(guò)blastx將Unigene序列比對(duì)到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)nr、Swiss-Prot、KEGG和COG(Evalue<0.00001)，并通過(guò)blastn將Unigene比對(duì)到核酸數(shù)據(jù)庫(kù)nt(Evalue<0.00001)，得到跟給定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，從而得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。通過(guò)功能注釋?zhuān)瑥幕⒀廴f(wàn)年青轉(zhuǎn)錄組序列中發(fā)現(xiàn)一個(gè)長(zhǎng)為1777bp的，具有UDP-木糖合成酶基因保守序列的Contig，即CL1017(SEQIDNO.3)。實(shí)施例2OsaUXS3基因克隆取100mg虎眼萬(wàn)年青無(wú)菌鱗莖于液氮中速凍，研缽研成細(xì)粉狀，Trizol提取法，提取虎眼萬(wàn)年青無(wú)菌鱗莖總RNA。使用RT-PCRKit(ReverTra-Plus-，TOYOBO公司)將虎眼萬(wàn)年青無(wú)菌鱗莖總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系和程序如下：在20μL體系中加入總RNA1μg，RNaseFreeH2O4μL，Oligo(dT)201μL，65℃保溫5min后，立刻置于冰上冷卻，然后在上述管中再依次加入5×RTbuffer4μL，RNaseInhibitor(10U/μL)1μL，dNTPMixture(10mM)和ReverTraAce1μL，30℃保溫10min，42℃溫育60min，85℃變性5min，冰上5min，完成cDNA的合成。cDNA置于-20℃?zhèn)溆?。以虎眼萬(wàn)年青無(wú)菌鱗莖cDNA為模板，設(shè)計(jì)兩對(duì)OsaUXS2特異引物，通過(guò)巢式PCR的方法擴(kuò)增OsaUXS3基因。第一輪PCR，50μL體系中含10×PCRbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMgSO43μL，10μM的引物FCL1017-1(5’-AATCAATCAATCAGAGCGAATC-3’，SEQIDNO.4)和RCL1017-1(5’-CCGGCTCCTCCTGTTTGCT-3’，SEQIDNO.5)各1.5μL，KOD-Plus-Neo1μL，cDNA2μL，ddH2O補(bǔ)足。PCR程序：94℃預(yù)變性5min；98℃變性30s，53℃復(fù)性45s，每一個(gè)循環(huán)遞減1℃，68℃延伸120s，共15循環(huán)；98℃變性30s，38℃復(fù)性45s，68℃延伸120s，共15循環(huán)；68℃延伸7min，4℃保溫。第二輪PCR，50μL體系中含10×PCRbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMgSO43μL，10μM的引物FCL1017-2(5’-ATGAAGCAGCTCTACAAGCAG-3’，SEQIDNO.6)和RCL1017-2(5’-CTATTTCTCCCCGTTCAGG-3’，SEQIDNO.7)各1.5μL，KOD-Plus-Neo1μL，第一輪PCR產(chǎn)物2μL，ddH2O補(bǔ)足。PCR程序：94℃預(yù)變性5min；98℃變性30s，45℃復(fù)性45s，68℃延伸120s，共30個(gè)循環(huán)；68℃延伸7min，4℃保溫。0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，結(jié)果表明，擴(kuò)增得到了一條長(zhǎng)約為1.3kb的條帶(圖2)。PCR產(chǎn)物與pEASYTM-T1Simple(Transgen公司)載體連接，轉(zhuǎn)化到Trans1-T1(Transgen公司)菌株，在含有100μg/mL羧芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR，篩選陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序。結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果完全一樣，長(zhǎng)為1275bp(SEQIDNO.8)，含有該基因的載體命名為pEASY-OsaUXS3。實(shí)施例3OsaUXS3表達(dá)載體的構(gòu)建多序列比對(duì)結(jié)果表明，OsaUXS3(SEQIDNO.9)與細(xì)胞質(zhì)溶型UXS的蛋白序列相比，在氮末端多出100個(gè)左右的氨基酸序列(圖3)。用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)OsaUXS3蛋白的跨膜區(qū)，結(jié)果表明OsaUXS3存在一個(gè)明顯的跨膜區(qū)，預(yù)測(cè)OsaUXS3蛋白為一種二型膜蛋白(圖4)。所以為使該蛋白在原核系統(tǒng)中表達(dá)為可溶性蛋白，需要在設(shè)計(jì)In-Fusion引物時(shí)將其跨膜區(qū)去除。根據(jù)In-Fusion(Clontech公司)同源重組的原理，以測(cè)序正確的質(zhì)粒pEASY-OsaUXS3為模板，F(xiàn)ET28aUXS3(5’-tcgcggatccgaattcatgcacccttacttctcttac-3’，SEQIDNO.10)和RET28aUXS3 (5’-gtgcggccgcaagcttctatttctccccgttcaggat-3’，SEQIDNO.11)為引物，通過(guò)如下程序和體系進(jìn)行PCR，50μL體系中含10×PCRbuffer5μL，2mMdNTPs5μL，25mMMgSO43μL，10μM的引物FET28aUXS3和RET28aUXS3各1.5μL，KOD-Plus-Neo1μL，質(zhì)粒1μL，ddH2O補(bǔ)足。PCR程序：94℃預(yù)變性5min；98℃變性30s，63℃復(fù)性45s，68℃延伸120s，共30個(gè)循環(huán)；68℃延伸7min，4℃保溫。擴(kuò)增得到長(zhǎng)為1.1kb的截短型OsaUXS3基因。將該基因通過(guò)In-Fusion的方法連接到EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切處理的pET-28a(+)中，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans1-T1菌株，在含有50μg/mL的卡那霉素LB平板上培養(yǎng)，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明載體構(gòu)建正確，命名為pET28a-OsaUXS3(圖5)。實(shí)施例4重組OsaUXS3蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和檢測(cè)將構(gòu)建好的質(zhì)粒pET28a-OsaUXS3用熱激法轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌Transetta(DE3)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含卡那霉素(50μg/mL)及氯霉素(35μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基(10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化鈉溶于1L蒸餾水中，加入15g瓊脂粉，而后調(diào)節(jié)pH為7.0)上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，直至長(zhǎng)出單克隆。挑取單克隆轉(zhuǎn)接于20mL含卡那霉素(50μg/mL)及氯霉素(35μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基(10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化鈉溶于1L蒸餾水中，而后調(diào)節(jié)pH為7.0)，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD600為1.0左右，按1:50比例轉(zhuǎn)接入50mL含卡那霉素(50μg/mL)及氯霉素(35μg/mL)的LB培養(yǎng)基(10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化鈉溶于1L蒸餾水中，而后調(diào)節(jié)pH為7.0)，至OD600為0.6時(shí)，加入IPTG(終濃度為0.5mM)，在25℃，160rpm條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)12小時(shí)。取1mL菌液，12000rpm，離心2min收集菌體。加入1mL預(yù)冷裂解緩沖液(25mM，pH為8.0的磷酸鈉緩沖液)，重懸菌體，菌體采用超聲破碎法破碎(超聲5s，停10s，總共超聲破碎6min)。破碎液通過(guò)12000rpm，離心20min，吸取上清。取10μL上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖6所示，從圖中可以看出，和對(duì)照相比，實(shí)驗(yàn)菌的誘導(dǎo)產(chǎn)物中出現(xiàn)了一條長(zhǎng)約為40kDa的特異性條帶。與OsaUXS3的理論大小一致，表明截短型OsaUXS3在大腸桿菌中成功表達(dá)。為進(jìn)一步確證截短型OsaUXS3基因的表達(dá)，進(jìn)行了免疫印跡分析。離心收集E.coli[pET28a-OsaUXS3]的菌體，用超聲破碎液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用Westernblot進(jìn)行檢測(cè)。所用一抗為抗His-Tag的小鼠單克隆抗體，二抗為山羊抗小鼠IgG(1：5000)。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，E.coli[pET28a-OsaUXS3]經(jīng)免疫印跡后，在相應(yīng)的位置上出現(xiàn)了一條相應(yīng)的雜交帶(圖7)。因此，確認(rèn)重組的OsaUXS3蛋白具有特異的免疫活性，表明截短型OsaUXS3基因在E.coli中得到了表達(dá)。實(shí)施例5截短型OsaUXS3蛋白功能鑒定本實(shí)驗(yàn)以UDP-葡萄糖醛酸為底物，探討截短型OsaUXS3對(duì)該底物的脫羧基作用，結(jié)果表明，截短型OsaUXS3能催化UDP-葡萄糖醛酸形成UDP-木糖。截短型OsaUXS3催化UDP-葡萄糖醛酸形成的產(chǎn)物鑒定以純化的截短型OsaUXS3蛋白作為催化劑，建立200μL反應(yīng)體系(200mM磷酸緩沖液50μL，加入20μL濃度為10mM的底物UDP-葡萄糖醛酸，20μL粗酶液(1.5ml菌液的菌體加150μL緩沖液破碎取其上清液)，110μL滅菌水)。20℃反應(yīng)30min后，用200μL氯仿終止反應(yīng)。利用0.22μM尼龍膜過(guò)濾反應(yīng)液，進(jìn)樣20μL進(jìn)行HPLC分析。色譜柱為Shodex公司的WA-pak陰離子交換柱。HPLC條件表1所示，其中A相為H2O；B相為700mM的醋酸銨-醋酸緩沖液，pH為5.2。檢測(cè)波長(zhǎng)為261nm。表1時(shí)間A相％B相％流速ml/min0982120505013201001339821409821HPLC結(jié)果(圖8)表明，截短型OsaUXS3能催化UDP-葡萄糖醛酸，實(shí)驗(yàn)組底物峰消耗較多，同時(shí)在底物峰之前出現(xiàn)了一個(gè)新的產(chǎn)物峰，該產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)為261nm，為尿嘧啶的特征吸收峰。為進(jìn)一步確證新產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，通過(guò)液相制備樣品，樣品冷干后用氘代水溶解，用1HNMR(600M)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析(圖9)。歸屬各氫信號(hào)，結(jié)果如下：Xylosyl：H1”5.44(1H,dd)H2”3.40(1H,dt)H3”3.59(1H,t)H4”3.53(1H,dt)H5a”/H5b”3.64(2H,m)Rib：H1’5.88(1H,d)H2’4.27(2H,m)H4’4.18(1H,m)H5a’(1H,m)H5b’(1H,m)Uridine：H55.87(1H,d)H67.85(1H,d)綜合以上分析，可以確證截短型OsaUXS3催化UDP-葡萄糖醛酸所形成的新產(chǎn)物為UDP-木糖。從而表明，截短型OsaUXS3具有UDP-木糖合成酶的功能。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，截短型OsaUXS3在沒(méi)有外加NAD+的情況下活性明顯降低。實(shí)施例6截短型OsaUXS3催化UDP-葡萄糖醛酸酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定截短型OsaUXS3催化UDP-葡萄糖醛酸最適溫度確定取1.5mLEP管，加入200mM磷酸緩沖液50μL，20μL純化的酶，110μL滅菌水，置于不同溫度下孵育10min后，快速加入20μL濃度為10mM的UDP-葡萄糖醛酸。反應(yīng)30min后加入200μL氯仿終止反應(yīng)，利用0.22μM尼龍膜過(guò)濾反應(yīng)液，進(jìn)樣20μL進(jìn)行HPLC分析。色譜柱為Shodex公司的WA-pak陰離子交換柱。HPLC條件表1所示，其中A相為H2O；B相為700mM的醋酸銨-醋酸緩沖液，pH為5.2。檢測(cè)波長(zhǎng)為261nm。以產(chǎn)物峰面積最大者為100％，其余取對(duì)應(yīng)的相對(duì)值。結(jié)果表明(圖10)，截短型OsaUXS3催化UDP-葡萄糖醛酸的最適溫度為20℃，在4-40℃范圍內(nèi)均能達(dá)到大于50％的活性，溫度過(guò)高不利于反應(yīng)進(jìn)行，在60℃下酶失活。截短型OsaUXS3催化UDP-葡萄糖醛酸最適pH值確定配置pH4-6的100mM的醋酸鈉-醋酸緩沖液，pH6-9的10mM的磷酸鹽緩沖液，pH7.5-9.2的100mM的Tris-HCl緩沖液。取100μL不同pH的緩沖液，20μL粗酶液，60μL滅菌水，30℃孵育10min，加入20μL濃度為10mM的UDP-葡萄糖醛酸。30℃反應(yīng)30min后，加入200μL氯仿終止反應(yīng)，12000rpm離心5min，吸取水相用0.22μM尼龍膜過(guò)濾，取濾液20μL用HPLC分析，HPLC條件如表1，檢測(cè)波長(zhǎng)261nm，各自進(jìn)樣量相同。通過(guò)比較HPLC檢測(cè)產(chǎn)物峰面積并比較不同pH下催化效率，以產(chǎn)物峰面積最大者為100％，其余取相對(duì)值。通過(guò)HPLC分析結(jié)果(圖11)表明，催化UDP-葡萄糖醛酸的最適pH為6.0，隨著pH升高或降低，其活性下降。截短型OsaUXS3催化UDP-葡萄糖醛酸動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定利用反應(yīng)緩沖液配置(pH6.0，50mM磷酸鹽)不同濃度UDP-木糖標(biāo)準(zhǔn)品，并HPLC檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)261nm，得到峰面積。通過(guò)線(xiàn)性回歸得出峰面積同UDP-木糖濃度的關(guān)系，得到一擬合方程Y＝111.9X+1.428(0.1≤X≤1)，X為UDP-木糖濃度(mM)，Y為峰面積變化值。建立100μL反應(yīng)體系，pH為5.0，50mM磷酸鹽緩沖液，截短型OsaUXS3粗酶液20μL，改變底物UDP-葡萄糖醛酸濃度，在最適溫度20℃下反應(yīng)10min，立即用氯仿終止各個(gè)反應(yīng)，利用HPLC分析UDP-木糖的生成量，利用峰面積求得UDP-木糖的濃度，進(jìn)而求出反應(yīng)初速度(μM/s)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果做酶活曲線(xiàn)(圖12)。使用GraphPadPrism5中相關(guān)程序自動(dòng)計(jì)算出Km和Vmax(圖13)。截短型OsaUXS3酶學(xué)性質(zhì)數(shù)據(jù)如表2表2當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3