用于識別、富集和/或擴增抗原特異性T細胞的試劑和方法與流程

本申請的主題涉及免疫治療，并且涉及公開于2014年3月13日提交的pct/us2014/25889中的主題，其中的內(nèi)容以引入方式并入。

背景技術(shù)：

抗原特異性t細胞的擴增因抗原特異性天然前體的稀有性而復(fù)雜，其可僅為百萬分之一。為了產(chǎn)生過繼治療所需要的大量的腫瘤特異性t細胞(例如)，淋巴細胞通常用抗原刺激多周，常常接著在勞動密集過程中的t細胞選擇和亞克隆。

出于治療和診斷目的兩者，存在對可從天然前體快速產(chǎn)生大量和高頻率抗原特異性t細胞，或快速識別t細胞應(yīng)答以候選肽抗原的技術(shù)的需要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在各種方面，本發(fā)明提供在培養(yǎng)液中，包括從天然t細胞并且包括從稀少前驅(qū)細胞快速富集和擴增抗原特異性t細胞。本發(fā)明由此提供用于更有效免疫治療(例如通過過繼轉(zhuǎn)移)的平臺。本發(fā)明通過確定對候選肽抗原庫的t細胞反應(yīng)性，進一步提供用于快速識別來自患者淋巴細胞的抗原特異性t細胞應(yīng)答的平臺和用于個性化免疫治療的平臺。

在各種實施例中本發(fā)明采用納米級人工抗原呈遞細胞(aapc)，其捕獲刺激信號并且將其傳遞到免疫細胞，如抗原特異性t淋巴細胞，如ctl。存在于aapc上的信號可包括信號1，在主要組織相容性復(fù)合體(mhc)的情形下呈遞的抗原肽(i類或ii類)；以及信號2，調(diào)節(jié)t細胞應(yīng)答的一種或多種共刺激配體。在一些實施例中信號2為通過cd28結(jié)合并且活化的配體。在各種實施例中，粒子材料為順磁性的并且優(yōu)選地為生物兼容性的，如聚葡萄糖涂布的氧化鐵粒子。順磁性的粒子允許磁性捕獲或通過施加磁場“富集”，以及在富集的細胞部分內(nèi)活化和后續(xù)擴增抗原特異性淋巴細胞，其另外通過施加磁場增強。

在一些方面，本發(fā)明提供用于制備抗原特異性t細胞群的方法。所述方法包含提供包含來自患者的t細胞的樣品。在一些實施例中，患者需要抗原特異性t細胞的過繼轉(zhuǎn)移。樣品可為pbmc樣品，或通過白細胞去除術(shù)獲得的樣品。樣品可富集所關(guān)注的t細胞，如cd8+t細胞和/或天然t細胞。含有t細胞的樣品與呈遞所關(guān)注的疾病(例如腫瘤型)常見的抗原和/或呈遞基于個人化選擇的一種或多種抗原的順磁性aapc的群接觸。在某些實施例中，每個aapc珠粒呈遞單個抗原，并且各自呈遞不同抗原的aapc珠粒的混合液用于富集/擴增。順磁性特性用于通過鄰近放置磁體針對特異性t細胞捕獲或“富集”抗原樣品以由此分離aapc-締合細胞與非締合細胞?；厥盏膖細胞可通過具有aapc的培養(yǎng)液體外擴增，并且抗原特異性細胞的擴增通過磁場的存在進一步增強。富集和擴增過程可重復(fù)一次或多次，用于抗原特異性細胞的理想擴增(以及進一步純化)。

在某些實施例中，所述方法提供抗原特異性t細胞的約1000至10,000倍擴增(或更多)，其中大于約10⁸抗原特異性t細胞在例如1至3周里產(chǎn)生。所得細胞可向患者給藥以治療疾病?？乖禺愋灶l率為在轉(zhuǎn)移之后對于理想擴增的獨特重要的參數(shù)，因為競爭來自無關(guān)的共同轉(zhuǎn)移的細胞的生長信號可顯著減弱所關(guān)注的抗腫瘤t細胞的動態(tài)平衡擴增。

在另外其它方面，本發(fā)明提供用于基于個人化選擇t細胞抗原的方法。舉例來說，各自呈遞候選抗原肽的aapc的陣列或庫用來自受試者或患者的t細胞篩選，并且確定或定量t細胞對每個aapc-肽的應(yīng)答。t細胞應(yīng)答可例如通過細胞因子表達或t細胞活化的其它替代標(biāo)記的表達定量。示例性的測定平臺包括免疫化學(xué)，如elisa，或已表達基因的擴增，例如通過rt-pcr。在其它實施例中，t細胞活化通過測量指示t細胞活化(如鈣信號傳遞)的胞內(nèi)信號傳遞事件定量。此類測定可采用本領(lǐng)域中已知的任何多種比色測定。

對于免疫治療選擇示出最魯棒應(yīng)答的肽抗原，所述免疫治療在一些實施例中包括過繼免疫治療，其可通過抗原特異性t細胞的富集和擴增實現(xiàn)。在一些實施例中，并且具體來說對于癌免疫治療，基因分析患者的腫瘤，并且根據(jù)患者的獨特腫瘤突變特征預(yù)測腫瘤抗原。合成這些預(yù)測的抗原(“新抗原”)并且使用aapc平臺針對患者的t細胞進行篩選。當(dāng)識別/確認(rèn)反應(yīng)性抗原時，可制備aapc用于本文所述的富集和擴增方案，或在一些實施例中aapc可直接向患者給藥。

在一些實施例中，針對各自呈遞不同候選肽抗原的順磁性aapc的陣列或庫篩選患者或受試者的t細胞。此篩選可提供大量關(guān)于受試者或患者的t細胞抗體庫的信息，并且結(jié)果可用于診斷或預(yù)測目的。舉例來說，針對突變蛋白、過表達蛋白和/或其它腫瘤相關(guān)的抗原的t細胞抗腫瘤應(yīng)答的數(shù)量和標(biāo)識可用作分層風(fēng)險的生物標(biāo)記，以監(jiān)測免疫治療的功效，或預(yù)測免疫治療治療的結(jié)果。另外，此類t細胞應(yīng)答的數(shù)量或強度可與疾病進展的風(fēng)險成反比或可預(yù)測化學(xué)療法的抗性或非應(yīng)答性。在其它實施例中，針對各自呈遞候選肽抗原的納米apc的陣列或庫篩選受試者的或患者的t細胞，并且t細胞應(yīng)答的存在或這些t細胞應(yīng)答的數(shù)量或強度，例如通過識別自體免疫疾病或識別患者患有亞臨床腫瘤，提供關(guān)于患者健康的信息。在這些實施例中，所述方法不僅識別可能疾病病況，而且提供疾病生物學(xué)的初始理解。

由此本發(fā)明提供多個t細胞相關(guān)的疾病或病況的診斷和治療發(fā)展，所述疾病或病況包括癌癥、自體免疫疾病和其中離體抗原特異性免疫細胞的檢測、富集、活化和/或擴增為治療或診斷上期望的其它疾病。

基于以下詳細描述，本發(fā)明的另外的方面和實施例對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。

附圖說明

圖1a至圖1b呈現(xiàn)抗原特異性t細胞的富集和擴增的實施例的示意圖。(圖1a)納米級人工抗原呈遞細胞(納米aapc)的實施例通過將mhc-ig二聚體(信號1)和共刺激抗cd28抗體(信號2)偶聯(lián)到50nm至100nm鐵-聚葡萄糖納米粒子合成。(圖1b)磁性富集的示意圖。在“富集”步驟中，結(jié)合到納米aapc的抗原特異性cd8+t細胞保留在磁性塔中，而非同源細胞不大可能結(jié)合。然后富集的t細胞通過納米aapc活化并且在“擴增”步驟中增殖。

圖2a至圖2c.納米aapc介導(dǎo)的抗原特異性t細胞的富集。(圖2a)納米aapc介導(dǎo)來自千倍多的多克隆thy1.2+b6脾細胞的集合的同源thy1.1+pmel細胞的抗原特異性富集。(圖2b)在如在(圖2a)中用增加量的納米aapc進行pmel富集之后，抗原特異性細胞頻率和％回收的細胞的匯總。(圖2c)通過納米aapc的內(nèi)源性db-gp100脾細胞的富集(頂部)。在富集之后，非同源kb-trp2細胞的頻率不增加(底部)。

圖3a至圖3g.在富集之后抗原特異性t細胞的擴增。(圖3a)用于評估富集對擴增的影響的細胞部分的示意圖。粒子結(jié)合的抗原特異性t細胞在磁性塔中捕獲(陽性部分)，而未結(jié)合細胞通過(陰性部分)。陰性部分可加回到陽性部分以消除富集(陽性+陰性)的影響。(圖3b)在通過用kb-trp2納米aapc富集培養(yǎng)七天之后產(chǎn)生的抗原特異性細胞的增加頻率。陰性(左)、陽性(中間)和陰性+陽性(右)部分培養(yǎng)七天，然后用同源kb-trp2(頂部)和對照kb-siinf(底部)二聚體染色。(圖3c)當(dāng)細胞富集時kb-trp2細胞的頻率的10至15倍增加(*，通過t檢驗，p<0.001)。(圖3d)在用同源納米aapc富集之后db-gp100、kb-siinf和ld-a5納米aapc擴增七天的代表性facs曲線。(圖3e)在用指定納米aapc富集和活化之后％抗原特異性細胞(左)和總抗原特異性細胞(右)的匯總。(圖3f)三種抗原(db-gp100、kb-siinf、kb-trp2)同時富集和擴增。對于來自相同t細胞培養(yǎng)的每種抗原的抗原特定性的代表性facs曲線。(圖3g)當(dāng)單獨或一起富集和擴增時對于三種指定抗原產(chǎn)生的抗原特定性(左)和總抗原特異性細胞(右)的比較。

圖4a至圖4d：富集和擴增的t細胞介導(dǎo)腫瘤排斥反應(yīng)的過繼轉(zhuǎn)移。(圖4a)在過繼轉(zhuǎn)移之后淋巴細胞耗盡和降低的旁觀者競爭對擴增的影響。b6小鼠在10⁶或10⁷無關(guān)的b6細胞任一者存在下在10⁵pmelt細胞的過繼轉(zhuǎn)移之前一天未用500cgyγ輻射治療或淋巴細胞耗盡。淋巴細胞耗盡和較少旁觀者細胞的施用兩者增加從脾和淋巴結(jié)回收的pmelt細胞的頻率(通過雙向方差分析p<0.01)。(圖4b)在(圖4a)中回收的thy1.1+pmel細胞的總數(shù)。(圖4c)在抑制黑素瘤生長的過繼轉(zhuǎn)移之前培養(yǎng)7天的kb-trp2和db-gp100富集+擴增的淋巴細胞(通過雙向方差分析p<0.01，8個小鼠/組)。小鼠八天前用皮下黑素瘤注射并且一天前用500cgyγ輻射來輻射。非同源富集和擴增的淋巴細胞(siinf)不抑制腫瘤生長(與未經(jīng)治療的相比)，而同源富集和擴增(trp2+gp100)抑制腫瘤生長。(圖4d)來自(圖4c)的動物的存活期。在kb-trp2和db-gp100治療的組中，2/8小鼠示出腫瘤的完全排斥反應(yīng)，與非同源和未經(jīng)治療的組相比，其具有顯著較長的存活期(通過mantel-cox，p<0.01)。

圖5a至圖5b：人類抗腫瘤應(yīng)答的擴增。cd8+pbmc從健康供體中分離并且使用富集和擴增方案擴增一周。(圖5a)緊接在cd8分離之后(第0天，左)和在富集和擴增一周之后(第7天，右)a2-ny-eso1(頂部)和a2-mart1(底部)特異性細胞的代表性染色和頻率。(圖5b)在用指定的納米aapc富集/擴增之后％抗原特異性細胞頻率(頂部)和總抗原特異性細胞(底部)的匯總。結(jié)果來源于具有不同供體的三個實驗。

圖6a至圖6c：新表位擴增。(圖6a)用于產(chǎn)生用于b16和ct26mutomes的候選肽的方法的示意圖。通過mhcnet預(yù)測算法針對mhc結(jié)合評估圍繞單個堿基對替換(sbs)的17-mer序列。(圖6b)針對新表位用納米aapce+e擴增七天的細胞到同源(頂部)和非同源(底部)mhc的代表性結(jié)合。圖(6c)在e+e之后一周獲得的總新表位特異性細胞。

圖7a至圖7c：微aapcare對抗原特異性富集無效。(圖7a)微aapc(頂部)和納米aapc(底部)到同源pmel(紅色)或非同源2c(藍色)cd8+t細胞的結(jié)合，其特征在于結(jié)合珠粒的螢光標(biāo)記。無珠粒(灰色)背景作為對照示出。(圖7b)微aapc不富集同源細胞。在thy1.1+pmel細胞用多克隆thy1.2+b6脾細胞以1:1000比率培育，并且富集使用db-gp100微米粒子嘗試。在富集之后thy1.1+細胞的頻率不顯著增加。(圖7c)抗原特異性細胞頻率和回收的細胞的百分比，如在具有增加量的微aapc的(圖7c)中進行。

具體實施方式

過繼免疫治療涉及離體免疫細胞的活化和擴增，其中所得細胞轉(zhuǎn)移到患者以治療疾病，如癌癥。如果足夠數(shù)量和頻率的活化和抗原特異性ctl可在相對較短時間產(chǎn)生，包括從稀少前驅(qū)細胞，那么例如通過過繼轉(zhuǎn)移，抗原特異性細胞毒素(cd8+)淋巴細胞(ctl)應(yīng)答的誘導(dǎo)可為有吸引力的治療。在一些實施例中此方法可甚至產(chǎn)生預(yù)防疾病復(fù)發(fā)的長期的記憶。除了癌癥免疫治療和涉及ctl的免疫治療之外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)與其它免疫細胞(包括cd4+t細胞和調(diào)節(jié)t細胞)一起使用，并且因此大體上適用于用于傳染病和自體免疫疾病的免疫治療。

在一方面，本發(fā)明提供人工抗原呈遞細胞(aapc)，其捕獲刺激信號并且將其傳遞到免疫效應(yīng)細胞，如抗原特異性t淋巴細胞，如ctl。在一些實施例中，這些aapc提供用于過繼免疫治療的有力工具。存在于支持t細胞活化的aapc上的信號包括信號1，在主要組織相容性復(fù)合體(mhc)(i類或ii類)的情形下呈遞的抗原肽，其結(jié)合抗原特異性t細胞受體(tcr)；以及信號2，調(diào)節(jié)t細胞應(yīng)答的一種或多種共刺激配體。在此系統(tǒng)的一些實施例中，信號1通過單體、二聚或多聚mhc構(gòu)建體帶來。二聚構(gòu)建體在一些實施例中通過融合到免疫球蛋白重鏈序列的可變區(qū)或ch1區(qū)產(chǎn)生。mhc復(fù)合物負載有一種或多種抗原肽，并且信號2為b7.1(用于t細胞受體cd28的天然配體)或抗cd28的活化抗體任一者。兩種配體可直接化學(xué)偶聯(lián)到微米級(4.5μm)或納米級珠粒的表面以產(chǎn)生人工抗原呈遞細胞(aapc)。在一些實施例中，粒子材料為順磁性的，其允許通過施加磁場磁性捕獲或“富集”，以及在富集的細胞部分內(nèi)抗原特異性淋巴細胞的后續(xù)擴增，這還通過施加磁場增強。在其它實施例中，順磁性特性支持快速t細胞應(yīng)答(例如活化)，即使來自天然細胞，其可在數(shù)分鐘到數(shù)小時內(nèi)體外檢測到。

在一些方面，本發(fā)明提供用于制備用于過繼轉(zhuǎn)移的抗原特異性t細胞群的方法。所述方法包含提供包含來自患者的t細胞的樣品，其中患者需要抗原特異性t細胞的過繼轉(zhuǎn)移。如本文詳細描述，使t細胞或含有t細胞的樣品與順磁性aapc的群接觸，其中的每個在mhc(i類或ii類)的情形下呈遞所關(guān)注的肽抗原，并且由此結(jié)合樣品中的抗原特異性t細胞(包括不頻繁表示的天然抗原特異性細胞)。aapc可呈遞常用于所關(guān)注的疾病(例如腫瘤型)的抗原，或可呈遞基于個人化選擇的一種或多種抗原。順磁性特性可用于例如通過使用磁體針對抗原特異性t細胞捕獲或“富集”樣品以分離aapc-締合細胞與非締合細胞。回收的t細胞，例如保持與順磁性aapc粒子締合的那些，可在aapc存在下體外擴增，并且抗原特異性細胞的擴增另外通過磁場的存在增強。不希望受理論所束縛，據(jù)相信，結(jié)合到抗原特異性t細胞的順磁性aapc在磁場存在下將促進t細胞受體集群。在一些實施例中，擴增步驟可進行約3天到約2周，或約5天到約10天(例如約1周)。富集和擴增方法然后可重復(fù)一次或多次，用于抗原特異性細胞的理想擴增(以及進一步純化)。對于后續(xù)輪的富集和擴增，附加aapc可添加到t細胞以支持在樣品中較大抗原特異性t細胞群的擴增。在某些實施例中，最終輪(例如第2、3、4或5輪)的擴增在體內(nèi)發(fā)生，其中生物兼容性納米apc添加到擴增的t細胞群，并且然后輸注入患者。

在某些實施例中，所述方法提供抗原特異性t細胞的約1000至10,000倍擴增(或更多)，其中大于約10⁸抗原特異性t細胞在例如小于約一個月，或小于約三周，或小于約兩周，或在約一周里產(chǎn)生。所得細胞可向患者給藥以治療疾病。aapc可與在一些實施例中制備的所得抗原特異性t細胞一起向患者給藥。

在另外其它方面，本發(fā)明提供用于基于個人化選擇t細胞抗原的方法。舉例來說，在某些實施例中，各自呈遞候選抗原肽的aapc的陣列或庫從受試者或患者篩選t細胞(并且在一些實施例中在磁場存在下)，并且確定或定量t細胞對每種aapc肽的應(yīng)答。在一些實施例中，t細胞應(yīng)答可以分子形式定量，例如通過定量細胞因子表達或t細胞活化的其它替代標(biāo)記的表達(例如通過免疫化學(xué)或已表達基因的擴增如通過rt-pcr)。在一些實施例中，在培養(yǎng)液中定量步驟在約15小時和48小時之間進行。在其它實施例中，t細胞應(yīng)答通過檢測胞內(nèi)信號傳遞(例如ca2+信號傳遞，或在t細胞活化期間早期出現(xiàn)的其它信號傳遞)確定，并且因此可在用納米aapc培養(yǎng)的約15分鐘到約5小時內(nèi)(例如在約15分鐘到約2小時內(nèi))定量。對于免疫治療選擇示出最魯棒應(yīng)答的肽，所述免疫治療在一些實施例中包括本文所述的過繼免疫治療方法。在一些實施例中，并且具體來說對于癌癥免疫治療，基因分析(例如使用下一代測序)患者的腫瘤，并且根據(jù)患者的獨特腫瘤突變特征預(yù)測腫瘤抗原。針對患者的t細胞使用本文所述的aapc平臺合成并且篩選這些預(yù)測的抗原(“新抗原”)當(dāng)識別/確認(rèn)反應(yīng)性抗原時，可制備aapc用于本文所述的富集和擴增方案，或在一些實施例中aapc可直接向患者給藥。

在一些方面，針對順磁性納米aapc(如本文所述)的陣列或庫篩選受試者或患者的t細胞，其中每種順磁性納米aapc呈遞肽抗原。如本文所述確定或定量對每個的t細胞應(yīng)答，提供關(guān)于患者的t細胞抗體庫的有用的信息，并且從而提供受試者或患者的條件。

舉例來說，對抗突變蛋白、過表達蛋白和/或其它腫瘤相關(guān)的抗原的t細胞抗腫瘤應(yīng)答的數(shù)量和標(biāo)識可用作分層風(fēng)險的生物標(biāo)記，并且在一些實施例中可包括計算機實施的分類器算法以對用于抗藥性或藥物敏感性的應(yīng)答分布進行分類，或?qū)?yīng)答分布分層作為用于免疫治療的候選(例如檢查點抑制劑治療或過繼t細胞傳遞治療)。舉例來說，此類t細胞應(yīng)答的數(shù)量或強度可與疾病進展的高風(fēng)險成反比，和/或可直接涉及患者的對免疫治療的可能應(yīng)答，這可包括用于癌癥的檢查點抑制劑治療、過繼t細胞轉(zhuǎn)移或其它免疫治療中的一種或多種。

在另外其它方面和實施例中，針對各自呈遞候選肽抗原的順磁性納米apc的陣列或庫篩選患者的t細胞。舉例來說，陣列或庫可呈遞腫瘤相關(guān)的抗原，或可呈遞自體抗原，或可呈遞與各種傳染病相關(guān)的t細胞抗原。通過與患者的t細胞一起培育陣列或庫，并且在促進t細胞受體集群的磁場存在下，可快速確定t細胞應(yīng)答的存在和/或這些t細胞應(yīng)答的數(shù)量或強度。此信息可用于診斷，例如亞臨床腫瘤、自體免疫或免疫疾病，或傳染病，并且可提供疾病生物學(xué)(包括可能病原或治療t細胞、t細胞抗原)的初始理解，和所關(guān)注的t細胞受體的理解，其表示藥物或免疫治療目標(biāo)。

本發(fā)明的各種方面的各種替代實施例在下文詳細描述。

本發(fā)明提供用于癌癥和其中離體抗原特異性免疫細胞的檢測、富集、活化和/或擴增為治療或診斷上期望的其它疾病的免疫治療。本發(fā)明通?？蛇m用于抗原特異性t細胞(包括細胞毒素t淋巴細胞(ctl)、輔助t細胞和調(diào)節(jié)t細胞)的檢測、富集和/或擴增。

在一些實施例中，患者為癌癥患者。用于過繼轉(zhuǎn)移到患者的離體抗原特異性ctl的富集和擴增提供魯棒抗腫瘤免疫應(yīng)答?？筛鶕?jù)所述方法治療或評定的癌癥包括歷史上違禁差免疫應(yīng)答或具有高復(fù)發(fā)比率的癌癥。示例性癌癥包括各種類型的實體腫瘤，包括癌瘤、肉瘤和淋巴瘤。在各種實施例中，所述癌癥為黑素瘤(包括轉(zhuǎn)移性黑素瘤)、結(jié)腸癌、十二指腸癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、導(dǎo)管癌、肝癌、胰腺癌、腎癌、子宮內(nèi)膜癌、睪丸癌、胃癌、發(fā)育異常的口腔黏膜、息肉病、頭頸癌、侵襲性口腔癌、非小細胞肺癌瘤、小細胞肺癌、間皮瘤、過渡和鱗狀細胞泌尿癌瘤、大腦癌、神經(jīng)母細胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤。在一些實施例中，癌癥為血液惡性病，如慢性骨髓性白血病、兒童急性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病、惡性皮膚t細胞、毒蕈樣霉菌病、非mf皮膚t細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣的丘疹病、富含t細胞的皮膚淋巴增生和盤狀紅斑狼瘡。

在各種實施例中，癌癥為階段i、階段ii、階段iii或階段iv。在一些實施例中，癌癥為轉(zhuǎn)移性的和/或復(fù)發(fā)性的。在一些實施例中，癌癥為臨床前，并且在本文所述的篩選系統(tǒng)中檢測(例如結(jié)腸癌、胰腺癌，或難以早期檢測的其它癌癥)。

在一些實施例中，患者患有傳染病。傳染病可為其中用于過繼轉(zhuǎn)移到患者的離體抗原特異性免疫細胞(如cd8+或cd4+t細胞)的富集和擴增可增強或提供產(chǎn)生性的免疫應(yīng)答的一種傳染病?？芍委煹膫魅静“ㄓ杉毦?、病毒、朊病毒、真菌、寄生蟲、蠕蟲等引起的那些傳染病。此類疾病包括aids、肝炎、cmv感染和后移植淋巴增生失調(diào)癥(ptld)。舉例來說，cmv為在器官移植患者中發(fā)現(xiàn)的最常見病毒病原體，并且為進行骨髓或周邊血液干細胞移植的患者的發(fā)病和死亡的主要原因。這是由于這些患者的免疫功能不全狀態(tài)，其允許在血清反應(yīng)陽性的患者中的潛伏病毒的再活化或在血清反應(yīng)陰性的個體中的機會性感染。這些治療的有用替代方案為涉及在移植程序開始之前來源于患者或來源于適當(dāng)供體的病毒特異性ctl的產(chǎn)生的防治性免疫治療劑療程。ptld出現(xiàn)在大部分移植患者中并且由艾伯斯坦-巴爾病毒(ebv)感染產(chǎn)生。在美國，ebv感染被認(rèn)為存在于大約90％的成年群體中?；钚圆《緩?fù)制和感染通過免疫系統(tǒng)檢查保持，但如在cmv的情況下，通過移植治療免疫功能不全的個體失去控制t細胞群，其允許病毒再活化。這表示移植方案的嚴(yán)重障礙。ebv還可與多種血液和非血液癌癥的腫瘤促進有關(guān)。

在一些實施例中，患者患有自體免疫疾病，其中用于過繼轉(zhuǎn)移到患者的離體調(diào)節(jié)t細胞(例如cd4+、cd25+、foxp3+)的富集和擴增可減弱有害免疫應(yīng)答。可治療的自體免疫疾病包括全身性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、i型糖尿病、多發(fā)性硬化、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、牛皮癬、重癥肌無力、古巴士德氏綜合癥、格雷夫氏疾病、尋常天皰瘡、艾迪森氏疾病、皰疹樣皮炎、乳糜瀉和橋本氏病甲狀腺炎。在一些實施例中，患者懷疑患有自體免疫疾病或免疫病癥(如在前述語句中描述的那些)，并且針對如本文所述的順磁性納米aapc的庫的t細胞應(yīng)答的評定可用于識別或確定免疫病癥。

因此，在各種實施例中，本發(fā)明涉及抗原特異性t細胞(如細胞毒素t淋巴細胞(ctl)、輔助t細胞和調(diào)節(jié)t細胞)的富集和/或擴增。在一些實施例中，本發(fā)明涉及抗原特異性ctl的富集和擴增。前體t細胞可從患者或從合適的hla匹配供體獲得。前體t細胞可從多個來源獲得，包括外周血單個核細胞(pbmc)、骨髓、淋巴結(jié)組織、脾臟組織和腫瘤。在一些實施例中，樣品為來自患者的pbmc樣品。在一些實施例中，pbmc樣品用于分離所關(guān)注的t細胞群，如cd8+、cd4+或調(diào)節(jié)t細胞。在一些實施例中，前體t細胞使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何數(shù)目的技術(shù)(如ficoll分離)從受試者收集的血液的單元獲得。舉例來說，來自個體的循環(huán)血液的前體t細胞可通過單采血液成分術(shù)或白細胞去除術(shù)獲得。單采血液成分術(shù)產(chǎn)物通常含有淋巴細胞，包括t細胞和前體t細胞、單核細胞、粒細胞、b細胞、其它有核的白細胞、紅血細胞和血小板。白細胞去除術(shù)為其中白血細胞與血液樣品分離的實驗室程序。

可洗滌通過單采血液成分術(shù)收集的細胞以去除血漿部分并且將細胞放置在用于后續(xù)處理步驟的適當(dāng)緩沖液或培養(yǎng)基中。洗滌步驟可根據(jù)制造商的說明書通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的方法實現(xiàn)，如通過使用半自動化“流通式”離心機(例如cobe2991細胞處理器)。在洗滌之后，細胞可在多種生物兼容性緩沖液(如例如無ca無mg的pbs)中再懸浮。可替代地，可去除單采血液成分術(shù)樣品的不希望的組分并且細胞在培養(yǎng)基中直接再懸浮。

如果需要，前體t細胞可通過溶解紅血細胞和消耗單核細胞(例如通過經(jīng)percolltm梯度的離心)從外周血淋巴細胞中分離。

如果需要，t細胞的亞群可與可存在的其它細胞分離。舉例來說，t細胞的特異性亞群，如cd28+、cd4+、cd8+、cd45ra+和cd45ro+t細胞可進一步通過陽性或陰性選擇技術(shù)分離。其它富集技術(shù)包括經(jīng)由負磁性免疫粘附或流式細胞測量術(shù)，例如使用針對存在于不利地選擇的細胞上的細胞表面標(biāo)記的單克隆抗體的混合液的細胞分揀和/或選擇。

在某些實施例中，白細胞通過白細胞去除術(shù)收集，并且隨后使用已知方法(如可商購的磁性富集塔)富集cd8+t細胞。富集cd8的細胞然后使用借助aapc試劑的磁性富集來富集抗原特異性t細胞。在各種實施例中，對于抗原特異性t細胞富集，分離至少約10⁵，或至少約10⁶，或至少約10⁷富集cd8的細胞。

在各種實施例中，包含免疫細胞(例如cd8+t細胞)的樣品與具有磁特性的人工抗原呈遞細胞(aapc)接觸。順磁性的材料對磁場具有小正敏感性。這些材料通過磁場吸引并且當(dāng)去除外部場時材料不保留磁特性。示例性順磁性材料包括(但不限于)鎂、鉬、鋰、鉭和氧化鐵。適合于磁性富集的順磁性珠粒為可商購的(dynabeads^tm、macsmicrobeads^tm、美天旎生物技術(shù)公司(miltenyibiotec))。在一些實施例中，aapc粒子為右旋糖酐鐵珠粒(例如聚葡萄糖涂布的鐵氧化物珠粒)。

在某些實施例中，aapc含有至少兩種配體，抗原呈遞復(fù)合物(肽-mhc)和淋巴細胞活化配體。

抗原呈遞復(fù)合物包含抗原結(jié)合裂隙，其具有用于呈遞到t細胞或t細胞前體的抗原?？乖蔬f復(fù)合物可為例如mhci類或ii類分子，并且可連接或系栓以提供二聚或多聚mhc。在一些實施例中，mhc為單體，但其與納米粒子的緊密關(guān)聯(lián)對于親合力和活化為足夠的。在一些實施例中，mhc為二聚的。二聚mhci類構(gòu)建體可通過融合到免疫球蛋白重鏈序列構(gòu)建，其然后經(jīng)一個或多個二硫鍵締合(并且具有締合輕鏈)。在一些實施例中，信號1復(fù)合物為非經(jīng)典的mhc類分子，如cd1家族的成員(例如cd1a、cd1b、cd1c、cd1d和cd1e)。mhc多聚體可通過經(jīng)肽或化學(xué)連接體直接系栓產(chǎn)生，或可為經(jīng)由經(jīng)生物素部分與抗生蛋白鏈菌素締合的多聚的。在一些實施例中，抗原呈遞復(fù)合物為涉及用免疫球蛋白序列融合的mhci類或mhcii類分子復(fù)合物，其極其穩(wěn)定并且易于產(chǎn)生，基于通過免疫球蛋白主結(jié)構(gòu)提供的穩(wěn)定性和分泌效率。

具有免疫球蛋白序列的mhci類分子復(fù)合物描述于美國專利6,268,411中，其以全文引用的方式并入本文。這些mhci類分子復(fù)合物可在免疫球蛋白重鏈的末端以構(gòu)象完整形式形成。結(jié)合抗原肽的mhci類分子復(fù)合物可穩(wěn)定結(jié)合到抗原特異性淋巴細胞受體(例如t細胞受體)。在各種實施例中，免疫球蛋白重鏈序列不是全長，但包含ig鉸鏈區(qū)以及ch1、ch2和/或ch3域中的一個或多個。ig序列可或可不包含可變區(qū)，但其中存在可變區(qū)序列，可變區(qū)可為完全或部分的。復(fù)合物可進一步包含免疫球蛋白輕鏈。

示例性mhci類分子復(fù)合物包含至少兩種融合蛋白。第一融合蛋白包含第一mhci類α鏈和第一免疫球蛋白重鏈(或其包含鉸鏈區(qū)的部分)，并且第二融合蛋白包含第二mhci類α鏈和第二免疫球蛋白重鏈(或其中包含鉸鏈區(qū)的部分)。第一免疫球蛋白重鏈和第二免疫球蛋白重鏈締合以形成mhci類分子復(fù)合物，其包含兩種mhci類肽結(jié)合裂隙。免疫球蛋白重鏈可為igm、igd、igg1、igg3、igg2β、igg2α、igg4、ige或iga的重鏈。在一些實施例中，igg重鏈用于形成mhci類分子復(fù)合物。如果期望多價mhci類分子復(fù)合物，那么igm或iga重鏈可用于分別提供五價或四價分子。

示例性i類分子包括hla-a、hla-b、hla-c、hla-e，并且這些可單獨地或以任何組合采用。在一些實施例中，抗原呈遞復(fù)合物為hla-a2配體。

示例性mhcii類分子復(fù)合物描述于美國專利6,458,354、美國專利6,015,884、美國專利6,140,113和美國專利6,448,071，其以全文引用的方式并入本文。mhcii類分子復(fù)合物包含至少四種融合蛋白。兩種第一融合蛋白包含(i)免疫球蛋白重鏈(或其中包含鉸鏈區(qū)的部分)和(ii)mhcii類β鏈的胞外域。兩種第二融合蛋白包含(i)免疫球蛋白κ或λ輕鏈(或其部分)和(ii)mhcii類α鏈的胞外域。兩種第一融合蛋白和兩種第二融合蛋白締合以形成mhcii類分子復(fù)合物。每個第一融合蛋白的mhcii類β鏈的胞外域和每個第二融合蛋白的mhcii類α鏈的胞外域形成mhcii類肽結(jié)合裂隙。

免疫球蛋白重鏈可為igm、igd、igg3、igg1、igg2β、igg2α、igg4、ige或iga的重鏈。在一些實施例中，igg1重鏈用于形成包含兩種抗原結(jié)合裂隙的二價分子復(fù)合物。任選地，可包括重鏈的可變區(qū)。igm或iga重鏈可用于分別提供五價或四價分子復(fù)合物。

mhcii類分子復(fù)合物的融合蛋白可包含插入免疫球蛋白鏈和mhcii類多肽的胞外域之間的肽連接體。連接體序列的長度可根據(jù)調(diào)節(jié)抗原結(jié)合和受體交聯(lián)的程度所需要的靈活性而變化。

在一些實施例中免疫球蛋白序列為人類化單克隆抗體序列。

信號2通常為t細胞影響分子，即，對前體t細胞或?qū)乖禺愋詔細胞具有生物效應(yīng)的分子。此類生物效應(yīng)包括例如前體t細胞分化成ctl、輔助t細胞(例如th1、th2)，或調(diào)節(jié)t細胞；和/或t細胞的增殖。因此，t細胞影響分子包括t細胞共刺激分子、粘附分子、t細胞生長因子和調(diào)節(jié)t細胞誘導(dǎo)劑分子。在一些實施例中，aapc包含至少一種此類配體；任選地aapc包含至少兩種、三種或四種此類配體。

在某些實施例中，信號2為t細胞共刺激分子。t細胞共刺激分子有助于抗原特異性t細胞的活化。此類分子包括(但不限于)特異性結(jié)合到cd28(包括抗體)、cd80(b7-1)、cd86(b7-2)、b7-h3、4-1bb、4-1bbl、cd27、cd30、cd134(ox-40l)、b7h(b7rp-1)、cd40、light的分子，特異性結(jié)合到hvem的抗體、特異性結(jié)合到cd40l的抗體、特異性結(jié)合到ox40的抗體以及特異性結(jié)合到4-1bb的抗體。在一些實施例中，共刺激分子(信號2)為抗體(例如單克隆抗體)或其部分，如f(ab')2、fab、scfv，或單鏈抗體，或其它抗原結(jié)合片段。在一些實施例中，抗體為人類化單克隆抗體或其中具有抗原結(jié)合活性的部分，或為全人類抗體或其中具有抗原結(jié)合活性的部分。

可用于納米aapc的粘附分子可用于介導(dǎo)納米aapc到t細胞或到t細胞前體的粘附性。有用的粘附分子包括例如icam-1和lfa-3。

在一些實施例中，信號1通過肽-hla-a2復(fù)合物提供，并且信號2通過b7.1-ig或抗cd28提供。示例性抗cd28單克隆抗體為9.3mab(tan等人，《實驗醫(yī)學(xué)雜志(j.exp.med.)》1993177:165)，在某些實施例中其可為人類化和/或作為完全完整抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合到珠粒。

一些實施例采用t細胞生長因子，其影響t細胞的增殖和/或分化。t細胞生長因子的實例包括細胞因子(例如白介素、干擾素)和超抗原。如果需要，細胞因子可存在于包含融合蛋白的分子復(fù)合物中，或可由aapc封裝。尤其有用的細胞因子包括il-2、il-4、il-7、il-10、il-12、il-15、il-21γ干擾素和cxcl10。任選地，細胞因子在擴增步驟期間通過培養(yǎng)基組分單獨提供。

納米粒子可由任何材料制成，并且針對期望的磁性材料可經(jīng)適當(dāng)?shù)剡x擇，并且可包含例如金屬，如鐵、鎳、鈷或稀土金屬的合金。順磁性材料還包括鎂、鉬、鋰、鉭和氧化鐵。適合于材料(包括細胞)的富集的順磁性珠粒為可商購的，并且包括右旋糖酐鐵珠粒，如聚葡萄糖涂布的氧化鐵珠粒。在其中不需要磁特性的本發(fā)明的方面中，納米粒子還可由非金屬或有機(例如聚合物)材料，如纖維素、陶瓷、玻璃、尼龍、聚苯乙烯、橡膠、塑料或膠乳制成。用于制備納米粒子的示例性材料為聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)和其共聚物，其可與這些實施例結(jié)合使用。包括可采用的聚合物和共聚物的其它材料包括在pct/us2014/25889中描述的那些材料，該文獻以全文引用的方式并入本文。

在一些實施例中，磁性粒子為生物兼容性的。這在其中aapc將遞送到與富集和擴增的細胞相關(guān)聯(lián)的患者的實施例中尤其重要。舉例來說，在一些實施例中，磁性粒子為生物兼容性右旋糖酐鐵順磁性珠粒。

在各種實施例中，粒子具有在約10nm到約500nm內(nèi)，或在約20nm到約200nm內(nèi)的尺寸(例如平均直徑)。尤其在其中aapc將遞送到患者的實施例中，微米級aapc太大難以通過淋巴管運送，并且當(dāng)皮下注射時保持在注射部位。當(dāng)靜脈內(nèi)注射時，它們倒伏在毛細管床中。實際上，微米級珠粒的不良運輸已阻止其中對于理想免疫治療aapc應(yīng)運輸?shù)难芯俊＜{米aapc的運輸和生物分布可能將比微米級aapc更有效。舉例來說，其中aapc可最有效的兩個可能部位為其中天然和記憶t細胞駐留的淋巴結(jié)以及腫瘤自身。約50nm到約200nm直徑的納米粒子可被淋巴管吸收并且運輸?shù)搅馨徒Y(jié)，因此獲得進入t細胞的較大集合。如描述于pct/us2014/25889(其以引入方式并入本文)中，納米aapcs的皮下注射比對照或靜脈內(nèi)注射的珠粒產(chǎn)生較少腫瘤生長。

在一些實施例中，僅在將t細胞輸注入患者之前，使用納米尺寸aapc再富集抗原特異性t細胞將避免靜脈和動脈的堵塞，例如這可為如果微米尺寸的aapc與細胞一起輸注入患者的效應(yīng)。

在細胞-納米粒子界面處受體-配體相互作用不好理解。然而，納米粒子結(jié)合和細胞活化對膜空間組構(gòu)敏感，這在t細胞活化期間尤其重要，并且磁場可用于操控集群結(jié)合納米粒子以增強活化。參見wo/2014/150132。舉例來說，t細胞活化誘導(dǎo)持久增強的納米級tcr集群的狀態(tài)，并且納米粒子以較大粒子不敏感的方式對此集群敏感。參見wo/2014/150132。

此外，可利用納米粒子與tcr集群相互作用以增強受體觸發(fā)。t細胞活化通過信號傳遞蛋白的集合介導(dǎo)，其中“信號傳遞集群”橫跨數(shù)百納米，首先在t細胞-apc接觸部位的外周形成并且向內(nèi)遷移。如本文所述，外部磁場可用于富集抗原特異性t細胞(包括稀少天然細胞)并且驅(qū)動磁性納米aapc的集合結(jié)合到tcr，產(chǎn)生tcr集群的集合和天然t細胞的增強的活化。磁場可對順磁性粒子施加適當(dāng)強的力，但否則的話為生物性惰性，使它們成為控制粒子行為的有力工具。結(jié)合到順磁性納米aapc的t細胞在外部施加的磁場存在下活化。納米aapc自身磁化，并且附著到磁場源極和在磁場中的附近納米粒子，感應(yīng)珠粒以及因此tcr集合提高aapc介導(dǎo)的活化。參見wo/2014/150132。

與天然t細胞相比，納米aapc結(jié)合更多tcr并且誘導(dǎo)先前活化的更大活化。此外，外部磁場的施加誘導(dǎo)納米aapc在天然細胞上集合，增強體外和后續(xù)過繼轉(zhuǎn)移體內(nèi)兩者t細胞增殖。重要的是，在黑素瘤過繼免疫治療模型中，通過納米aapc活化t細胞在磁場中介導(dǎo)腫瘤排斥反應(yīng)。因此，施加的磁場的使用允許天然t細胞群的活化，否則的話其不佳地響應(yīng)于刺激。這是免疫治療的重要特征，因為天然t細胞已經(jīng)示出比用于癌癥免疫治療的更分化的次型更有效，具有較高的增殖能力和更大能力以產(chǎn)生強的、長期的t細胞應(yīng)答。因此，納米aapc可用于t細胞的磁場增強活化以增加從天然前體擴增的抗原特異性t細胞的產(chǎn)量和活性，改善細胞治療，例如患有傳染病、癌癥或自體免疫疾病的患者，或為免疫抑制患者提供防治性保護。

分子可通過吸附或通過直接化學(xué)結(jié)合(包括共價結(jié)合)直接附接至納米粒子。參見，hermanson《生物結(jié)合物技術(shù)(bioconjugatetechniques)》，學(xué)術(shù)出版社(academicpress)，紐約(newyork)，1996。分子自身可直接用多種化學(xué)官能團(包括親核基團、離去基團或親電子基團)活化?；罨墓倌軋F包括烷基和酰基鹵、胺、硫氫基、醛、不飽和鍵、酰肼、異氰酸酯、異硫氰酸酯、酮和已知用于化學(xué)結(jié)合活化的其它基團?？商娲?，分子可通過使用小分子偶聯(lián)劑結(jié)合到納米粒子。偶聯(lián)劑的非限制性實例包括碳二酰亞胺、馬來酰亞胺、n-羥基丁二酰亞胺酯、雙氯乙胺、雙官能醛如戊二醛、酸酐等。在其它實施例中，分子可通過親和力結(jié)合(如生物素抗生蛋白鏈菌素鍵或偶聯(lián))偶聯(lián)到納米粒子，如在本領(lǐng)域中所熟知的。舉例來說，抗生蛋白鏈菌素可通過共價或非共價附接結(jié)合到納米粒子，并且生物素化分子可使用本領(lǐng)域中熟知的方法合成。

如果設(shè)想共價結(jié)合到納米粒子，那么負載物可涂覆有聚合物，所述聚合物含有可用于共價附接到合適的反應(yīng)物(通常通過連接體)的一種或多種化學(xué)部分或官能團。舉例來說，氨基酸聚合物可具有基團，如賴氨酸的ε-氨基，其可用于共價地經(jīng)由適當(dāng)連接體偶聯(lián)分子。本公開還設(shè)想將第二涂層放置在納米粒子上以提供這些官能團。

活化化學(xué)反應(yīng)可用于允許分子到納米粒子的表面的特異性穩(wěn)定附接。存在可用于將蛋白附接到官能團的許多方法。舉例來說，常見交聯(lián)劑戊二醛可用于以兩步法將蛋白氨基附接到胺化納米粒子表面。所得鍵為水解穩(wěn)定的。其它方法包括使用含有與在蛋白上的胺反應(yīng)的n-氫丁二酰亞氨基(nhs)酯的交聯(lián)劑、含有與含胺、含硫氫基或含組氨酸的蛋白反應(yīng)的活性鹵素的交聯(lián)劑，含有與胺或硫氫基反應(yīng)的環(huán)氧化物的交聯(lián)劑、在順丁烯二酰亞胺基和硫氫基之間的共軛，以及在還原氨基化后通過側(cè)鏈糖部分的高碘酸鹽氧化形成蛋白醛基團。

在相同納米粒子上的特定配體的比率可變化以增加在抗原或共刺激配體呈遞中的納米粒子的效力。舉例來說，納米粒子可與以多種比率的hla-a2-ig和抗cd28偶聯(lián)，如約30:1、約25:1、約20:1、約15:1、約10:1、約5:1、約3:1、約2:1、約1:1、約0.5:1、約0.3:1；約0.2:1、約0.1:1或約0.03:1。偶聯(lián)到負載物的蛋白的總量可為例如約250mg/ml、約200mg/ml、約150mg/ml、約100mg/ml或約50mg/ml的粒子。因為效應(yīng)功能(如細胞因子剝離和生長)可對于信號1對信號2具有與t細胞活化和分化不同的需要，所以這些功能可分別確定。

納米粒子的配置可在形狀的不規(guī)則到球形和/或具有不均勻或不規(guī)則表面到具有平滑表面范圍內(nèi)變化。非球形aapc描述于wo2013/086500中，其以全文引用的方式并入本文。

aapc將抗原呈遞到t細胞并且因此可用于富集和擴增抗原特異性t細胞兩者，包括從天然t細胞。將基于期望的治療(例如癌癥、癌癥的類型、傳染病等)選擇肽抗原。在一些實施例中，進行所述方法以治療癌癥患者，并識別患者專有的新抗原，且用于負載apac而合成。在一些實施例中，通過腫瘤的基因分析(例如核酸測序)識別在三個和十個之間的新抗原，接著預(yù)測生物信息學(xué)。如本文所示，若干抗原可一起使用(在分離aapc方面)，而無在所述方法中功能性的損失。在一些實施例中，抗原為天然非突變的癌癥抗原，其中許多為已知的。用于基于個人化識別抗原的這種方法在下文更詳細地描述。

多種抗原可結(jié)合到抗原呈遞復(fù)合物。抗原的性質(zhì)取決于使用的抗原呈遞復(fù)合物的類型。舉例來說，肽抗原可結(jié)合到mhci類和ii類肽結(jié)合裂隙。非經(jīng)典的mhc類分子可用于呈遞非肽抗原，如磷脂、復(fù)合碳水化合物等(例如細菌膜組分如分枝菌酸和脂阿拉伯甘露聚糖)。能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的任何肽可結(jié)合到抗原呈遞復(fù)合物?？乖陌[瘤相關(guān)的抗原、自身抗原、同種異體抗原和傳染劑的抗原。

“腫瘤相關(guān)的抗原”包括通過它們從其衍生的腫瘤專門表達的獨特腫瘤抗原，在許多腫瘤中但不在正常成年組織中表達的共享腫瘤抗原(癌胚的抗原)，和也通過出現(xiàn)腫瘤的正常組織表達的組織特定抗原。腫瘤相關(guān)的抗原可為例如胚胎抗原、具有異常翻譯后修飾的抗原、分化抗原、突變致癌基因或腫瘤抑制因子的產(chǎn)物、融合蛋白或致癌病毒蛋白。

多種腫瘤相關(guān)的抗原為本領(lǐng)域中已知的，并且這些中的許多可商購。癌胚的和胚胎抗原包括癌胚抗原和α-胎蛋白(通常僅在發(fā)育胚胎中高度表達但經(jīng)常分別通過肝和結(jié)腸的腫瘤高度表達)、mage-1和mage-3(在黑素瘤、乳癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達)、胎盤堿性磷酸酶唾液酸-lewisx(在腺癌中表達)、ca-125和ca-19(在腸胃、肝和婦科腫瘤中表達)、tag-72(在結(jié)腸直腸腫瘤中表達)、上皮醣蛋白2(在許多癌瘤中表達)、胰腺癌胚抗原、5t4(在胃癌中表達)、甲胎蛋白受體(在多個腫瘤類型中，尤其乳房腫瘤中表達)和m2a(在生殖細胞瘤形成中表達)。

腫瘤相關(guān)的分化抗原包括酪氨酸酶(在黑素瘤中表達)和特定表面免疫球蛋白(在淋巴瘤中表達)。

突變的致癌基因或腫瘤抑制基因產(chǎn)物包括ras和p53，其中兩者在多腫瘤類型中表達，her-2/neu(在乳癌和婦科癌癥中表達)、egf-r、雌激素受體、孕酮受體、成視網(wǎng)膜細胞瘤基因產(chǎn)物、myc(與肺癌相關(guān))、ras、p53、與乳房腫瘤相關(guān)的未突變體、mage-1和mage-3(與黑素瘤、肺和其它癌癥相關(guān))。融合蛋白包括bcr-abl，其在鉻骨髓白血病中表達。致癌病毒蛋白包括hpv型16、e6和e7，其在宮頸癌中發(fā)現(xiàn)。

組織特定抗原包括黑色素轉(zhuǎn)鐵蛋白和muc1(在胰腺和乳癌中表達)；cd10(先前被稱為常見急性淋巴母細胞白血病抗原，或calla)或表面免疫球蛋白(在b細胞白血病和淋巴瘤中表達)；il-2受體、t細胞受體、cd45r、cd4+/cd8+的α鏈(在t細胞白血病和淋巴瘤中表達)；前列腺特異性抗原和前列腺酸-磷酸酶(在前列腺癌中表達)；gp100、melana/mart-1、酪氨酸酶、gp75/brown、bage和s-100(在黑素瘤中表達)；細胞角蛋白(在各種癌瘤中表達)；以及cd19、cd20和cd37(在淋巴瘤中表達)。

腫瘤相關(guān)的抗原還包括變化的糖脂和醣蛋白抗原，如含神經(jīng)氨酸的鞘醣脂(例如gm2和gd2，在黑色素瘤和一些大腦腫瘤中表達)；血型抗原，尤其t和唾液酸化tn抗原，其可在癌瘤中異常表達)；以及粘蛋白，如ca-125和ca-19-9(在卵巢癌瘤上表達)或低糖基化muc-1(在乳房和胰腺癌瘤上表達)。

“傳染物的抗原”包括原蟲、細菌、真菌(單細胞和多細胞兩者)、病毒、朊病毒、胞內(nèi)寄生蟲、蠕蟲和可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的其它傳染物的組分。細菌抗原包括革蘭氏陽性球菌、革蘭氏陽性桿菌、革蘭氏陰性細菌、厭氧細菌(如放線菌科、芽胞桿菌科、巴爾通氏體科、博代氏桿菌科、captophagaceae科、棒狀桿菌科、腸桿菌科、軍團稈菌科、細球菌科、分枝桿菌科、諾卡菌科、巴斯德氏菌科、假單胞菌科、螺旋體科、弧菌科的生物體以及不動桿菌屬、布氏桿菌屬、彎曲桿菌屬、紅斑丹毒絲菌屬、愛文氏菌屬、弗朗西斯氏菌屬、加德納菌屬、螺旋桿菌屬、列文菌屬、李斯特氏菌屬、鏈桿菌屬和tropheryma的生物體)的抗原。原蟲傳染物的抗原包括瘧疾瘧原蟲、利什曼原蟲種、錐蟲種和裂體吸蟲種的抗原。

真菌抗原包括曲霉、芽生菌、假絲酵母、粗球菌、隱球菌屬、組織漿菌、paracoccicioides、孢子絲菌、毛霉目的生物體、誘導(dǎo)著色真菌病和足菌病的生物體和發(fā)癬菌屬、小芽孢菌屬、表皮癬菌屬和馬拉色氏霉菌屬的生物體的抗原。

病毒肽抗原包括(但不限于)腺病毒、單純皰疹病毒、乳頭瘤病毒、呼吸合胞體病毒、痘病毒、hiv、流感病毒和cmv的那些抗原。尤其有用的病毒肽抗原包括hiv蛋白，如hivgag蛋白(包括(但不限于)膜錨定(ma)蛋白、核心殼體(ca)蛋白和核殼體(nc)蛋白)、hiv聚合酶、流感病毒基質(zhì)(m)蛋白和流感病毒核殼體(np)蛋白、b型肝炎表面抗原(hbsag)、b型肝炎核心蛋白(hbcag)、肝炎e蛋白(hbeag)、b型肝炎dna聚合酶、c型肝炎抗原等。

包括抗原肽的抗原可主動地或被動地結(jié)合到抗原呈遞復(fù)合物的抗原結(jié)合裂隙，如描述于美國專利6,268,411中，其以全文引用的方式并入本文。任選地，抗原肽可共價結(jié)合到肽結(jié)合裂隙。

如果需要，肽系栓可用于將抗原肽連接到肽結(jié)合裂隙。舉例來說，多個i類mhc分子的結(jié)晶分析指示β2m的氨基末端非常接近，大約距駐留在mhc肽結(jié)合裂隙中的抗原肽的羧基端20.5埃。因此，使用相對較短連接體序列，大約13個氨基酸長度，可將肽系栓到β2m的氨基末端。如果序列為適當(dāng)?shù)?，那么肽將結(jié)合到mhc結(jié)合槽(參見美國專利6,268,411)。

結(jié)合到aapc的抗原特異性t細胞可與不使用磁性富集或其它細胞分揀或捕獲技術(shù)結(jié)合的細胞分離?？捎糜诖四康牡钠渌椒ò魇郊毎麥y量術(shù)和其它色譜方法(例如涉及本文所述的抗原呈遞復(fù)合物或其它配體的固定)。在一個實施例中，抗原特異性t細胞通過與珠粒例如抗原呈遞復(fù)合物/抗cd28共軛順磁性珠粒(如)一起培育足以陽性選擇期望的抗原特異性t細胞的時間段而分離(或富集)。

在一些實施例中，t細胞的群可使用例如對cd44的抗體基本上耗盡先前活性t細胞，留下天然t細胞富集的群。將納米aapc結(jié)合到此群將基本上不活化天然t細胞，但將準(zhǔn)許其純化。

在另外其它實施例中，靶向nk細胞、nkt細胞或b細胞(或免疫效應(yīng)細胞)的配體可并入到順磁性納米粒子中，并且用于磁性富集這些細胞群，任選地伴隨如下所述的在培養(yǎng)液中擴增。附加免疫效應(yīng)細胞配體描述于pct/us2014/25889中，其以全文引用的方式并入本文。

不希望受理論所束縛，去除不需要的細胞可降低細胞因子和生長信號的競爭，去除抑制細胞，或可簡單地提供用于所關(guān)注的細胞的擴增的更多物理空間。

富集的t細胞然后在鄰近產(chǎn)生磁場的磁體的培養(yǎng)液中擴增，這增強aapc結(jié)合細胞的t細胞受體集群。培養(yǎng)液可用納米aapc刺激可變量的時間(例如約0.5、2、6、12、36、48或72小時以及連續(xù)刺激)?？稍u估在高度富集的抗原特異性t細胞培養(yǎng)液中的刺激時間的效應(yīng)?？乖禺愋詔細胞可放置回培養(yǎng)液中并且分析細胞生長、增殖速率、各種效應(yīng)功能等，如本領(lǐng)域中已知。此類條件可根據(jù)期望的抗原特異性t細胞應(yīng)答變化。在一些實施例中，t細胞在培養(yǎng)液中擴增約2天到約3周，或在一些實施例中，約5天到約2周，或約5天到約10天。在一些實施例中，t細胞在培養(yǎng)液中擴增約1周，之后任選地進行第二富集和擴增步驟。在一些實施例中，進行2、3、4或5個富集和擴增輪。

在一輪或多輪的富集和擴增之后，樣品的抗原特異性t細胞組分將為細胞的至少約1％，或在一些實施例中，樣品中的細胞的至少約5％、至少約10％、至少約15％或至少約20％或至少約25％。另外，這些t細胞通常顯示活化狀態(tài)。根據(jù)從患者分離的原始樣品，在各種實施例中抗原特異性t細胞擴增約100倍到約10,000倍，如在各種實施例中至少約1000倍、至少約2000倍、至少約3,000倍、至少約4,000倍或至少約5,000倍。在一輪或多輪的富集和擴增之后，獲得至少約10⁶，或至少約10⁷，或至少約10⁸，或至少約10⁹抗原特異性t細胞。

納米aapc對t細胞前體的擴增、活化和分化的的效應(yīng)可以本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的任何數(shù)目的方式測定。功能的快速測定可使用增殖測定通過檢測每種類型的t細胞專有的標(biāo)記確定在培養(yǎng)液中ctl、輔助t細胞或調(diào)節(jié)t細胞的增加而實現(xiàn)。此類標(biāo)記是本領(lǐng)域中已知的。ctl可通過使用鉻剝離測定來測定細胞因子生產(chǎn)或溶細胞活性檢測。

除了產(chǎn)生具有適當(dāng)效應(yīng)功能的抗原特異性t細胞之外，抗原特異性t細胞功效的另一參數(shù)為使t細胞運輸?shù)讲±韺W(xué)部位的歸巢受體的表達(sallusto等人，《自然(nature)》401，708-12，1999；lanzavecchia&sallusto，《科學(xué)(science)》290，92-97，2000)。

舉例來說，效應(yīng)ctl功效已與歸巢受體、cd62l+、cd45ro+和ccr7-的后續(xù)表現(xiàn)型有關(guān)。因此，納米aapc誘導(dǎo)和/或擴增的ctl群可表征這些歸巢受體的表達。歸巢受體表達為與初始刺激條件有關(guān)的復(fù)雜特點?？赡?，這通過共刺激復(fù)合物以及細胞因子環(huán)境兩者控制。已暗示的一個重要細胞因子為il-12(salio等人，2001)。如下文所論述，納米aapc提供將單獨的組分(例如t細胞效應(yīng)分子和抗原呈遞復(fù)合物)單獨地變化以優(yōu)化生物結(jié)果參數(shù)的可能。任選地，細胞因子(如il-12)可包括在初始誘導(dǎo)培養(yǎng)液中以影響在抗原特異性t細胞群中的歸巢受體分布。

任選地，包含抗原特異性t細胞的細胞群可繼續(xù)與相同納米aapc或第二納米aapc任一者一起培育足以形成包含相對于在第一細胞群中的抗原特異性t細胞的數(shù)量增加數(shù)量的抗原特異性t細胞的第二細胞群的時間段。通常，此類培育進行3至21天，優(yōu)選地7至10天。

合適的培育條件(培養(yǎng)基、溫度等)包括用于培養(yǎng)t細胞或t細胞前體的那些條件，以及本領(lǐng)域中已知用于使用dc或人工抗原呈遞細胞誘導(dǎo)抗原特異性t細胞形成的那些條件。參見例如latouche&sadelain《自然生物技術(shù)(naturebiotechnol.)》18，405-09，2000年4月；levine等人《免疫學(xué)雜志(j.immunol.)》159，5921-30，1997；maus等人，《自然生物技術(shù)(naturebiotechnol.)》20，143-48，2002年2月。還參見下文具體實例。

為了評估增殖信號的量級，抗原特異性t細胞群可用cfse標(biāo)記并且分析細胞分裂的速率和數(shù)量。t細胞可在用結(jié)合抗原的納米aapc刺激一至兩輪之后用cfse標(biāo)記。在那時，抗原特異性t細胞應(yīng)表示總細胞群的2％至10％?？乖禺愋詔細胞可使用抗原特異性染色檢測，使得抗原特異性t細胞的分裂速率和數(shù)量可后跟著cfse損失。在刺激之后，在變化的時間(例如12、24、36、48和72小時)，可針對抗原呈遞復(fù)合物染色和cfse兩者分析細胞。用尚未結(jié)合抗原的納米aapc刺激可用于確定增殖的基線水平。任選地，增殖可通過監(jiān)測3h-胸苷的并入來檢測，如本領(lǐng)域中已知。

使用納米aapc獲得的抗原特異性t細胞可通過任何適當(dāng)?shù)耐緩较蚧颊呓o藥，包括靜脈內(nèi)給藥、動脈內(nèi)給藥、皮下給藥、皮內(nèi)給藥、淋巴管內(nèi)給藥和瘤內(nèi)給藥?；颊甙ㄈ祟惡图倚蠡颊邇烧?。

抗原特異性調(diào)節(jié)t細胞可用于實現(xiàn)免疫抑制效應(yīng)，例如治療或預(yù)防在移植患者中的移植物抗宿主疾病，或治療或預(yù)防自體免疫疾病，如上文所列的那些，或過敏。調(diào)節(jié)t細胞的使用公開于例如us2003/0049696、us2002/0090724、us2002/0090357、us2002/0034500和us2003/0064067，其以全文引用的方式并入本文。

根據(jù)這些方法制備的抗原特異性t細胞可以在約5至10×10⁶ctl/kg的體重(～7×10⁸ctl/治療)到約3.3×10⁹ctl/kg的體重(～6×10⁹ctl/治療)范圍內(nèi)的劑量向患者給藥(walter等人，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(newenglandjournalofmedicine)》333，1038-44，1995；yee等人，《實驗醫(yī)學(xué)雜志(jexpmed)》192，1637-44，2000)。在其它實施例中，患者可接受約10³、約5×10³、約10⁴、約5×10⁴、約10⁵、約5×10⁵、約10⁶、約5×10⁶、約10⁷、約5×10⁷、約10⁸、約5×10⁸、約10⁹、約5×10⁹或約10¹⁰個細胞每靜脈內(nèi)給藥劑量。在另外其它實施例中，患者可接受在200μl大丸劑中的例如約8×10⁶或約12×10⁶細胞的結(jié)節(jié)內(nèi)注射。用細胞給藥的納米apc的劑量包括約10³、約5×10³、約10⁴、約5×10⁴、約10⁵、約5×10⁵、約10⁶、約5×10⁶、約10⁷、約5×10⁷、約10⁸、約5×10⁸、約10⁹、約5×10⁹或約10¹⁰納米aapc每劑量。

在示例性實施例中，對來源于患者的相同樣品反復(fù)地進行富集和擴增過程。t細胞的群在第0天富集和活化，接著在培養(yǎng)液中合適的時間段(例如約3至20天)。隨后，納米aapc可用于針對所關(guān)注的抗原再次富集和擴增，進一步增加群純度并且為進一步t細胞擴增提供附加刺激。納米aapc和富集的t細胞的混合物可隨后再次體外培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r間段，或緊接著再輸注入患者用于進一步體內(nèi)擴增和治療效果。富集和擴增可重復(fù)任何數(shù)目的次數(shù)直至實現(xiàn)期望的擴增。

在一些實施例中，每種針對不同抗原的納米aapc的混合液可使用一次以同時針對多個抗原富集和擴增抗原t細胞。在此實施例中，每批帶有不同mhc肽的多個不同納米aapc批將組合并用于針對所關(guān)注的抗原中的每種同時富集t細胞。所得t細胞集合將針對這些抗原中的每種富集和活化，并且針對多個抗原的應(yīng)答可因此同時培養(yǎng)。這些抗原可與單個治療性干預(yù)有關(guān)；例如存在于單個腫瘤上的多個抗原。

在一些實施例中，患者在通過過繼轉(zhuǎn)移接受抗原特異性t細胞之前，或在直接給藥帶有通過患者的腫瘤的基因分析體外識別的新抗原的aapc之前，接受具有一種或多種檢查點抑制劑的免疫治療。在各種實施例中，(一種或多種)檢查點抑制劑靶向ctla-4或pd-1/pd-l1中的一個或多個，其可包括針對此類目標(biāo)的抗體，如單克隆抗體，或其部分，或其人類化或完全人類形式。在一些實施例中，檢查點抑制劑治療包含伊派利單抗或克珠達(派立珠單抗)。

在一些實施例中，患者接受約1輪到5輪的過繼免疫治療(例如一輪、兩輪、三輪、四輪或五輪)。在一些實施例中，與一輪檢查點抑制劑治療同時或在其之后(例如約1天到約1周之后)進行過繼免疫治療的每種給藥。在一些實施例中，在檢查點抑制劑治療之后約1天、約2天或約3天提供過繼免疫治療。

在另外其它實施例中，納米aapc過繼轉(zhuǎn)移或直接輸注到患者包含如在珠粒上的配體、靶向ctla-4或pd-1/pd-l1中的一個或多個的配體。在這些實施例中，所述方法可避免給藥可溶檢查點抑制劑治療的某些副作用。

用于個人化治療的方法

在一些方面，本發(fā)明提供用于個人化癌癥免疫治療的方法。所述方法使用aapc識別患者將對其應(yīng)答的抗原，接著將適當(dāng)?shù)呢撦d肽的aapc向患者給藥，或接著離體抗原特異性t細胞的富集和擴增來實現(xiàn)。

全基因組定序已大大改變我們對癌癥生物學(xué)的理解。癌癥的測序已產(chǎn)生關(guān)于與許多人類癌癥的發(fā)展有關(guān)的分子方法的重要數(shù)據(jù)。驅(qū)動突變已經(jīng)在與調(diào)整三種主要細胞方法(1)細胞歸宿，(2)細胞存活期和(3)基因組維護的路徑有關(guān)的關(guān)鍵基因中識別。vogelstein等人，《科學(xué)(science)》339，1546-58(2013)。

全基因組測序還具有變革我們的癌癥免疫治療的方法的可能。測序數(shù)據(jù)可提供關(guān)于對于癌癥免疫治療的兩者共享以及個人化目標(biāo)的信息。大體上，突變蛋白為免疫系統(tǒng)外來的并且為假定的腫瘤特異性抗原。實際上，測序成果已限定如果不是數(shù)千也有數(shù)百的可能相關(guān)免疫目標(biāo)。有限的研究已示出針對這些新表位的t細胞應(yīng)答可在癌癥患者中發(fā)現(xiàn)或通過癌癥疫苗誘導(dǎo)。然而，針對特定癌癥的此類應(yīng)答的頻率和在患者之間共享的此類應(yīng)答的程度不熟知。對于我們對腫瘤特異性免疫應(yīng)答的有限理解的一個主要原因為用于驗證可能免疫相關(guān)目標(biāo)的當(dāng)前方法繁瑣且費時。

因此，在一些方面，本發(fā)明提供用于檢測針對在癌癥中的新抗原的t細胞應(yīng)答的高通量平臺類方法。此方法使用用于檢測針對癌癥抗原的甚至低頻t細胞應(yīng)答的本文所述的aapc平臺。理解此類應(yīng)答的頻率和個人之間的變化將對于癌癥疫苗的設(shè)計和個人化癌癥免疫治療具有重要暗示。

雖然中樞耐受消除針對自蛋白的t細胞應(yīng)答，但致癌突變誘導(dǎo)針對可形成t細胞應(yīng)答的新表位。來源于整個外顯子組測序的突變目錄提供用于識別此類新表位的開始點。使用hla結(jié)合預(yù)測算法(srivastava，《科學(xué)公共圖書館綜合卷(plosone)》4，e6094(2009)，它已預(yù)測每種癌癥可具有最多7至10個新表位。類似方法估計數(shù)百的腫瘤新表位。然而，此類算法在預(yù)測t細胞應(yīng)答方面可具有低精確性，并且在hla的情形下僅10％的預(yù)測的結(jié)合表位期望結(jié)合(lundegaardc，《免疫學(xué)(immunology)》130，309-18(2010))。因此，預(yù)測的表位必須證實針對那些可能的新表位的t細胞應(yīng)答的存在。

在某些實施例中，納米aapc系統(tǒng)用于篩選在多種癌癥中或在特定患者的癌癥中誘導(dǎo)t細胞應(yīng)答的新表位。癌癥可例如通過整個外顯子組測序基因分析。舉例來說，在一組24種晚期腺癌中，識別平均約50種突變每種腫瘤。在大約分析的20,000種基因中，1327種具有至少一種突變，并且148種具有兩種或更多種突變。識別974種錯義突變，其中少附加數(shù)量的刪除和插入。

候選肽的列表可在突變的蛋白中重疊九個氨基酸窗口產(chǎn)生。將從每種蛋白選擇含有突變氨基酸的所有九個aa窗口和2個非突變“對照”。將使用mhc結(jié)合預(yù)測算法的共識(包括netmhc和穩(wěn)定矩陣方法(smm))針對mhc結(jié)合在計算上評估這些候選肽。納米aapc和mhc結(jié)合算法已經(jīng)開發(fā)主要用于hla-a2等位基因?？烧{(diào)節(jié)共識預(yù)測的敏感性截斷直至識別易控制數(shù)量的含有突變肽(～500)和非突變的對照肽(～50)。

然后合成肽庫。帶有aapc的mhc(例如a2)在多孔板中沉積并且被動地負載肽。cd8t細胞可從a2陽性健康供體和a2陽性胰腺癌癥患者(或本文所述的其它癌癥或疾病)兩者的pbmc中分離。隨后，分離的t細胞與負載的aapc一起在盤中培育用于富集步驟。在培育之后，將盤放置在磁場上并且去除含有未結(jié)合到aapc的無關(guān)t細胞的上清液。將培養(yǎng)結(jié)合到aapc的剩余t細胞并且使其擴增7到21天。通過用aapc和胞內(nèi)ifnγ螢光染色再刺激評估抗原特異性擴增。

在一些實施例中，針對納米aapc的陣列或庫篩選患者的t細胞，并且結(jié)果用于診斷或預(yù)測目的。舉例來說，針對突變的蛋白、過表達蛋白和/或其它腫瘤相關(guān)的抗原的t細胞抗腫瘤應(yīng)答的數(shù)量和標(biāo)識可用作分層風(fēng)險的生物標(biāo)記。舉例來說，此類t細胞應(yīng)答的數(shù)量可與疾病進展的風(fēng)險或化學(xué)療法的抗性或非應(yīng)答性的風(fēng)險成反比。在其它實施例中，針對納米apc的陣列或庫篩選患者的t細胞，并且t細胞應(yīng)答存在或這些t細胞應(yīng)答的數(shù)量或強度識別患者患有亞臨床腫瘤，和/或提供腫瘤生物學(xué)的初始理解。

在一些實施例中，針對各自呈遞不同候選肽抗原的順磁性aapc的陣列或庫篩選患者或受試者的t細胞。此篩選可提供大量關(guān)于受試者或患者的t細胞抗體庫的信息，并且結(jié)果可用于診斷或預(yù)測目的。舉例來說，針對突變蛋白、過表達蛋白和/或其它腫瘤相關(guān)的抗原的t細胞抗腫瘤應(yīng)答的數(shù)量和標(biāo)識可用作分層風(fēng)險的生物標(biāo)記，以監(jiān)測免疫治療的功效，或預(yù)測免疫治療治療的結(jié)果。另外，此類t細胞應(yīng)答的數(shù)量或強度可與疾病進展的風(fēng)險成反比或可預(yù)測化學(xué)療法的抗性或非應(yīng)答性。在其它實施例中，針對各自呈遞候選肽抗原的納米apc的陣列或庫篩選受試者的或患者的t細胞，并且t細胞應(yīng)答的存在或這些t細胞應(yīng)答的數(shù)量或強度，例如通過識別自體免疫疾病或識別患者患有亞臨床腫瘤，提供關(guān)于患者健康的信息。在這些實施例中，所述方法不僅識別可能疾病病況，而且提供疾病生物學(xué)的初始理解。

試劑/試劑盒

在本發(fā)明的另一個方面，在試劑盒中提供納米aapc連同用于進行富集和擴增過程的組分。用于納米aapc的合適的容器包括例如瓶子、小瓶、針筒和試管。容器可由多種材料(包括玻璃或塑料)形成。容器可具有無菌進入孔(例如容器可為靜脈內(nèi)溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。任選地，一種或多種不同抗原可結(jié)合到納米aapc或可分別供應(yīng)。可替代地或此外，試劑盒可包含用于t細胞的一種或多種多壁盤或培養(yǎng)盤。在一些實施例中，試劑盒包含密封的容器，其包含aapcs、磁體和(任選地)試管和/或用于進行磁性富集的溶液或緩沖液。

試劑盒可進一步包含第二容器，其包含醫(yī)藥學(xué)上可接受的緩沖液，如磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它還可含有適用于最終用戶的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋液、過濾器、針和針筒。

試劑盒還可含有用于評估抗原特異性t細胞活化或擴增的程度和功效的試劑，如針對特異性標(biāo)記蛋白的抗體、mhci類或ii類分子復(fù)合物、tcr分子復(fù)合物、抗克隆型抗體等。

試劑盒還可包含含有用于誘導(dǎo)抗原特異性t細胞、擴增抗原特異性t細胞、以各種方案使用在試劑盒中的納米aapc的方法的書面說明書的包裝說明書。包裝說明書可為未經(jīng)批準(zhǔn)的草案包裝說明書或可為由食品和藥物管理局(fda)或其它監(jiān)管機構(gòu)審批通過的包裝說明書。

實例

實例1

過繼t細胞治療可介導(dǎo)癌癥的持久消退。為了從天然t細胞快速產(chǎn)生大量的功能腫瘤特異性t細胞，我們開發(fā)使用順磁性納米級人工抗原呈遞細胞的富集+擴增策略，其能夠在磁性塔中富集稀少腫瘤特異性t細胞而同時活化它們。富集+擴增產(chǎn)生小鼠和人類腫瘤特異性t細胞的大于1000倍擴增，并且用通過富集+擴增產(chǎn)生的腫瘤特異性ctl治療的小鼠具有顯著較少腫瘤生長。通過富集+擴增以經(jīng)濟的可再生的形式精簡大量腫瘤特異性t細胞的產(chǎn)生可為自體腫瘤免疫治療方案的有力補充。

腫瘤特異性t細胞的過繼轉(zhuǎn)移可介導(dǎo)癌癥¹的持久消退。雖然預(yù)先存在的抗腫瘤應(yīng)答僅可從少數(shù)的癌癥患者²培養(yǎng)，但對廣泛多種腫瘤抗原具有特異性的t細胞可通過具有腫瘤抗原³的天然前驅(qū)細胞的刺激來產(chǎn)生。此培養(yǎng)過程依賴于自體抗原呈遞細胞和喂養(yǎng)細胞，其為對于每個個體患者⁴必須產(chǎn)生的復(fù)合物生物制劑，顯著增加過繼免疫治療的成本和復(fù)雜度。

腫瘤特異性t細胞的擴增進一步因腫瘤特異性天然前體的稀有性而復(fù)雜，其可僅為百萬分之一^5-7。為了產(chǎn)生有效治療^8-10所需要的大量的腫瘤特異性t細胞，在許多周內(nèi)淋巴細胞用抗原反復(fù)刺激，常常接著t細胞選擇和亞克隆¹¹。此勞動密集過程增加在最終細胞產(chǎn)物中的腫瘤特異性t細胞的總數(shù)和抗原特異性頻率(或“純度”)兩者?？乖禺愋灶l率為在轉(zhuǎn)移之后對于理想擴增的獨特重要的參數(shù)，因為競爭來自無關(guān)的共同轉(zhuǎn)移的細胞的生長信號可顯著減弱所關(guān)注的抗腫瘤t細胞的動態(tài)平衡擴增^12-14。

因此，存在對可從天然前體快速產(chǎn)生大量和高頻率的腫瘤特異性t細胞的技術(shù)的需要，而不添加細胞apc或喂養(yǎng)細胞的費用和復(fù)雜度。本發(fā)明因此提供使用納米級人工抗原呈遞細胞(納米aapc)的t細胞富集和擴增策略。這里例示的納米aapc為順磁性的鐵-聚葡萄糖納米粒子，直徑為50nm至100nm，用通過內(nèi)源性apc遞送的兩種活化信號官能化：信號1，在結(jié)合tcr的mhc的情形下呈遞同源抗原肽；以及信號2，調(diào)節(jié)t細胞應(yīng)答并且促進有效活化的多個共刺激受體中的一個(圖1，頂部)。順磁性納米aapc因此能夠在磁性富集塔中捕獲同源t細胞和誘導(dǎo)抗原特異性t細胞擴增(圖1，底部)。

通過與納米aapc一起培育天然、多克隆小鼠cd8+t淋巴細胞，使細胞-粒子混合物通過磁性塔，洗脫并且然后培養(yǎng)磁體結(jié)合部分進行用納米aapc富集(圖1)。為了評估富集的功效，對db-gp100黑素瘤抗原具有特異性的已知數(shù)量的thy1.1+pmeltcr轉(zhuǎn)殖基因t細胞以1:1000比率與來自b6小鼠的thy1.2+cd8t細胞混合。在用pmelgp100特異性aapc富集之后，抗原特異性pmelt細胞的頻率從在富集之前的0.07％增加大于10倍到在以劑量依賴性方式富集之后的1.17％(圖2a)。優(yōu)化與t細胞一起培育的納米aapc的量增加富集效率并且產(chǎn)生最多95％的添加的pmelt細胞的回收率(圖2b)。

通過用可溶mhc五聚體染色評估來自內(nèi)源性b6cd8+脾細胞的野生型db-gp100細胞的富集。在富集之前db-gp100特異性頻率低于可檢測水平，但之后增加到0.30％。與db-gp100粒子一起培育的非特異性kb-trp2細胞的頻率不增加(圖2c)。

在富集之后，體外洗脫和培養(yǎng)富集細胞的磁體結(jié)合部分(陽性部分)和納米aapc。為研究富集對后續(xù)增殖的影響，通過收集陰性部分(未結(jié)合到納米aapc的cd8+t細胞)并將其添加回陽性部分，在對照樣品中“未進行”富集程序(圖3a)。

在擴增之后富集顯著增強抗原特異性頻率和總t細胞數(shù)量。在用kb-trp2納米-aapc富集七天之后，與來自陰性+陽性未富集組的1.46％的細胞相比，17.6％的來自陽性部分的擴增的細胞為kb-trp2特異性(圖3b)。富集程序產(chǎn)生全部抗原特異性細胞的2至3倍增加，不管陰性+陽性部分的總細胞的更大數(shù)量如何。我們假設(shè)全部t細胞擴增的增加可通過對淋巴細胞因子降低的競爭介導(dǎo)。

富集+擴增方法大體上適用于多種腫瘤和模型t細胞抗原，包括黑素瘤抗原gp100(db-gp100)、kb-限制的卵白蛋白抗原siin(kb-siin)以及結(jié)腸癌瘤抗原ld-ah1/a5(ld-a5)(圖3d、圖3e)。絕對數(shù)量的抗原特異性細胞和頻率為抗原依賴性的。在一周之后kb-siin應(yīng)答不斷地產(chǎn)生20％抗原特異性細胞，而db-gp100特異性為總t細胞的大約5％并且ld-a5為總t細胞的大約7.5％。

根據(jù)所關(guān)注的抗原的已知前體頻率估計t細胞增殖(表1)。對外來抗原的cd8應(yīng)答的前體頻率在10s/10⁷至100s/10⁷的范圍內(nèi)，⁷并且對于自身抗原如trp2期望在此范圍的下端。db-gp100的前體頻率已經(jīng)在10⁷中的10處測量，⁵并且對于kb-siinf在10⁷中40至350處。在一周之后，由10⁷多克隆cd8t細胞產(chǎn)生150,000trp2特異性細胞；因此，我們估計trp2特異性增殖在100至1000倍之間。相比之下，由10⁷t細胞產(chǎn)生大約35,000db-gp100和150,000kb-siinf特異性t細胞，這表明對于每種抗原最多5,000倍擴增。這與在體內(nèi)病毒感染之后觀察的魯棒擴增相當(dāng)¹⁸。

為了驗證這些估計，我們用增殖標(biāo)記染料cfse標(biāo)記天然t細胞群，其用每輪的t細胞分裂稀釋一半。在e+e四天之后，kb-trp2四聚體結(jié)合t細胞已稀釋其cfse低于可檢測極限。用中等劑量的納米aapc刺激的轉(zhuǎn)殖基因pmelt細胞用于比較；這些細胞示出cfse熒光的多個峰，這表明在2至7輪的分裂之間。這允許我們確定富集+擴增trp2特異性t細胞已完成大于7輪的分裂，僅在四天之后與大于256倍擴增一致。擴增的t細胞示出cd62l低cd44高效應(yīng)記憶表型，與魯棒活化和增殖一致。

通過e+e的t細胞擴增與使用經(jīng)trp2肽脈沖的成熟、骨髓衍生的樹突狀細胞擴增相比。一千萬天然淋巴細胞的刺激產(chǎn)生2±0.5×10⁴trp2-特異性t細胞，其中抗原特異性頻率在0.5％至2.85％之間，比用e+e實現(xiàn)的數(shù)量和頻率低大約10倍。這與在人類中通過apc和人工apc擴增一致，其中在一周的刺激之后抗原特異性應(yīng)答經(jīng)常不可檢測¹⁹。

對多種腫瘤抗原的t細胞應(yīng)答的同時產(chǎn)生將增加由單個天然t細胞群產(chǎn)生的抗腫瘤t細胞的數(shù)量，并且降低由于單個抗原下調(diào)的腫瘤免疫逃逸的可能性^20-22。我們因此開發(fā)用于同時產(chǎn)生多個抗腫瘤群的單步e+e方案。

天然淋巴細胞與帶有db-gp100、kb-siinf和kb-trp2mhc二聚體的納米aapc一起培育，每種以標(biāo)準(zhǔn)單個抗原劑量。在“三”e+e一周之后，通過針對所關(guān)注的每種抗原的五聚體染色檢測抗原特異性t細胞(圖3f)。雖然每個群的頻率低于在僅用一種抗原刺激的對照樣品中發(fā)現(xiàn)的頻率(圖3g)，但無論分開單獨地或同時，總抗原特異性細胞相同(通過雙向方差分析p>0.4)(圖3g)。因此，對于每種腫瘤特異性t細胞群體，三e+e方案與單個抗原對照中的任一個一樣有效。

過繼性轉(zhuǎn)移的腫瘤特異性t細胞與共轉(zhuǎn)移的非腫瘤特異性旁觀者細胞競爭生長信號^12-14。然而，此效應(yīng)尚未證實t細胞的抗原特異性擴增先前已經(jīng)體外活化，如在富集+擴增期間出現(xiàn)。

我們因此以粗略估計具有和無e+e(分別10％和1％)的情況下實現(xiàn)的抗原特異性頻率的比率組合腫瘤特異性pmelt細胞和多克隆、野生型b6細胞。在每組中，給藥的pmelt細胞的總數(shù)相同(10⁵)；僅旁觀者t細胞的量不同(10⁶或10⁷)。在接受較少(106)旁觀者細胞的小鼠中觀察最大數(shù)量和最高頻率的pmelt細胞(圖4a至圖4b)。從這些動物的脾和淋巴結(jié)回收大約5.5±1.5×10⁵pmelt細胞(圖4b)。從接受10⁷旁觀者細胞的動物回收僅1.4±0.7×10⁵pmelt細胞(通過用tukey后測試雙向方差分析，p<0.05)。因此，在轉(zhuǎn)移之后去除來自共轉(zhuǎn)移細胞的競爭增強移植和擴增。

此外，腫瘤特異性t細胞與宿主細胞競爭生長信號²⁴，其在過繼轉(zhuǎn)移之前已推動宿主放射和化療類淋巴細胞耗盡的使用^25，26。因此，接受10⁶或10⁷旁觀者細胞的動物為在轉(zhuǎn)移之前用500cgyγ輻射來輻射24小時或保持未經(jīng)治療任一者，產(chǎn)生四個實驗組。未輻射的動物示出不良移植，其中在10⁶或10⁷旁觀者組任一者中回收少于0.3×10⁵pmelt細胞(圖4a至圖4b)。因此，去除轉(zhuǎn)移的旁觀者淋巴細胞和/或宿主淋巴細胞兩者顯著增加在宿主中的過繼性轉(zhuǎn)移腫瘤特異性t細胞的產(chǎn)量。

我們接下來確定通過富集+擴增用納米aapc產(chǎn)生的腫瘤特異性淋巴細胞介導(dǎo)形成的黑素瘤的排斥反應(yīng)。b16-f10細胞(侵略性、差免疫原性黑素瘤模型)皮下植入到b6宿主小鼠中并且使其生長八天直至腫瘤可觸知。同時，cd8淋巴細胞從天然b6供體小鼠中分離并且針對db-gp100和kb-trp2抗原富集+擴增，然后在淋巴細胞耗盡一天之后轉(zhuǎn)移到宿主。

接受腫瘤特異性e+e供體淋巴細胞的動物具有比未經(jīng)治療小鼠或接受針對不相關(guān)的kb-siinf抗原產(chǎn)生的等效數(shù)量的淋巴細胞的小鼠顯著少的腫瘤生長(圖4c)。在腫瘤注射十八天之后，對于未經(jīng)治療小鼠的平均腫瘤面積為130±12mm²，相比于對于kb-siinf治療的小鼠為144±11mm²和對于db-gp100/kb-trp2治療的小鼠為22±9mm²(通過用tukey后測試方差分析，p<0.05)。

由于過度的腫瘤負荷在第22天處死在未經(jīng)治療和kb-siinf治療組中的所有小鼠。相比而言，在db-gp100/kb-trp2組中的小鼠直至第24天才被處死，并且2/8小鼠在移植2個月之后不具有可檢測的腫瘤(通過mantel-cox，p<0.01)。在e+e治療組(28天)中的中值存活期比未經(jīng)治療(20天)或非同源治療(20天)組顯著更大。因此，從天然細胞培養(yǎng)僅一周的的e+e淋巴細胞能夠延遲并且在一些情況下，完全排斥形成的b16黑素瘤。

通過用hla-a2官能化的納米aapc富集+擴增還在從天然淋巴細胞擴增人類抗腫瘤應(yīng)答下有效。人類cd8+淋巴細胞從健康供體的外周血單個核細胞中分離，并且e+e用帶有ny-eso1或mart1腫瘤抗原任一者的納米aapc進行。在一周之后，產(chǎn)生44,000±21,000ny-eso1特異性細胞，表示大約1000倍前體擴增(表1，圖5)。對于mart1應(yīng)答，在一周中產(chǎn)生83,000±37,000；這表示大約100倍數(shù)擴增，反映甚至在健康供體27中發(fā)現(xiàn)的mart1應(yīng)答的高前體頻率(表1，圖5)。因此，富集+擴增不限于鼠類t細胞，但還為用于天然、低頻、抗腫瘤人類ctl的擴增的魯棒方法。

用于癌癥的廣泛應(yīng)用的過繼免疫治療受腫瘤特異性細胞的有成本效益和方便的來源的可用性限制。這里，我們開發(fā)用于從天然細胞快速擴增大量高頻腫瘤特異性淋巴細胞的簡化技術(shù)，其中在一周中大于1000倍擴增。我們進一步證實通過富集去除不相關(guān)的旁觀者細胞在體外培養(yǎng)期間和在體內(nèi)過繼轉(zhuǎn)移之后均將顯著存活期和增殖優(yōu)點賦予腫瘤特異性t細胞。

雖然抗原特異性t細胞可在t細胞擴增之后使用mhc四聚合物富集^28-30，但我們的平臺通過允許富集和擴增用單個試劑進行來簡化此過程。此外，在不存在共刺激的情況下通過多聚mhc的tcr的交聯(lián)可誘導(dǎo)t細胞細胞凋亡或失能^31-33，其中在四聚體接合之后最多二分之一的抗原特異性細胞缺失。因此，用于t細胞富集和擴增兩者的單個平臺的使用簡化并且改善現(xiàn)有方案。

腫瘤特異性t細胞現(xiàn)在可通過淋巴細胞的基因工程來產(chǎn)生以表達抗癌tcr或嵌合抗原受體(car)¹并且為提高可用性的有前景的方法；然而，尚未通過內(nèi)源性耐受機構(gòu)調(diào)節(jié)的外來受體的使用理論上增加交叉反應(yīng)性和毒性的可能性，在實驗中觀察具有顯著毒性³⁴。自體黑素瘤浸潤淋巴細胞已證明在臨床試驗中高度有效，但不可從所有黑素瘤患者或?qū)τ诖蟛糠制渌┌Y²培養(yǎng)。

用于從內(nèi)源性天然細胞產(chǎn)生應(yīng)答的可靠方法可因此增加可用性和安全兩者³。現(xiàn)有方案已用來源于天然細胞的應(yīng)答展示令人鼓舞結(jié)果^35，36，但依賴于在多周到數(shù)月內(nèi)重復(fù)的刺激和克隆以產(chǎn)生在10⁸和10¹⁰之間的給藥的腫瘤反應(yīng)性t細胞^36-38每輸注，這導(dǎo)致高成本和復(fù)雜度。就總數(shù)和純度兩者而言e+e為有前景的新穎方法，相比于現(xiàn)有嘗試在較短時間段中產(chǎn)生魯棒擴增。舉例來說，在培養(yǎng)液中一周之后，ny-eso1用樹突狀細胞類方法的擴增為不可檢測的或未報告任一者，使實現(xiàn)在4％至27％之間的抗原特異性純度，其中1000倍擴增均更顯著。相比之下，若干組已報告高前體頻率mart1應(yīng)答的有效擴增。舉例來說，由等人³⁹描述的新穎dc類ace-cd8平臺為已非?？捎糜趲椭薅ê蛢?yōu)化用于人類cd8細胞的擴增的需要的充分表征系統(tǒng)并且示出了印象深刻的10天擴增，這表明需要培養(yǎng)條件的進一步優(yōu)化以支持理想mart1體外擴增。盡管如此，為了產(chǎn)生可為臨床上需要的t細胞的量，dc類ace-cd8平臺將另外可能需要從患者多個血漿除去以每周產(chǎn)生用于非抗原特異性技術(shù)的擴增或使用的dc的培養(yǎng)液。納米aapc類e+e不受制于此類約束。

假設(shè)大約1至10每百萬的腫瘤特異性t細胞前體頻率，大約0.5×10¹⁰cd8t細胞從單個白細胞采集物收獲，并且e+e觀察具有1000至5000倍擴增，大于10⁸抗原特異性t細胞可在一周中產(chǎn)生。同時擴增多個抗原將增加此數(shù)量，另外產(chǎn)生用于輸注的足夠的細胞。因此，通過排除培養(yǎng)細胞apc的需要和簡化大量的高頻腫瘤特異性t細胞的產(chǎn)生，富集+擴增可為自體腫瘤免疫治療方案的有力補充。

方法

小鼠和試劑。pmeltcr/thy1arag-/-轉(zhuǎn)基因小鼠維持為純合體。c57bl/6j和balb/c小鼠購自杰克遜實驗室(jacksonlaboratories)(緬因州巴港(barharbor,me))。所有小鼠根據(jù)約翰霍普金斯大學(xué)的機構(gòu)審查委員會(johnshopkinsuniversity'sinstitutionalreviewboard)維持。熒光標(biāo)記的單克隆抗體購自博萊德(biolegend)(加利福尼亞州圣地亞哥)。

mhc-ig二聚體和納米aapc的制備。如所描述制備可溶的mhc-ig二聚體、kb-ig、db-ig和a2-ig并且用肽負載。¹⁹如所描述通過mhc-ig二聚體和抗cd28抗體(37.51；博萊德)直接共軛到macs微珠(美天旎生物技術(shù)公司(miltenyibiotec))制造納米aapc。¹⁵

淋巴細胞分離。小鼠淋巴細胞從均勻化的小鼠脾和淋巴結(jié)獲得，接著rbc的低滲裂解。細胞毒素淋巴細胞按照制造商的方案使用來自美天旎生物技術(shù)公司(德國科隆)的cd8無接觸分離試劑盒和磁性富集塔分離。在適用的情況下，細胞在37℃下用羧基熒光素丁二酰亞胺基酯(cfse)標(biāo)記15分鐘，然后充分洗滌。對于人類研究，約翰霍普金斯大學(xué)的道德委員會審批通過本研究并且所有健康志愿者給出書面知情同意書。hla-a2+供體的pbmc通過密度梯度離心(通用電氣醫(yī)療集團，淋巴細胞分離培養(yǎng)基ficoll-paque(lymphocyteseparationmediumficoll-paque,gehealthcare))獲得。隨后，cd8+t細胞按照制造商的方案使用來自美天旎生物技術(shù)公司(德國科隆)的cd8無接觸分離試劑盒和磁性富集塔分離。經(jīng)純化的cd8+t細胞在4℃下用納米aapc染色1h，并且利用ms塔(美天旎生物技術(shù)公司)磁性富集。

富集和擴增。1千萬富集cd8的淋巴細胞在4℃下與10μl的納米aapc一起培育1小時。細胞-粒子混合物隨后穿過磁性富集塔，收集陰性部分并且洗脫陽性部分?；旌戏蛛x的部分并且在96孔圓底盤中在完全rpmi-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，在提供5％co2和37℃的含濕氣培育箱中的96孔圓底盤(法爾康(falcon))中用10％人類自體血清和3％t細胞成長因子(tcgf)補充1周。培養(yǎng)基和tcgf一周補充一次。利用facs分析通過四聚體和mhc-ig染劑在第0天和第7天監(jiān)測ctl的特定性。

旁觀者體內(nèi)實驗。pmel和野生型b6cd8+t淋巴細胞的混合物以指定比率混合。在過繼轉(zhuǎn)移之前，細胞混合物用20μl的db-gp100納米aapc培養(yǎng)一周。在指定組中在用msdnordiongammacell雙cs137源極(約翰霍普金斯分子成像中心)過繼轉(zhuǎn)移之前一天，在宿主小鼠中通過半致命的輻射(500cgy)誘導(dǎo)暫時淋巴球減少癥。小鼠在過繼轉(zhuǎn)移的當(dāng)天和之后的當(dāng)天兩者用30,000單位腹膜內(nèi)il-2治療。在過繼轉(zhuǎn)移之后七天和二十天，每組三個小鼠被處死并且淋巴細胞從外周血、脾和腹股溝、頸和腋下淋巴結(jié)中分離，并且然后用抗thy1.1抗體染色。

腫瘤排斥反應(yīng)實驗。腫瘤排斥反應(yīng)實驗如上進行，例外為在過繼t細胞轉(zhuǎn)移之前十天皮下注射3×10⁵b16黑素瘤細胞。在如上文所描述在過繼轉(zhuǎn)移之前一天誘導(dǎo)暫時淋巴球減少癥。對于每個腫瘤宿主(最多每個供體3個宿主)來自每個供體的1千萬天然淋巴細胞用于產(chǎn)生抗原特異性細胞，這表示在培養(yǎng)一周之后產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移大約2×10⁵腫瘤特異性t細胞。小鼠在過繼轉(zhuǎn)移的當(dāng)天和之后的當(dāng)天兩者用30,000單位腹膜內(nèi)il-2治療。使用數(shù)字卡尺以2天時間間隔監(jiān)測腫瘤生長。當(dāng)腫瘤達到150mm²時處死小鼠。

表1：抗原特異性t細胞擴增。估計每1千萬淋巴細胞的t細胞前體頻率。由1千萬淋巴細胞產(chǎn)生的抗原特異性細胞(參考)。

實例2

新抗原的擴增

迄今描述的腫瘤抗原為來源于在腫瘤中過度表達的蛋白的先前已知的“共享抗原”，并且存在于來自多個患者的腫瘤上或在其之間共享。借助全基因組測序的出現(xiàn)，已經(jīng)證明大部分癌癥含有可結(jié)合到患者的mhc的克隆非同義單個堿基對取代基，由此打開免疫治療的新途徑。²⁹后續(xù)分析已增強此想法。^38-45這些“新抗原”具有優(yōu)于作為腫瘤目標(biāo)的共享抗原的理論優(yōu)點，如對于腫瘤組織更大特定性并且可能較高親和力tcr-mhc相互作用。然而，在每種癌癥中突變的模式是獨特的，并且方法必須開發(fā)用于快速個人化識別和這些新抗原的靶向。

為了使用富集+擴增針對新抗原產(chǎn)生t細胞應(yīng)答，我們采用公布的對于小鼠黑素瘤系b16和結(jié)腸癌瘤系ct26描述的“mutomes”。^46，47簡單來說，組合基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集以識別表達的單個堿基對取代基(圖6a)。經(jīng)由計算機提取每個sbs的上游和下游的八個或九個側(cè)接氨基酸。這些～17個氨基酸序列然后通過netmhc處理，所述netmhc為使用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)⁴⁸預(yù)測肽到人類hla以及小鼠mhc等位基因的結(jié)合的算法。此算法預(yù)測在對于ct26和b16的長度中的氨基酸新表位8到10個氨基酸(表2)。合成表示大范圍預(yù)測親和力的七個候選肽(2個來自ct26和5個來自b16)并且用于產(chǎn)生新表位特異性納米aapc。然后用帶有這些新表位的納米aapc進行e+e并且在第7天評估m(xù)hc多聚體。

對于測試的兩種ct26衍生的候選肽的兩者(fps和saf)，識別來自第7天培養(yǎng)液的抗原特異性群。圖6b示出了ld-fps和ld-saf活化的樣品的代表性第7天同源mhc染色。來源于b16mutome的肽示出響應(yīng)性(db-ytg)和非響應(yīng)性(kb-lay)染色圖案(圖6b)；研究的總體2/5肽(db-ytg和kb-vdw)示出強應(yīng)答，2/5示出中等應(yīng)答(db-iam和db-rtf)，和1/5為非響應(yīng)性(kb-lay)。如通過netmhc(表2)預(yù)測的對于mhc的肽親和力不精確預(yù)測e+e應(yīng)答；分別在991nm和9066nm處強應(yīng)答者ytg和vdw具有低預(yù)測親和力，而分別在69nm和5nm處無應(yīng)答者lay和模棱兩可的應(yīng)答者iam具有高預(yù)測親和力?？傮w上，在第7天產(chǎn)生的細胞的總數(shù)近似于用共享的抗原db-gp100和ld-a5觀察的那些數(shù)量，在15,000至40,000范圍內(nèi)(圖6c)，但少于共享的抗原kb-trp2和kb-siin。

表2.候選新表位

含有來源于b16腫瘤的新表位候選肽序列的列表，包括如通過netmhc預(yù)測的mhc親和力。

僅用于實例2的參考文獻：

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(5)morgan,r.a.；chinnasamy,n.；abate-daga,d.；gros,a.；robbins,p.f.；zheng,z.；dudley,m.e.；feldman,s.a.；yang,j.c.；sherry,r.m.；等人，在抗mage-a3tcr基因治療之后的癌癥消退和神經(jīng)毒性(cancerregressionandneurologicaltoxicityfollowinganti-mage-a3tcrgenetherapy.)《免疫療法雜志(jimmunother.)》2013,36,133-151.

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(10)itzhaki,o.；hovav,e.；ziporen,y.；levy,d.；kubi,a.；zikich,d.；hershkovitz,l.；treves,a.j.；shalmon,b.；zippel,d.；等人，最低限度地過繼轉(zhuǎn)移治療的建立和大規(guī)模擴增(establishmentandlarge-scaleexpansionofminimallyadoptivetransfertherapy)《免疫療法雜志(jimmunother.)》2011，34，212-220。

(11)satthaporn,s.；robins,a.；vassanasiri,w.；el-sheemy,m.；jibril,j.a；clark,d.；valerio,d.；eremin,o.在患有可操作乳癌患者中樹突狀細胞功能異常(dendriticcellsaredysfunctionalinpatientswithoperablebreastcancer)《癌癥免疫與免疫療法(cancerimmunol.immunother.)》2004，53，510-518。

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(14)perica,k.；deleónmedero,a.；durai,m.；chiu,y.l.；bieler,j.g.；sibener,l.；m.；assenmacher,m.；richter,a.；edidin,m.；等人，用于t細胞免疫治療的納米級人工抗原呈遞細胞(nanoscaleartificialantigenpresentingcellsfortcellimmunotherapy)《納米醫(yī)學(xué)(nanomedicine)》2013，10，119-129。

(15)zhang,n.；bevan,m.j.cd8(+)t細胞：免疫系統(tǒng)的步兵(cd8(+)tcells:footsoldiersoftheimmunesystem)《免疫(immunity)》2011，35，161-168。

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(17)perica,k.；tu,a.；richter,a.；bieler,j.g.；edidin,m.；schneck,j.p.通過納米粒子集群的磁場誘導(dǎo)t細胞受體增強t細胞活化并刺激抗腫瘤活性(magneticfield-inducedtcellreceptorclusteringbynanoparticlesenhancestcellactivationandstimulatesantitumoractivity)《美國化學(xué)學(xué)會·納米(acsnano)》2014，8，2252-2260。

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(20)semete,b.；booysen,l.；lemmer,y.；kalombo,l.；katata,l.；verschoor,j.；swai,h.s.作為藥物遞送系統(tǒng)的plga納米粒子的生物分布和安全的體內(nèi)評價(invivoevaluationofthebiodistributionandsafetyofplgananoparticlesasdrugdeliverysystems)《納米醫(yī)學(xué)(nanomedicine)》2010，6，662-671。

(21)schamel,w.w.a；alarcón,b.在納米級低聚物中靜息tcr的組構(gòu)(organizationoftherestingtcrinnanoscaleoligomers)《免疫學(xué)評論(immunol.rev.)》2013，251，13-20。

(22)rizzuto,g.a；merghoub,t.；hirschhorn-cymerman,d.；liu,c.；lesokhin,a.m.；sahawneh,d.；zhong,h.；panageas,k.s.；perales,m.-a.；altan-bonnet,g.；等人，自抗原特異性cd8+t細胞前體頻率確定抗腫瘤免疫應(yīng)答的質(zhì)量(self-antigen-specificcd8+tcellprecursorfrequencydeterminesthequalityoftheantitumorimmuneresponse)《實驗醫(yī)學(xué)雜志(j.exp.med.)》2009，206，849-866。

(23)jenkins,m.k.；chu,h.h.；mclachlan,j.b.；moon,j.j.關(guān)于對肽主要組織相容性復(fù)合體配體具有特異性的t細胞的免疫前抗體庫的組合物(onthecompositionofthepreimmunerepertoireoftcellsspecificforpeptide-majorhistocompatibilitycomplexligands)《免疫學(xué)年鑒(annu.rev.immunol.)》2010，28，275-294。

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(26)klebanoff,c.a；gattinoni,l.；palmer,d.c.；muranski,p.；ji,y.；hinrichs,c.s.；borman,z.a；kerkar,s.p.；scott,c.d.；finkelstein,s.e.；等人，用于在小鼠中大量形成的腫瘤的成功cd8+t細胞過繼免疫治療的決定因素(determinantsofsuccessfulcd8+t-celladoptiveimmunotherapyforlargeestablishedtumorsinmice)《臨床癌癥研究(clin.cancerres.)》2011，17，5343-5352。

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(28)besser,m.j.；shapira-frommer,r.；treves,a.j.；zippel,d.；itzhaki,o.；hershkovitz,l.；levy,d.；kubi,a.；hovav,e.；chermoshniuk,n.；等人，在使用在轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者中的短期培養(yǎng)的腫瘤穿透淋巴細胞的過繼轉(zhuǎn)移的ii期研究中的臨床應(yīng)答(clinicalresponsesinaphaseiistudyusingadoptivetransferofshort-termculturedtumorinfiltrationlymphocytesinmetastaticmelanomapatients)《臨床癌癥研究(clin.cancerres.)》2010，16，2646-2655。

(29)segal,n.h.；parsons,d.w.；peggs,k.s.；velculescu,v.；kinzler,k.w.；vogelstein,b.；allison,j.p.在乳房和結(jié)腸直腸癌中的表位概貌(epitopelandscapeinbreastandcolorectalcancer)《癌癥研究(cancerres.)》2008，68，889-892。

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(32)sarkar,s.；v.；kalia,v.；polley,a.；masopust,d.；harrington,l.e.；ahmed,r.；wherry,e.j.刺激強度和克隆競爭影響記憶cd8t細胞分化的速率(strengthofstimulusandclonalcompetitionimpacttherateofmemorycd8tcelldifferentiation)《免疫學(xué)雜志》(j.immunol.)2007，179，6704-6714。

(33)oelke,m.；kurokawa,t.；hentrich,i.；behringer,d.；cerundolo,v.；lindemann,a.基于細胞因子分泌作用在富集之后cd81抗原特異性細胞毒素t淋巴細胞的功能表征：與mhc四聚體技術(shù)比較(functionalcharacterizationofcd81antigen-specificcytotoxictlymphocytesafterenrichmentbasedoncytokinesecretion:comparisonwiththemhc-tetramertechnology)2000，544-549。

(34)oelke,m.；maus,m.v；didiano,d.；june,c.h.；mackensen,a.；schneck,j.p.通過hla-ig-涂布的人工抗原呈遞細胞的抗原特異性細胞毒素t細胞的離體誘導(dǎo)和擴增(exvivoinductionandexpansionofantigen-specificcytotoxictcellsbyhla-ig-coatedartificialantigen-presentingcells)《自然醫(yī)學(xué)》(nat.med.)2003，9，619-624。

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(37)jensen,s.m.；twitty,c.g.；maston,l.d.；antony,p.a；lim,m.；hu,h.-m.；petrausch,u.；restifo,n.p.；fox,b.a.抑制調(diào)節(jié)t細胞的增加的頻率和t細胞介導(dǎo)的抗原損失產(chǎn)生鼠類黑素瘤復(fù)發(fā)(increasedfrequencyofsuppressiveregulatorytcellsandtcell-mediatedantigenlossresultsinmurinemelanomarecurrence)《免疫學(xué)雜志(j.immunol.)》2012，189，767-776。

(38)duan,f.；duitama,j.；alseesi,s.；ayres,c.m.；corcelli,s.a.；pawashe,a.p.；blanchard,t.；mcmahon,d.；sidney,j.；sette,a.；等人，突變新表位的基因組和生物信息學(xué)分布顯示預(yù)測抗癌免疫原性的新規(guī)則(genomicandbioinformaticprofilingofmutationalneoepitopesrevealsnewrulestopredictanticancerimmunogenicity)《實驗醫(yī)學(xué)雜志(j.exp.med.)》2014。

(39)rajasagi,m.；shukla,s.a；fritsch,e.f.；keskin,d.b.；deluca,d.；carmona,e.；zhang,w.；sougnez,c.；cibulskis,k.；sidney,j.；等人，在慢性淋巴細胞性白血病中的個人腫瘤特異性新抗原的系統(tǒng)識別(systematicidentificationofpersonaltumor-specificneoantigensinchroniclymphocyticleukemia)《血液(blood)》2014，124，453-462。

(40)fritsch,e.f.；rajasagi,m.；ott,p.a；brusic,v.；hacohen,n.；wu,c.j.人類的腫瘤新表位的hla結(jié)合特性(hla-bindingpropertiesoftumorneoepitopesinhumans)《癌癥免疫學(xué)研究(cancerimmunol.res.)》2014，2，522-529。

(41)srivastava,p.k.；duan,f.利用用于人類癌癥的免疫治療的每個個體癌癥的抗原指紋：基因組學(xué)示出了新方式及其挑戰(zhàn)(harnessingtheantigenicfingerprintofeachindividualcancerforimmunotherapyofhumancancer:genomicsshowsanewwayanditschallenges)《癌癥免疫與免疫療法(cancerimmunol.immunother)》2013，62，967-974。

(42)tran,e.；turcotte,s.；gros,a.；robbins,p.f.；lu,y.；dudley,m.e.；parkhurst,m.r.；yang,j.c.；rosenberg,s.a.基于在患有上皮癌的患者中的突變特異性cd4+t細胞的癌癥免疫治療(cancerimmunotherapybasedonmutation-specificcd4+tcellsinapatientwithepithelialcancer)《科學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)(sci.transl.med.)》2014，9，641-645。

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(44)yadav,m.；jhunjhunwala,s.；phung,q.t.；lupardus,p.；tanguay,j.；bumbaca,s.；franci,c.；cheung,t.k.；fritsche,j.；weinschenk,t.；等人，通過組合質(zhì)譜和外顯子組測序預(yù)測免疫原性腫瘤突變(predictingimmunogenictumourmutationsbycombiningmassspectrometryandexomesequencing)《自然(nature)》2014，515，572-576。

(45)gubin,m.m.；zhang,x.；schuster,h.；caron,e.；ward,j.p.；noguchi,t.；ivanova,y.；hundal,j.；arthur,c.d.；krebber,w.-j.；等人，檢查點阻斷癌癥免疫治療靶向腫瘤特異性突變抗原(checkpointblockadecancerimmunotherapytargetstumour-specificmutantantigens)《自然(nature)》2014，515，577-581。

(46)castle,j.c.；kreiter,s.；diekmann,j.；m.；vanderoemer,n.；degraaf,j.；selmi,a.；diken,m.；boegel,s.；paret,c.；等人，采用用于腫瘤接種的mutanome(exploitingthemutanomefortumorvaccination)《癌癥研究(cancerres.)》2012，72，1081-1091。

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(49)ernst,b.；lee,d.；chang,j.m.；sprent,j.；surh,c.d.；cd,i.在胸腺中介導(dǎo)陽性選擇肽配體控制在外周中的t細胞存活期和動態(tài)平衡增殖(thepeptideligandsmediatingpositiveselectioninthethymuscontroltcellsurvivalandhomeostaticproliferationintheperiphery)1999，11，173-181。

(50)dummer,w.；ernst,b.；leroy,e.；surh,c.d.；lee,d.在t細胞區(qū)室內(nèi)的天然t細胞動態(tài)靜止的自體調(diào)節(jié)(autologousregulationofnaivetcellhomeostasiswithinthetcellcompartment)《免疫學(xué)雜志(j.immunol.)》2001，166，2460-2468。

(51)wu,z.；bensinger,s.j.；zhang,j.；chen,c.；yuan,x.；huang,x.；markmann,j.f.；kassaee,a.；rosengard,b.r.；hancock,w.w.；等人，動態(tài)平衡增殖是移植耐受的障礙(homeostaticproliferationisabarriertotransplantationtolerance)《自然醫(yī)學(xué)(nat.med.)》2004，10，87-92。

(52)klebanoff,c.a；khong,h.t.；antony,p.a；palmer,d.c.；restifo,n.p.儲集、抑制因子和抗原呈遞者：淋巴細胞耗盡如何增強t細胞介導(dǎo)的腫瘤免疫治療(sinks,suppressorsandantigenpresenters:howlymphodepletionenhancestcell-mediatedtumorimmunotherapy)《免疫學(xué)趨勢(trendsimmunol.)》2005，26，111-117。

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(54)gattinoni,l.；finkelstein,s.e.；klebanoff,c.a；antony,p.a；palmer,d.c.；spiess,p.j.；hwang,l.n.；yu,z.；wrzesinski,c.；heimann,d.m.；等人，通過淋巴細胞耗盡的去除動態(tài)平衡細胞因子儲集增強過繼性轉(zhuǎn)移腫瘤特異性cd8+t細胞的功效(removalofhomeostaticcytokinesinksbylymphodepletionenhancestheefficacyofadoptivelytransferredtumor-specificcd8+tcells)《實驗醫(yī)學(xué)雜志(j.exp.med.)》2005202,907-912.

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(56)lu,x.；jiang,x.；liu,r.；zhao,h.；liang,z.通過珠粒類人工抗原呈遞細胞擴增ptrp2特異性ctl的過繼轉(zhuǎn)移介導(dǎo)抗黑素瘤應(yīng)答(adoptivetransferofptrp2-specificctlsexpandingbybead-basedartificialantigen-presentingcellsmediatesanti-melanomaresponse)《癌癥快報(cancerlett.)》2008，271，129-139。

(57)cobbold,m.；khan,n.；pourgheysari,b.；tauro,s.；mcdonald,d.；osman,h.；assenmacher,m.；billingham,l.；steward,c.；crawley,c.；等人，在通過hla-肽四聚合物選擇之后巨細胞病毒特異性ctl過繼轉(zhuǎn)移到干細胞移植患者(adoptivetransferofcytomegalovirus-specificctltostemcelltransplantpatientsafterselectionbyhla-peptidetetramers)《實驗醫(yī)學(xué)雜志(j.exp.med.)》2005，202，379-386。

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(60)cebecauer,m.；guillaume,p.；hozák,p.；mark,s.；everett,h.；schneider,p.；luescher,i.f.可溶mhc肽復(fù)合物誘導(dǎo)cd8+ctl的快速死亡(solublemhc-peptidecomplexesinducerapiddeathofcd8+ctl)《免疫學(xué)雜志(j.immunol.)》2005，174，6809-6819。

(61)guillaume,p.；legler,d.f.；boucheron,n.；doucey,m.-a.；cerottini,j.-c.；luescher,i.f.具有減弱的cd8結(jié)合選擇性地誘導(dǎo)fas依賴性細胞凋亡的可溶主要組織相容性復(fù)合體肽八聚物(solublemajorhistocompatibilitycomplex-peptideoctamerswithimpairedcd8bindingselectivelyinducefas-dependentapoptosis)，《生物化學(xué)雜志(j.biol.chem.)》2003，278，4500-4509。

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