本發(fā)明涉及含腙的嘧啶類衍生物及其光學(xué)異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，它們的制備方法以及含有所述化合物的藥物組合物。本發(fā)明還涉及所述化合物較強(qiáng)的alk和ros1激酶抑制作用，并且還涉及該類化合物及其光學(xué)異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于治療和/或預(yù)防由于alk和ros1異常表達(dá)所引起疾病的藥物中的應(yīng)用，特別是在制備治療和/或預(yù)防癌癥的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
激酶靶點(diǎn)藥物的研究已成為當(dāng)今抗腫瘤藥物研究開(kāi)發(fā)的重要方向。目前發(fā)現(xiàn)的激酶靶點(diǎn)藥物中蛋白激酶類是已知研究最多的一類。蛋白激酶由于突變或重排，可引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程障礙或出現(xiàn)異常，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、代謝和生物學(xué)行為異常，因而可誘發(fā)多種腫瘤。
蛋白激酶(proteinkinases,pks)，是一種通過(guò)atp的末端磷酸酯轉(zhuǎn)移催化蛋白質(zhì)的酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基上的羥基磷酸化的酶，主要包括蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase,ptk)和絲氨酸-蘇氨酸激酶(serine-threoninekinase,stk)。通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，這些酶調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和增殖等。ptk通過(guò)和生長(zhǎng)因子配體結(jié)合，使生長(zhǎng)因子受體轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨问?，后者與細(xì)胞膜內(nèi)表面的蛋白相互作用。這導(dǎo)致受體和其他蛋白的酪氨酸殘基磷酸化并且導(dǎo)致與多種細(xì)胞質(zhì)信號(hào)分子的復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)形成，從而影響諸如細(xì)胞分裂(增殖)、細(xì)胞分化、細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝作用等多種細(xì)胞反應(yīng)。
alk，即間變性淋巴激酶(anaplasticlymphomakinase)，于1994年首次發(fā)現(xiàn)于間變性大細(xì)胞淋巴瘤ams3細(xì)胞中，是一個(gè)由1620個(gè)氨基酸組成的單鏈跨膜蛋白，一種酪氨酸激酶，屬于胰島素受體家族成員之一。它在胚胎發(fā)育時(shí)期呈高表達(dá)水平，隨后表達(dá)水平逐漸下降，成年時(shí)期少量表達(dá)。該蛋白由膜外部分、跨膜區(qū)域以及膜內(nèi)催化區(qū)域組成，下游信號(hào)通路為ras-erk、jak3-stat3，以及pi3-k/akt等，這些通路與細(xì)胞增殖、存活、遷移密切相關(guān)。
1994年morri等人發(fā)現(xiàn)，2號(hào)染色體上alk基因與5號(hào)染色體上的核仁磷酸蛋白npm(nucleophosmin)基因錯(cuò)位融合，該重排突變基因nmp-alk具有致癌性。2007年日本科學(xué)家soda等人首次在肺腺癌組織中發(fā)現(xiàn)了alk基因突變：2號(hào)染色體短臂內(nèi)發(fā)生倒置突變，使得棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白4(eml4)基因的1～13號(hào)外顯子與alk基因的20～29號(hào)外顯子融合形eml4-alk融合基因轉(zhuǎn)染了eml4-alk融合基因的nih-3t3成纖維細(xì)胞具有惡性轉(zhuǎn)化能力。約有3％～7％的nsclc患者中存在eml4-alk融合基因。此外，研究還表明alk基因突變參與了多種腫瘤包括漸變性大細(xì)胞淋巴瘤、炎性肌纖維母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)病。
因此，靶向alk的抑制劑，可以通過(guò)抑制alk下游相關(guān)信號(hào)而達(dá)到抗腫瘤的目的。
與alk類似，原癌基因蛋白酪氨酸激酶ros(ros1)也是一個(gè)單體型受體酪氨酸激酶。ros1基因的融合、過(guò)度表達(dá)和突變均會(huì)導(dǎo)致ros1蛋白的失調(diào)。異常的ros1蛋白激酶將會(huì)激活下游多條致癌信號(hào)通路，控制細(xì)胞增殖、存活和細(xì)胞周期的通路。
ros1和alk的激酶域有49％的氨基酸同源序列，多種alk抑制劑在體外均可抑制ros1的活性。最近，麻省總醫(yī)院腫瘤中心的一項(xiàng)研究顯示，以ros1為驅(qū)動(dòng)基因的腫瘤可予以克唑替尼治療，并詳細(xì)描述了克唑替尼對(duì)一位患者的顯著療效。因此，開(kāi)發(fā)ros1和alk雙靶點(diǎn)抑制劑是一種科學(xué)有效的藥物設(shè)計(jì)策略。
文獻(xiàn)報(bào)道的色瑞替尼屬于嘧啶類化合物，是一種口服的alk激酶抑制劑，已于2015年在美國(guó)上市。臨床研究表明，色瑞替尼對(duì)ros1也有很好的抑制活性。
本發(fā)明人在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)并合成了一系列含腙的嘧啶類衍生物。經(jīng)體外活性篩選，表明該類化合物具有抗腫瘤活性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明涉及通式ⅰ所示的含腙的嘧啶類衍生物及其光學(xué)異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，
其中，
x為o、s、nh、nch3；
r1為羥基、鹵素、硝基、氨基、氰基、(c1-c6)烷基亞磺酰基、(c1-c6)烷基磺酰基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基?；被柞；?、被1-2個(gè)(c1-c6)烷基取代的氨基甲酰基、(c1-c3)亞烷基二氧基；
r2為1-2個(gè)選自鹵素、三鹵甲基、羥基、氰基、氨基、硝基:
r3為h、(c1-c6)烷基；
ar為(c6-c10)芳基、5-10元雜芳基，其中，所述雜芳基含有1-3個(gè)選自n、o或s的雜原子，并且ar任選1-3個(gè)相同或不同的r4取代；
r4為1-4個(gè)選自氫、羥基、鹵素、硝基、氨基、氰基、(c1-c6)烷基、(c2-c6)烯基、(c2-c6)炔基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基硫基、任選被羥基、氨基或鹵代的(c1-c6)烷基或(c1-c6)烷氧基、被1-2個(gè)(c1-c6)烷基取代的氨基、(c1-c6)烷基酰胺基、游離的、成鹽的、酯化的和酰胺化的羧基、(c1-c6)烷基亞磺?；?、(c1-c6)烷基磺?；?、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基?；被柞；⒈?-2個(gè)(c1-c6)烷基取代的氨基甲?；?、(c1-c3)亞烷基二氧基、烯丙基。
本發(fā)明涉及通式ⅰ所示的含腙的嘧啶類衍生物及其光學(xué)異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，其中，
x為nh、nch3；
r1為羥基、鹵素、硝基、氨基、氰基、(c1-c6)烷基亞磺酰基、(c1-c6)烷基磺酰基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基?；?、氨基甲?；?、被1-2個(gè)(c1-c6)烷基取代的氨基甲?；?c1-c3)亞烷基二氧基；
r2為1-2個(gè)選自鹵素、三鹵甲基、羥基、氰基、氨基、硝基:
r3為h、(c1-c6)烷基；
ar為(c6-c10)芳基、5-10元雜芳基，其中，所述雜芳基含有1-3個(gè)選自n、o或s的雜原子，并且ar任選1-3個(gè)相同或不同的r4取代；
r4為1-4個(gè)選自氫、羥基、鹵素、硝基、氨基、氰基、(c1-c6)烷基、(c2-c6)烯基、(c2-c6)炔基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基硫基、任選被羥基、氨基或鹵代的(c1-c6)烷基或(c1-c6)烷氧基、被1-2個(gè)(c1-c6)烷基取代的氨基、(c1-c6)烷基酰胺基、游離的、成鹽的、酯化的和酰胺化的羧基、(c1-c6)烷基亞磺酰基、(c1-c6)烷基磺?；?c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基?；被柞；⒈?-2個(gè)(c1-c6)烷基取代的氨基甲?；?、(c1-c3)亞烷基二氧基、烯丙基。
本發(fā)明涉及通式ⅰ所示的含腙的嘧啶類衍生物及其光學(xué)異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，
其中，
x為nh、nch3；
r1為(c1-c6)烷基磺?；?；
r2為1-2個(gè)選自鹵素、三鹵甲基、羥基、氰基、氨基、硝基:
r3為h、(c1-c6)烷基；
ar為(c6-c10)芳基、5-10元雜芳基，其中，所述雜芳基含有1-3個(gè)選自n、o或s的雜原子，并且ar任選1-3個(gè)相同或不同的r4取代；
r4為1-4個(gè)選自羥基、鹵素、硝基、氨基、氰基、(c1-c6)烷基、(c2-c6)烯基、(c2-c6)炔基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基硫基、任選被羥基、氨基或鹵代的(c1-c6)烷基或(c1-c6)烷氧基、被1-2個(gè)(c1-c6)烷基取代的氨基、(c1-c6)烷基酰胺基、游離的、成鹽的、酯化的和酰胺化的羧基、(c1-c6)烷基亞磺?；?c1-c6)烷基磺?；?c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基酰基、氨基甲酰基、被1-2個(gè)(c1-c6)烷基取代的氨基甲酰基、(c1-c3)亞烷基二氧基、烯丙基。
本發(fā)明涉及通式ⅰ所示的含腙的嘧啶類衍生物及其光學(xué)異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，
其中，
x為nh、nch3；
r1為(c1-c6)烷基磺酰基；
r2為任選1-2個(gè)以下取代基：鹵素、三鹵甲基、甲基、氰基、硝基；
r3為h、(c1-c3)烷基；
ar為(c6-c10)芳基、5-10元雜芳基，其中，所述雜芳基含有1-3個(gè)選自n、o或s的雜原子，并且ar任選1-3個(gè)相同或不同的r4取代；
r4為1-4個(gè)選自羥基、鹵素、硝基、氨基、氰基、(c1-c6)烷基、(c2-c6)烯基、(c2-c6)炔基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基硫基、任選被羥基、氨基或鹵代的(c1-c6)烷基或(c1-c6)烷氧基、被1-2個(gè)(c1-c6)烷基取代的氨基、(c1-c6)烷基酰胺基、游離的、成鹽的、酯化的和酰胺化的羧基、(c1-c6)烷基亞磺?；?、(c1-c6)烷基磺?；?、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基?；?、氨基甲?；?、被1-2個(gè)(c1-c6)烷基取代的氨基甲?；?、(c1-c3)亞烷基二氧基、烯丙基。
本發(fā)明涉及通式ⅰ所示的含腙的嘧啶類衍生物及其光學(xué)異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，
其中，
x為nh；
r1為異丙基磺?；?/p>
r2為任選1-2個(gè)以下取代基：鹵素、三鹵甲基、甲基、氰基、硝基；
r3為h、(c1-c3)烷基；
ar為(c6-c10)芳基、5-10元雜芳基，其中，所述雜芳基含有1-3個(gè)選自n、o或s的雜原子，并且ar任選1-3個(gè)相同或不同的r4取代；
r4為1-4個(gè)選自羥基、鹵素、硝基、氨基、氰基、(c1-c6)烷基、(c2-c6)烯基、(c2-c6)炔基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基硫基、任選被羥基、氨基或鹵代的(c1-c6)烷基或(c1-c6)烷氧基、被1-2個(gè)(c1-c6)烷基取代的氨基、(c1-c6)烷基酰胺基、游離的、成鹽的、酯化的和酰胺化的羧基、(c1-c6)烷基亞磺?；?、(c1-c6)烷基磺酰基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基?；?、氨基甲酰基、被1-2個(gè)(c1-c6)烷基取代的氨基甲酰基、(c1-c3)亞烷基二氧基、烯丙基。
本發(fā)明涉及通式ⅰ所示的含腙的嘧啶類衍生物及其光學(xué)異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，
其中，
x為nh；
r1為異丙基磺?；?；
r2為f、cl；
r3為h、ch3；
ar為苯基、萘基、喹啉基、異喹啉基、喹唑啉基、吲哚基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、嘧啶基，并且ar任選1-3個(gè)相同或不同的r4取代；
r4為1-4個(gè)選自羥基、鹵素、硝基、氨基、氰基、(c1-c6)烷基、(c2-c6)烯基、(c2-c6)炔基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基硫基、任選被羥基、氨基或鹵代的(c1-c6)烷基或(c1-c6)烷氧基、被1-2個(gè)(c1-c6)烷基取代的氨基、(c1-c6)烷基酰胺基、游離的、成鹽的、酯化的和酰胺化的羧基、(c1-c6)烷基亞磺?；?c1-c6)烷基磺?；?c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基酰基、氨基甲?；⒈?-2個(gè)(c1-c6)烷基取代的氨基甲?；?、(c1-c3)亞烷基二氧基、烯丙基。
本發(fā)明涉及通式ⅰ所示的含腙的嘧啶類衍生物及其光學(xué)異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，
其中，
x為nh；
r1為異丙基磺?；?；
r2為f、cl；
r3為h、ch3；
ar為苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基，并且ar任選1-3個(gè)相同或不同的r4取代；
r4為氫、鹵素、羥基、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、甲氧基、甲硫基、二甲氨基、甲磺?；?/p>
本發(fā)明化合物及其光學(xué)異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥優(yōu)選以下化合物，但這些化合物并不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制：
(e)-2-(2-苯基亞甲基肼基)-5-氯-n-(2-(異丙磺酰基)苯基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(吡啶-4-基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(吡啶-3-基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(噻吩-2-基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-2-(2-(呋喃-2-基亞甲基)肼基)-n-(2-(異丙磺酰基)苯基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-2-(2-(4-氟苯基)肼基)-n-(2-(異丙磺?；?苯基)嘧啶-4-胺
(e)-2-(2-(4-溴苯基亞甲基)肼基)-5-氯-n-(2-(異丙磺酰基)苯基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(4-硝基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺酰基)苯基)-2-(2-(4-甲基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(4-(三氟甲基)苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(4-甲氧基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(4-氰基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(4-(甲硫基)苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺酰基)苯基)-2-(2-(2-甲氧基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-n-(2-異丙磺?；?苯基)-2-(2-(3-甲氧基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-2-(2-(2-氟苯基亞甲基)肼基)-n-(2-(異丙磺?；?苯基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(3-(三氟甲基)苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-2-(2-(2,4-二氟苯亞甲基)肼基)-n-(2-(異丙磺?；?苯基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺酰基)苯基)-2-(2-(3,4,5-三甲氧基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺酰基)苯基)-2-(2-(1-(4-甲氧基苯基)亞乙基)肼基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-2-(2-(1-(4-氟苯基)亞乙基)肼基)-n-(2-(異丙磺?；?苯基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-2-(2-(1-(2,4-二氟苯基)亞乙基)肼基)-n-(2-(異丙磺?；?苯基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-2-(2-(1-(2-氟苯基)亞乙基)肼基)-n-(2-(異丙磺?；?苯基)嘧啶-4-胺
(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(1-(4-甲基苯基)亞乙基)肼基)嘧啶-4-胺
(e)-2-(2-(1-(4-溴苯基)亞乙基)肼基)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)嘧啶-4-胺。
而且，按照本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一些通常方法，本發(fā)明中通式ⅰ的含腙的嘧啶類衍生物可以與酸生成藥學(xué)上可接受的鹽?？伤幱眉映甥}包括無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸加成鹽，與下列酸加成的鹽是特別優(yōu)選的：鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、對(duì)甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、馬來(lái)酸、檸檬酸、富馬酸、草酸、酒石酸、苯甲酸等。
此外，本發(fā)明還包括本發(fā)明衍生物的前藥。本發(fā)明衍生物的前藥是通式ⅰ的含腙的嘧啶類衍生物，它們自身可能具有較弱的活性甚至沒(méi)有活性，但是在給藥后，在生理?xiàng)l件下(例如通過(guò)代謝、溶劑分解或另外的方式)被轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的生物活性形式。
本發(fā)明中“鹵素”是指氟、氯、溴或碘代；“烷基”是指直鏈或支鏈的烷基；“亞烷基”是指直鏈或支鏈的亞烷基；“芳基”是指無(wú)取代基或連有取代基的苯基或萘基；“雜芳基”是指含有一個(gè)或多個(gè)選自n、o、s雜原子的單環(huán)或多環(huán)的環(huán)狀體系，環(huán)狀體系是芳香性的，如咪唑基、吡啶基、吡唑基、(1,2,3)-和(1,2,4)-三唑基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、苯并噻唑基、噁唑基、異噁唑基、喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基和苯并噁唑基等。
本發(fā)明的活性化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可作為唯一的抗增生性藥物單獨(dú)使用，或者可以與現(xiàn)已上市的抗增生性藥物聯(lián)合使用，用于治療和/或預(yù)防增生性疾病，如牛皮癬、良性前列腺肥大、動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄。
我們已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物體外具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性，因此，它可以用作制備治療和/或預(yù)防癌癥的藥物，如乳腺、肺、肝臟、腎臟、結(jié)腸、直腸、胃、前列腺、膀胱、子宮、胰腺、骨髓、睪丸、卵巢、淋巴、軟組織、頭頸、甲狀腺、食道的癌和白血病、成神經(jīng)細(xì)胞瘤等。
通過(guò)體外抑制結(jié)肺癌細(xì)胞hcc78、淋巴細(xì)胞瘤karpas299、肺腺癌細(xì)胞a549、肺癌細(xì)胞h460和腸癌細(xì)胞ht-29活性試驗(yàn)，本發(fā)明化合物對(duì)肺癌細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞具有顯著抑制作用，特別用于制備治療和/或預(yù)防肺癌和淋巴癌的藥物。
通過(guò)對(duì)alk和ros1酶活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明化合物具有顯著的抑制alk和ros1激酶活性，對(duì)alk和ros1高表達(dá)的肺癌細(xì)胞、淋巴瘤等具有較強(qiáng)的抑制作用，特別用于制備治療和/或預(yù)防肺癌的藥物。
本發(fā)明的活性化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可作為唯一的抗腫瘤藥物單獨(dú)使用，或者可以與現(xiàn)已上市的抗腫瘤藥物(如鉑類藥物順鉑、喜樹(shù)堿類藥物伊立替康、長(zhǎng)春堿類藥物諾維本等)聯(lián)合使用。聯(lián)合治療通過(guò)將各個(gè)治療組分同時(shí)、順序或隔開(kāi)給藥來(lái)實(shí)現(xiàn)。
下文中提供的實(shí)施例和制備例進(jìn)一步闡明和舉例說(shuō)明本發(fā)明化合物及其制備方法。應(yīng)當(dāng)理解，下述實(shí)施例和制備例的范圍并不足以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
下面的合成路線概括并描述了本發(fā)明的式ⅰ衍生物的制備，所有的原料都是通過(guò)這些路線中描述的方式、通過(guò)有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法制備的或者可商購(gòu)。本發(fā)明的全部最終衍生物都是通過(guò)這些路線中描述的方法或通過(guò)與其類似的方法制備的，這些方法是有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。這些路線中應(yīng)用的全部可變因數(shù)如下文的定義或如權(quán)利要求中的定義。
按照本發(fā)明的式ⅰ衍生物，都可按照路線1的方法由中間體m和相應(yīng)的醛或酮在醇類溶劑如乙醇中，通過(guò)縮合反應(yīng)制得。其中，化合物中的x、r1、r2、r3和ar如權(quán)利要求中所定義。
中間體m可按照路線2由中間體iv與取代的二氯嘧啶縮合，再經(jīng)水合肼肼解得到。其中，化合物中的x、r1、r2如權(quán)利要求中所定義。
當(dāng)x為nh，r1為異丙磺?；衔飉-1的制備方法如路線3，其他取代基如權(quán)利要求中所定義。
具體實(shí)施方式：
實(shí)施例旨在闡述而不是限制本發(fā)明的范圍。化合物的核磁共振氫譜用brukerarx-400測(cè)定，質(zhì)譜用agilent1100lc/msd測(cè)定；所用試劑均為分析純或化學(xué)純。
實(shí)施例1：
步驟a異丙基(2-硝基苯基)硫醚(ⅱ)
將509.1g(3.61mol)鄰氟硝基苯和698.0g(5.06mol)無(wú)水碳酸鉀加入至2500ml干燥的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，緩慢滴入301.8g(3.97mol)異丙硫醇，滴畢，升溫至110℃反應(yīng)10h。冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入大量水中，用乙酸乙酯萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑，得黃色液體604.6g，收率85.0％。
步驟b1-異丙磺?；?2-硝基苯(ⅲ)
將197.1g(1.00mol)異丙基(2-硝基苯基)硫醚加入至1500ml冰醋酸中，緩慢滴入583.0g(6.00mol)35％雙氧水,升溫至80℃，反應(yīng)9h。冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入大量水中，室溫?cái)嚢?0min，抽濾，餅干燥后得黃色固體164.7g，收率85％。
步驟c2-異丙磺?；桨?ⅳ)
將115.0g(0.50mol)中間體ⅲ加入至500ml乙醇中，加入0.6g(0.05mol)活性炭和8.1g(0.05mol)無(wú)水三氯化鐵，升溫至50℃，緩慢滴入417.2g(5.00mol)60％的水合肼，升溫至80℃，反應(yīng)15h。趁熱抽濾，蒸去大部分溶劑，將剩余物倒入水中，室溫?cái)嚢?0min，抽濾，濾餅干燥后得淺黃色固體81.62g，收率82％。
步驟d2,5-二氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)嘧啶-4-胺(ⅴ)
將39.8g(0.20mol)中間體ⅳ加入至400ml干燥的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，冰浴下分批加入32.0g(0.80mol)60％氫鈉，冰浴下攪拌30min，緩慢滴入73.4g(0.40mol)2,4,5-三氯嘧啶，冰浴下反應(yīng)10h。將反應(yīng)液倒入大量氯化銨飽和溶液中，室溫?cái)嚢?0min，抽濾，得棕紅固體。乙腈重結(jié)晶得淺黃色固體27.6g，收率40.0％。
步驟e5-氯-2-肼基-n-(2-(異丙磺酰基)苯基)嘧啶-4-胺341.07(ⅵ)
將17.3g(0.05mol)中間體ⅵ加入到200ml乙醇中，緩慢滴入16.7g(0.20mol)60％的水合肼，室溫反應(yīng)7h。抽濾，濾餅干燥得白色固體15.7g，收率92％。
步驟f(e)-2-(2-苯亞甲基肼基)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)嘧啶-4-胺(實(shí)施例1)
將0.3g(0.88mmol)中間體ⅵ及0.11g(1.00mmol)苯甲醛加入到5ml乙醇中，回流反應(yīng)5h。冷卻，抽濾，濾餅用少量乙醇淋洗，得白色固體0.24g，收率63.6％。
esi-ms[m+h](m/z):430.1；1hnmr(600mhz,dmso)δ11.38(s,1h),9.77(s,1h),9.30(s,1h),8.31(s,1h),8.14(s,1h),7.85(dd,j＝15.9,7.7hz,2h),7.72(d,j＝7.5hz,2h),7.48(t,j＝7.5hz,2h),7.39(t,j＝7.4hz,2h),3.56–3.47(m,1h),1.20(d,j＝6.8hz,6h).
按照實(shí)施例1的方法，以不同取代基中間體ⅵ為原料與相應(yīng)的醛或酮進(jìn)行縮合反應(yīng)制備得到實(shí)施例2-25的化合物。
實(shí)施例2(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(吡啶-4-基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):431.1；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.69(s,1h),9.80(s,1h),9.21(s,1h),8.36(s,1h),8.10(s,1h),7.88(t,j＝7.8hz,2h),7.64(d,j＝5.8hz,2h),7.40(t,j＝7.6hz,1h),3.58–3.45(m,1h),1.20(d,j＝6.8hz,6h).
實(shí)施例3(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(吡啶-3-基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):431.1；
實(shí)施例4(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(噻吩基-2-基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):436.1；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.24(s,1h),9.68(s,1h),9.07(s,1h),8.27(s,1h),8.02(s,1h),7.84–7.77(m,3h),7.34(t,j＝7.6hz,1h),6.77(d,j＝3.1hz,1h),6.59(s,1h),3.47(dp,j＝13.7,6.9hz,1h),1.17(d,j＝6.7hz,6h).
實(shí)施例5(e)-5-氯-2-(2-(呋喃-2-基亞甲基)肼基)-n-(2-(異丙磺?；?苯基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):420.1；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.27(s,1h),9.71(s,1h),9.10(s,1h),8.29(s,1h),8.04(s,1h),7.83(dd,j＝18.9,7.9hz,3h),7.37(t,j＝7.6hz,1h),6.79(d,j＝3.1hz,1h),6.62(s,1h),3.50(dt,j＝13.5,6.7hz,1h),1.20(d,j＝6.7hz,6h).
實(shí)施例6(e)-5-氯-2-(2-(4-氟苯基亞甲基)肼基)-n-(2-(異丙磺?；?苯基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):448.1；1hnmr(600mhz,dmso)δ11.35(s,1h),9.75(s,1h),9.26(s,1h),8.28(s,1h),8.11(s,1h),7.86–7.82(m,2h),7.74(dd,j＝8.2,5.8hz,2h),7.36(t,j＝7.4hz,1h),7.31(t,j＝8.6hz,2h),3.52–3.44(m,1h),1.18(d,j＝6.8hz,6h).
實(shí)施例7(e)-2-(2-(4-溴苯基亞甲基)肼基)-5-氯-n-(2-(異丙磺酰基)苯基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):508.0；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),9.76(s,1h),9.23(s,1h),8.29(s,1h),8.08(s,1h),7.85(t,j＝7.8hz,2h),7.65(q,j＝8.7hz,4h),7.36(t,j＝7.7hz,1h),3.55–3.43(m,1h),1.18(d,j＝6.8hz,6h).
實(shí)施例8(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺酰基)苯基)-2-(2-(4-硝基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):475.1；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.71(s,1h),9.79(s,1h),9.20(s,1h),8.34(s,2h),8.32(s,1h),8.20(s,1h),7.93(d,j＝8.6hz,3h),7.85(d,j＝7.8hz,1h),7.39(t,j＝7.5hz,1h),3.56–3.43(m,1h),1.18(d,j＝6.8hz,6h).
實(shí)施例9(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(4-甲基苯亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):444.1；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.31(s,1h),9.77(s,1h),9.31(s,1h),8.10(s,1h),7.90–7.79(m,2h),7.61(d,j＝8.0hz,2h),7.39(t,j＝7.6hz,1h),7.29(d,j＝7.9hz,2h),3.56–3.44(m,1h),2.35(s,3h),1.20(d,j＝6.8hz,6h).
實(shí)施例10(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(4-(三氟甲基)苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):498.1；
實(shí)施例11(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(4-甲氧基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):460.1；hnmr(400mhz,dmso)δ11.21(s,1h),9.76(s,1h),9.29(s,1h),8.28(s,1h),8.09(s,1h),7.85(t,j＝7.9hz,2h),7.66(d,j＝8.7hz,2h),7.38(t,j＝7.6hz,1h),7.05(d,j＝8.7hz,2h),3.82(s,3h),3.56–3.44(m,1h),1.20(d,j＝6.8hz,6h).
實(shí)施例12(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺酰基)苯基)-2-(2-(4-氰基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):455.1；
實(shí)施例13(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(4-(甲硫基)苯基亞甲基基)肼基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):476.1；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.33(s,1h),9.77(s,1h),9.29(s,1h),8.30(s,1h),8.09(s,1h),7.91–7.83(m,2h),7.65(d,j＝8.1hz,2h),7.38(dd,j＝14.8,7.8hz,3h),3.58–3.44(m,1h),2.53(s,3h),1.20(d,j＝6.7hz,6h).
實(shí)施例14(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(2-甲氧基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):476.1；
實(shí)施例15(e)-5-氯-n-(2-異丙磺?；?苯基)-2-(2-(3-甲氧基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):460.1；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.39(s,1h),9.76(s,1h),9.24(s,1h),8.31(s,1h),8.10(s,1h),7.92–7.74(m,2h),7.39(t,j＝7.0hz,2h),7.28(d,j＝7.7hz,2h),6.97(d,j＝7.2hz,1h),3.82(s,3h),3.57–3.44(m,1h),1.20(d,j＝6.6hz,6h).
實(shí)施例16(e)-5-氯-2-(2-(2-氟苯基亞甲基)肼基)-n-(2-(異丙磺?；?苯基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):460.1；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.52(s,1h),9.79(s,1h),9.24(s,1h),8.34(d,j＝7.8hz,2h),7.98(t,j＝7.2hz,1h),7.85(dd,j＝14.2,7.7hz,2h),7.40(qd,j＝13.3,6.8hz,3h),7.32–7.24(m,1h),3.59–3.44(m,1h),1.20(d,j＝6.8hz,6h).
實(shí)施例17(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(3-(三氟甲基)苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):498.1；
實(shí)施例18(e)-5-氯-2-(2-(2,4-二氟苯基亞甲基)肼基)-n-(2-(異丙磺?；?苯基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):466.1；
實(shí)施例19(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(3,4,5-三甲氧基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):520.1；
實(shí)施例20(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(1-(4-甲氧基苯基)亞乙基)肼基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):459.1；1hnmr(400mhz,dmso)δ10.24(s,1h),9.80(s,1h),9.41(d,j＝8.4hz,1h),8.32(s,1h),7.90–7.83(m,3h),7.80(t,j＝8.5hz,1h),7.38(t,j＝7.6hz,1h),7.04(d,j＝8.8hz,2h),3.82(s,3h),3.50(dt,j＝13.5,6.8hz,1h),2.29(s,3h),1.20(d,j＝6.8hz,6h).
實(shí)施例21(e)-5-氯-2-(2-(1-(4-氟苯基)亞乙基)肼基)-n-(2-(異丙磺?；?苯基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):462.1；
實(shí)施例22(e)-5-氯-2-(2-(1-(2,4-二氟苯基)亞乙基)肼基)-n-(2-(異丙磺?；?苯基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):480.1；
實(shí)施例23(e)-5-氯-2-(2-(1-(2-氟苯基)亞乙基)肼基)-n-(2-(異丙磺?；?苯基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):480.1；
實(shí)施例24(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)-2-(2-(1-(4-甲基苯基)亞乙基)肼基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):458.1；
實(shí)施例25(e)-2-(2-(1-(4-溴苯基)亞乙基)肼基)-5-氯-n-(2-(異丙磺?；?苯基)嘧啶-4-胺
esi-ms[m+h](m/z):522.0；
本發(fā)明產(chǎn)物的抗腫瘤活性研究
體外抗腫瘤細(xì)胞活性
對(duì)按照本發(fā)明的上式ⅰ的嘧啶類衍生物進(jìn)行了體外結(jié)肺癌細(xì)胞hcc78、淋巴細(xì)胞瘤karpas299、肺腺癌細(xì)胞a549、肺癌細(xì)胞h460和腸癌細(xì)胞ht-29體外活性篩選。
(1)細(xì)胞復(fù)蘇并傳代2-3次穩(wěn)定后，用胰蛋白酶溶液(0.25％)使其從培養(yǎng)瓶底部消化下來(lái)。將細(xì)胞消化液倒入離心管中后，之后加入培養(yǎng)液以終止消化。將離心管在800r/min下離心10min，棄去上清液后加入5ml培養(yǎng)液，吹打混勻細(xì)胞，吸取10μl細(xì)胞混懸液加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為104個(gè)/孔。96孔板中除a1孔為空白孔不加細(xì)胞外，其余皆加入100μl細(xì)胞混懸液。將96孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
(2)用50μl二甲基亞砜溶解受試樣品，然后加入適量培養(yǎng)液，使樣品溶解成2mg/ml藥液，然后在24孔板中將樣品稀釋為20、4、0.8、0.16、0.032μg/ml。
每個(gè)濃度加入3孔，其中周圍兩行兩列細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)受環(huán)境影響較大，只和為空白細(xì)胞孔使用。將96孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。
(3)將96孔板中帶藥培養(yǎng)液棄去，用磷酸緩沖溶液(pbs)將細(xì)胞沖洗兩遍，在每孔中加入mtt(0.5mg/ml)100μl放入培養(yǎng)箱中4h后，棄去mtt溶液，加入二甲基亞砜100μl。在磁力振蕩器上振蕩使存活細(xì)胞與mtt反應(yīng)產(chǎn)物甲臜充分溶解，放入酶標(biāo)儀中測(cè)定結(jié)果。通過(guò)bliss法可求出藥物ic50值。
化合物的抑制肺癌細(xì)胞hcc78、淋巴細(xì)胞瘤karpas299、肺腺癌細(xì)胞a549、肺癌細(xì)胞h460和腸癌細(xì)胞ht-29活性結(jié)果見(jiàn)表1。
表1
alk和ros1酶活性試驗(yàn)
用于測(cè)量alk酶活性的試驗(yàn)基于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。具體操作是：
室溫下，在0.25mg/mlpgt包被的板上，將實(shí)施例化合物、50pmalk和5umatp在試驗(yàn)緩沖液中(25mmmops,ph7.4,1mmdtt,5mmmgcl2,1mmmncl2,0.1％nan3)溫育20min。通過(guò)沖洗除去反應(yīng)混合液并用0.2ug/ml綴合辣根過(guò)氧化酶的磷酸酪氨酸特異性克隆抗體檢測(cè)磷酸聚合物底物。加入1m磷酸終止顯色后，于450nm處通過(guò)分光光度法定量顯色的底物顏色。
ros1酶活性的試驗(yàn)操作同alk酶活性測(cè)試方法。
實(shí)施例化合物對(duì)alk和ros1的抑制數(shù)據(jù)見(jiàn)表2.
表2
本發(fā)明中通式ⅰ的化合物可單獨(dú)施用，但通常是和藥用載體混合物給予，所述藥用載體的選擇要根據(jù)所需用藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥物實(shí)踐，下面分別用該類化合物的各種藥物劑型，例如片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑和軟膏劑的制備方法，說(shuō)明其在制藥領(lǐng)域中的新應(yīng)用。
實(shí)施例26：片劑
用含有權(quán)利要求1中化合物的化合物(以實(shí)施例12化合物為例)10g，按照藥劑學(xué)一般壓片法加輔料20g混勻后，壓制成100片，每片重300mg。
實(shí)施例27：膠囊劑
用含有權(quán)利要求1中化合物的化合物(以實(shí)施例16化合物為例)10g，按照藥劑學(xué)膠囊劑的要求將輔料20g混勻后，裝入空心膠囊，每個(gè)膠囊重300mg。
實(shí)施例28：注射劑
用含有權(quán)利要求1中化合物的化合物(以實(shí)施例1化合物為例)10g，按照藥劑學(xué)常規(guī)方法，進(jìn)行活性炭吸附，經(jīng)0.65μm微孔濾膜過(guò)濾后，填入氮?dú)夤拗瞥伤樦苿?，每只裝2ml，共灌裝100瓶。
實(shí)施例29：氣霧劑
用含有權(quán)利要求1中化合物的化合物(以實(shí)施例22化合物為例)10g，用適量丙二醇溶解后，加入蒸餾水及其他輻料后，制成500ml的澄清溶液即得。
實(shí)施例30：栓劑
用含有權(quán)利要求1中化合物的化合物(以實(shí)施例19化合物為例)10g，將之研細(xì)加入甘油適量，研勻后加入已熔化的甘油明膠，研磨均勻，傾入已涂潤(rùn)滑劑的模型中，制得栓劑50顆
實(shí)施例31：膜劑
用含有權(quán)利要求1中化合物的化合物(以實(shí)施例13化合物為例)10g，將聚乙烯醇、藥用甘油、水等攪拌膨脹后加熱溶解，80目篩網(wǎng)過(guò)濾，再將實(shí)施例18化合物加入到濾液中攪拌溶解，涂膜機(jī)制膜100片。
實(shí)施例32：滴丸劑
用含有權(quán)利要求1中化合物的化合物(以實(shí)施例17化合物為例)10g，與明膠等基質(zhì)50g加熱熔化混勻后，滴入低溫液體石蠟中，共制得滴丸1000丸。
實(shí)施例33：外用搽劑
用含有權(quán)利要求1中化合物的化合物(以實(shí)施例8化合物為例)10g，按照常規(guī)藥劑學(xué)方法與乳化劑等輔料2.5g混合研磨，再加蒸餾水至200ml制得。
實(shí)施例34：軟膏劑
用含有權(quán)利要求1中化合物的化合物(以實(shí)施例7化合物為例)10g，研細(xì)后與凡士林等油性基質(zhì)500g研勻制得。
盡管已經(jīng)通過(guò)特定實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但修改和等價(jià)變化對(duì)于精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯見(jiàn)的，且它們都包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。