四對黃綠卷毛菌核基因引物的設(shè)計、擴增與測序方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及真菌系統(tǒng)發(fā)育、譜系地理學技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及四對黃綠卷毛菌核基 因（EF1 - a、RPB1、RPB2、Mcm7 )引物的設(shè)計、擴增與測序方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃綠卷毛菌（Floccularia Iuteo virens)隸屬于傘菌目（Agaricales) 口磨科 (化icholomataceae)，是一種主要分布在青藏高原的產(chǎn)子實體的外生菌根真菌。由于其子 實體色澤嫩黃、口味鮮美、營養(yǎng)豐富，長久W來一直被作為青藏高原特色美食、有著較高的 經(jīng)濟價值。但是，近年來隨著子實體貿(mào)易的不斷升溫，黃綠蜜環(huán)菌資源正面臨過度采伐的危 險，同時，其分類地位也一直存在著爭議。因此很有必要利用分子標記研究該菌遺傳多樣性 及系統(tǒng)發(fā)育學問題。
[0003] RNA聚合酶(RNA polymerases)在基因表達的過程中扮演著很重要的角色。目前， 在真核生物中成功地分離出巧中RNA聚合酶。其中，RNA聚合酶II由12個亞基組成（RPB1-RPB12)dRNA聚合酶II大亞基(RPBl)是決定真核生物信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄起始和延伸的最主 要的功能亞基，存在多種翻譯后修飾。負責轉(zhuǎn)錄生成hnRNA和mRNA的RPB2(The second largest RNA polymerase subunit) 基因負責編碼 RNA 聚合酶 II 的第2 大亞基，具有單拷貝和進 化速率慢的特點。而EFl-a是真核生物細胞內(nèi)第二大蛋白，在蛋白質(zhì)合成延伸過程中起重要 作用，其具有高度的種間保守性，適合進行系統(tǒng)發(fā)育研究。Mcm7是微小染色體維持蛋白7的 縮寫，它有著適宜的進化速率也是真菌系統(tǒng)發(fā)育學與譜系地理學研究的有效工具。目前，上 述基因由于通用引物具有良好的擴增性能，因而廣泛應用于真菌系統(tǒng)發(fā)育與系統(tǒng)發(fā)育學W 及譜系地理學研究當中。
[0004] 然而，在研究黃綠卷毛菌遺傳多樣性與譜系地理學過程中，利用上述基因的通用 引物擴增該菌相應基因，卻得不到擴增結(jié)果或者擴增出多條非特異性條帶。因此，雖然上述 基因有諸多有優(yōu)勢，但其在黃綠卷毛菌的研究上卻表現(xiàn)出了局限性，限制了利用上述基因 對于黃綠卷毛菌的相關(guān)研究。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種簡便易行的四對黃綠卷毛菌核基因引物 的設(shè)計、擴增與測序方法。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明所述的四對黃綠卷毛菌核基因引物的設(shè)計、擴增與測序 方法，包括W下步驟： (1)分別采用與6。1-〇、1?^1、1?^2、1畑17基因相匹配的通用引物對黃綠卷毛菌進行擴增， 分別得到EFl-a、RPBl、RPB2、Mcm7基因的擴增片段； 間分別對所述6。1-〇、3口81、1?口82、1(31117基因的擴增片段做膠檢測，割取目的條帶，經(jīng) SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化回收后進行測序，分別得到521bp的EFl-a、751bp的 RPBl、782bp的RPB2、688 bp的Mcm7基因片段； 間除去所述步驟間所得的6。1-〇、3?81、1??82、1(31117基因片段兩頭各30 69序列，在線設(shè) 計引物選取得分最高的一對引物，其中： EF1 -a引物的上游引物EF-9F有18個堿基AGCACGCTCTCCTTGCTT，其下游引物EF-9R有21 個堿基 AGCACGCTCTCCTTGCTT; RPB1引物的上游引物RPB1-FF1有2 2個堿基AAACTCCCTTGGGGATCTAAT，其下游引物RPB1 -FRl 有 20 個堿基 TCAGGAAATCTTCGCCACG; RPB2引物的上游引物RPB2-61F1有22個堿基TGGAAGAATGGGGTTTGGAGT，其下游引物 RPB2-61R1 有 20 個堿基 TGGTCCGGGAAAGGTATAAT; Mcm7引物的上游引物MClF有21個堿基TGCAAACTCGTGCATGTAGGT，其下游引物MC3R有20 個堿基 TCCTCATGGCCATATATCTCA; (4)用不同地理分布來源的黃綠卷毛菌菌株擴增測序驗證所述步驟間中引物的專一性 即可。
[0007] 所述步驟(1)與EFl-a基因相匹配的通用引物是指EF-983F與EF-1567R。
[000引所述步驟(1)與RPBl基因相匹配的通用引物是指RPBl-Ff與RPBl-G么。
[0009] 所述步驟(1)與RPB2基因相匹配的通用引物是指RPB2-6F與RPB2-7.1R。
[0010] 所述步驟(1)與Mcm7基因相匹配的通用引物是指Mcm7-709fo;r與Mcm7-1447rev。
[0011] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有W下優(yōu)點： 1、本發(fā)明所得到的引物有著優(yōu)異的擴增性能，50~6(TC溫度梯度試驗均能擴增出明亮、 唯一的產(chǎn)物條帶(參見圖1)，有利于后續(xù)研究大規(guī)模應用該引物進行擴增。
[0012] 2、應用本發(fā)明所得到的引物擴增片段對50個不同地理分布的黃綠卷毛菌菌株進 行擴增，均能夠得到特異性產(chǎn)物，說明該引物具有良好的個體間的通用性。
[0013] 3、應用本發(fā)明所得到的引物擴增片段對50個不同地理分布的黃綠卷毛菌菌株進 行測序均獲得了理想的結(jié)果，說明該引物具有良好的測序性能。
[0014] 4、本發(fā)明簡便易行。
【附圖說明】
[0015] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳吸的說明。
[0016] 圖1為本發(fā)明各片段50~60°C溫度梯度做膠檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0017] 四對黃綠卷毛菌核基因引物的設(shè)計、擴增與測序方法，包括W下步驟： (1)分別采用與6。1-〇、1?^1、1?^2、1畑17基因相匹配的通用引物對黃綠卷毛菌進行擴增， 分別得到6。1-〇、1?^1、1?^2、]^1117基因的擴增片段。
[001引 其中； ①采用通用引物983F與1567R對黃綠卷毛菌進行擴增，得到EFl-a基因的擴增片段。
[0019] 擴增 PCR 反應體系：25 化內(nèi)含 dd 此 0 19.3 yL，10XBuffer(+Mg2+)2.5 yL，dNTP (lOmM)0.5 jiL，983F(10mM)0.5 jiL，1567R(10 mM)0.5 JiLJaq polymerase(抓/化）0.5 化， 0.2 化 DNA模板（15 ng)1.5 化。
[0020] 擴增條件:95°C預變性5 min,然后94°C變性30 S，53°C退火50 S，72°C延伸55 S， 共34個循環(huán)，最后72°C延伸10 min。
[0021] ②采用通用引物RPBl-Ff與RPB1-G2r對黃綠卷毛菌進行擴增，得到RPBl、基因的擴 增片段。
[0022] 擴增PCR反應體系：25 化內(nèi)含dd此0 19.3 yL，10XBuffer(+Mg2+)2.5 yL，dNTP (10mM)0.5 yL，RPBl-Ff(10 mM)0.5 化，RPB1-G2r(10 mM)0.5 化，Taq polymerase(抓/化） 0.5 化，0.2 化 DNA模板（15 ng)1.5 化。
[0023] 擴增條件:95°C預變性5 min,然后94°C變性30 s，53°C退火45 s，72°C延伸50 S， 共34個循環(huán)，最后72°C延伸10 min。
[0024] ③采用通用引物RPB2-6F與RPB2-7.1R對黃綠卷毛菌進行擴增，得到RPB2基因的擴 增片段。
[0025] 擴增PCR反應體系：25化內(nèi)含dd出0 19.化L，10XBuffer(+Mg2+)2.5化，dNTP(10 mM)0.5 jiL，RPB2-6F(10 mM)0.5 jiL，RPB2-7.1R(10 mM)0.5 JiLJaq polymerase(抓/化） 0.5 化，0.2 化 DNA模板（15 ng)1.5 化。
[0026] 擴增條件:95°C預變性5 min,然后94°C變性30 S，53°C退火50 S，72°C延伸55 S， 共34個循環(huán)，最后72°C延伸10 min。
[0027] ④采用通用引物Mcm7-709fo;r與Mcm7-1447rev對黃綠卷毛菌進行擴增，得到Mcm7 基因的擴增片段。
[002引擴增PCR反應體系：25 化內(nèi)含dd此0 19.3 yL，10XBuffer(+Mg2+)2.5 yL，dNTP (10 mM)0.5 yL，Mcm7-709for(10 mM)0.5 yL，Mcm7-1447rev(10 mM)0.5 yL'Taq polymerase巧U/]iL)0.5 化，0.2 化 DNA模板（15 ng)1.5 化。
[0029] 擴增條件:95°C預變性5 min,然后94°C變性30 s，53°C退火50 s，72°C延伸55 s， 共34個循環(huán)，最后72°C延伸10 min。
[0030] 間分別對EFl-a、RPB1、RPB2、Mcm7基因的擴增片段做膠檢測，割取目的條帶，經(jīng) SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化回收后進行測序，分別得到521bp的EFl-a、751bp的 RPBl、782bp的RPB2、688 bp的Mcm7基因片段。
[0031 ] 具體步驟如下： i擴增獲得片段通過瓊脂糖凝膠電泳盡可能將目的DNA片段與其它片段分開，用干凈的 手術(shù)刀片將含目的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊切下，放入1.5 ml離屯、管中，稱重。
[0032] ii根據(jù)膠塊的重量和濃度，按每100 mg瓊脂糖(如膠塊不足100 mg則用水補充至 100 mg)加300~600 yL的比例加入Buffer B2。
[0033] 化將離屯、管置于50°C水浴5~10 min,間或混勻，直至膠塊完全溶化。
[0034] iv加入所使用的Buffer B2體積1/3的異丙醇，混勻。
[0035] V將溶化好的溶液全部移入吸附柱，8000 X g離屯、30 S。倒掉收集管中的液體， 將吸附柱放入同一個收集管中。
[0036] Vi向吸附柱中加入500化Wash Solution，9000 X g離屯、30 S。倒掉收集管中的液 體，將吸附柱放入同一個收集管中。
[0037] 油重復步驟Vi-次。
[003引 Vi將空吸附柱和收集管放入離屯、機，9000 X g離屯、1 min。
[0039] k在吸附膜中央加入15~40化Elution Buffer,室溫靜置1-2 min，9000 X g離 屯、I min。將所得到的DNA溶液置于-20°C保存。
[0040] 間除去步驟間所得的6。1-〇、3?81、1?^2、1(31117基因片段兩頭各30 69序列，在線設(shè) 計引物化ttp:// www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer參數(shù)為默認參數(shù)）選取得分 最高的一對引物，其中： EF1 -a引物的上游引物EF-9F有18個堿基AGCACGCTCTCCTTGCTT，其下游引物EF-9R有21 個堿基 AGCACGCTCTCCTTGCTT。
[0041 ] RPBl引物的上游引物RPBl-FFl有22個堿基AAACTCCCTTGGGGATCTAAT，其下游引物 RPBl-FRl 有 20 個堿基 TCAGGAAATCTTCGCCACG。
[0042] RPB2引物的上游引物RPB2-61F1有22個堿基TGGAAGAATGGGGTTTGGAGT，其下游引物 RPB2-61R1 有 20 個堿基 TGGTCCGGGAAAGGTATAAT。
[0043] Mcm7引物的上游引物MC1F有21個堿基TGCAAACTCGTGCATGTAGGT，其下游引物MC3R 有 20 個堿基 TCCTCATGGCCATATATCTCA。
[0044] (4)用50個不同地理分布來源的黃綠卷毛菌菌株(運些菌株來自青藏高原西藏、青 海、四川涵蓋了卷毛蜜環(huán)菌分布的大部分區(qū)域。）擴增測序驗證步驟間中引物的專一性即可 (參見表1)。
[0045] 表1綠卷毛菌菌株地理分布
具體驗證過程如下： iEFl-a 引物： 擴增 PCR反應體系為 25 化內(nèi)含 dd也 0 19.3 化，10XBuffer(+Mg2+)2.化L，dNTP(10 mM)0.5]iL，EF-9F(10 mM)0.5]iL，EF-9R(10 mM)0.5]iL，Taq polymerase巧U/]iL)，0.扣L DNA 模板(15 ng)l.f5]iL。
[0046] 擴增條件:95°C預變性5 min,然后94°C變性30 s，5rC退火45 s，72°C延伸50 s， 共35個循環(huán)，最后72°C延伸10 min。
[0047] 測序共獲得375~376 bp長度的序列。
[0048] ii RPBl 引物： 擴增PCR反應體系為25化內(nèi)含dd也0 19.化L，10XBuffer(+Mg2+)2.扣L，dNTP(10mM) 0.f5]iL，RPBl-FFl(10 mM)0.5]iL，RPBl-FRl(10 mM)0.5]iL，Taq polymerase(抓/化），0.5化 DNA模板（15 ng)I.。
[0049] 擴增條件為:95°C預變性5min，然后94°C變性30s，5rC退火45s，72°C延伸45s，共 35個循環(huán)，最后72°C延伸10 min。
[00加]擴增獲得427~427 bp的片段 iiiRPB2 引物： 擴增 PCR反應體系為 25 化內(nèi)含 d 地 2〇 19.化L，10XBuffer(+Mg2+)2.5^，dNTP(10 mM)，0.扣L RPB2-61F(10 mM)0.5化，RPB2-61R(10mM)0.5化，Taq polymerase(抓/jiL)，0.5ii L DNA模板（15 ng)l.
[0051 ] 擴增條件為:95°C預變性5min，然后94°C變性30s，5rC退火50s，72°C延伸50s，共 35個循環(huán)，最后72°C延伸10 min。
[0化2] 測序共獲得559~560 bp長度的序列。
[0化；3] ivMcm7 引物： 擴增PCR反應體系為25化內(nèi)含d地20 19.化L，10XBuffer(+Mg2+)2.化L，dNTP(10 mM)0.5化，MClFdO mM)0.5化，MC3R(10 mM)0.5化，Taq polymerase(抓/化），0.5化 DNA模 板（15 ng)l.^iL。
[0054] 擴增條件為：95°C預變性5 min,然后94°C變性30 S，53°C退火45 S，72°C延伸50 S，共35個循環(huán)，最后72°C延伸10 min。
[0化日]測序共獲得393~395 bp長度的序列。
【主權(quán)項】
1. 四對黃綠卷毛菌核基因引物的設(shè)計、擴增與測序方法，包括以下步驟： ⑴分別采用與EFl-α、RPBl、RPB2、MCm7基因相匹配的通用引物對黃綠卷毛菌進行擴增， 分別得到EFl-a、RPBl、RPB2、Mcm7基因的擴增片段； ⑵分別對所述EF1 - a、RPB1、RPB2、Mcm7基因的擴增片段做膠檢測，割取目的條帶，經(jīng) SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化回收后進行測序，分別得到521bp的EFl-a、751bp的 RPBl、782bp的RPB2、688 bp的Mcm7基因片段； (3)除去所述步驟⑵所得的EFl-a、RPBl、RI?2、MCm7基因片段兩頭各30bp序列，在線設(shè) 計引物選取得分最高的一對引物，其中： EF 1 -a引物的上游引物EF-9F有18個堿基AGCACGCTCTCCTTGCTT，其下游引物EF-9R有21 個堿基 AGCACGCTCTCCTTGCTT; RPB 1引物的上游引物RPB 1-FF1有2 2個堿基AAACTCCCTTGGGGATCTAAT，其下游引物RPB 1 -FR1 有 20 個堿基 TCAGGAAATCTTCGCCACG; RPB2引物的上游引物RPB2-61F1有22個堿基TGGAAGAATGGGGTTTGGAGT，其下游引物 RPB2-61R1 有 20 個堿基 TGGTCCGGGAAAGGTATAAT; Mcm7引物的上游引物MC1F有21個堿基TGCAAACTCGTGCATGTAGGT，其下游引物MC3R有20 個堿基 TCCTCATGGCCATATATCTCA; ⑷用不同地理分布來源的黃綠卷毛菌菌株擴增測序驗證所述步驟⑶中引物的專一性 即可。2. 如權(quán)利要求1所述的四對黃綠卷毛菌核基因引物的設(shè)計、擴增與測序方法，其特征在 于:所述步驟⑴與EF1-a基因相匹配的通用引物是指EF-983F與EF-1567R。3. 如權(quán)利要求1所述的四對黃綠卷毛菌核基因引物的設(shè)計、擴增與測序方法，其特征在 于:所述步驟⑴與RPB1基因相匹配的通用引物是指RPBl-Ff與RPB1-G2 r。4. 如權(quán)利要求1所述的四對黃綠卷毛菌核基因引物的設(shè)計、擴增與測序方法，其特征在 于:所述步驟⑴與RPB2基因相匹配的通用引物是指RPB2-6F與RPB2-7.1R。5. 如權(quán)利要求1所述的四對黃綠卷毛菌核基因引物的設(shè)計、擴增與測序方法，其特征在 于:所述步驟⑴與Mcm7基因相匹配的通用引物是指Mcm7_709f or與Mcm7_1447rev〇
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種四對黃綠卷毛菌核基因引物的設(shè)計、擴增與測序方法，該方法包括以下步驟：⑴分別采用與<i>EF1</i><i>–</i>α、<i>RPB1</i>、<i>RPB2</i>、<i>Mcm7</i>基因相匹配的通用引物對黃綠卷毛菌進行擴增，分別得到<i>EF1</i><i>–</i>α、<i>RPB1</i>、<i>RPB2</i>、<i>Mcm7</i>基因的擴增片段；⑵分別對所述<i>EF1</i><i>–</i>α、<i>RPB1</i>、<i>RPB2</i>、<i>Mcm7</i>基因的擴增片段做膠檢測，割取目的條帶，經(jīng)SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化回收后進行測序，分別得到521bp的<i>EF1</i><i>–</i>α、751bp的<i>RPB1</i>、782bp的<i>RPB2</i>、688bp的<i>Mcm7</i>基因片段；⑶除去所述步驟⑵所得的<i>EF1</i><i>–</i>α、<i>RPB1</i>、<i>RPB2</i>、<i>Mcm7</i>基因片段兩頭各30bp序列，在線設(shè)計引物選取得分最高的一對引物；⑷用不同地理分布來源的黃綠卷毛菌菌株擴增測序驗證所述步驟⑶中引物的專一性即可。本發(fā)明簡便易行，所得引物有著優(yōu)異的擴增性能。
【IPC分類】C12Q1/04, C12R1/645, C12Q1/68
【公開號】CN105713980
【申請?zhí)枴緾N201610226253
【發(fā)明人】邢睿, 高慶波, 張發(fā)起, 陳世龍
【申請人】中國科學院西北高原生物研究所