本發(fā)明屬生物藥物領域，涉及續(xù)隨子二萜烷型化合物的轉(zhuǎn)化方法，具體涉及利用已知微生物對續(xù)隨子二萜醇及其衍生物進行微生物轉(zhuǎn)化，并進一步結合化學?；ǎ苽渚哂锌拱┗钚缘睦m(xù)隨子二萜烷型衍生物。
背景技術：
現(xiàn)有技術公開了續(xù)隨子二萜烷型化合物屬于二萜骨架的天然產(chǎn)物，具有較明顯的抗腫瘤活性與抗腫瘤多藥耐藥性（mdr）。構效關系研究表明，其母核上取代基的差異能明顯改變該類化合物的抗腫瘤活性和mdr活性。
有研究從大戟科植物續(xù)隨子euphorbialathyrisl.中分離得到（tetrahedronletters,1971,18:1325-1328）續(xù)隨子二萜烷型化合物；隨后從其他植物中陸續(xù)分離得到多種續(xù)隨子二萜烷型衍生物，如從大戟科植物euphorbialagascae中分離得到5個具有誘導腫瘤細胞凋亡和抗腫瘤多藥耐藥性的續(xù)隨子二萜醇酯衍生物（plantamedica,2005,72:162-168）；此外對從植物中分離得到的續(xù)隨子二萜烷型衍生物的化學反應修飾，也得到一些抗腫瘤多藥耐藥性活性更好的衍生物（bioorganic&medicinalchemistry,2014,22:6392-6400）。為了發(fā)現(xiàn)活性更強的續(xù)隨子二萜衍生物，特別是對其結構中低活性碳位點的結構修飾產(chǎn)物，將對進一步研究該類化合物的構效關系有著重要的意義；該類二萜骨架中c-18和c-19位為低活性位點，難以用化學方法接上羥基，而羥基是此類化合物進一步合成修飾的良好起始基團。
微生物轉(zhuǎn)化是利用微生物生長過程中合成的特異酶完成特定生化反應。據(jù)報道，微生物在生長過程中可以合成多種酶，催化不同反應，例如氧化反應、還原反應、水解反應、脫氫反應、縮合反應和開環(huán)反應等，這類酶催化反應具有特異性和專屬性，相對于化學反應，在底物的非活性碳原子上進行反應更高效環(huán)保。
迄今為止尚未見有關續(xù)隨子二萜類化合物的微生物轉(zhuǎn)化研究的報道。因此，本申請的發(fā)明人擬利用微生物對續(xù)隨子二萜烷型化合物進行轉(zhuǎn)化研究，以期獲得一些難以用傳統(tǒng)化學合成制備的特異位點（尤其是c-8、c-18和c-19低活性碳位點）的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，并結合化學合成法，對微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進一步進行化學修飾。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供續(xù)隨子二萜烷型化合物非活性碳上進行結構改造的方法，尤其是制備具有生理活性、難以通過傳統(tǒng)化學法羥基化得到的續(xù)隨子二萜烷型類化合物的微生物轉(zhuǎn)化方法。
本發(fā)明使用拉曼被孢霉mortierellaramanniana分別對續(xù)隨子二萜醇(lathyrol)和7β-羥基續(xù)隨子二萜醇（7β-hydroxylathyrol）進行了微生物轉(zhuǎn)化或生物轉(zhuǎn)化組合化學酰化，獲得以下結構通式的續(xù)隨子烷型二萜衍生物：
經(jīng)鑒定，所獲得的續(xù)隨子烷型二萜衍生物化合物為：
化合物118-羥基續(xù)隨子二萜醇：r1=r3=h,r2=oh
化合物27β,18-二羥基續(xù)隨子二萜醇：r1=r2=oh,r3=h
化合物319-羥基續(xù)隨子二萜醇：r1=r2=h,r3=oh
化合物418-煙酰氧基續(xù)隨子二萜醇：r1=r3=h,r2=
本發(fā)明中所述的微生物轉(zhuǎn)化法包括以下步驟：
（1）生產(chǎn)菌株為拉曼被孢霉mortierellaramanniana，該菌株在瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，將生長在瓊脂培養(yǎng)基上的拉曼被孢霉菌絲劃線接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基上，在20-28°c的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-7天，得到試管種；
其中，所述拉曼被孢霉mortierellaramanniana菌種微生物還包括其功能等同的變異體和突變體；
（2）將試管種中的菌絲接種到250ml的三角瓶中，每瓶含有50ml液體馬鈴薯培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25-28°c，轉(zhuǎn)速為130-180rpm，培養(yǎng)時間為24小時，獲得種子液；
（3）將種子液按2%~5%體積比接入新鮮馬鈴薯培養(yǎng)基，28°c，130-180rpm條件下培養(yǎng)24-72小時后，加入轉(zhuǎn)化底物續(xù)隨子二萜醇或7β-羥基續(xù)隨子二萜醇,在20-28°c、130-180rpm的條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)72-240小時。本發(fā)明的一個實施例中，優(yōu)選將拉曼被孢霉mortierellaramanniana種子液按1%-3%體積比接入馬鈴薯培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)12-48小時，再加入4mg/ml續(xù)隨子二萜醇或7β-羥基續(xù)隨子二萜醇的乙醇溶液；
（4）將發(fā)酵液用布氏漏斗減壓過濾，獲得發(fā)酵濾液，按照1:1.5體積比用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，減壓蒸干，發(fā)酵產(chǎn)物用硅膠柱層析法分離得到發(fā)酵產(chǎn)物18-羥基續(xù)隨子二萜醇衍生物(1和2)和發(fā)酵產(chǎn)物19-羥基續(xù)隨子二萜醇衍生物(3)；
其中，所述的液體培養(yǎng)基包括組分：200g馬鈴薯去皮，切成1立方厘米小丁，1l水微沸煎煮20分鐘，隨后用8層紗布趁熱過濾，放涼后用水將濾液補齊至1l，加入20g葡萄糖，攪拌溶解；分裝并經(jīng)121°c高壓滅菌20分鐘后，放涼使用；
其中，所述的固體培養(yǎng)基包含組分：液體培養(yǎng)基加入1%瓊脂，加熱溶解并分裝，121°c高壓滅菌20分鐘后，放涼使用。
本發(fā)明中，對續(xù)隨子二萜醇經(jīng)拉曼被孢霉mortierellaramanniana轉(zhuǎn)化所得的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物18-羥基續(xù)隨子二萜醇(1)進一步進行化學煙?；?，得到18-煙酰氧基續(xù)隨子二萜醇(4)。
本發(fā)明中，所述的生物轉(zhuǎn)化組合化學?；ǎㄒ韵虏襟E：
制備18-煙酰氧基續(xù)隨子二萜醇(4)：將10-15mg的18-羥基續(xù)隨子二萜醇(1)溶于無水四氫呋喃，滴加1-2滴三乙胺，1-2mgdmap，磁力攪拌混合均勻，在冰浴條件下投入1個當量的煙酰氯鹽酸鹽，逐漸升至室溫，最后加熱回流反應10-15小時，加入碳酸氫鈉飽和溶液終止反應，用乙酸乙酯萃取5-7次，合并萃取液，加入適量的無水nahco3除水溶性成分后過濾，合并有機相。有機溶劑回收后用制備液相分離，流動相比例為60%甲醇-水，保留時間在35分鐘為18-煙酰氧基續(xù)隨子二萜醇(4)，保留時間在20分鐘為18-羥基續(xù)隨子二萜醇(1)。
本發(fā)明利用拉曼被孢霉mortierellaramanniana產(chǎn)生的羥化酶對續(xù)隨子二萜醇型化合物進行生物轉(zhuǎn)化，制備了羥基化續(xù)隨子二萜烷衍生物，其中c-18羥基衍生物產(chǎn)率高達40%。其中，利用該菌產(chǎn)生的羥基化酶對續(xù)隨子二萜醇的c-18和c-19位進行羥化反應，制備得到其羥基化產(chǎn)物1和3；利用該菌產(chǎn)生的羥基化酶對7β-羥基續(xù)隨子二萜醇進行羥化反應，制備得到其羥基化產(chǎn)物2。本發(fā)明對制備得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進一步進行單?；磻?，得到c-18煙酰氧基取代產(chǎn)物(4)。本發(fā)明在該類二萜的c-18和c-19位引入羥基，增加了續(xù)隨子二萜醇的化學結構修飾位點，增加水溶性，提高了成藥性。更進一步，本發(fā)明制得的續(xù)隨子烷型化合物可制備抗腫瘤多藥耐藥性的藥物或藥物組合物，其中含有所述的化合物或其藥學上可接受的溶劑及藥學上可接受的載體。
具體實施方式
實施例1制備18-羥基續(xù)隨子二萜醇(1)和19-羥基續(xù)隨子二萜醇(3)
采用兩步活化法活化菌種，獲得的種子液以1%體積比接種于裝有250ml馬鈴薯培養(yǎng)基、體積為1l三角瓶中，28°c，180rpm條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48h，每瓶活化后的菌液加入5mg/ml續(xù)隨子二萜醇的乙醇溶液，終濃度為0.1mg/ml。同條件培養(yǎng)72h后，抽濾發(fā)酵液，濾液加乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，得到發(fā)酵液提取物；
發(fā)酵液提取物用少量乙酸乙酯溶解，以硅膠（100目-200目）拌樣，上樣于裝有40~50g柱層析硅膠（200-300目）的硅膠柱內(nèi)，用二氯甲烷-甲醇（20:1）洗脫，先后得到含底物續(xù)隨子二萜醇、19-羥基續(xù)隨子二萜醇(3)和18-羥基續(xù)隨子二萜醇(1)的流分，回收溶劑，用丙酮溶解殘渣，將樣品溶液點于硅膠薄層板上，以二氯甲烷-甲醇（10:1）上行法展開，取出晾干溶劑后，噴以10%的硫酸-乙醇溶液，加熱顯色，樣品點在硅膠薄層板中為磚紅色-棕色斑點，其中轉(zhuǎn)化主產(chǎn)物18-羥基續(xù)隨子二萜醇(1)，rf值為0.4左右，產(chǎn)率40~45%；微量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物19-羥基續(xù)隨子二萜醇(3)的rf值為0.5左右，產(chǎn)率2~5%；底物續(xù)隨子二萜醇的rf值為0.6左右?；衔?和3的nmr結構鑒定數(shù)據(jù)如表1所示。
實施例2制備7β,18-二羥基續(xù)隨子二萜醇(2)
采用兩步活化法活化菌種，獲得的種子液以1%體積比接種于裝有250ml馬鈴薯培養(yǎng)基、體積為1l三角瓶中，28°c，180rpm條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48h，每瓶活化后的菌液加入5mg/ml的7β-羥基續(xù)隨子二萜醇的乙醇溶液，終濃度為0.1mg/ml，同條件培養(yǎng)72h后，發(fā)酵液抽濾，濾液加乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，得到發(fā)酵液提取物；
發(fā)酵液提取物用少量乙酸乙酯溶解，以硅膠（100-200目）拌樣，上樣裝有40~50g柱層析硅膠（200-300目）的硅膠柱內(nèi)，用二氯甲烷-甲醇（20:1）洗脫，得到含7β,18-二羥基續(xù)隨子二萜醇(2)的流分，回收溶劑，用丙酮溶解殘渣，將樣品溶液點于硅膠薄層板上，以二氯甲烷-甲醇（10:1）上行法展開，取出晾干溶劑后，噴以10%的硫酸-乙醇溶液，加熱顯色，7β,18-二羥基續(xù)隨子二萜醇(2)在硅膠薄層板中顯示一個磚紅色-棕色斑點，rf值為0.35左右；底物7β-羥基續(xù)隨子二萜醇rf值為0.6左右?；衔?的nmr結構鑒定數(shù)據(jù)如表1所示。
表1是轉(zhuǎn)化產(chǎn)物18-羥基續(xù)隨子二萜醇(1)、7β,18-二羥基續(xù)隨子二萜醇(2)和19-羥基續(xù)隨子二萜醇(3)的nmr數(shù)據(jù)(400mhz,cd3od)。
表1
實施例3制備18-煙酰氧基續(xù)隨子二萜醇（4）
取10mg干燥無水的18-羥基大戟因子l3(1)于50ml圓底燒瓶內(nèi)，加入10-15ml無水四氫呋喃，加入8ml三乙胺、微量4-二甲氨基吡啶（dmap），用磁力攪拌器攪拌溶解混合，冰浴條件下加入1個當量的煙酰氯鹽酸鹽，共同攪拌反應至室溫8小時，若反應未完成再回流加熱反應1~3小時；
檢測反應是否完成：用毛細管吸取少量反應液，點樣于硅膠薄層板，平行點樣18-羥基續(xù)隨子二萜醇，采用二氯甲烷-甲醇（20:1）上行法展開，完畢后取出晾干，254nm紫外燈下檢視，反應完成的標志是在反應液展開處，與18-羥基續(xù)隨子二萜醇相同位置（rf=0.3）沒有亮斑或僅有微弱亮斑，在rf=0.6左右處產(chǎn)生新的亮斑；
確定反應完成后，加入20ml飽和碳酸氫鈉淬滅，反應液用等體積乙酸乙酯萃取6~10次，合并乙酸乙酯層，回收溶劑得到殘渣。殘渣用少量甲醇溶解，經(jīng)制備液相（流動相為60%甲醇:水），分離得到18-煙酰氧基續(xù)隨子二萜醇（4），其保留時間為35分鐘。
實施例418-煙酰氧基續(xù)隨子二萜醇（4）的抗腫瘤多藥耐藥活性測試
采用人乳腺癌細胞（mcf-7）及耐阿霉素人乳腺癌細胞（mcf-7/adm）外排羅丹明-123能力變化評價待測化合物的體外抗腫瘤多藥耐藥性（mdr）活性。mcf-7及mcf-7/adm細胞培養(yǎng)基為含有10%小牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%co2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細胞密度為70~80%鋪滿。mcf-7及mcf-7/adm細胞經(jīng)10%胰蛋白酶消化后，吹散制成單細胞懸液，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為105/ml，將細胞懸浮液加入1.5ml離心管，每管體積為500ml，再加入含不同藥物濃度的培養(yǎng)基500ml，每個濃度設置3個復孔，于37℃、5%co2孵育10min。實驗組含藥培養(yǎng)基藥物濃度分別為80μm、40μm、8μm(終濃度為40、20、和4μm)，陰性對照組加入含有dmso溶液的培養(yǎng)基。孵育10min后，實驗組與陰性對照組加入100μl羅丹明-123的pbs溶液（終濃度2.2μm），再置于37℃，含5%co2的細胞孵育箱內(nèi)孵育20min；空白組加入等體積不含羅丹明-123的空白pbs溶液。孵育結束后，離心棄培養(yǎng)基，并用pbs清洗細胞2次。用200μmpbs緩沖液吹散細胞沉淀，mcf-7及mcf-7/adm細胞懸浮液樣品經(jīng)流式細胞儀測得10000個細胞熒光值的均值greenb，逆轉(zhuǎn)程度far=（greenbmcf-7/adm實驗組/greenbmcf-7/adm陰性對照組）/（greenbmcf-7實驗組/greenbmcf-7陰性對照組）；
結果顯示，18-煙酰氧基續(xù)隨子二萜醇（4）與18-羥基續(xù)隨子二萜醇在40mm的far(40μm)分別為2.4和1.0，提高2.4倍，表明c-18煙酰氧基化，能提高續(xù)隨子二萜醇的抗腫瘤多藥耐藥活性。