本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，涉及大別山五針?biāo)傻臉淦ぬ崛∥锛捌渲苽浞椒ê驮谥扑幹械挠猛荆景l(fā)明從大別山五針?biāo)桑╬inusdabeshanensis）的樹皮中提取分離得到異海松烷型和松香烷型二萜化合物，經(jīng)生物活性測試表明該類化合物可顯著抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1b（ptp1b），可用于制備預(yù)防或治療ptp1b介導(dǎo)的疾病，特別是ii型糖尿病、肥胖癥及其并發(fā)癥的藥物或該類藥物的先導(dǎo)化合物。本發(fā)明還涉及該類化合物的制備方法。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有技術(shù)公開了蛋白酪氨酸磷酸酶（proteintyrosinephosphatase,ptp）是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白酪氨酸殘基磷酸化水平的酶家族，與細胞增殖和胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程密切相關(guān)（fischeretal,science1991,253:401-406）。蛋白酪氨酸磷酸酶1b（proteintyrosinephosphatase1b,ptp1b）廣泛分布于多種人體組織中，全長約50kda，是最早被純化和確定生物學(xué)特征的ptp家族成員之一（charbonneauetal,proc.natl.acad.sci.usa.1989,86:5252–5256）。ptp1b表達的改變與人類糖尿病、肥胖癥和癌癥等疾病相關(guān)。糖尿病（diabetesmellitus）和肥胖癥（obesity）是嚴重威脅人類身體健康的內(nèi)分泌紊亂性代謝類疾病，常伴隨著外周組織細胞對胰島素敏感性的降低（即胰島素抵抗），引起肌肉、肝臟及脂肪組織中的糖脂代謝平衡失調(diào)。根據(jù)糖尿病的發(fā)病機制，目前一般將糖尿病分為i型糖尿?。ㄒ葝u素依賴型，iddm）與ii型糖尿?。ǚ且葝u素依賴型，niddm）。其中ii型糖尿病占90%以上，胰島素抵抗是ii型糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵因素。研究表明，ptp1b可使激活的胰島素受體和胰島素受體底物去磷酸化，在胰島素和瘦素的信號傳導(dǎo)過程中起著重要的負調(diào)控作用（kenndyetal,science1999,283:1544–1548）。ptp1b的過度表達將會導(dǎo)致胰島素和瘦素信號的變化，從而導(dǎo)致糖尿病和肥胖癥的發(fā)生。因此，ptp1b可視為治療糖尿病和肥胖癥等相關(guān)疾病的重要的藥物靶點（johnsonetal.,nat.rev.drug.discov.2002,1:696–709）。尋找ptp1b的特異性抑制劑，通過抑制ptp1b的活性來提高外周組織對胰島素的敏感性，對糖尿病和肥胖癥治療有著重要的應(yīng)用前景。另有研究發(fā)現(xiàn)ptp1b在包括慢性髓細胞性白血病、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌在內(nèi)的若干癌細胞中都有過量表達和水平提高現(xiàn)象（liuetal.,j.biol.chem.1996,271,31290–31295;kennethetal.,mol.cell.biol.1998,18,2965–2975;weinerteal.,j.natl.cancerinst.1996,86,372–378），說明ptp1b在這些癌癥細胞中起著調(diào)控激酶活性的作用。因此，ptp1b的抑制劑可用于治療或預(yù)防癌癥或在癌癥發(fā)展時用于減緩其進展。還有研究表明ptp1b抑制劑可用于治療或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病。ptp1b作為新的藥用靶點已成為近年來生物學(xué)及創(chuàng)新藥物研究的一個熱點。隨著高通量篩選技術(shù)的廣泛運用，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)較多種類的ptp1b抑制劑。然而迄今為止，尚未有任何ptp1b抑制劑得以成功上市成為藥物，限制其成藥的首要原因是ptp1b與ptp家族中其他的酶具有相同的催化中心，在抑制ptp1b活性的同時提高其針對ptp1b的選擇性極其重要。另外，目前發(fā)現(xiàn)的活性比較高的抑制劑多帶有磷酸、羧酸、磺酸等極性基團，具有較高的負電荷，不利于透過細胞膜，導(dǎo)致生物利用度差。因此尋找高效、高選擇性，同時兼具良好藥代動力學(xué)性質(zhì)的小分子ptp1b抑制劑具有重要意義，對于糖尿病和肥胖癥等疾病的治療有著廣闊的應(yīng)用前景。天然產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和結(jié)構(gòu)多樣性的特點，是新藥發(fā)現(xiàn)的重要來源。天然產(chǎn)物及其衍生物獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使其具有高藥效和對特定靶點高選擇性的優(yōu)點以及潛在的獨特的作用機制等優(yōu)點（newman,etal.,nat.prod.rep.2000,17:215–34;newmanetal.,j.nat.prod.2012,75:311–335）。因此從天然活性成分中尋找開發(fā)新型、高效的ptp1b抑制劑具有重要的研究價值。統(tǒng)計表明，瀕危植物次生代謝產(chǎn)物的成藥性較高，是發(fā)現(xiàn)具有新穎結(jié)構(gòu)和獨特作用機制的新藥物的重要來源，在國際上正引起高度重視（ibrahimetal.,proc.natl.acad.sci.usa.2013:110,16832–16837;zhuetal.,proc.natl.acad.sci.usa.2011,108:12943–12948）。大別山五針?biāo)桑╬inusdabeshanensis）隸屬松科（pinaceae）松屬（pinus）植物，是一種常綠喬木，成年后高達30余米，直徑可達50cm，是我國特有的面臨瀕危滅絕的珍稀樹種之一，于1992年10月被列為國家珍稀樹種第一批二級保護樹種（fuetal.,chinaplantreddatabook,sciencepress:beijing;newyork,1992）；其天然分布于大別山地區(qū)海拔800-1350米的山脊懸?guī)r陡坡和溝谷兩側(cè)。分布范圍狹窄，結(jié)實母株罕見，授粉率極低，球果種子十粒九空，種子敗育率極高，發(fā)芽率極低，而且常因球果種子遭松鼠危害，故林下幼樹極少，自然更新十分困難，其化學(xué)成分尚未有任何報道。本申請的發(fā)明人基于保護性地采集少許大別山五針?biāo)芍参飿悠?，積極促進利用這一瀕危珍稀資源為人類服務(wù)的宗旨，擬提供大別山五針?biāo)傻臉淦ぬ崛∥锛捌渲苽浞椒ê驮谥扑幹械挠猛?。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是提供大別山五針?biāo)傻臉淦ぬ崛∥锛捌渲苽浞椒ê驮谥扑幹械挠猛?，本發(fā)明從大別山五針?biāo)桑╬inusdabeshanensis）的樹皮中提取分離得到異海松烷型和松香烷型二萜化合物，經(jīng)生物活性測試表明該類化合物可顯著抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1b（ptp1b），可用于制備預(yù)防或治療ptp1b介導(dǎo)的疾病，特別是ii型糖尿病、肥胖癥及其并發(fā)癥的藥物或該類藥物的先導(dǎo)化合物。本發(fā)明的所述的二萜類化合物具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)式：其中化合物1和2為異海松烷型二萜，化合物3–5為松香烷型二萜，本發(fā)明中，所述的二萜類化合物，其中c-18位均氧化成羧基，同時異海松烷型二萜1和2的側(cè)鏈具有三元氧環(huán)；所述的松香烷型二萜化合物3–5結(jié)構(gòu)中c環(huán)芳化。本發(fā)明的另一目的是提供所述的化合物的制備方法。本發(fā)明所述的化合物由大別山五針?biāo)蓸淦そ?jīng)由本領(lǐng)域所涉常規(guī)的提取分離方法制備而得，其包括步驟：晾干粉碎的大別山五針?biāo)蓸淦び眉状际覝亟萏崛?，提取液減壓回收溶劑，合并后得浸膏。浸膏用水分散后依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，得石油醚部分、乙酸乙酯部分和水溶性部分，乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠、sephadexlh-20及半制備hplc分離，得化合物1–5。本發(fā)明所述的化合物可通過從植物中分離純化得到；也可經(jīng)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的化學(xué)方法合成獲得。本發(fā)明對所制得的二萜類化合物進行了蛋白酪氨酸磷酸酶1b（ptp1b）抑制活性實驗，結(jié)果表明該類化合物均具有顯著的抑制活性，進一步，所述的化合物可作為蛋白酪氨酸磷酸酶ptp1b抑制劑，用于制成預(yù)防、延緩或治療由ptp1b介導(dǎo)的疾病，特別是ii型糖尿病和肥胖癥的藥物或是作為該類藥物的先導(dǎo)化合物。本發(fā)明所述的化合物可單獨應(yīng)用或者合用，亦可與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑結(jié)合，按照常規(guī)方法制成口服或者非口服劑型。本發(fā)明具有如下優(yōu)點：所述目標(biāo)化合物1為新的異海松烷型二萜化合物，而化合物2為首次從自然界中分離得到；首次發(fā)現(xiàn)所述二萜類化合物具有顯著的ptp1b酶抑制活性，對現(xiàn)代人群中高發(fā)的糖尿病、肥胖癥等具有應(yīng)用前景。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但這些實施例絕非對本發(fā)明有任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說明書的啟示下對本發(fā)明實施中所作的任何變動都將落在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。具體實施方式下述制備例中，，比旋光測試通過jascop-1020旋光儀完成；紫外和紅外光譜數(shù)據(jù)分別通過shimadzuuv-2550紫外光譜儀和nicoletavatar360型紅外光譜儀獲得；nmr用brukeravanceii400型儀測定；lr-ms由agilent1100serieslc/msdg1946d型儀測定,hr-ms由absciextripletof5600型儀測定；所使用的硅膠和薄層板為煙臺康比諾公司生產(chǎn)，sephadexlh-20凝膠為瑞士gehealthcarebio-sciences公司生產(chǎn)；半制備hplc為waterse2695，配備2998pda和2424蒸發(fā)光散射雙檢測器以及sunfireods(5μm,250×10mm)半制備柱，日本島津lc-2010ahtshimadzunormal-phasechiralitycolumn(5μm,250×4.6mm,chiralpak,ad-h)；所有試劑均為上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。實施例1：二萜類化合物的制備取大別山五針?biāo)蓸淦?80g，粉碎后用90%甲醇室溫冷浸提取5次，合并提取液，減壓濃縮，得浸膏50g。浸膏用水分散后依次用石油醚與乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯部分40.0g。乙酸乙酯部分經(jīng)100-200目硅膠柱層析，以石油醚：乙酸乙酯30:1-0:1及乙酸乙酯：甲醇15:1-0:1梯度洗脫，得到8個組分（fr.a-fr.h），組分fr.b（1.9g）又經(jīng)200-300目硅膠柱層析（洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯10:1-2:1）得到3個亞組分（fr.b1-3），其中亞組分fr.b1(30.6mg)采用半制備型hplc進一步分離，以73%乙腈等度洗脫（流速：3ml/min），得到化合物3（8.0mg,tr=21.3min），組分fr.c（1.9g）經(jīng)200-300目硅膠柱層析（洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯7:1-3:1）得到2個亞組分（fr.c1-2），其中亞組分fr.c1經(jīng)過凝膠sephadexlh-20柱層析（洗脫劑為甲醇）得到化合物4（28.0mg），亞組分fr.c2經(jīng)過半制備型hplc進一步分離，以90%甲醇等度洗脫（流速：3ml/min），分別得到化合物1和2的混合物，該混合物又經(jīng)過手性柱（正己烷：異丙醇94:6，流速：1ml/min）進一步分離得到化合物1（2.2mg,tr=9.5min）和2（2.5mg,tr=12.5min），組分fr.f（0.5g）經(jīng)sephadexlh-20以純甲醇洗脫，得到化合物5（120.0mg）?；衔?–5的核磁及理化數(shù)據(jù)如下：化合物1(15(r*),16-epoxy-13-epi-pimara-7-en-18-oicacid):無色油狀,[α]d20+5.0°(c0.1,chcl3);uv(chcl3)λmax(logε)217(0.97)nm;ir(kbr)νmax2922,2857,1698,1452,1442,1386,1366,1024,786cm?1;1hnmr(400mhz,cdcl3):δ0.75(3h,s,me-17),0.90(3h,s,me-20),1.13(1h,m,h-1a),1.28(3h,s,h-19),1.36(1h,m,h-11a),1.39(1h,m,h-12a),1.45(1h,m,h-12b),1.56(2h,m,h-2),1.58(1h,m,h-11b),1.68(1h,m,h-3a),1.71(1h,m,h-6),1.76(1h,m,h-5),1.77(1h,m,h-3b),1.85(1h,d,j=13.6hz,h-14a),1.86(1h,m,h-1b),1.94(1h,d,j=13.6hz,h-14b),1.96(1h,m,h-9),1.99(1h,m,h-6b),2.64(2h,brd,j=3.6hz,h-16),2.72(1h,dd,j=3.6,3.2hz,h-15),5.34(1h,brd,j=5.2hz,h-7).13cnmr(100mhz,cdcl3):δ38.8(c-1),17.9(c-2),36.9(c-3),46.3(c-4),52.0(c-5),25.2(c-6),121.3(c-7),134.7(c-8),44.9(c-9),35.0(c-10),19.4(c-11),33.3(c-12),33.9(c-13),42.0(c-14),60.6(c-15),43.4(c-16),18.1(c-17),184.7(c-18),17.1(c-19),15.3(c-20);(+)esimsm/z319[m+h]+,341[m+na]+;hresimsm/z341.2095[m+na]+(calcdforc20h30o3na,calcd341.2093,δ=－2.7ppm).化合物2(15(s*),16-epoxy-13-epi-pimara-7-en-18-oicacid):無色油狀,[α]d20+8.0°(c0.1,chcl3);uv(chcl3)λmax(logε)217(0.83)nm;ir(kbr)νmax2922,2857,1698,1452,1442,1386,1366,1024,786cm?1;1hnmr(400mhz,cdcl3):δ0.78(3h,s,me-17),0.90(3h,s,me-20),1.13(1h,m,h-1a),1.28(3h,s,h-19),1.36(1h,m,h-11a),1.37(1h,m,h-12a),1.45(1h,m,h-12b),1.56(2h,m,h2-2),1.58(1h,m,h-11b),1.68(1h,m,h-3a),1.71(1h,m,h-6),1.76(1h,m,h-5),1.77(1h,m,h-3b),1.85(1h,d,j=13.6hz,h-14a),1.86(1h,m,h-1b),1.94(1h,d,j=13.6hz,h-14b),1.96(1h,m,h-9),1.99(1h,m,h-6b),2.64(1h,dd,j=4.8,4.0hz,h-16),2.68(1h,dd,j=4.8,3.2hz,h-16),2.72(1h,dd,j=4.0,3.2hz,h-15),5.34(1h,brd,j=5.2hz,h-7).13cnmr(100mhz,cdcl3):δ38.8(c-1),17.9(c-2),36.9(c-3),46.3(c-4),52.0(c-5),25.2(c-6),121.3(c-7),134.7(c-8),44.9(c-9),35.0(c-10),19.4(c-11),32.0(c-12),33.9(c-13),42.9(c-14),60.7(c-15),43.5(c-16),18.5(c-17),184.7(c-18),17.1(c-19),15.3(c-20);(+)esimsm/z319[m+h]+,341[m+na]+;hresimsm/z341.2095[m+na]+(calcdforc20h30o3na,calcd341.2093,δ=－2.5ppm).化合物3(abieta-8,11,13,15-tetraen-18-oicacid):白色無定形粉末,[α]d20+55.0(c0.1,meoh).1hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.25(3h,s,me-20),1.29(3h,s,me-19),1.50(1h,m,overlapped,h-6a),1.50(1h,dd,overlapped,h-1a),1.72(1h,m,h-3a),1.75(2h,m,h2-2),1.80(1h,m,h-3b),1.84(1h,m,h-6b),2.14(3h,brs,h-17),2.25(1h,dd,j=12.4,2.1hz,h-5),2.33(1h,brd,j=13.5hz,h-1b),2.94(2h,m,h2-7),5.04(1h,brs,h-16a),5.34(1h,brs,h-16b),7.16(1h,d,j=2.0hz,h-14),7.20(1h,d,j=8.0hz,h-11),7.26(1h,dd,j=8.0,2.0hz,h-12);(+)esimsm/z299[m+h]+,321[m+na]+.化合物4(12-hydroxydehydroabieticacid):淡黃色油狀,[α]d20+35.0°(c0.1,cdcl3).1hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.22(3h,s,me-20),1.25(3h,d,j=7.2hz,me-16),1.27(3h,d,j=7.2hz,me-17),1.29(3h,s,h-19),1.52(1h,m,overlapped,h-6a),1.52(1h,dd,overlapped,h-1a),1.70(1h,m,h-3a),1.74(2h,m,h2-2),1.79(1h,m,h-3b),1.82(1h,m,h-6b),2.22(1h,dd,j=12.5,2.2hz,h-5),2.25(1h,brd,j=13.5hz,h-1b),2.83(2h,m,h2-7),3.12(1h,sept.,j=7.2hz,h-15),6.64(1h,s,h-11),6.85(1h,s,h-14),13cnmr(100mhz,cdcl3):δ37.9(c-1),18.5(c-2),36.7(c-3),47.4(c-4),44.5(c-5),21.9(c-6),29.2(c-7),127.0(c-8),147.8(c-9),36.8(c-10),110.8(c-11),150.7(c-12),131.8(c-13),126.7(c-14),26.8(c-15),22.7(c-16),22.5(c-17),184.5(c-18),16.2(c-19),25.0(c-20);(+)esimsm/z317[m+h]+,339[m+na]+.化合物5(15-hydroxy-7-oxo-8,11,13-abietatrien-18-oicacid):淡黃色粉末,[α]d20+16.5(c0.1,meoh).1hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.27(3h,s,me-20),1.29(3h,s,me-19),1.58(6h,s,me-16,17),1.68(1h,m,h-1a),1.80(5h,m,h-1b,h2-2,h2-3),2.42(1h,dd,j=17.0,3.2hz,h-6a),2.68(1h,dd,j=13.5,3.2hz,h-5),2.86(1h,dd,j=17.0,13.5hz,h-6b),7.38(1h,d,j=8.4hz,h-11),7.76(1h,d,j=8.4,2.1hz,h-12),8.06(1h,d,j=2.1hz,h-12),13cnmr(100mhz,cdcl3):δ37.7(c-1),18.1(c-2),37.0(c-3),46.3(c-4),43.5(c-5),36.4(c-6),198.8(c-7),130.4(c-8),153.8(c-9),37.3(c-10),123.6(c-11),130.7(c-12),147.3(c-13),123.3(c-14),72.4(c-15),31.7(c-16),31.5(c-17),182.5(c-18),16.1(c-19),23.6(c-20);(+)esimsm/z331[m+h]+,353[m+na]+.。實施例2：蛋白酪氨酸磷酸酶1b抑制活性測定實驗方法：采用分子生物學(xué)的方法，構(gòu)建基因重組的hgst-ptp1b-bl21e.coli人類ptp1b工程菌，經(jīng)純化后的hgst-ptp1b重組蛋白能水解底物para-nitrophenylphosphate(pnpp)的磷脂鍵，得到的脫磷酸產(chǎn)物pnp在波長405nm處有很強的光吸收，因此可通過直接檢測405nm處光吸收的變化以觀察酶活性變化以及化合物對酶活性的抑制情況；初篩選擇所述化合物濃度為20μg/ml時對ptp1b酶活性的百分抑制率進行考察，試驗結(jié)果表明化合物4和5抑制率高于95%，化合物1-3抑制率高于60%。進一步測定ic50值：樣品臨用前溶于dmso配成合適濃度，3倍稀釋，7個稀釋度，三復(fù)孔，取2μl樣品溶液加入到標(biāo)準的測活體系（30nmgst-hptp1b,2mmpnpp,50mm3-嗎啉丙磺酸(mops)，ph6.5,2mmdtt,1mmedta,2%dmso）。反應(yīng)溫度為30oc，在versamax上動態(tài)測量405nm處的光吸收，時間為3min，其動力學(xué)曲線一級反應(yīng)的斜率作為酶的活性指標(biāo)。以相對活性對化合物濃度作圖，經(jīng)公式v/v0＝100/(1+b*[i]/ic50)擬合得到ic50值。實驗重復(fù)三次，結(jié)果取三次的平均值，陽性對照齊墩果酸（oleanolicacid）ic50值為1.45μg/ml；表1.測試化合物抑制ptp1b活性數(shù)據(jù)化合物ic50(μg/ml)113.04±1.21211.17±3.09316.10±1.4441.61±0.2653.42±0.28化合物1–5抑制ptp1b的ic50值如表1所示，測試結(jié)果表明，所述5個化合物均表現(xiàn)出顯著的抑制活性，尤其化合物4和5的作用強度與陽性對照齊墩果酸基本相當(dāng)，表明本發(fā)明所述化合物可用于制備治療糖尿病、肥胖癥及其并發(fā)癥的藥物或是作為該類藥物的先導(dǎo)化合物。當(dāng)前第1頁12