制備小腦祖先組織的方法與流程

[技術(shù)領(lǐng)域]

本發(fā)明涉及用于在體外誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞分化成小腦祖先組織的技術(shù)。

[

背景技術(shù)：
]

小腦是運(yùn)動系統(tǒng)的主要組成部分，是高度有序的腦結(jié)構(gòu)，具有一些已確定的細(xì)胞類型。在包括人的羊膜動物中，小腦的早期發(fā)育是保守的。小腦發(fā)育的初始階段是形成峽部形成體(isthmicorganizer)，其位于中腦-后腦邊界(midbrain-hindbrainboundary，mhb)。在其誘導(dǎo)影響下，在菱腦原節(jié)1(r1)的背側(cè)區(qū)(翼板)中形成小腦原基(cerebellaranlage)(非專利文件1-3)。小腦細(xì)胞在r1中的兩個(gè)不同的胚區(qū)(germinalzone)生成。一個(gè)是小腦板的腦室區(qū)(ventricularzone，vz)，其表達(dá)堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bhlh)轉(zhuǎn)錄因子ptf1a。ptf1a⁺祖先細(xì)胞產(chǎn)生小腦皮質(zhì)(浦肯野細(xì)胞(purkinjecell)和中間神經(jīng)元)和深部小腦核(dcn)的γ-氨基丁酸能神經(jīng)元(gabaergicneuron)。另一個(gè)區(qū)是菱唇(rhombiclip，rl)，其表達(dá)另一種bhlh因子，即atoh1(也稱為math1)。atoh1⁺祖先細(xì)胞產(chǎn)生小腦谷氨酸能神經(jīng)元，包括顆粒細(xì)胞(gc)、單極刷細(xì)胞(unipolarbrushcell)和大dcn投射神經(jīng)元(非專利文件4-9)。在這十年來在對小腦細(xì)胞分化的控制的理解方面已經(jīng)取得了很多進(jìn)展。這些知識已經(jīng)促進(jìn)了在體外由多能干細(xì)胞產(chǎn)生小腦神經(jīng)元組成部分的技術(shù)進(jìn)展(非專利文件10-13)。然而，所產(chǎn)生的細(xì)胞成分怎樣組裝形成錯(cuò)綜復(fù)雜的小腦構(gòu)造在很大程度上仍然保持是難以理解的。

本發(fā)明人之前報(bào)道通過重建三維(3d)培養(yǎng)過程中的自誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)微環(huán)境可以從小鼠胚胎干細(xì)胞(mesc)有效地生成小腦神經(jīng)元(非專利文件11)。mesc具有響應(yīng)fgf2和胰島素在聚集體內(nèi)形成一些峽部形成體組織的潛力。在那些條件下，當(dāng)用抑制劑抑制內(nèi)源性shh信號傳導(dǎo)時(shí)，mesc-衍生的神經(jīng)祖先細(xì)胞分化成表達(dá)浦肯野細(xì)胞祖先細(xì)胞標(biāo)記kirrel2(也稱為neph3)的小腦板ne。另一方面，向培養(yǎng)物中加入bmp信號促進(jìn)向atoh1⁺gc和tbr1⁺dcn神經(jīng)元的分化，而其抑制浦肯野細(xì)胞在mesc聚集體中的產(chǎn)生。盡管在mesc中能夠成功地誘導(dǎo)小腦神經(jīng)元分化，但是目前尚未再現(xiàn)小腦原基的3d形成。

已經(jīng)報(bào)道，fgf19，即小鼠fgf15(在mhb中表達(dá))的人直向同源物，參與后腦背側(cè)祖先細(xì)胞的發(fā)育(非專利文件14和15)。

sdf1(也稱為cxcl12)，即分泌的針對趨化因子受體4(cxcr4)的配體，在腦膜細(xì)胞中表達(dá)并在表達(dá)cxcr4的外部顆粒(egl)細(xì)胞的遷移中起關(guān)鍵作用(非專利文件16-19)。sdf1-或cxcr4-缺陷型小鼠異常發(fā)育，具有不規(guī)則的外部顆粒層(egl)和異位存在的浦肯野細(xì)胞。

本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)rho相關(guān)卷曲螺旋激酶(rho-associatedcoiled-coilkinase，rock)的抑制劑阻抑通過分散誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(特別是，人多能干細(xì)胞)的細(xì)胞死亡(專利文件1和2)。

[文件列表]

[專利文件]

專利文件1:jp-a-2008-99662

專利文件2:wo2008/035110

[非專利文件]

非專利文件1:wingate，r.j.t，和hatten，m.e.(1999).theroleoftherhombiclipinaviancerebellumdevelopment(菱唇在鳥類小腦發(fā)育中的作用).development126，4395-4404.

非專利文件2:joyner，a.l.，liu，a.，和millet，s.(2000).otx2，gbx2andfgf8interacttopositionandmaintainamid-hindbrainorganizer(otx2，gbx2和fgf8相互作用以安置并保持中-后腦組織體).curr.opin.cellbiolo.12，736-741.

非專利文件3:zervas，m.，milet，s.，ahn，s.，和joyner，a.l.(2004).cellbehaviorandgeneticlineageofthemesencephalonandrhombomere1(中腦和菱腦原節(jié)1的細(xì)胞行為和遺傳譜系).neuron43，345-357.

非專利文件4:ben-arie，n.，bellen，h.j.，armstrong，d.l.mccall，a.e.，gordadze，p.r.，guo，q.，matzuk，m.m.，和zoghbi，h.(1997).math1isessentialforgenesisofcerebellargranuleneurons(math1是小腦顆粒神經(jīng)元發(fā)生所必需的).nature390，169-172.

非專利文件5:hoshino，m.，nakamura，s.，mori，k.，kawauchi，t.，terao，m.，nishimura，y.v.，fukuda，a.，fuse，t.，matsuo，n.，sone，m.，watanabe，m.，bito，h.，terashima，t.，wright，c.v.e.，kawaguchi，y.，nakano，k.，和nabeshima，y.(2005).ptf1a，abhlhtranscriptionalgene，definesgabaergicneuronalfatesincerebellum(ptf1a，即一種bhlh轉(zhuǎn)錄基因，限定小腦中的γ-氨基丁酸能(gabaergic)神經(jīng)元命運(yùn)).neuron47，201-213.

非專利文件6:machold，r.，和fishell，g.(2005).math1isexpressedintemporallydiscretepoolsofcerebellarrhombic-lipneuralprogenitors(math1在小腦-菱唇神經(jīng)祖先的臨時(shí)離散性集合中表達(dá)).neuron48，17-24.

非專利文件7:wang，v.y.，rose，m.f.，和zoghbi，h.y.(2005).math1expressionredefinestherhombiclipderivativesandrevealsnovellineageswithinthebrainstemandcerebellum(math1表達(dá)重新限定菱唇衍生物并且揭示腦干和小腦內(nèi)的新譜系).neuron48，31-43.

非專利文件8:fink，a.j.，englund，c.，daza，r.a.m.，pham，d.，lau，c.，nivison，m.，kowalczyk，t.，和hevner，r.f.(2006).developmentofthedeepcerebellarnuclei:transcriptionfactorsandcellmigrationfromtherhombiclip(深部小腦核的發(fā)育：來自菱唇的轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞遷移).j.neurosci.26，3066-3076.

非專利文件9:carletti，b.，和rossi，f.(2008).neurogenesisinthecerebellum(小腦中的神經(jīng)發(fā)生).neuroscientist14，91-100.

非專利文件10:su，h.-l.，muguruma，k.，matsuo-takasaki，m.，kengaku，m.，watanabe，k.，和sasai，y.(2006).generationofcerebellarneuronprecursorsfromembryonicstemcells(從胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生小腦神經(jīng)元前體).dev.biol.290，287-296.

非專利文件11:muguruma，k.，nishiyama，a.，ono，y.，miyawaki，h.，mizuhara，e.，hori，s.，kakizuka，a.，obata，k.，yanagawa，y.，hirano，t.，和sasai，y.(2010).ontogeny-recapitulatinggenerationandtissueintegrationofescell-derivedpurkinjecells(es細(xì)胞-衍生的浦肯野細(xì)胞的個(gè)體發(fā)育-重現(xiàn)性產(chǎn)生和組織整合).natureneurosci.13，1171-1180.

非專利文件12:tao，o.，shimazaki，t.，okada，y.，naka，h.，kohda，k.，yuzaki，m.，mizusawa，h.，和okano，h.(2010).efficientgenerationofmaturecerebellarpurkinjecellsfrommouseembryonicstemcells(從小鼠胚胎干細(xì)胞有效產(chǎn)生成熟的小腦浦肯野細(xì)胞).j.neurosci.res.88，234-247.

非專利文件13:erceg，s.，ronaghi，m.，zipancic，i.，lainez，s.，rosello，m.g.，xiong，c.，moreno-manzano，v.，rodriguez-jimenez，f.j.，planells，r.，alvarez-dolado，m.，bhattacharya，s.s.，和stojkovic，m.(2010).efficientdifferentiationofhumanembryonicstemcellsintofunctionalcerebellar-likecells(人胚胎干細(xì)胞向功能性小腦樣細(xì)胞的有效分化).stemcellsdev.，19，1745-1756.

非專利文件14:gimeno，l.，和martinez，s.(2007)expressionofchickfgf19andmousefgf15orthologsisregulatedinthedevelopingbrainbyfgf8andshh(在發(fā)育的腦中，fgf8和shh調(diào)節(jié)雞fgf19和小鼠fgf15直向同源物的表達(dá)).dev.dyn.236，2285-2297.

非專利文件15:fischer，t.，faus-kessler，t.，welzl，g.，simeone，a.，wurst，w.，和prakash，n.(2011)fgf15-mediatedcontrolofneurogenicandproneuralgeneexpressionregulatesdorsalmidbrainneurogenesis(fgf15-介導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)生和頸板基因表達(dá)的控制調(diào)節(jié)背側(cè)中腦神經(jīng)發(fā)生).dev.biol.350，496-510.

非專利文件16:ma，q.，jones，d.，borghesani，p.r.，segal，r.a.，nagasawa，t.，kishimoto，t.，bronson，r.t.，和springer，t.a.(1998).impairedb-lymphopoiesis，myelopoiesis，andderailedcerebellarneuronmigrationincxcr4-andsdf-1-deficientmice(在cxcr4-和sdf-1-缺陷型小鼠中損害的b-淋巴細(xì)胞生成、髓細(xì)胞生成和偏離正常進(jìn)程的(derailed)小腦神經(jīng)元遷移).proc.natl.acad.sci.usa95，9448-9453.

非專利文件17:reiss，k.，mentlein，r.，sievers，j.，和hartmann，d.(2002).stromalcell-derivedfactor1issecretedbymeningealcellsandactaschemotacticfactoronneuronalstemcellsofthecerebellarexternalgranularlayer(基質(zhì)細(xì)胞-衍生的因子1由腦膜細(xì)胞分泌，并且以趨化性因子作用在小腦外部顆粒層的神經(jīng)元干細(xì)胞上).neurosci.115，295-305.

非專利文件18:zou，y.-r.，kottmann，a.h.kuroda，m.，taniuchi，i.，和littman，d.r.(1998).functionofthechemokinereceptorcxcr4inhaematopoiesisandincerebellardevelopment(趨化因子受體cxcr4在血細(xì)胞生成和在小腦發(fā)育中的功能).nature393，595-599.

非專利文件19:zhu，y.，yu，t.，zhang，x.-c.，nagasawa，t.，wu，j.y.，和rao，y.(2002).roleofthechemokinesdf-1asthemeningealattractantforembryoniccerebellarneurons(趨化因子sdf-1作為胚胎小腦神經(jīng)元的腦膜引誘劑的作用).natureneurosci.5，719-720.

[發(fā)明概述]

[發(fā)明解決的問題]

如上文提及的，已經(jīng)報(bào)道小鼠多能干細(xì)胞在含有fgf2和胰島素的培養(yǎng)基中進(jìn)行聚集體懸浮培養(yǎng)時(shí)能夠分化成小腦祖先細(xì)胞(非專利文件11)。然而，發(fā)現(xiàn)當(dāng)將用于小鼠多能干細(xì)胞的培養(yǎng)條件直接應(yīng)用于人多能干細(xì)胞時(shí)，不支持人多能干細(xì)胞的小腦分化，沒有觀察到小腦分化，并且由于聚集體的瓦解和其他原因，神經(jīng)培養(yǎng)本身不能繼續(xù)。另外，極大地促進(jìn)小鼠多能干細(xì)胞向小腦祖先組織的分化誘導(dǎo)的hedgehog抑制劑(環(huán)杷明(cyclopamine))沒有顯著地促進(jìn)由人多能干細(xì)胞形成小腦板。這提示由人多能干細(xì)胞的小腦祖先組織的分化條件極大地不同于小鼠的那些，原因在于，例如，向人多能干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中添加sonichedgehog相反地促進(jìn)極化的小腦板的形成。

因此，本發(fā)明目的在于提供用于在體外由人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)小腦組織或其祖先組織的技術(shù)。

[解決問題的方式]

本發(fā)明人對人esc培養(yǎng)應(yīng)用自形成原則，以在體外產(chǎn)生人小腦組織。使用改良的培養(yǎng)條件，包括添加rock抑制劑(y-27632)或tgf-β抑制劑(sb431542)并且不添加hedgehog抑制劑等，在體外它們能夠首次從人多能干細(xì)胞分化為小腦祖先組織。并且，在優(yōu)化3d培養(yǎng)條件的過程中，本發(fā)明人鑒定了兩種因子，即fgf19和sdf1，它們以不同的方式促進(jìn)有序的小腦板樣組織的自形成。在聚集體培養(yǎng)中加入fgf19促進(jìn)由人多能干細(xì)胞的小腦板形成并且增強(qiáng)在所述聚集體中的中腦-后腦邊界神經(jīng)組織中的背腹(dv)極性。在用于小腦組織的自形成的hesc培養(yǎng)中額外的sdf1處理誘導(dǎo)產(chǎn)生如在早期小腦板中觀察到的分層的連續(xù)的小腦板ne。此外，神經(jīng)外胚層(ne)邊緣形成由atoh1⁺/barh1⁺細(xì)胞組成的獨(dú)特的rl-樣胚區(qū)。另外，在小腦祖先組織(小腦板組織)的自組織過程中加入gdf7促進(jìn)在小腦板組織中的菱唇形成。

基于上文提及的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究并且完成了本發(fā)明。

因此，本發(fā)明如下所述：

[1]用于制備包含小腦祖先組織的人細(xì)胞聚集體的方法，其包括使人多能干細(xì)胞聚集體在包含胰島素的無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，并且在所述懸浮培養(yǎng)中，用rock抑制劑、tgfβ信號抑制劑和第一成纖維細(xì)胞生長因子處理所述人多能干細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體。

[2][1]的制備方法，其中所述小腦祖先組織是中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織。

[3][1]或[2]的制備方法，其中在所述懸浮培養(yǎng)中，不用bmp4處理所述人多能干細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體。

[4][1]-[3]中任一項(xiàng)的制備方法，其中在所述懸浮培養(yǎng)中，不用sonichedgehog抑制劑處理所述人多能干細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體。

[5][1]-[4]中任一項(xiàng)的制備方法，其中所述第一成纖維細(xì)胞生長因子是fgf2或fgf8。

[6][1]的制備方法，其包括：

(i)將人多能干細(xì)胞聚集體在包含胰島素的無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，并且，在所述懸浮培養(yǎng)中，用rock抑制劑、tgfβ信號抑制劑和第一成纖維細(xì)胞生長因子處理所述人多能干細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體，從而得到包含中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的人細(xì)胞聚集體，并且

(ii)將得到的包含中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的人細(xì)胞聚集體在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行進(jìn)一步的懸浮培養(yǎng)，從而誘導(dǎo)所述神經(jīng)祖先組織中的神經(jīng)祖先細(xì)胞形成神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)，由此得到包含小腦板組織的人細(xì)胞聚集體。

[7][6]的制備方法，其包括在步驟(i)的懸浮培養(yǎng)中，用第二成纖維細(xì)胞生長因子進(jìn)一步處理所述人多能干細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體。

[8][7]的制備方法，其中所述第二成纖維細(xì)胞生長因子是fgf19、fgf17或fgf8。

[9][6]-[8]中任一項(xiàng)的制備方法，其包括在步驟(ii)的懸浮培養(yǎng)中，用sdf1處理所述包含中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先細(xì)胞的人細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體。

[10][6]的制備方法，其包括在步驟(ii)的懸浮培養(yǎng)中，用gdf7處理所述包含中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先細(xì)胞的人細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體。

[11][7]或[8]的制備方法，其中所述小腦板組織是包含γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞和小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)。

[12][11]的制備方法，其中所述神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)具有背-腹極性。

[13][9]的制備方法，其中所述小腦板組織包含在所述細(xì)胞聚集體表層區(qū)域上的連續(xù)的小腦神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)和菱唇樣組織。

[14][13]的制備方法，其中所述小腦板組織具有三層結(jié)構(gòu)，所述三層結(jié)構(gòu)包括自頂端面按順序成層的腦室區(qū)、浦肯野細(xì)胞區(qū)和源自菱唇的細(xì)胞區(qū)。

[15]通過[1]-[14]中任一項(xiàng)的制備方法得到的人細(xì)胞聚集體。

[16]用于制備人浦肯野細(xì)胞、人高爾基細(xì)胞或人中間神經(jīng)元的方法，其包括：

(i)通過[6]-[14]中任一項(xiàng)的制備方法由人多能干細(xì)胞得到包含小腦板組織的人細(xì)胞聚集體，

(ii)由所得到的人細(xì)胞聚集體得到γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞，并且

(iii)將所述γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞與哺乳動物小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞共同培養(yǎng)，從而誘導(dǎo)所述γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞向浦肯野細(xì)胞、高爾基細(xì)胞或中間神經(jīng)元的分化。

[17]用于制備人小腦顆粒細(xì)胞的方法，其包括：

(i)通過[6]-[14]中任一項(xiàng)的制備方法由人多能干細(xì)胞得到包含小腦板組織的人細(xì)胞聚集體，

(ii)由所得到的人細(xì)胞聚集體得到小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞，并且

(iii)將所述小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞與哺乳動物小腦細(xì)胞共同培養(yǎng)，從而誘導(dǎo)向小腦顆粒細(xì)胞的分化。

[發(fā)明效果]

按照本發(fā)明，在體外可以由人多能干細(xì)胞有效地誘導(dǎo)小腦祖先組織。這是首次在體外能夠由人多能干細(xì)胞形成中腦-后腦邊界祖先組織。在該中腦-后腦邊界祖先組織中可以重現(xiàn)在體內(nèi)觀察到的背-腹極性。按照本發(fā)明，可以在人多能干細(xì)胞-衍生的細(xì)胞的聚集體中自組織具有連續(xù)的表皮結(jié)構(gòu)的小腦祖先組織(小腦板組織)。在該人小腦板組織中，可以鄰近地自形成小腦神經(jīng)上皮(小腦浦肯野細(xì)胞和中間神經(jīng)元的祖先組織)和菱唇(小腦顆粒細(xì)胞和小腦核神經(jīng)細(xì)胞的祖先組織)，它們是在體內(nèi)觀察到兩個(gè)主要的區(qū)域。另外，可以進(jìn)一步誘導(dǎo)體外誘導(dǎo)的人小腦板組織向浦肯野細(xì)胞、小腦中間神經(jīng)元、小腦顆粒細(xì)胞、小腦核等的分化。

[附圖簡述]

圖1顯示使用針對gbx2(綠色)、otx2(紅色)和n-鈣黏著蛋白(藍(lán)色)的抗體對細(xì)胞聚集體的熒光免疫組織化學(xué)染色圖像。

圖2顯示通過定量pcr法對區(qū)域特異性基因表達(dá)的分析。six3和otx2(前腦)；en2(中腦)；gbx2(吻側(cè)后腦)；pax2和hoxa2(尾側(cè)后腦)。分別地，左側(cè)柱(cdmi)顯示不添加fgf2的條件，右側(cè)柱(+fgf2)顯示添加fgf2的條件。

圖3顯示在分化誘導(dǎo)培養(yǎng)第35天的細(xì)胞聚集體的熒光免疫組織化學(xué)染色圖像。a:n-鈣黏著蛋白(綠色)，kirrel2(紅色)。b:kirrel2(綠色)。c:kirrel2(綠色)，ptf1a(紅色)。在所有的圖像中，細(xì)胞核用dapi(藍(lán)色)復(fù)染。

圖4顯示通過抗-kirrel2抗體的facs分析。左：對照組，右：添加fgf2的組。

圖5顯示通過共同培養(yǎng)分選的kirrel2細(xì)胞與小鼠上菱唇-衍生的細(xì)胞得到的浦肯野細(xì)胞(a-e)或高爾基細(xì)胞(f)的熒光抗體染色圖像。a:l7(綠色)，鈣結(jié)合蛋白(紅色)。b:l7(綠色)。c:l7(綠色)，glurdelta2(紅色)。d:l7(綠色)，glurdelta2(紅色)。e:鈣結(jié)合蛋白(綠色)，glurdelta2(白色)，cbln1(紅色)。f:神經(jīng)顆粒蛋白(紅色)。

圖6顯示在分化誘導(dǎo)培養(yǎng)第35天細(xì)胞聚集體的熒光免疫組織化學(xué)染色圖像。a:kirrel2(綠色)，atoh1(紅色)。b:sox2(綠色)，atoh1(紅色)。c:barhl1(綠色)，atoh1(紅色)。d:zic1(綠色)，atoh1(紅色)。

圖7顯示在分化誘導(dǎo)第35天(a和b)和第53天(c)細(xì)胞聚集體的熒光免疫組織化學(xué)染色圖像。a:barhl1(綠色)，atoh1(紅色)，dapi(藍(lán)色)。b:barhl1(綠色)，atoh1(紅色)，lhx2(綠色)。c:tbr1(綠色)，smi32(紅色)。

圖8顯示在再聚集培養(yǎng)后第5天(上圖)和第8天(下圖)的熒光免疫組織化學(xué)染色圖像。a:gfp(綠色)，barhl1(白色)，map2(紅色)。b:gfp(綠色)，barhl1(白色)，map2(紅色)。c:gfp(綠色)，pax6(白色)，map2(紅色)。d:gfp(綠色)。e:pax6(白色)，map2(紅色)。f:gfp(綠色)。

圖9顯示由fgf2誘導(dǎo)的兩個(gè)結(jié)構(gòu)不同的kirrel2+/n-鈣黏著蛋白+神經(jīng)上皮(ne)的免疫組織化學(xué)分析。a:小玫瑰花結(jié)樣ne。n-鈣黏著蛋白(綠色)，kirrel2(紅色)。b:扁平-卵形連續(xù)的ne。n-鈣黏著蛋白(綠色)，kirrel2(紅色)。c:顯示添加fgf19時(shí)具有小玫瑰花結(jié)ne的細(xì)胞聚集體和具有扁平-卵形連續(xù)的ne的細(xì)胞聚集體的比例的圖表。

圖10顯示在分化誘導(dǎo)培養(yǎng)第35天細(xì)胞聚集體的熒光抗體染色圖像。a:kirrel2(綠色)，ptf1a(紅色)。b:kirrel2(綠色)，skor2(白色)，dapi(藍(lán)色)。c:kirrel2(紅色)，nkx6.1(白色)，dapi(藍(lán)色)。d:kirrel2(綠色)，nestin(白色)，nkx6.1(紅色)。e:kirrel2(綠色)，foxa2(白色)，nkx6.1(紅色)，dapi(藍(lán)色)。

圖11是顯示人es細(xì)胞衍生的神經(jīng)上皮和胚胎小鼠菱腦原節(jié)1的背腹軸的示意圖。

圖12顯示在培養(yǎng)第35天(左側(cè)和中間)細(xì)胞聚集體的熒光免疫組織化學(xué)染色圖像和通過定量pcr法進(jìn)行的atoh1基因表達(dá)分析(右側(cè))。atoh1(紅色)，dapi(藍(lán)色)。

圖13顯示在人es細(xì)胞聚集體中神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)的自形成。pkcζ(綠色)，n-鈣黏著蛋白(紅色)。

圖14顯示在關(guān)于通過sdf1處理形成小腦組織的檢測中在培養(yǎng)第35天細(xì)胞聚集體的熒光抗體染色。a:kirrel2(綠色)。b:pkc(綠色)，sox2(紅色)。c:kirrel2(綠色)，skor2(紅色)。d:sox2(紅色)，ph3(白色)。e:kirrel2(綠色)，atoh1(紅色)。f:barhl1(綠色)，atoh1(紅色)。g:kirrel2(綠色)，ptf1a(紅色)。h:sox2(綠色)，oligo2(紅色)，lhx5(白色)。i:oligo2(紅色)，sox2(白色)。j:barhl1(綠色)，sox2(白色)。k:kirrel2(綠色)，atoh1(紅色)。l:kirrel2(綠色)，atoh1(紅色)，barhl1(白色)。

圖15是分別顯示在兩份報(bào)道中具有通過fgf19和另外的sdf1誘導(dǎo)的rl-樣結(jié)構(gòu)的極化的小腦ne和連續(xù)的ne的自組織的示意圖。svz:腦室下區(qū)，vz:腦室區(qū)。

圖16顯示浦肯野細(xì)胞的電生理特性特征，所述特征在由人多能干細(xì)胞聚集體誘導(dǎo)的浦肯野細(xì)胞中觀察到。

[實(shí)施方案描述]

(1)多能干細(xì)胞

“多能干細(xì)胞”是指具有分化成組成身體的所有細(xì)胞的潛能(多能性)和經(jīng)由細(xì)胞分裂產(chǎn)生具有相同的分化能力的子細(xì)胞的潛能(自我復(fù)制能力)的細(xì)胞。

多能性可以通過將評價(jià)靶標(biāo)的細(xì)胞移植到裸鼠中并且檢測是否存在包含三個(gè)胚層(外胚層、中胚層、內(nèi)胚層)的每種細(xì)胞的畸胎瘤的形成來評價(jià)。

多能干細(xì)胞的實(shí)例包括胚胎干細(xì)胞(es細(xì)胞)、胚胎生殖細(xì)胞(eg細(xì)胞)、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(ips細(xì)胞)等，并且多能干細(xì)胞沒有限制，只要其具有多能性和自我復(fù)制能力二者即可。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。

例如，胚胎干細(xì)胞(es細(xì)胞)可以通過培養(yǎng)預(yù)植入的早期胚胎、構(gòu)成早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、單個(gè)卵裂球等而建立(manipulatingthemouseembryoalaboratorymanual(操作小鼠胚胎實(shí)驗(yàn)室手冊)，第二版，coldspringharborlaboratorypress(1994)；thomson，j.a.等人，science，282，1145-1147(1998))。作為早期胚胎，可以使用通過對體細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行核移植制備的早期胚胎(wilmut等人(nature，385，810(1997))，cibelli等人(science，280，1256(1998))，akirairitani等人(tanpakushitsukakusankoso，44，892(1999))，baguisi等人(naturebiotechnology，17，456(1999))，wakayama等人(nature，394，369(1998)；naturegenetics，22，127(1999)；proc.natl.acad.sci.usa，96，14984(1999))，rideoutiii等人(naturegenetics，24，109(2000)，tachibana等人(humanembryonicstemcellsderivedbysomaticcellnucleartransfer(通過體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移獲得的人胚胎干細(xì)胞)，cell(2013)，出版中))。作為早期胚胎，還可以使用單性生殖胚(kim等人(science，315，482-486(2007))，nakajima等人(stemcells，25，983-985(2007))，kim等人(cellstemcell，1，346-352(2007))，revazova等人(cloningstemcells，9，432-449(2007))，revazova等人(cloningstemcells，10，11-24(2008))。

用于本發(fā)明方法的胚胎干細(xì)胞中還包括通過將es細(xì)胞與體細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合獲得的融合es細(xì)胞。

胚胎干細(xì)胞可從適當(dāng)?shù)臋C(jī)構(gòu)獲得，并且可以購買商業(yè)產(chǎn)品。例如，人胚胎干細(xì)胞khes-1、khes-2和khes-3可從京都大學(xué)(kyotouniversity)的前沿醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所(instituteforfrontiermedicalsciences)獲得。

胚胎生殖細(xì)胞(eg細(xì)胞)可以通過在lif、bfgf和scf存在下培養(yǎng)原生殖細(xì)胞而建立(matsui等人，cell，70，841-847(1992)，shamblott等人，proc.natl.acad.sci.usa，95(23)，13726-13731(1998)，turnpenny等人，stemcells，21(5)，598-609，(2003))。

誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(ips細(xì)胞)是指通過使體細(xì)胞(例如，成纖維細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)與核重編程因子(nuclearreprogrammingfactor)接觸而人工獲得多能性和自我復(fù)制能力的細(xì)胞。通過包括向體細(xì)胞(例如，成纖維細(xì)胞、皮膚細(xì)胞等)中引入由oct3/4、sox2、klf4和c-myc構(gòu)成的核重編程因子的方法首次發(fā)現(xiàn)ips細(xì)胞(cell，126:第663-676頁，2006)。此后，多名研究者已經(jīng)在重編程因子的組合和所述因子的引入方法方面進(jìn)行了多種改進(jìn)，并且已經(jīng)報(bào)道了多種誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的制備方法。

所述核重編程因子可以用任意物質(zhì)配置，諸如蛋白質(zhì)因子或編碼其的核酸(包括結(jié)合在載體中的形式)或低分子化合物，只要其是能夠由諸如成纖維細(xì)胞的體細(xì)胞誘導(dǎo)具有多能性和自我復(fù)制能力的細(xì)胞的物質(zhì)即可。當(dāng)所述核重編程因子是蛋白質(zhì)因子或編碼其的核酸時(shí)，優(yōu)選的核重編程因子由以下組合示例(以下，僅顯示蛋白質(zhì)因子的名稱)：

(1)oct3/4，klf4，sox2，c-myc(其中sox2可被sox1、sox3、sox15、sox17或sox18替換。klf4可被klf1、klf2或klf5替換。此外，c-myc可被t58a(活性形式突變體)、n-myc或l-myc替換。)

(2)oct3/4，klf4，sox2

(3)oct3/4，klf4，c-myc

(4)oct3/4，sox2，nanog，lin28

(5)oct3/4，klf4，c-myc，sox2，nanog，lin28

(6)oct3/4，klf4，sox2，bfgf

(7)oct3/4，klf4，sox2，scf

(8)oct3/4，klf4，c-myc，sox2，bfgf

(9)oct3/4，klf4，c-myc，sox2，scf

在這些組合中，當(dāng)考慮將獲得的ips細(xì)胞用于治療應(yīng)用時(shí)，優(yōu)選的是oct3/4、sox2和klf4三種因子的組合。另一方面，當(dāng)不考慮將ips細(xì)胞用于治療應(yīng)用時(shí)(例如，用作藥物發(fā)現(xiàn)篩選等的研究工具)，優(yōu)選的是由oct3/4、klf4、sox2和c-myc組成的四種因子，或向其加入lin28或nanog的5種因子。

ips細(xì)胞優(yōu)選地用于自體移植。

通過由已知的遺傳工程方法修飾染色體中的基因而獲得的多能干細(xì)胞也可以用于本發(fā)明。所述多能干細(xì)胞可以是這樣的細(xì)胞，其中已經(jīng)通過已知方法以符合讀碼框的(in-frame)方式在編碼分化標(biāo)記物的基因中敲入標(biāo)記基因(例如，熒光蛋白，如gfp等)，所述細(xì)胞可以通過使用所述標(biāo)記基因的表達(dá)作為指標(biāo)而被鑒定為已經(jīng)達(dá)到相應(yīng)的分化階段。

可以使用溫血動物多能干細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動物多能干細(xì)胞作為多能干細(xì)胞。例如，哺乳動物包括實(shí)驗(yàn)室動物，包括嚙齒動物，如小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠，和兔；家畜動物，如豬、牛、山羊、馬和綿羊；陪伴動物，如狗和貓；靈長類動物，如人、猴、猩猩和黑猩猩。多能干細(xì)胞優(yōu)選是嚙齒動物(小鼠、大鼠等)或靈長類動物(人等)的多能干細(xì)胞，并且最優(yōu)選是人多能干細(xì)胞。

多能干細(xì)胞可以通過本身已知的方法培養(yǎng)來維持。例如，從臨床應(yīng)用方面來看，優(yōu)選地通過使用血清替代品(如knockout^tm血清替代物(knockout^tmserumreplacement，ksr))的無血清培養(yǎng)或不含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)維持多能干細(xì)胞。

用于本發(fā)明的多能干細(xì)胞優(yōu)選是分離的?！胺蛛x的”意指已經(jīng)進(jìn)行去除靶細(xì)胞或成分之外的因子的操作，并且所述細(xì)胞或成分不再以天然狀態(tài)存在?！胺蛛x的人多能干細(xì)胞”的純度(人多能干細(xì)胞的數(shù)目占總細(xì)胞數(shù)目的百分比)通常不小于70％，優(yōu)選地不小于80％，更優(yōu)選地不小于90％，進(jìn)一步優(yōu)選地不小于99％，最優(yōu)選100％。

(2)多能干細(xì)胞聚集體的形成

可以通過在不粘附于培養(yǎng)容器的條件下培養(yǎng)(即，懸浮培養(yǎng))分散的多能干細(xì)胞并且組裝多個(gè)多能干細(xì)胞以允許聚集體形成，而獲得多能干細(xì)胞聚集體。

用于聚集體形成的培養(yǎng)容器沒有特別限制，并且其實(shí)例包括燒瓶、組織培養(yǎng)瓶、平皿、培養(yǎng)皿、組織培養(yǎng)皿、多重平皿(multi-dishes)、微量板、微孔板、微孔、多重板(multi-plates)、多孔板(384孔，192孔，96孔，48孔，24孔等)、室載玻片(chamberslide)、碗(schale)、管、托盤、培養(yǎng)袋和旋轉(zhuǎn)瓶。為了允許在非貼壁條件下的培養(yǎng)，培養(yǎng)容器優(yōu)選是非細(xì)胞粘附的。可用的非細(xì)胞粘附培養(yǎng)容器包括其表面被人工處理成非細(xì)胞粘附的培養(yǎng)容器、其表面沒有進(jìn)行用于改善細(xì)胞粘附性的人工處理(例如，利用胞外基質(zhì)的包被處理等)的培養(yǎng)容器。

多孔板、微孔、室載玻片、管等的底部形狀優(yōu)選是u型底或v型底，更優(yōu)選是v型底，從而促使分散的多能干細(xì)胞沉淀在一個(gè)點(diǎn)上。v型底容器是指具有帶斜面的底表面的容器，其中所述斜面在整個(gè)底表面上形成均勻的傾斜角(例如，從水平面起30-60°)。

用于聚集體形成的培養(yǎng)基可以使用用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基來制備。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基沒有特別限制，只要其可以用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞即可，并且可以是bme培養(yǎng)基，bgjb培養(yǎng)基，cmrl1066培養(yǎng)基，glasgowmem培養(yǎng)基，改良的mem鋅選擇培養(yǎng)基(improvedmemzincoptionmedium)，imdm培養(yǎng)基，medium199培養(yǎng)基，eaglemem培養(yǎng)基，αmem培養(yǎng)基，dmem培養(yǎng)基，ham培養(yǎng)基，ham’sf-12培養(yǎng)基，rpmi1640培養(yǎng)基，fischer’s培養(yǎng)基，neurobasal培養(yǎng)基，其混合培養(yǎng)基等。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用imdm培養(yǎng)基與ham’sf-12培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)基。例如，混合比例為imdm:ham’sf-12＝0.8-1.2:1.2-0.8(體積比)。

用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以是含有血清的培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基。所述無血清培養(yǎng)基意指不含未調(diào)節(jié)的或未純化的血清的培養(yǎng)基。含有純化的來源于血液的成分和來源于動物組織的成分(例如，生長因子)的培養(yǎng)基對應(yīng)于無血清培養(yǎng)基。為了避免化學(xué)上未確定的成分的污染，在本發(fā)明中優(yōu)選使用無血清培養(yǎng)基。

用于聚集體形成的培養(yǎng)基可以包含血清替代品。例如，所述血清替代品可以是適當(dāng)?shù)匕宓鞍?、運(yùn)鐵蛋白、脂肪酸、膠原蛋白前體、痕量元素、2-巰基乙醇或3’-硫代甘油或其等價(jià)物等的替代品。例如，這樣的血清替代品可以通過wo98/30679中所述的方法制備。為了促使本發(fā)明的方法更容易實(shí)施，可以使用商購的血清替代品。所述商購血清替代品的實(shí)例包括敲除血清替代物(knockoutserumreplacement，ksr，由lifetechnologies制備)、化學(xué)成分確定的濃縮脂質(zhì)(chemically-definedlipidconcentrated，由lifetechnologies制備)。

用于聚集體形成的培養(yǎng)基可以包含其他添加劑，只要對多能干細(xì)胞向小腦或其祖先組織的分化誘導(dǎo)沒有不利影響即可。添加劑的實(shí)例包括，但不限于，胰島素、鐵源(例如，運(yùn)鐵蛋白等)、礦物質(zhì)(例如，硒酸鈉等)、糖(例如，葡萄糖等)、脂質(zhì)(例如，膽固醇等)、有機(jī)酸(例如，丙酮酸、乳酸等)、血清蛋白(例如，清蛋白等)、氨基酸(例如，l-谷氨酰胺等)、還原劑(例如，2-巰基乙醇、單硫代甘油等)、維生素(例如，抗壞血酸、d-生物素等)、抗生素(例如，鏈霉素、青霉素、慶大霉素等)、緩沖劑(例如，hepes等)等。

用于聚集體形成的培養(yǎng)基可以優(yōu)選地是用于下文提到的步驟(i)的培養(yǎng)基。

為了形成多能干細(xì)胞聚集體，自傳代培養(yǎng)物收集多能干細(xì)胞，并且分散成單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)或接近單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)。將多能干細(xì)胞用適當(dāng)?shù)募?xì)胞離散溶液分散。所述細(xì)胞離散溶液的實(shí)例包括edta；蛋白酶，如胰蛋白酶、膠原酶iv和金屬蛋白酶等，它們單獨(dú)使用或者以適當(dāng)?shù)慕M合使用。這些中，優(yōu)選的是顯示低細(xì)胞毒性的那種，并且此種細(xì)胞離散溶液的實(shí)例包括商購的產(chǎn)品，如dispase(eidia)，tryple(lifetechnologies)，和accutase(millipore)。分散的多能干細(xì)胞被懸浮在上述培養(yǎng)基中。

為了抑制由分散引起的多能干細(xì)胞(特別是人多能干細(xì)胞)的細(xì)胞死亡，優(yōu)選的是自培育開始起就加入rho相關(guān)卷曲螺旋激酶(rock)的抑制劑(jp-a-2008-99662)。盡管添加rock抑制劑的期間沒有特別限制，只要可以抑制多能干細(xì)胞的細(xì)胞死亡即可，例如，其在自培育開始起的15天的期間內(nèi)加入。rock抑制劑的實(shí)例包括y-27632((+)-(r)-反式-4-(1-氨基乙基)-n-(4-吡啶基)環(huán)己烷甲酰胺二鹽酸鹽)等。用于懸浮培養(yǎng)的rock抑制劑的濃度是能夠抑制由分散引起的多能干細(xì)胞的細(xì)胞死亡的濃度。例如，對于y-27632，該濃度通常為約0.1-200μm，優(yōu)選地約2-50μm。rock抑制劑的濃度在其添加期間可以變化，例如，在后半階段濃度可以減半。

為了抑制由分散引起的多能干細(xì)胞(特別是人多能干細(xì)胞)的細(xì)胞死亡，可以將rock抑制劑添加到前述細(xì)胞解離溶液中，并且可以在存在rock抑制劑的條件下分散多能干細(xì)胞。

將分散的多能干細(xì)胞的懸浮液接種到上述培養(yǎng)容器中，并且將分散的多能干細(xì)胞在不粘附細(xì)胞培養(yǎng)容器的條件下培養(yǎng)，由此多個(gè)多能干細(xì)胞組裝形成聚集體。在該情形中，分散的多能干細(xì)胞可以被接種到比較大的培養(yǎng)容器(如10-cm平皿)中，以在一個(gè)培養(yǎng)隔室中同時(shí)形成多個(gè)多能干細(xì)胞聚集體。然而，聚集體的尺寸，以及所述聚集體中包含的多能干細(xì)胞的數(shù)量可以寬泛地變化，并且所述變化可能引起聚集體之間多能干細(xì)胞向小腦或其祖先組織的分化水平的差異，這又可能降低分化誘導(dǎo)的效率。因此，優(yōu)選的是快速地使分散的多能干細(xì)胞團(tuán)聚以在一個(gè)培養(yǎng)隔室中形成一個(gè)聚集體。用于快速地使分散的多能干細(xì)胞團(tuán)聚的方法的實(shí)例包括下述方法：

(1)包括將分散的多能干細(xì)胞裝入具有比較小的體積(例如，不大于1ml，不大于500μl，不大于200μl，不大于100μl)的培養(yǎng)隔室中以在所述隔室中形成一個(gè)聚集體的方法。優(yōu)選地，在裝入所述分散的多能干細(xì)胞后，將所述培養(yǎng)隔室靜置。所述培養(yǎng)隔室的實(shí)例包括，但不限于，多孔板(384-孔，192-孔，96-孔，48-孔，24-孔等)中的孔，微孔，室載玻片等；管；懸滴法中的培養(yǎng)基的液滴。由于重力，裝在所述隔室中的分散的多能干細(xì)胞沉淀于一點(diǎn)上，或者細(xì)胞彼此粘附從而在一個(gè)培養(yǎng)隔室中形成一個(gè)聚集體。多壁板、微孔、室載玻片、管等的底部的形狀優(yōu)選是u型底或v型底，最優(yōu)選是v型底，以促使分散的多能干細(xì)胞沉淀于一點(diǎn)。

(2)包括將分散的多能干細(xì)胞放置在離心管中，將其離心以允許多能干細(xì)胞沉淀于一點(diǎn)上，由此在管中形成一個(gè)聚集體的方法。

要接種在一個(gè)培養(yǎng)隔室中的多能干細(xì)胞的數(shù)量沒有特別的限制，只要每個(gè)培養(yǎng)隔室形成一個(gè)聚集體，并且可以通過本發(fā)明的方法在所述聚集體中誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向小腦或其祖先組織的分化。通常，在一個(gè)培養(yǎng)隔室中接種約1×10³-約5×10⁴個(gè)，優(yōu)選約1×10³-約2×10⁴個(gè)，更優(yōu)選約2×10³-約1.2×10⁴個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選地約5×10³-約7×10³個(gè)(例如，6000個(gè))多能干細(xì)胞。然后，通過快速地使多能干細(xì)胞團(tuán)聚，每個(gè)培養(yǎng)隔室形成通常由約1×10³-約5×10⁴個(gè)、優(yōu)選約1×10³-約2×10⁴個(gè)、更優(yōu)選約2×10³-約1.2×10⁴個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選地約5×10³-約7×10³個(gè)(例如，6000個(gè))多能干細(xì)胞構(gòu)成的一個(gè)細(xì)胞聚集體。

可以適當(dāng)?shù)卮_定至聚集體形成的時(shí)間，只要每個(gè)隔室形成一個(gè)聚集體，并且可以通過本發(fā)明的方法在所述聚集體中誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向小腦或其祖先組織的分化。通過縮短所述時(shí)間，預(yù)期向目標(biāo)小腦或其祖先組織的分化的有效誘導(dǎo)，并且，因此，所述時(shí)間優(yōu)選更短。優(yōu)選地，在24小時(shí)內(nèi)形成多能干細(xì)胞聚集體，更優(yōu)選地，在12小時(shí)內(nèi)形成，更優(yōu)選地在6小時(shí)內(nèi)形成，最優(yōu)選地在2–3小時(shí)內(nèi)形成?？梢酝ㄟ^由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇用于細(xì)胞聚集的工具、離心條件等來適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)至聚集體形成的時(shí)間。

可以適當(dāng)?shù)卦O(shè)定其他培養(yǎng)條件，如聚集體形成時(shí)的培養(yǎng)溫度和co2濃度。培養(yǎng)溫度沒有特別限制，并且，例如，是約30-40℃，優(yōu)選地約37℃。例如，co2濃度是約1-10％，優(yōu)選約5％。

此外，準(zhǔn)備多個(gè)在相同培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)隔室，并且在每個(gè)培養(yǎng)隔室中形成一個(gè)多能干細(xì)胞聚集體，由此可以獲得多能干細(xì)胞聚集體的質(zhì)量均一的群體。多能干細(xì)胞聚集體是否是質(zhì)量均一的可以基于下述進(jìn)行評價(jià)：聚集體團(tuán)塊的尺寸和其中的細(xì)胞數(shù)量，通過組織染色分析的其宏觀形態(tài)學(xué)、微觀形態(tài)學(xué)和同質(zhì)性，分化和不分化標(biāo)記物的表達(dá)及其同質(zhì)性，分化標(biāo)記物表達(dá)的調(diào)節(jié)及其同步性，聚集體間分化效率的重現(xiàn)性等。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法的多能干細(xì)胞聚集體的群體在所述聚集體中包含均一數(shù)量的多能干細(xì)胞。特定參數(shù)“均一”的多能干細(xì)胞聚集體的群體意指在其群體中的總聚集體的不低于90％落在所述聚集體群體中該參數(shù)的平均數(shù)±10％、優(yōu)選±5％的范圍內(nèi)。

(3)誘導(dǎo)小腦祖先組織

本發(fā)明提供用于制備包含小腦祖先組織的人細(xì)胞聚集體的方法，所述方法包括將多能干細(xì)胞聚集體在包含胰島素的無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，并且，在所述懸浮培養(yǎng)中，用rock抑制劑、tgfβ信號抑制劑和第一成纖維細(xì)胞生長因子處理所述人多能干細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體。

小腦祖先組織的實(shí)例包括，但不限于，中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織；小腦板組織；其部分組織(例如，腦室區(qū)，菱唇)等。所述中腦-后腦邊界是在胚胎發(fā)生過程中控制中腦和后腦前部發(fā)育的形成體。中腦-后腦邊界可以通過中腦-后腦邊界標(biāo)記的表達(dá)來鑒定。關(guān)于中腦-后腦邊界標(biāo)記，可以提及en2(中腦標(biāo)記)、gbx2(吻側(cè)后腦標(biāo)記)等。中腦-后腦邊界包含選自由下述組成的組的至少一種：en2陽性神經(jīng)祖先細(xì)胞和gbx2陽性神經(jīng)祖先細(xì)胞，優(yōu)選兩種細(xì)胞。所述神經(jīng)祖先細(xì)胞可以鑒定為n-鈣黏著蛋白陽性細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，中腦-后腦邊界是en2陽性和/或gbx2陽性神經(jīng)祖先組織。小腦板組織的定義在下文中提及。

在本發(fā)明中，組織是指具有這樣的結(jié)構(gòu)的細(xì)胞群體的結(jié)構(gòu)：其中具有不同形式和特性的多種細(xì)胞以特定的樣式立體排列。

本發(fā)明的制備方法特別包括將多能干細(xì)胞聚集體在包含胰島素的無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，并且，在所述懸浮培養(yǎng)中，用rock抑制劑、tgfβ信號抑制劑和第一成纖維細(xì)胞生長因子處理所述人多能干細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體，從而得到包含中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的細(xì)胞聚集體(步驟(i))。當(dāng)需要進(jìn)一步的小腦分化進(jìn)程時(shí)，將在步驟(i)中得到的包含中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的細(xì)胞聚集體進(jìn)一步在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，以誘導(dǎo)所述神經(jīng)祖先組織中的神經(jīng)祖先細(xì)胞形成神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)，由此得到包含小腦板組織的人細(xì)胞聚集體(步驟(ii))。在步驟(i)中，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織分化，并且在步驟(ii)中，誘導(dǎo)中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織向小腦板組織的進(jìn)一步分化。

由于在本發(fā)明的方法中在細(xì)胞聚集體中誘導(dǎo)小腦祖先組織的自組織，包含在所述細(xì)胞聚集體中的小腦祖先組織的分化階段隨著時(shí)間進(jìn)展繼續(xù)進(jìn)行。因此，培養(yǎng)期間和培養(yǎng)條件優(yōu)選地按照目的小腦祖先組織的分化階段適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行調(diào)節(jié)。

(3.1)步驟(i)

在步驟(i)中，將多能干細(xì)胞聚集體在包含胰島素的無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，并且在懸浮培養(yǎng)中，用rock抑制劑、tgfβ信號抑制劑和第一成纖維細(xì)胞生長因子處理所述多能干細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體。

多能干細(xì)胞聚集體的“懸浮培養(yǎng)”是指在不粘附于培養(yǎng)容器的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞聚集體。

用于懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基包含胰島素。培養(yǎng)基中胰島素的濃度可以在能夠在所述細(xì)胞聚集體中誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織分化的范圍內(nèi)適當(dāng)?shù)卮_定。其濃度通常不小于0.1μg/ml，優(yōu)選不小于1μg/ml。盡管上限沒有特別設(shè)定，只要對向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的分化沒有不利影響即可，但是，從培養(yǎng)成本方面來看，其通常不超過100μg/ml，優(yōu)選不超過20μg/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中胰島素的濃度通常為0.1-100μg/ml，優(yōu)選1-20μg/ml(例如，7μg/ml)。由于胰島素特別有助于促進(jìn)多能干細(xì)胞或源自其的細(xì)胞的分化，其以能夠?qū)崿F(xiàn)這一效果的濃度包含在培養(yǎng)基中。

用于懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以使用用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基來制備。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基沒有特別限制，只要其可以用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞即可，并且可以是bme培養(yǎng)基，bgjb培養(yǎng)基，cmrl1066培養(yǎng)基，glasgowmem培養(yǎng)基，改良的mem鋅選擇培養(yǎng)基，imdm培養(yǎng)基，medium199培養(yǎng)基，eaglemem培養(yǎng)基，αmem培養(yǎng)基，dmem培養(yǎng)基，ham培養(yǎng)基，ham’sf-12培養(yǎng)基，rpmi1640培養(yǎng)基，fischer’s培養(yǎng)基，neurobasal培養(yǎng)基，其混合培養(yǎng)基等。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用imdm培養(yǎng)基與ham’sf-12培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)基。例如，混合比例為imdm:ham’sf-12＝0.8-1.2:1.2-0.8(體積比)。

為了避免化學(xué)上未確定的成分的污染，優(yōu)選使用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

用于細(xì)胞聚集體懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以包含血清替代品。例如，所述血清替代品可以是適當(dāng)?shù)匕宓鞍?、運(yùn)鐵蛋白、脂肪酸、痕量元素、2-巰基乙醇或3’-硫代甘油或其等價(jià)物等的替代品。例如，這樣的血清替代品可以通過wo98/30679中所述的方法制備。為了促使本發(fā)明的方法更容易實(shí)施，可以使用商購的血清替代品。所述商購血清替代品的實(shí)例包括化學(xué)成分確定的濃縮脂質(zhì)(由lifetechnologies制備)。優(yōu)選包含化學(xué)確定的成分的血清替代品。另外，優(yōu)選不包含由不同于要培養(yǎng)的細(xì)胞的動物物種的動物分離的成分(異種動物來源的成分)(例如，當(dāng)培養(yǎng)人細(xì)胞時(shí)，從非人動物分離的成分)的血清替代品。由于化學(xué)成分不確定的血清替代品和包含異種動物來源的成分的血清替代品(例如，ksr(敲除血清替代物))可能抑制多能干細(xì)胞向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的分化誘導(dǎo)，不優(yōu)選它們的使用。

用于細(xì)胞聚集體懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以包含其他添加劑，只要對多能干細(xì)胞向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的分化誘導(dǎo)沒有不利影響即可。添加劑的實(shí)例包括，但不限于，鐵源(例如，運(yùn)鐵蛋白等)、礦物質(zhì)(例如，硒酸鈉等)、糖(例如，葡萄糖等)、脂質(zhì)(例如，膽固醇等)、有機(jī)酸(例如，丙酮酸、乳酸等)、血清蛋白(例如，清蛋白等)、氨基酸(例如，l-谷氨酰胺等)、還原劑(例如，2-巰基乙醇、單硫代甘油等)、維生素(例如，抗壞血酸、d-生物素等)、抗生素(例如，鏈霉素、青霉素、慶大霉素等)、緩沖劑(例如，hepes等)等。

在一個(gè)實(shí)施方案中，為了避免對向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織分化誘導(dǎo)的不利影響，用于細(xì)胞聚集體懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基需要除了本說明書中特別描述包含在培養(yǎng)基中的那些之外不含生長因子。此處，“生長因子”包括模式形成因子(patternformationfactor)，如fgf；bmp；wnt，nodal，notch和shh；富脂質(zhì)清蛋白；細(xì)胞外基質(zhì)。不含生長因子的培養(yǎng)基的實(shí)例包括wataya等人，procnatlacadsciusa，105(33):11796-11801，2008中公開的gfcdm。

為了避免化學(xué)成分未確定的成分的污染，用于懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)選是成分化學(xué)確定的培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，用于懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基不包含異種動物來源的成分。

用于細(xì)胞聚集體懸浮培養(yǎng)的其他培養(yǎng)條件下，諸如培養(yǎng)溫度、co2濃度和o2濃度，可以適當(dāng)設(shè)定。例如，培養(yǎng)溫度是約30-40℃，優(yōu)選約37℃。co2濃度例如是約1-10％，優(yōu)選約5％。o2濃度例如是約20％。

在步驟(i)的懸浮培養(yǎng)中，細(xì)胞聚集體的懸浮培養(yǎng)可以在存在或不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下進(jìn)行，只要可以通過本發(fā)明的方法誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向小腦祖先組織的分化即可。為了避免未確定因子的污染，細(xì)胞聚集體的懸浮培養(yǎng)優(yōu)選地在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下進(jìn)行。

作為可以用于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集體的容器，可以提及上文(2)中作為可以用于形成多能干細(xì)胞聚集體的容器引用的那些。為了使細(xì)胞聚集體穩(wěn)定地位于一個(gè)位置并且避免聚集體的瓦解，容器的底部優(yōu)選是u型底或v型底，更優(yōu)選是v型底。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將多能干細(xì)胞聚集體的質(zhì)量均一的群體在包含胰島素的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。使用多能干細(xì)胞聚集體的質(zhì)量均一的群體，可以將聚集體之間向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的分化水平的差異抑制至最小程度，并且可以提高目標(biāo)分化誘導(dǎo)的效率。多能干細(xì)胞聚集體的質(zhì)量均一的群體的懸浮培養(yǎng)包括以下實(shí)施方案：

(1)準(zhǔn)備多個(gè)培養(yǎng)隔室，并且接種多能干細(xì)胞聚集體的質(zhì)量均一的群體，以使在一個(gè)培養(yǎng)隔室中包含一個(gè)多能干細(xì)胞聚集體(例如，在96孔板的每個(gè)孔中放置一個(gè)多能干細(xì)胞聚集體)。在每個(gè)培養(yǎng)隔室中，將一個(gè)多能干細(xì)胞聚集體在包含胰島素的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。

(2)接種多能干細(xì)胞聚集體的質(zhì)量均一的群體，以使在一個(gè)培養(yǎng)隔室中包含多個(gè)多能干細(xì)胞聚集體(例如，在10cm的平皿中放置多個(gè)多能干細(xì)胞聚集體)。在所述培養(yǎng)隔室中，將多個(gè)多能干細(xì)胞聚集體在包含胰島素的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。

可以將實(shí)施方案(1)和(2)中任一個(gè)用于本發(fā)明的方法，并且在培養(yǎng)過程中可以改變實(shí)施方案(從實(shí)施方案(1)到實(shí)施方案(2)，或從實(shí)施方案(2)到實(shí)施方案(1))。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(i)中用實(shí)施方案(1)，并且在步驟(ii)中用實(shí)施方案(2)。

在步驟(i)中，在上文提及的懸浮培養(yǎng)中，用rock抑制劑、tgfβ信號抑制劑和第一成纖維細(xì)胞生長因子處理多能干細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體。用這些因子處理所述細(xì)胞聚集體可以通過向懸浮培養(yǎng)中添加rock抑制劑、tgfβ信號抑制劑和第一成纖維細(xì)胞生長因子并且使所述多能干細(xì)胞聚集體或源自其的細(xì)胞聚集體與培養(yǎng)基中的所述rock抑制劑、tgfβ信號抑制劑和第一成纖維細(xì)胞生長因子接觸而實(shí)現(xiàn)。

rho相關(guān)卷曲螺旋激酶(rock)抑制劑具有抑制由分散誘發(fā)的多能干細(xì)胞(特別是人多能干細(xì)胞)的細(xì)胞死亡和支持生長的作用。關(guān)于rock抑制劑，一些化合物是已知的(例如，ishizaki等人，mol.pharmacol.57，976-983(2000)和narumiya等人，methodsenzymol.325，273-284(2000))。具體地，關(guān)于rock抑制劑，可以提及y-27632((+)-(r)-反式-4-(1-氨基乙基)-n-(4-吡啶基)環(huán)己烷甲酰胺)(優(yōu)選地，二鹽酸鹽)；法舒地爾(fasudil)(5-(1-高哌嗪基)磺?；愢?(優(yōu)選地，鹽酸鹽)；h-1152((s)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-異喹啉基)磺?；鵠-六氫-1h-1,4-二氮雜)(優(yōu)選地，二鹽酸鹽)等。所述rock抑制劑優(yōu)選是y-27632。

用rock抑制劑處理細(xì)胞聚集體的時(shí)機(jī)和持續(xù)時(shí)間沒有特別限制，只要能夠抑制由分散誘發(fā)的多能干細(xì)胞的細(xì)胞死亡并且多能干細(xì)胞向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的分化是可能的即可。為了有效地抑制由分散誘發(fā)的多能干細(xì)胞的細(xì)胞死亡，優(yōu)選在自多能干細(xì)胞聚集體的懸浮培養(yǎng)開始起的2小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選在自懸浮培養(yǎng)開始起的0.5小時(shí)內(nèi)，進(jìn)一步優(yōu)選自懸浮培養(yǎng)開始起，將rock抑制劑添加到培養(yǎng)基中，從而用所述rock抑制劑處理所述細(xì)胞聚集體。使用rock抑制劑的處理時(shí)期通常不小于12小時(shí)，優(yōu)選不小于2、4或7天。使用rock抑制劑處理時(shí)期的上限沒有特別設(shè)定，只要多能干細(xì)胞向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的分化是可能的即可。為了避免對分化的不可預(yù)料的不利影響，其通常在21天內(nèi)，優(yōu)選在14天內(nèi)。在使用rock抑制劑的處理時(shí)期過去后，從培養(yǎng)基中去除所述rock抑制劑。在使用rock抑制劑處理期間rock抑制劑在培養(yǎng)基中的濃度是能夠抑制由分散誘發(fā)的多能干細(xì)胞的細(xì)胞死亡的濃度。例如，對于y-27632，該濃度通常為約0.1至200μm，優(yōu)選約2至50μm。在處理期間內(nèi)，rock抑制劑的濃度可以變化。例如，在后半階段濃度可以減半。

tgfβ信號抑制劑具有抑制多能干細(xì)胞向中胚層分化并且促進(jìn)向神經(jīng)外胚層分化的作用。tgfβ信號抑制劑沒有特別限制，只要其能夠抑制由tgfβ介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)即可。tgfβ信號抑制劑的實(shí)例包括，但不限于，sb431542(4-(5-苯并[1,3]二氧代-5-基-4-吡啶-2-基-1h-咪唑-2-基)-苯甲酰胺)，ly-364947，sb-505，a-83-01等。特別地，優(yōu)選是sb431542。

用tgfβ信號抑制劑處理所述細(xì)胞聚集體的時(shí)機(jī)和持續(xù)時(shí)間沒有特別限制，只要能夠抑制多能干細(xì)胞向中胚層的分化并且能夠促進(jìn)向神經(jīng)外胚層的分化即可。為了有效地抑制中胚層分化和有效地促進(jìn)向神經(jīng)外胚層的分化，優(yōu)選地在自多能干細(xì)胞聚集體的懸浮培養(yǎng)開始起的2小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選在自懸浮培養(yǎng)開始起的0.5小時(shí)內(nèi)，進(jìn)一步優(yōu)選自懸浮培養(yǎng)開始起，將tgfβ信號抑制劑添加到培養(yǎng)基中，從而用所述tgfβ信號抑制劑處理所述細(xì)胞聚集體。使用tgfβ信號抑制劑的處理時(shí)期通常不小于2天，優(yōu)選不小于7天。使用tgfβ信號抑制劑處理時(shí)期的上限沒有特別設(shè)定，只要多能干細(xì)胞向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的分化是可能的即可。為了避免對分化的不可預(yù)料的不利影響，其通常在21天內(nèi)，優(yōu)選在14天內(nèi)。在使用tgfβ信號抑制劑的處理時(shí)期過去后，從培養(yǎng)基中去除所述tgfβ信號抑制劑。在使用tgfβ信號抑制劑處理期間tgfβ信號抑制劑在培養(yǎng)基中的濃度是能夠抑制多能干細(xì)胞向中胚層分化并且能夠促進(jìn)向神經(jīng)外胚層分化的濃度。例如，對于sb431542，該濃度通常為約0.1至200μm，優(yōu)選約2至50μm，更優(yōu)選約10-30μm。在處理期間內(nèi)，tgfβ信號抑制劑的濃度可以變化。例如，在后半階段濃度可以減半。

第一成纖維細(xì)胞生長因子是具有促進(jìn)多能干細(xì)胞向中腦-后腦邊界分化并且抑制向前腦分化的作用的fgf。成纖維細(xì)胞生長因子沒有特別限制，只要其促進(jìn)向中腦-后腦邊界的分化即可。關(guān)于成纖維細(xì)胞生長因子(fgf)，已經(jīng)在人和小鼠中鑒定了fgf1-fgf23。由于人fgf19是小鼠fgf15的直向同源物，人和小鼠的fgf家族由22個(gè)成員組成。在本說明書中，fgf的名稱按照人fgf的命名法。所述第一成纖維細(xì)胞生長因子優(yōu)選是fgf2或fgf8，更優(yōu)選是fgf2。fgf2是一種已知的細(xì)胞因子，其還稱為堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bfgf)，并且其氨基酸序列也是已知的。用于本發(fā)明的fgf2通常是哺乳動物fgf2。哺乳動物的實(shí)例包括上文提及的那些。由于fgf2在多種哺乳動物物種之間具有交叉反應(yīng)性，也可以使用任意哺乳動物的fgf2，只要能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的即可。優(yōu)選地，使用與培養(yǎng)的細(xì)胞相同物種的哺乳動物fgf2。例如，使用嚙齒動物(小鼠、大鼠等)或靈長動物(人等)的fgf2。此處，小鼠fgf2意指fgf2具有在小鼠體內(nèi)天然表達(dá)的fgf2的氨基酸序列。在本說明書中，相似的解釋也應(yīng)用其他蛋白等。代表性的小鼠fgf2的氨基酸序列的實(shí)例包括ncbi登記號np_032032.1(2014年2月18日更新)，即通過從所述氨基酸序列去除n-端信號序列(1-9)得到的氨基酸序列(成熟的小鼠fgf2氨基酸序列)等。代表性的人fgf2的氨基酸序列的實(shí)例包括ncbi登記號np_001997.5(2014年2月18日更新)等。

用第一成纖維細(xì)胞生長因子處理細(xì)胞聚集體的時(shí)機(jī)和持續(xù)時(shí)間沒有特別限制，只要能夠促進(jìn)多能干細(xì)胞向中腦-后腦邊界的分化即可。當(dāng)將多能干細(xì)胞聚集體懸浮培養(yǎng)開始時(shí)視為第0天(d0)時(shí)，優(yōu)選在d2-d4、更優(yōu)選在d2的任意時(shí)間點(diǎn)向培養(yǎng)基中添加第一成纖維細(xì)胞生長因子，從而開始用所述第一成纖維細(xì)胞生長因子處理所述細(xì)胞聚集體。用第一成纖維細(xì)胞生長因子的處理期間通常不小于2天，優(yōu)選不小于5天。用第一成纖維細(xì)胞生長因子的處理期間的上限沒有特別設(shè)定，只要多能干細(xì)胞向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的分化是可能的即可。為了避免對分化的不可預(yù)料的不利影響，其通常在19天內(nèi)，優(yōu)選在12天內(nèi)。在使用第一成纖維細(xì)胞生長因子的處理時(shí)期過去后，從培養(yǎng)基中去除所述第一成纖維細(xì)胞生長因子。在使用第一成纖維細(xì)胞生長因子處理期間第一成纖維細(xì)胞生長因子在培養(yǎng)基中的濃度是能夠促進(jìn)多能干細(xì)胞向中腦-后腦邊界分化的濃度。盡管第一成纖維細(xì)胞生長因子還用于多能干細(xì)胞的維持培養(yǎng)，但是用于促進(jìn)向中腦-后腦邊界分化的濃度通常高于用于維持培養(yǎng)的濃度。當(dāng)使用fgf2作為第一成纖維細(xì)胞生長因子時(shí)，其在培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選不小于20ng/ml，更優(yōu)選不小于40ng/ml，進(jìn)一步優(yōu)選不小于50ng/ml。盡管fgf2濃度的上限沒有特別設(shè)定，只要沒有發(fā)現(xiàn)對向中腦-后腦邊界分化的不利影響即可，但是，從培養(yǎng)成本方面來看，其優(yōu)選不超過1000ng/ml，更優(yōu)選不超過300ng/ml，進(jìn)一步優(yōu)選不超過100ng/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中fgf2的濃度優(yōu)選為20-1000ng/ml，優(yōu)選為40-300ng/ml，進(jìn)一步優(yōu)選為50-100ng/ml。第一成纖維細(xì)胞生長因子的濃度在處理期間內(nèi)可以變化。例如，在后半階段濃度可以減半。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，從懸浮培養(yǎng)開始起直到開始用第一成纖維細(xì)胞生長因子處理時(shí)，不用第一成纖維細(xì)胞生長因子刺激細(xì)胞聚集體。即，從懸浮培養(yǎng)開始起直到開始用第一成纖維細(xì)胞生長因子處理時(shí)，用于懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)選地基本上不含第一成纖維細(xì)胞生長因子。“基本上不含第一成纖維細(xì)胞生長因子”意指培養(yǎng)基中第一成纖維細(xì)胞生長因子的濃度低于用于促進(jìn)向中腦-后腦邊界分化的濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，在自懸浮培養(yǎng)開始起到開始用第一成纖維細(xì)胞生長因子處理的期間過程中，培養(yǎng)基中第一成纖維細(xì)胞生長因子的濃度通常小于1ng/ml，優(yōu)選地小于0.1ng/ml，更優(yōu)選地小于0.01ng/ml。

在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(i)包括在懸浮培養(yǎng)中進(jìn)一步用第二成纖維細(xì)胞生長因子處理人多能干細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體。

所述第二成纖維細(xì)胞生長因子是具有對步驟(ii)中形成的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)賦予沿著神經(jīng)管的背腹軸的極性的作用的fgf，所述步驟(ii)是使用步驟(i)得到的細(xì)胞聚集體進(jìn)行的。關(guān)于所述成纖維細(xì)胞生長因子(fgf)，已經(jīng)在人和小鼠中鑒定了fgf1-fgf23。第二成纖維細(xì)胞生長因子優(yōu)選是fgf19、fgf17或fgf8，更優(yōu)選是fgf19。fgf19是已知的細(xì)胞因子，并且其氨基酸序列也是已知的。用于本發(fā)明的fgf19通常是哺乳動物fgf19。哺乳動物的實(shí)例包括上文提及的那些。也可以使用任意哺乳動物的fgf19，只要能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的即可。優(yōu)選地，使用與培養(yǎng)的細(xì)胞相同物種的哺乳動物fgf19。例如，使用嚙齒動物(小鼠、大鼠等)或靈長動物(人等)的fgf19。代表性的人fgf19的氨基酸序列的實(shí)例包括ncbi登記號np_0015108.1(2014年4月27日更新)，即通過從所述氨基酸序列去除n-端信號序列(1-22)得到的氨基酸序列(成熟的人fgf19)等。

用第二成纖維細(xì)胞生長因子處理細(xì)胞聚集體的時(shí)機(jī)和持續(xù)時(shí)間沒有特別限制，只要對神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)賦予沿著神經(jīng)管背腹軸的極性即可。當(dāng)將多能干細(xì)胞聚集體懸浮培養(yǎng)開始時(shí)視為第0天(d0)時(shí)，優(yōu)選在d10-d14、更優(yōu)選在d14的任意時(shí)間點(diǎn)向培養(yǎng)基中添加第二成纖維細(xì)胞生長因子，從而開始用所述第二成纖維細(xì)胞生長因子處理所述細(xì)胞聚集體。用第二成纖維細(xì)胞生長因子的處理期間通常不小于2天，優(yōu)選不小于4天。用第二成纖維細(xì)胞生長因子的處理期間的上限沒有特別設(shè)定，只要對神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)賦予沿著神經(jīng)管背腹軸的極性即可。為了抑制向除中腦-后腦邊界之外的結(jié)構(gòu)部分分化的可能性，其通常在14天內(nèi)，優(yōu)選在11天內(nèi)，更優(yōu)選在7天內(nèi)。在用第二成纖維細(xì)胞生長因子處理期間后，從培養(yǎng)基中取出所述第二成纖維細(xì)胞生長因子。在第二成纖維細(xì)胞生長因子處理期間內(nèi)培養(yǎng)基中第二成纖維細(xì)胞生長因子的濃度是對神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)賦予沿著神經(jīng)管背腹軸的極性的濃度。當(dāng)使用fgf19作為第二成纖維細(xì)胞生長因子時(shí)，其在培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選不小于30ng/ml，更優(yōu)選不小于40ng/ml，進(jìn)一步優(yōu)選不小于50ng/ml。盡管fgf19濃度的上限沒有特別設(shè)定，只要沒有發(fā)現(xiàn)對向中腦-后腦邊界的分化的不利作用即可，但是其優(yōu)選不超過1000ng/ml，更優(yōu)選不超過500ng/ml，更優(yōu)選不超過300ng/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中fgf2的濃度優(yōu)選為30-1000ng/ml，優(yōu)選為40-500ng/ml，更優(yōu)選為50-300ng/ml。第二成纖維細(xì)胞生長因子的濃度在處理期間可以變化。例如，在后半階段濃度可以減半。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，從懸浮培養(yǎng)開始起直到開始用第二成纖維細(xì)胞生長因子處理時(shí)，不用第二成纖維細(xì)胞生長因子刺激細(xì)胞聚集體。即，從懸浮培養(yǎng)開始起直到開始用第二成纖維細(xì)胞生長因子處理時(shí)，用于懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)選地基本上不含第二成纖維細(xì)胞生長因子?！盎旧喜缓诙衫w維細(xì)胞生長因子”意指培養(yǎng)基中第二成纖維細(xì)胞生長因子的濃度低于用于對神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)賦予沿著神經(jīng)管背腹軸的極性的濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，在自懸浮培養(yǎng)開始起到開始用第二成纖維細(xì)胞生長因子處理的期間過程中，培養(yǎng)基中第二成纖維細(xì)胞生長因子的濃度通常小于1ng/ml，優(yōu)選地小于0.1ng/ml，更優(yōu)選地小于0.01ng/ml，最優(yōu)選為0ng/ml。

用于本發(fā)明的胰島素、第一成纖維細(xì)胞生長因子和第二成纖維細(xì)胞生長因子優(yōu)選是分離的?！胺蛛x的”意指已經(jīng)進(jìn)行去除目的成分或細(xì)胞之外的因子的操作，并且所述成分或細(xì)胞不再以天然狀態(tài)存在。因此，“分離的蛋白x”不包括由培養(yǎng)的細(xì)胞或組織產(chǎn)生的內(nèi)源性蛋白x?！胺蛛x的蛋白x”的純度(蛋白x的重量占總蛋白重量的百分比)通常不小于70％，優(yōu)選地不小于80％，更優(yōu)選地不小于90％，進(jìn)一步優(yōu)選地不小于99％，最優(yōu)選為100％。包含在用于懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的分離的胰島素、第一成纖維細(xì)胞生長因子和第二成纖維細(xì)胞生長因子是外源添加到培養(yǎng)基中的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括提供分離的胰島素/分離的第一成纖維細(xì)胞生長因子/分離的第二成纖維細(xì)胞生長因子中的每一種的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，包括向步驟(i)中用于懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基中外源添加分離的胰島素/分離的第一成纖維細(xì)胞生長因子/分離的第二成纖維細(xì)胞生長因子中的每一種的步驟。

rock抑制劑、tgfβ信號抑制劑和第一成纖維細(xì)胞生長因子的優(yōu)選組合是y27632、sb431542和fgf2。

rock抑制劑、tgfβ信號抑制劑、第一成纖維細(xì)胞生長因子和第二成纖維細(xì)胞生長因子的優(yōu)選組合是y27632、sb431542、fgf2和fgf19。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(i)的懸浮培養(yǎng)中，多能干細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體自懸浮培養(yǎng)開始起用rock抑制劑處理，自懸浮培養(yǎng)開始起用tgfβ信號抑制劑處理，并且自懸浮培養(yǎng)開始后第2-4天用第一成纖維細(xì)胞生長因子處理。用rock抑制劑的處理期間是足以抑制由分散誘發(fā)的多能干細(xì)胞的細(xì)胞死亡的期間(例如，持續(xù)12小時(shí)(2天，4天，或7天)–21天(或14天))。用tgfβ信號抑制劑的處理期間是足以抑制中胚層分化并且促進(jìn)向神經(jīng)外胚層分化的期間(例如，持續(xù)2天(或7天)–21天(或14天))。用第一成纖維細(xì)胞生長因子處理的處理期間是足以促進(jìn)多能干細(xì)胞向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織分化的期間(例如，持續(xù)2天(或5天)–19天(或12天))。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(i)的懸浮培養(yǎng)中，多能干細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體自懸浮培養(yǎng)開始起用rock抑制劑處理，自懸浮培養(yǎng)開始起用tgfβ信號抑制劑處理，自懸浮培養(yǎng)開始后第2-4天用第一成纖維細(xì)胞生長因子處理，并且在懸浮培養(yǎng)開始后第10-14天用第二成纖維細(xì)胞生長因子處理。用rock抑制劑的處理期間是足以抑制由分散誘發(fā)的多能干細(xì)胞的細(xì)胞死亡的期間(例如，持續(xù)12小時(shí)(2天，4天，或7天)–21天(或14天))。用tgfβ信號抑制劑的處理期間是足以抑制中胚層分化并且促進(jìn)向神經(jīng)外胚層分化的期間(例如，持續(xù)2天(或7天)–21天(或14天))。用第一成纖維細(xì)胞生長因子處理的處理期間是足以促進(jìn)多能干細(xì)胞向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織分化的期間(例如，持續(xù)2天(或5天)–19天(或12天))。用第二成纖維細(xì)胞生長因子處理的處理期間是足以對神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)賦予沿著神經(jīng)管背腹軸的極性的期間(例如，持續(xù)2天(或4天)–14天(或11天或7天))。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，為了在上述(2)中形成多能干細(xì)胞聚集體，步驟(i)中所用的培養(yǎng)基用來形成多能干細(xì)胞的聚集體，并且在步驟(i)中繼續(xù)進(jìn)行所述聚集體的懸浮培養(yǎng)。即，將分散的多能干細(xì)胞懸浮在要用于步驟(i)的培養(yǎng)基(包含胰島素的無血清培養(yǎng)基)中，在上文提及的培養(yǎng)容器中接種所述分散的多能干細(xì)胞的混懸液，并且在不粘附所述細(xì)胞培養(yǎng)容器的條件下培養(yǎng)所述分散的多能干細(xì)胞，由此組裝多個(gè)多能干細(xì)胞形成聚集體，并且所形成的多能干細(xì)胞聚集體在該培養(yǎng)基中繼續(xù)懸浮培養(yǎng)。由于當(dāng)開始懸浮培養(yǎng)時(shí)分散的多能干細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)形成聚集體，在該實(shí)施方案中，開始培養(yǎng)所述分散的多能干細(xì)胞可以視為步驟(i)中懸浮培養(yǎng)的起始。

在一個(gè)實(shí)施方案中，分散在包含胰島素、rock抑制劑和tgfβ信號抑制劑的無血清培養(yǎng)基中的多能干細(xì)胞在培養(yǎng)容器中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而形成多能干細(xì)胞聚集體，并且將所得到的多能干細(xì)胞聚集體繼續(xù)在相同的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。在所述懸浮培養(yǎng)中，將所述多能干細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體進(jìn)一步用第一成纖維細(xì)胞生長因子(以及任選地用第二成纖維細(xì)胞生長因子)處理。

在一個(gè)實(shí)施方案中，分散在包含胰島素、rock抑制劑和tgfβ信號抑制劑的無血清培養(yǎng)基中的多能干細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而形成多能干細(xì)胞聚集體，并且將所得到的多能干細(xì)胞聚集體繼續(xù)在相同的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。在該懸浮培養(yǎng)中，自懸浮培養(yǎng)開始后第2-4天，將所述多能干細(xì)胞聚集體或源自其的細(xì)胞聚集體進(jìn)一步用第一成纖維細(xì)胞生長因子處理。用rock抑制劑的處理期間是足以抑制由分散誘發(fā)的多能干細(xì)胞的細(xì)胞死亡的期間(例如，持續(xù)12小時(shí)(2天，4天，或7天)–21天(或14天))。用tgfβ信號抑制劑的處理期間是足以抑制中胚層分化并且促進(jìn)向神經(jīng)外胚層分化的期間(例如，持續(xù)2天(或7天)–21天(或14天))。用第一成纖維細(xì)胞生長因子處理的處理期間是足以促進(jìn)多能干細(xì)胞向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織分化的期間(例如，持續(xù)2天(或5天)–19天(或12天))。

在一個(gè)實(shí)施方案中，分散在包含胰島素、rock抑制劑和tgfβ信號抑制劑的無血清培養(yǎng)基中的多能干細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而形成多能干細(xì)胞聚集體，并且將所得到的多能干細(xì)胞聚集體繼續(xù)在相同的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。在該懸浮培養(yǎng)中，自懸浮培養(yǎng)開始后第2-4天，將所述多能干細(xì)胞聚集體或源自其的細(xì)胞聚集體進(jìn)一步用第一成纖維細(xì)胞生長因子處理，并且自懸浮培養(yǎng)開始后第10-14天，用第二成纖維細(xì)胞生長因子處理。用rock抑制劑的處理期間是足以抑制由分散誘發(fā)的多能干細(xì)胞的細(xì)胞死亡的期間(例如，持續(xù)12小時(shí)(2天，4天，或7天)–21天(或14天))。用tgfβ信號抑制劑的處理期間是足以抑制中胚層分化并且促進(jìn)向神經(jīng)外胚層分化的期間(例如，持續(xù)2天(或7天)–21天(或14天))。用第一成纖維細(xì)胞生長因子的處理期間是足以促進(jìn)多能干細(xì)胞向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織分化的期間(例如，持續(xù)2天(或5天)–19天(或12天))。用第二成纖維細(xì)胞生長因子的處理期間是足以對神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)賦予沿著神經(jīng)管背腹軸的極性的期間(例如，持續(xù)2天(或4天)-14天(或11天或7天))。

步驟(i)的懸浮培養(yǎng)進(jìn)行足以誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織分化的期間。結(jié)果，得到包含所述中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的細(xì)胞聚集體。向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的分化可以通過，例如，使用中腦-后腦邊界標(biāo)記特異性的探針的rt-pcr，和使用中腦-后腦邊界標(biāo)記特異性的抗體和神經(jīng)祖先組織特異性的抗體的免疫組織化學(xué)進(jìn)行檢測。例如，進(jìn)行步驟(i)的懸浮培養(yǎng)直到不少于20％、優(yōu)選不少于50％、更優(yōu)選不少于70％的包含在所述細(xì)胞聚集體中的細(xì)胞變成中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先細(xì)胞。由于培養(yǎng)期間可能取決于多能干細(xì)胞的動物物種而變化；以及rock抑制劑、tgfβ信號抑制劑和第一成纖維細(xì)胞生長因子的種類和濃度而變化，其通常不能指定。然而，當(dāng)使用人多能干細(xì)胞時(shí)，例如，第一培養(yǎng)步驟通常是14–30天(例如，21天)。

關(guān)于中腦-后腦邊界標(biāo)記，可以提及en2(中腦標(biāo)記)、gbx2(吻側(cè)后腦標(biāo)記)等。關(guān)于神經(jīng)祖先細(xì)胞標(biāo)記，可以提及n-鈣黏著蛋白。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先細(xì)胞可以鑒定為en2-或gbx2-陽性、且n-鈣黏著蛋白-陽性的細(xì)胞。

步驟(i)可以包括證實(shí)在細(xì)胞聚集體中向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的分化誘導(dǎo)的步驟。該證實(shí)步驟可以通過分離一部分細(xì)胞聚集體并且對其進(jìn)行使用中腦-后腦邊界標(biāo)記特異性的探針的rt-pcr或使用中腦-后腦邊界標(biāo)記特異性的抗體和神經(jīng)祖先組織特異性的抗體的免疫組織化學(xué)分析而進(jìn)行。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(i)的懸浮培養(yǎng)中不添加sonichedgehog抑制劑，并且步驟(i)的懸浮培養(yǎng)在其整個(gè)期間內(nèi)不包含sonichedgehog抑制劑。即，所述多能干細(xì)胞聚集體或源自其的聚集體不用sonichedgehog抑制劑處理。在muguruma，k.等人，natureneurosci.13，1171-1180，2010的方法中，由小鼠es細(xì)胞的小腦分化需要sonichedgehog抑制劑，而通過本發(fā)明的方法，不添加sonichedgehog抑制劑，多能干細(xì)胞(特別是人多能干細(xì)胞)向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的有效分化是可能的。相反，添加sonichedgehog抑制劑抑制向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的分化。sonichedgehog抑制劑的實(shí)例包括，但不限于，低分子量化合物，如環(huán)杷明，介藜蘆胺(jervine)，gant61，sant-2，番茄堿(tomatidine)，花姜酮(zerumbone)，gdc-0449，xl139，ipi926，ipi609，lde225，曲帕拉醇(triparanol)，ay9944等。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(i)的懸浮培養(yǎng)中不添加bmp4，并且步驟(i)的懸浮培養(yǎng)在其整個(gè)期間內(nèi)基本上不含bmp4。即，所述多能干細(xì)胞聚集體或源自其的聚集體不用bmp4處理。在muguruma，k.等人，natureneurosci.13，1171-1180，2010的方法中，由小鼠es細(xì)胞的小腦分化需要bmp4，而通過本發(fā)明的方法，不添加bmp4，多能干細(xì)胞(特別是人多能干細(xì)胞)向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的分化是可能的?！盎旧喜缓琤mp4”意指培養(yǎng)基中bmp4的濃度低于生理活性表達(dá)的水平。具體地，培養(yǎng)基中bmp4的濃度通常小于0.1ng/ml，優(yōu)選小于0.01ng/ml，更優(yōu)選小于0.001ng/ml，最優(yōu)選為0ng/ml。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，由于在步驟(i)的懸浮培養(yǎng)中不添加sonichedgehog抑制劑和bmp4，并且步驟(i)的懸浮培養(yǎng)在其整個(gè)期間內(nèi)不含sonichedgehog抑制劑且基本上不含bmp4。即，所述多能干細(xì)胞聚集體或源自其的聚集體不用sonichedgehog抑制劑和bmp4處理。

(3.2)步驟(ii)

在步驟(ii)中，將在步驟(i)中得到的包含中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的人細(xì)胞聚集體進(jìn)一步在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，以誘導(dǎo)神經(jīng)祖先組織中的神經(jīng)祖先細(xì)胞形成神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)，由此得到包含小腦板組織的人細(xì)胞聚集體。

以與步驟(i)中相同的方式，通過使用用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可以制備用于步驟(ii)的培養(yǎng)基。關(guān)于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可以提及與步驟(i)相關(guān)聯(lián)描述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于步驟(ii)的培養(yǎng)基由用于培養(yǎng)人神經(jīng)元的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備。關(guān)于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可以提及neurobasal培養(yǎng)基。

用于步驟(ii)的培養(yǎng)基優(yōu)選是無血清培養(yǎng)基，以避免化學(xué)成分不確定的成分的污染。

用于步驟(ii)的培養(yǎng)基可以包含血清替代品。例如，所述血清替代品可以是適當(dāng)?shù)匕宓鞍?、運(yùn)鐵蛋白、脂肪酸、膠原蛋白前體、痕量元素、2-巰基乙醇或3’-硫代甘油或其等價(jià)物等的替代品。關(guān)于所述血清替代品，可以提及n2、b27、ksr等。n2是已知的包含胰島素、運(yùn)鐵蛋白、孕酮、腐胺和亞硒酸鈉的血清替代組合物。b27的組分記述在j.neurosci.res.，vol.35，第567-576頁，1993，brainres.，vol.494，第65-74頁，1989等中。n2，b27可以從lifetechnologies等購買。添加到培養(yǎng)基中的血清替代品的量沒有特別限制，只要其能夠?qū)崿F(xiàn)向小腦板組織的分化誘導(dǎo)即可。例如，當(dāng)其是由lifetechnologies生產(chǎn)的n2補(bǔ)充劑時(shí)，相對于培養(yǎng)基總體積，添加1/500-1/10體積。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于步驟(ii)的培養(yǎng)基包含n2。優(yōu)選包含化學(xué)成分確定的成分的血清替代品。另外，優(yōu)選不包含由不同于要培養(yǎng)的細(xì)胞的動物物種的動物分離的成分(異種動物來源的成分)(例如，當(dāng)培養(yǎng)人細(xì)胞時(shí)，從非人動物分離的成分)的血清替代品。不優(yōu)選化學(xué)成分不確定的血清替代品和包含異種動物來源的成分的血清替代品(例如，ksr(敲除血清替代物))的使用。

用于步驟(ii)的培養(yǎng)基可以包含其他添加劑，只要對向小腦板組織的分化誘導(dǎo)沒有實(shí)施不利影響即可。添加劑的實(shí)例包括，但不限于，胰島素、鐵源(例如，運(yùn)鐵蛋白等)、礦物質(zhì)(例如，硒酸鈉等)、糖(例如，葡萄糖等)、有機(jī)酸(例如，丙酮酸、乳酸等)、血清蛋白(例如，清蛋白等)、氨基酸(例如，l-谷氨酰胺等)、還原劑(例如，2-巰基乙醇等)、維生素(例如，抗壞血酸、d-生物素等)、抗生素(例如，鏈霉素、青霉素、慶大霉素等)、緩沖劑(例如，hepes等)等。由于在包含l-谷氨酰胺的培養(yǎng)基中長期培養(yǎng)可能引起氨毒性，也可以使用l-丙氨酰-l-谷氨酰胺二肽替代l-谷氨酰胺。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于步驟(ii)的培養(yǎng)基包含l-丙氨酰-l-谷氨酰胺二肽。例如，l-丙氨酰-l-谷氨酰胺二肽是市售的，例如作為glutamax(由lifetechnologies制備)等。

為了避免化學(xué)成分不確定的成分的污染，用于步驟(ii)的培養(yǎng)基優(yōu)選是其成分化學(xué)確定的培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，用于步驟(ii)的培養(yǎng)基不包含異種動物來源的成分。

步驟(ii)中的其他培養(yǎng)條件，諸如培養(yǎng)溫度和co2濃度，可以適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。例如，培養(yǎng)溫度是約30-40℃，優(yōu)選約37℃。例如，co2濃度是約1-10％，優(yōu)選約5％。

在步驟(ii)的懸浮培養(yǎng)中，細(xì)胞聚集體的懸浮培養(yǎng)可以在存在或不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下進(jìn)行，只要通過本發(fā)明的方法使中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織向小腦板組織的分化誘導(dǎo)是可能的即可。為了避免不確定因素的污染，細(xì)胞聚集體的懸浮培養(yǎng)優(yōu)選在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下進(jìn)行。

關(guān)于可以用于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集體的容器，可以提及在上述(2)中作為可以用于形成多能干細(xì)胞聚集體的容器的那些。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用具有平底的容器，如培養(yǎng)皿。

步驟(ii)中的懸浮培養(yǎng)進(jìn)行足以誘導(dǎo)中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先細(xì)胞形成神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)的期間。通過進(jìn)行步驟(ii)，可以在細(xì)胞聚集體中形成包含γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞和小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)，即，小腦板組織。所述神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)可以是上皮管狀組織。包含γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞和小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)的形成可以通過檢測包含γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞標(biāo)記陽性的細(xì)胞和小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞標(biāo)記陽性的細(xì)胞的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)(即，γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞標(biāo)記陽性且小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞標(biāo)記陽性的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu))的形成而證實(shí)，例如，通過使用對γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞標(biāo)記(例如，kirrel2，ptf1a，sox2)特異性的抗體和對小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞標(biāo)記(例如，atoh1，barhl1)特異性的抗體的免疫組織化學(xué)進(jìn)行檢測。例如，進(jìn)行步驟(ii)中的懸浮培養(yǎng)，直至不少于30％、優(yōu)選不少于50％、更優(yōu)選不少于70％的包含在培養(yǎng)物中的細(xì)胞聚集體中的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)(例如，n-鈣黏著蛋白陽性的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu))變成γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞標(biāo)記陽性的且小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞標(biāo)記陽性的。由于培養(yǎng)期間可能取決于多能干細(xì)胞的動物物種而變化；以及培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基組成而變化，其通常不能指定。然而，當(dāng)使用人多能干細(xì)胞時(shí)，由于在步驟(ii)中自懸浮培養(yǎng)起始起約3天內(nèi)開始形成神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)，因此，懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)期間不少于3天。步驟(ii)的培養(yǎng)期間沒有上限，只要維持包含γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞和小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)即可。當(dāng)培養(yǎng)期間過長時(shí)，細(xì)胞聚集體的脆弱性增加，并且所述細(xì)胞聚集體可能會瓦解。因此，培養(yǎng)期間通常在40天內(nèi)，優(yōu)選在32天內(nèi)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)具有頂端-基底極性。所述頂端-基底極性可以通過使用頂端標(biāo)記(例如，pkcζ)和針對基底標(biāo)記的抗體的免疫組織化學(xué)分析來鑒定。當(dāng)所述神經(jīng)上皮接哦故是上皮管狀組織時(shí)，頂端側(cè)面向管腔(頂端側(cè)向內(nèi))。

此處，當(dāng)上文提及的步驟(i)包括用第二成纖維細(xì)胞生長因子進(jìn)一步處理所述人多能干細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體時(shí)，要在步驟(ii)中得到的細(xì)胞聚集體中的小腦板組織(神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu))獲得背-腹極性。更具體地，在每個(gè)神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)中，對小腦神經(jīng)祖先細(xì)胞標(biāo)記(例如，kirrel2，ptf1a，atoh1，skor2)(在胚胎發(fā)育中，它們表達(dá)在神經(jīng)管的背側(cè))陽性的細(xì)胞位于所述細(xì)胞聚集體的外側(cè)，并且對腹側(cè)標(biāo)記(例如，nkx6.1，foxa2)陽性的細(xì)胞位于所述神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)內(nèi)腔對側(cè)的相對區(qū)域上。即，可以在體外在所述細(xì)胞聚集體中重現(xiàn)胚胎發(fā)育中的具有沿著神經(jīng)管背腹軸的極性的結(jié)構(gòu)。

當(dāng)在步驟(i)中不進(jìn)行使用第二成纖維細(xì)胞生長因子的處理時(shí)，大部分的細(xì)胞聚集體具有小玫瑰花結(jié)神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)。當(dāng)進(jìn)行使用第二成纖維細(xì)胞生長因子的處理時(shí)，促進(jìn)神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)的形成，并且大部分(例如，不少于70％)的細(xì)胞聚集體包含較大的扁平-卵形的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(ii)包括在懸浮培養(yǎng)中用gdf7處理包含中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的人細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體。用gdf7處理促進(jìn)向小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞(例如，atoh陽性的細(xì)胞)的分化，和菱唇的形成。

gdf7是一種已知的細(xì)胞因子，并且其氨基酸序列也是已知的。要用于本發(fā)明的gdf7通常是哺乳動物gdf7。關(guān)于哺乳動物，可以提到上文提及的那些。盡管可以使用任意哺乳動物的gdf7，只要能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的即可，但是優(yōu)選使用與要培養(yǎng)的細(xì)胞相同物種的哺乳動物的gdf7。例如，使用嚙齒動物(小鼠、大鼠等)或靈長動物(人等)的gdf7。代表性的人gdf7的氨基酸序列的實(shí)例包括ncbi登記號np_878248.2(2014年1月26日更新)，即所述氨基酸的第322個(gè)到第450個(gè)氨基酸的部分序列(成熟的人gdf7)等。

用gdf7處理細(xì)胞聚集體的時(shí)機(jī)和持續(xù)時(shí)間沒有特別限制，只要促進(jìn)向小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞的分化即可。為了有效地促進(jìn)向小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞的分化，優(yōu)選在自細(xì)胞聚集體的懸浮培養(yǎng)起始起的2天內(nèi)，更優(yōu)選自懸浮培養(yǎng)起始起的1天內(nèi)，進(jìn)一步優(yōu)選自懸浮培養(yǎng)起始時(shí)，向步驟(ii)的培養(yǎng)基中添加gdf7，從而用gdf7處理所述細(xì)胞聚集體。使用gdf7的處理期間通常不小于2天，優(yōu)選不小于7天。使用gdf7的處理期間的上限沒有特別限制，只要在所述細(xì)胞聚集體內(nèi)向小腦板組織的分化是可能的即可。為了避免對分化的不可預(yù)料的不利影響，其通常在21天內(nèi)，優(yōu)選在14天內(nèi)。在使用gdf7的處理時(shí)期過去后，從培養(yǎng)基中去除gdf7。在使用gdf7處理期間gdf7在培養(yǎng)基中的濃度是能夠促進(jìn)向小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞分化的濃度。例如，該濃度通常不小于10ng/ml，優(yōu)選不小于50ng/ml，更優(yōu)選不小于100ng/ml。gdf7濃度的上限沒有特別限制，只要沒有不利地影響向小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞的分化即可。從培養(yǎng)成本的方面看來，其通常不超過1000ng/ml，優(yōu)選不超過500ng/ml，更優(yōu)選不超過300ng/ml。gdf7濃度在處理期間內(nèi)可以變化。例如，在后半階段濃度可以減半。

在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(ii)包括在懸浮培養(yǎng)中用sdf1處理包含中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的人細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體。使用sdf1的處理促進(jìn)在小腦板組織中形成神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)。特別地，對于形成連續(xù)的小腦板神經(jīng)上皮是有效的。另外，可以形成與神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)連續(xù)的菱唇。

sdf1是一種已知的趨化因子，還稱為cxcl12，并且其氨基酸序列也是已知的。用于本發(fā)明的sdf1通常是哺乳動物sdf1。哺乳動物的實(shí)例包括上文提及的那些?？梢允褂萌我獠溉閯游锏膕df1，只要能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的即可。優(yōu)選地，使用與培養(yǎng)的細(xì)胞相同物種的哺乳動物的sdf1。例如，使用嚙齒動物(小鼠、大鼠等)或靈長動物(人等)的sdf1。代表性的人sdf1的氨基酸序列的實(shí)例包括ncbi登記號np_001171605.1(2014年5月25日更新)，即通過從所述氨基酸序列去除n端信號序列(1-22)得到的氨基酸序列(成熟的人sdf1)等。

用sdf1處理所述細(xì)胞聚集體的時(shí)機(jī)和持續(xù)時(shí)間沒有特別限制，只要促進(jìn)小腦板組織中神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)的形成即可。由于sdf1是參與大腦內(nèi)細(xì)胞的定位的因子，因此，優(yōu)選地在所述細(xì)胞聚集體中以某種程度形成包含γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞和小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)(小腦板組織)的階段用sdf1處理所述細(xì)胞聚集體。從這些方面看來，優(yōu)選地在自步驟(ii)中細(xì)胞聚集體懸浮培養(yǎng)起始起第4天-第10天的任意時(shí)間點(diǎn)，更優(yōu)選地在第6天-第8天的任意時(shí)間點(diǎn)，將sdf1添加到培養(yǎng)基中，從而用sdf1處理所述細(xì)胞聚集體。使用sdf1的處理期間通常不小于2天，優(yōu)選不小于7天。使用sdf1的處理期間的上限沒有特別限制，只要在所述細(xì)胞聚集體中向小腦板組織的分化是可能的即可。為了避免對分化的不可預(yù)料的不利影響，其通常在21天內(nèi)，優(yōu)選在14天內(nèi)。在使用sdf1的處理時(shí)期過去后，從培養(yǎng)基中去除sdf1。在使用sdf1處理期間sdf1在培養(yǎng)基中的濃度是能夠促進(jìn)神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)形成的濃度。例如，該濃度通常不小于約50ng/ml，優(yōu)選不小于100ng/ml。sdf1濃度的上限沒有特別限制，只要促進(jìn)神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)的形成即可。從培養(yǎng)成本方面看來，其通常不超過1000ng/ml，優(yōu)選不超過500ng/ml。sdf1濃度在處理期間內(nèi)可以變化。例如，在后半階段濃度可以減半。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，從步驟(ii)中懸浮培養(yǎng)開始起直到開始用sdf1處理，不用sdf1刺激細(xì)胞聚集體。即，從步驟(ii)中懸浮培養(yǎng)開始起直到開始用sdf1處理，用于懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)選基本上不含sdf1?！盎旧喜缓瑂df1”意指培養(yǎng)基中sdf1的濃度低于用于促進(jìn)神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)形成的濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，從步驟(ii)中懸浮培養(yǎng)開始起到開始用sdf1處理的期間內(nèi)，sdf1在培養(yǎng)基中的濃度通常小于1ng/ml，優(yōu)選小于0.1ng/ml，更優(yōu)選小于0.01ng/ml。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(i)的懸浮培養(yǎng)中，將多能干細(xì)胞聚集體或源自其的細(xì)胞聚集體用第二成纖維細(xì)胞生長因子(例如，fgf19)處理，并且，進(jìn)一步地，在在步驟(ii)的懸浮培養(yǎng)中，將包含中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織的細(xì)胞聚集體或源自其的細(xì)胞聚集體用sdf1處理。如上文所提及的，通過在步驟(i)中用第二成纖維細(xì)胞生長因子(例如，fgf19)處理，在步驟(ii)中得到的細(xì)胞聚集體中的小腦板組織(神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu))獲得背-腹極性。具體而言，在每個(gè)神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)中，小腦神經(jīng)祖先細(xì)胞標(biāo)記-陽性的細(xì)胞位于所述細(xì)胞聚集體的外側(cè)，并且腹側(cè)標(biāo)記-陽性的細(xì)胞位于所述神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)內(nèi)腔對側(cè)的相對區(qū)域上。通過用sdf1進(jìn)一步處理包含具有背-腹極性的小腦板組織(神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu))的所述細(xì)胞聚集體，促進(jìn)連續(xù)的小腦板神經(jīng)上皮形成，并且在所述細(xì)胞聚集體的表面區(qū)可以形成連續(xù)的小腦神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)(例如，kirrel2陽性的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu))。所述神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)具有這樣的極性：頂端側(cè)(例如，sox2+vz細(xì)胞，pkcζ陽性細(xì)胞)位于表面?zhèn)?細(xì)胞聚集體的表面)，并且基底側(cè)(例如，skor2+浦肯野祖先細(xì)胞)位于深部的部分。sdf1處理促進(jìn)小腦神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)沿著頂端-基底軸層疊成三層，如在胚胎的早期小腦發(fā)育中觀察到的，并且，從頂端到基底方向，產(chǎn)生腦室區(qū)(例如，apkc+，sox2+，ptf1a+，kirrel2+)、浦肯野細(xì)胞前體區(qū)(例如，skor2+，olig2+，gad+，lhx5+)和菱唇-來源的神經(jīng)細(xì)胞區(qū)(例如，atoh1+，barhl1+)的三層結(jié)構(gòu)。此外，其在連續(xù)的小腦神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)的邊緣引起菱唇樣組織的形成。所述菱唇樣組織表現(xiàn)出卷曲的結(jié)構(gòu)并且包含atoh1+細(xì)胞和barhl1+細(xì)胞。如上文所示，通過聯(lián)合在步驟(i)中用第二成纖維細(xì)胞生長因子(例如，fgf19)處理和在步驟(ii)中用sdf1處理，可以形成具有更高級結(jié)構(gòu)的小腦祖先組織。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(i)的懸浮培養(yǎng)中，將多能干細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體自懸浮培養(yǎng)起始起用rock抑制劑處理，自懸浮培養(yǎng)起始起用tgfβ信號抑制劑處理，自懸浮培養(yǎng)起始起第2-4天用第一成纖維細(xì)胞生長因子處理，并且自懸浮培養(yǎng)起始起第10-14天用第二成纖維細(xì)胞生長因子處理，并且進(jìn)一步地，在步驟(ii)的懸浮培養(yǎng)中，將包含中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先細(xì)胞的人細(xì)胞聚集體或源自其的人細(xì)胞聚集體自懸浮培養(yǎng)起始起第4-10天用sdf1處理。用rock抑制劑的處理期間是足以抑制由分散誘發(fā)的多能干細(xì)胞的細(xì)胞死亡的期間(例如，持續(xù)12小時(shí)(2天，4天，或7天)–21天(或14天))。用tgfβ信號抑制劑的處理期間是足以抑制中胚層分化并且促進(jìn)向神經(jīng)外胚層分化的期間(例如，持續(xù)2天(或7天)–21天(或14天))。用第一成纖維細(xì)胞生長因子處理的處理期間是足以促進(jìn)多能干細(xì)胞向中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織分化的期間(例如，持續(xù)2天(或5天)–19天(或12天))。用第二成纖維細(xì)胞生長因子處理的處理期間是足以對神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)賦予沿著神經(jīng)管背腹軸的極性的期間(例如，持續(xù)2天(或4天)–14天(或11天或7天))。使用sdf1的處理期間是足以促進(jìn)小腦板組織中形成神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)的期間(例如，持續(xù)2(或7天)–21天(或14天))。

用于本發(fā)明的gdf7和sdf1優(yōu)選是分離的。包含在用于懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的分離的gdf7和sdf1是外源添加到所述培養(yǎng)基中的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括提供分離的gdf7/分離的sdf1中的每一種的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括向步驟(ii)中用于懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基中外源添加分離的gdf7/分離的sdf1中的每一種的步驟。

(4)誘導(dǎo)浦肯野細(xì)胞、高爾基細(xì)胞或中間神經(jīng)元

由于通過上文提及的本發(fā)明的制備方法得到的包含小腦板組織的細(xì)胞聚集體包含γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞，因此，可以通過在分化條件下進(jìn)一步培養(yǎng)所述細(xì)胞聚集體而產(chǎn)生浦肯野細(xì)胞、高爾基細(xì)胞或中間神經(jīng)元。具體而言，從通過上文所述的本發(fā)明的制備方法得到的包含小腦板組織的細(xì)胞聚集體得到γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞，并將所述γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞與哺乳動物小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞共同培養(yǎng)，并且，所述γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞被誘導(dǎo)，由所述γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞向浦肯野細(xì)胞、高爾基細(xì)胞或中間神經(jīng)元分化。

γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞可以提供為多能干細(xì)胞衍生的包含γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞的細(xì)胞群體，優(yōu)選地，作為分離的γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞。γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞的分離可以使用針對γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞特有的標(biāo)記的抗體通過facs進(jìn)行。作為γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞特有的標(biāo)記，可以提及kirrel2等。

由于菱唇中大量包含小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞，因此，通過分離非人哺乳動物(例如，小鼠)胚胎的菱唇并且將其分散在適當(dāng)?shù)募?xì)胞分散溶液(例如，胰蛋白酶-edta，tryple等)中而得到的菱唇來源的細(xì)胞可以用作小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞。

γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞和小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞的共同培養(yǎng)可以通過以適當(dāng)?shù)谋壤?例如，γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞:小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞＝1:5-1:20)混合γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞和小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞并將該混合物在用細(xì)胞外基質(zhì)(如層粘連蛋白)包被的培養(yǎng)容器上培養(yǎng)而進(jìn)行。關(guān)于用于所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以使用多種用于培養(yǎng)小腦神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。優(yōu)選地向所述培養(yǎng)基中添加n2和三-碘甲腺原氨酸。另外，可以向培養(yǎng)基中加入胞嘧啶β-d-阿拉伯呋喃糖苷(ara-c)(tabata，t.等人，j.neurosci.method.104，45-53)。例如，可以使用補(bǔ)充有n2和三-碘甲腺原氨酸的dmem/hamf-12等。

盡管培養(yǎng)期沒有特別限制，只要其是足以使γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞向浦肯野細(xì)胞、高爾基細(xì)胞或中間神經(jīng)元分化的充分期間即可，但是其通常不小于15天。

向浦肯野細(xì)胞或中間神經(jīng)元的分化可以通過評價(jià)浦肯野細(xì)胞、高爾基細(xì)胞或中間神經(jīng)元特有的標(biāo)記的表達(dá)、細(xì)胞形、電生理特性等而確認(rèn)。本發(fā)明的方法可以包括所述確認(rèn)步驟。關(guān)于浦肯野細(xì)胞特異性標(biāo)記，可以提及l(fā)7/pcp2、鈣結(jié)合蛋白等。關(guān)于高爾基細(xì)胞的標(biāo)記，可以提及神經(jīng)顆粒蛋白(neurogranin)等。關(guān)于中間神經(jīng)元的標(biāo)記，可以提及小清蛋白(parvalbumin)等。

在向浦肯野細(xì)胞的分化過程中，首先產(chǎn)生具有軸突和樹突的浦肯野特異性的標(biāo)記(l7/pcp2，鈣結(jié)合蛋白)-陽性的細(xì)胞。通過進(jìn)一步培養(yǎng)所述細(xì)胞，成熟繼續(xù)，形成樹突棘，表達(dá)glurdeta2，并且由此產(chǎn)生成熟的浦肯野細(xì)胞。成熟的浦肯野細(xì)胞表現(xiàn)出特征性電生理特性，包括：(1)自發(fā)性動作電位的反復(fù)觸發(fā)，(2)超極化-激活的陽離子通道電流(ih電流)，和(3)nmda受體-不依賴性的ampa受體依賴性的谷氨酸接收。

可以通過從共同培養(yǎng)物中分離浦肯野細(xì)胞、高爾基細(xì)胞或中間神經(jīng)元而得到浦肯野細(xì)胞或中間神經(jīng)元。所述分離可以通過施用針對每種細(xì)胞特有的標(biāo)記的抗體經(jīng)由facs、淘選(panning)等進(jìn)行。

關(guān)于γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞和小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞的共同培養(yǎng)，可以參考muguruma，k.等人，natureneurosci.13，1171-1180，2010。

(5)誘導(dǎo)小腦顆粒細(xì)胞

由于通過上文提及的本發(fā)明的制備方法得到的包含小腦板組織的細(xì)胞聚集體包含小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞，因此，可以通過將所述祖先細(xì)胞在分化條件下進(jìn)一步培養(yǎng)而產(chǎn)生小腦顆粒細(xì)胞。具體而言，從通過上文提及的本發(fā)明的制備方法得到的包含小腦板組織的細(xì)胞聚集體得到小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞，將所述小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞與哺乳動物小腦細(xì)胞共同培養(yǎng)，從而誘導(dǎo)小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞向小腦顆粒細(xì)胞分化。

小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞可以提供為多能干細(xì)胞衍生的包含小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞的細(xì)胞群體，或作為分離的小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞。小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞的分離可以使用針對小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞特有的標(biāo)記的抗體通過facs、淘選、磁珠等進(jìn)行。關(guān)于小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞特異性的標(biāo)記，可以提及atoh1、barhl1、pax6等。

小腦細(xì)胞可以通過分離非人哺乳動物(例如，小鼠)小腦并且將其用適當(dāng)?shù)募?xì)胞分散溶液(例如，胰蛋白酶-edta，tryple等)分散而得到。優(yōu)選地，使用新生的(例如，在出生后2天內(nèi))非人哺乳動物小腦。

小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞與小腦細(xì)胞的共同培養(yǎng)可以通過以適當(dāng)?shù)谋壤?例如，小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞:小腦細(xì)胞＝1:5-1:40)混合小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞與小腦細(xì)胞并將該混合物在用細(xì)胞外基質(zhì)(如層粘連蛋白)包被的培養(yǎng)容器上培養(yǎng)而進(jìn)行。關(guān)于用于所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以使用多種用于培養(yǎng)小腦神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。優(yōu)選地向所述培養(yǎng)基中添加n2。例如，可以使用補(bǔ)充有n2和血清等的dmem/hamf-12。

盡管培養(yǎng)期沒有特別限制，只要其是足以使小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞向小腦顆粒細(xì)胞分化的充分期間即可，但是，其通常為約3-10天(優(yōu)選地，5-8天)。

向小腦顆粒細(xì)胞的分化可以通過評價(jià)小腦顆粒細(xì)胞特有的標(biāo)記的表達(dá)、細(xì)胞形等而確認(rèn)。本發(fā)明的方法可以包括所述確認(rèn)步驟。關(guān)于小腦顆粒細(xì)胞-特異性的標(biāo)記，可以提及barhl1、pax6、map2等。

由于分化的小腦顆粒細(xì)胞表現(xiàn)出這樣的特征性移動模式：其中細(xì)胞沿著神經(jīng)突移動，然后細(xì)胞的移動方向變?yōu)榕c該點(diǎn)的切線垂直的方向，因而，可以將具有此類移動模式的軸突的細(xì)胞鑒定為小腦顆粒細(xì)胞。

小腦顆粒細(xì)胞可以通過從共同培養(yǎng)物中分離小腦顆粒細(xì)胞而得到。分離可以通過使用針對小腦顆粒細(xì)胞特有的標(biāo)記的抗體經(jīng)由facs、淘選等進(jìn)行。

(6)細(xì)胞聚集體、分離的小腦祖先組織、組成小腦祖先組織的細(xì)胞、組成小腦的細(xì)胞以及它們的應(yīng)用

在另一方面，可以從通過上文提及的本發(fā)明的制備方法得到的細(xì)胞聚集體分離小腦祖先組織(小腦板組織等)。另外，可以通過用適當(dāng)?shù)募?xì)胞分散溶液分散小腦祖先組織而分離組成小腦祖先組織的多種細(xì)胞。本發(fā)明提供通過上文提及的本發(fā)明的制備方法得到的細(xì)胞聚集體、小腦祖先組織和組成小腦祖先組織的細(xì)胞。此外，本發(fā)明還提供通過上述(4)和(5)所述的方法得到的組成小腦的細(xì)胞(浦肯野細(xì)胞、高爾基細(xì)胞、中間神經(jīng)元、顆粒細(xì)胞、深部小腦核)。

通過本發(fā)明得到的細(xì)胞聚集體、小腦祖先組織、組成小腦祖先組織的細(xì)胞和組成小腦的細(xì)胞可以用于移植療法。例如，通過本發(fā)明的方法得到的細(xì)胞聚集體、小腦祖先組織、組成小腦祖先組織的細(xì)胞或組成小腦的細(xì)胞可以用作治療藥物用于由小腦紊亂導(dǎo)致的疾病，或用于補(bǔ)充小腦損傷病癥中相應(yīng)的被損傷的部分。通過對具有由小腦紊亂導(dǎo)致的疾病的患者或具有小腦損傷病癥的患者移植通過本發(fā)明得到的細(xì)胞聚集體、小腦祖先組織、組成小腦祖先組織的細(xì)胞或組成小腦的細(xì)胞，可以治療所述由小腦紊亂導(dǎo)致的疾病或小腦的損傷病癥。由小腦紊亂導(dǎo)致的疾病的實(shí)例包括癥狀性小腦皮層生活力缺損(symptomaticcerebellarcorticalabiotrophy)，橄欖體腦橋小腦萎縮(olivopontocerebellaratrophy)，夏伊-德雷格綜合征(shy-dragersyndrome)，脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(spinocerebellarataxia，sca)(例如，遺傳性脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(hereditaryspinocerebellarataxia)，偶發(fā)性脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(sporadicspinocerebellarataxia)(例如，多系統(tǒng)萎縮(multiplesystematrophy，msa))，皮質(zhì)小腦萎縮(corticalcerebellaratrophy，cca)))，丹迪-沃克綜合征(dandy-walkersyndrome)等。經(jīng)常在兒童中觀察到的髓母細(xì)胞瘤(medulloblastoma)常常在小腦蚓中發(fā)展，并且小腦中的此類髓母細(xì)胞瘤也包括在由小腦紊亂導(dǎo)致的疾病中。此外，這些小腦損傷病癥的實(shí)例包括小腦切除的患者，在對小腦中的腫瘤輻照后的患者、外傷。

在移植療法中，由于組織相容性抗原的差異導(dǎo)致的移植物排斥(graftrejection)通常構(gòu)成問題，然而，該問題可以通過使用由移植接受體的體細(xì)胞建立的多能干細(xì)胞(例如，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)而得到解決。即，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用由接受體的體細(xì)胞建立的多能干細(xì)胞(例如，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)作為本發(fā)明的方法中的多能干細(xì)胞，并且產(chǎn)生對于所述接受體來說是免疫學(xué)自身的細(xì)胞聚集體、小腦祖先組織、組成小腦祖先組織的細(xì)胞或組成小腦的細(xì)胞并將植入到所述接受體中。

此外，通過本發(fā)明的方法得到的細(xì)胞聚集體、小腦祖先組織、組成小腦祖先組織的細(xì)胞或組成小腦的細(xì)胞可以用于篩選和評價(jià)用于治療由小腦紊亂導(dǎo)致的疾病或用于小腦損傷病癥的藥物。具體地，由于通過本發(fā)明獲得的小腦祖先組織具有與活體內(nèi)的小腦祖先組織的結(jié)構(gòu)極相似的高等結(jié)構(gòu)，其可以用于篩選用于由小腦紊亂導(dǎo)致的疾病、小腦損傷病癥的治療藥，檢測藥物產(chǎn)品的副作用和毒性，并且開發(fā)用于小腦疾病的新治療方法等。例如，從具有前述由小腦紊亂導(dǎo)致的疾病、特別是由小腦紊亂導(dǎo)致的遺傳病的人患者制備ips細(xì)胞，并且使用該ips細(xì)胞，通過本發(fā)明的方法制備包含小腦祖先組織的細(xì)胞聚集體。包含在所得到的細(xì)胞聚集體中的小腦祖先組織可以在體外重現(xiàn)引起患者疾病的小腦紊亂。在存在或不存在(陰性對照)測試物質(zhì)的條件下，培育包含紊亂的小腦祖先組織的細(xì)胞聚集體或由所述細(xì)胞聚集體分離的紊亂的小腦祖先組織。然后，將用所述測試物質(zhì)處理的所述細(xì)胞聚集體或小腦祖先組織的紊亂程度與陰性對照進(jìn)行比較。結(jié)果，可以選擇降低紊亂水平的測試物質(zhì)作為用于由所述紊亂導(dǎo)致的疾病的治療藥的候選物質(zhì)。另外，通過向作為用于篩選的所述細(xì)胞聚集體或小腦祖先組織的來源的患者施用治療有效量的所選擇的物質(zhì)，可以治療該患者中由小腦紊亂導(dǎo)致的疾病，此時(shí)具有證實(shí)的作為藥物的安全性的物質(zhì)用作測試物質(zhì)。此外，使用包含紊亂的小腦祖先組織的細(xì)胞聚集體或由所述細(xì)胞聚集體分離的紊亂的小腦祖先組織，可以進(jìn)行藥物產(chǎn)品的毒性測試和開發(fā)用于由所述紊亂導(dǎo)致的疾病的新治療方法。

通過參考下述實(shí)施例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是示例，并不限制本發(fā)明的范圍。

[實(shí)施例]

[實(shí)施例1]由人多能干細(xì)胞立體形成中腦-后腦邊界神經(jīng)祖先組織

(方法)

使用通過常規(guī)方法在mef上進(jìn)行維持培養(yǎng)的人es細(xì)胞(khes-1)。為了通過用快速重聚無血清漂浮培養(yǎng)胚狀體樣聚集體(sfebq法)分化人es細(xì)胞，按照nakano等人(cellstemcell，10(6)，771-785，2012)的方法，將人es細(xì)胞酶解分散成單個(gè)細(xì)胞，并且使用低細(xì)胞粘附性v-底96孔平板(sumitomobakelite)重聚。每孔接種6,000個(gè)細(xì)胞，并且在37℃在5％co2下在作為分化培養(yǎng)基的cdm培養(yǎng)基[不含生長因子的化學(xué)合成培養(yǎng)基(無生長因子的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基(growth-factor-freechemicallydefinedmedium)；gfcdm；wataya等人，proc.natl.acad.sci.usa，105，11796-11801，2008)，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有胰島素(7μg/ml)和脫鐵運(yùn)鐵蛋白(15μg/ml)]中培養(yǎng)。

將接種日視為分化培養(yǎng)的第0天。從第0天到第7天，添加10μmy-27632(rock抑制劑；在分散過程中的細(xì)胞死亡的抑制劑:watanabe等人，natureneuroscience，8，288-296，2007)和10μmsb431542(tgf-β抑制劑)。從培養(yǎng)的第2天至第7天，向培養(yǎng)基中添加fgf2至50ng/ml的終濃度。在第7天，將1/3的培養(yǎng)基更換為不含y-27632、sb431542和fgf2的分化培養(yǎng)基。在培養(yǎng)的第14天，將培養(yǎng)基完全替換為不含y-27632、sb431542和fgf2的分化培養(yǎng)基。將細(xì)胞聚集體固定并切片，并且通過免疫熒光法和定量pcr法分析組織分化。

(結(jié)果)

到自分化培養(yǎng)起始起的第14天，細(xì)胞聚集體不少于90％的細(xì)胞分化成n-鈣黏著蛋白陽性的神經(jīng)祖先細(xì)胞。在第14天觀察到吻側(cè)后腦區(qū)標(biāo)記gbx2的表達(dá)，并且，在第21天，不少于80％的n-鈣黏著蛋白陽性細(xì)胞是gbx2陽性的。在這時(shí)，幾乎沒有觀察到作為中腦吻側(cè)區(qū)標(biāo)記的otx2的表達(dá)(圖1)。另外，在沿著神經(jīng)管首尾軸的區(qū)域特有的基因中，通過添加fgf2，中腦-后腦邊界標(biāo)記en2、gbx2的表達(dá)顯著增加(圖2)。在自培養(yǎng)起始起的第14天和第21天，還發(fā)現(xiàn)en2和gbx2的表達(dá)由于fgf2增加。盡管fgf2抑制前腦標(biāo)記six3和otx2的表達(dá)(圖2)，但是其增加fgf8和wnt1的表達(dá)，fgf8和wnt1被認(rèn)為參與在胚胎中腦-后腦邊界形成的峽部形成體的功能(第10和14天)。這些結(jié)果表明，以這種方法，fgf2促進(jìn)中腦-后腦邊界中神經(jīng)祖先細(xì)胞的自組織。

在上文提及的方法中，由于不添加y-27632時(shí)，人es細(xì)胞不形成聚集體，表明rock抑制劑提供抑制由于分散引起的細(xì)胞死亡以及支持細(xì)胞聚集體形成和多能干細(xì)胞的生長的作用。

sb431542在10-30μm范圍內(nèi)的濃度誘導(dǎo)向中腦-后腦邊界中神經(jīng)祖先細(xì)胞的分化。也在3μm的濃度觀察到向神經(jīng)祖先細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。

fgf2甚至在20ng/ml和100ng/ml的濃度也促進(jìn)向中腦-后腦邊界中神經(jīng)祖先細(xì)胞的分化。處于用于es細(xì)胞維持培養(yǎng)的濃度(5-10ng/ml)的fgf2沒有表現(xiàn)出促進(jìn)向中腦-后腦邊界中神經(jīng)祖先細(xì)胞的分化。甚至當(dāng)自第0天或第1天向培養(yǎng)基中添加fgf2時(shí)，沒有觀察到促進(jìn)向中腦-后腦邊界中神經(jīng)祖先細(xì)胞的分化。第2-14天、第3-7天、第4-7天的fgf2的添加各自也表現(xiàn)出對向中腦-后腦邊界中神經(jīng)祖先細(xì)胞的分化的促進(jìn)作用，并且第2-7天的fgf2的添加表現(xiàn)出最高的作用。當(dāng)使用fgf8b替代fgf2時(shí)，促進(jìn)向中腦-后腦邊界中神經(jīng)祖先細(xì)胞的分化；然而，該作用弱于fgf2。

當(dāng)在第7天不進(jìn)行培養(yǎng)基更換時(shí)，細(xì)胞聚集體培養(yǎng)物可以維持至第14天，并且向中腦-后腦邊界中的神經(jīng)祖先細(xì)胞的分化是可能的；然而，細(xì)胞聚集體的脆弱性增加并且細(xì)胞聚集體變得脆弱。

[實(shí)施例2]具有來自人多能干細(xì)胞的連續(xù)的上皮結(jié)構(gòu)的小腦板組織的自組織

(方法)

按照實(shí)施例1的方法培養(yǎng)人多能干細(xì)胞聚集體，在第21天及之后，將這些聚集體轉(zhuǎn)移到低細(xì)胞粘附性的10cm平皿中，并且在神經(jīng)培養(yǎng)基(neurobasal/glutamaxi/n2，均來自lifetechnologies)中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第28天，將總量的培養(yǎng)基更換為相同的神經(jīng)培養(yǎng)基，并且在培養(yǎng)的第35天通過免疫熒光法分析組織的分化。

(結(jié)果)

在一個(gè)聚集體中形成多個(gè)n-鈣黏著蛋白陽性的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)，并且不少于70％的神經(jīng)上皮細(xì)胞是小腦γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞-特異性kirrel2陽性的(圖3左圖，中圖)。不少于80％的表達(dá)kirrel2的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)也表達(dá)γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞-特異性的ptf1a(圖3，右圖)。該kirrel2陽性的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)也是en2陽性的。這些結(jié)果清楚地表明，通過實(shí)施例1的方法誘導(dǎo)分化的中腦-后腦邊界區(qū)祖先細(xì)胞被促進(jìn)自組織成小腦神經(jīng)板以及形成神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)。

甚至當(dāng)將用神經(jīng)培養(yǎng)基更換的時(shí)機(jī)設(shè)定為第14天、第18天和第28天時(shí)，形成與當(dāng)在第21天更換時(shí)得到的相似的n-鈣黏著蛋白陽性的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)。當(dāng)在第21天更換時(shí)，形成最有組織性的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)。

當(dāng)在第7-14天、第14-21天或第21-35天添加hedgehog抑制劑環(huán)杷明(1μm)時(shí)，向kirrel2陽性細(xì)胞的分化沒有進(jìn)一步提高。

[實(shí)施例3]通過分散培養(yǎng)人多能干細(xì)胞衍生的小腦板組織進(jìn)行的浦肯野細(xì)胞和小腦中間神經(jīng)元的分化

(方法)

按照實(shí)施例1和2的方法培養(yǎng)人多能干細(xì)胞聚集體，并且，在培養(yǎng)的第35天，使用針對小腦γ-氨基丁酸能神經(jīng)祖先細(xì)胞標(biāo)記kirrel2的抗體經(jīng)由facs分離kirrel2陽性細(xì)胞。將分離的kirrel2陽性細(xì)胞和由第14天胚胎小鼠的上菱唇制備的小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞通過細(xì)胞分散酶(tryple，lifetechnologies)分散成單個(gè)細(xì)胞，并且在用聚d-賴氨酸/層粘連蛋白包被的蓋玻片上在dmem/f12/10％fbs培養(yǎng)基中(5％co2，37℃)培養(yǎng)。在共同培養(yǎng)中，相對于小鼠來源的小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞(10體積)，混合人多能干細(xì)胞衍生的kirrel陽性細(xì)胞(1體積)。在6–12小時(shí)后，添加dmem/f12/n2/bsa/三-碘甲腺原氨酸(t3)，以將fbs濃度減少為約0.8％。然后，以每周一次的頻率，將一半培養(yǎng)基更換為dmem/f12/n2/bsa/三-碘甲腺原氨酸(t3)/胞嘧啶β-d-阿拉伯呋喃糖苷(ara-c)，以維持培養(yǎng)(muguruma等人，natureneurosci.，13，1171-1180，2010)。在自共同培養(yǎng)起始起的第15-115天，通過免疫熒光法分析細(xì)胞成熟。

(結(jié)果)

按照實(shí)施例1和2的方法培養(yǎng)人多能干細(xì)胞聚集體，并且在第35天，使用抗-kirrel2抗體通過facs分離細(xì)胞。觀察到幾乎30％的暴露于fgf2的細(xì)胞是kirrel2陽性的(圖4，右圖)。

將分離的細(xì)胞與小鼠上菱唇衍生的細(xì)胞共同培養(yǎng)。在第15天(在分化誘導(dǎo)后，總天數(shù)50)，觀察到浦肯野細(xì)胞特異性標(biāo)記l7/pcp2和鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)，并且在這些標(biāo)記陽性細(xì)胞中觀察到軸突延伸和不成熟的樹突的形成(圖5a)。在共同培養(yǎng)的第58天(總天數(shù)93)，觀察到l7陽性細(xì)胞的樹突分支和延伸(圖5b)。不僅在人es細(xì)胞的情形中，也在類似培養(yǎng)的人ips細(xì)胞(4個(gè)細(xì)胞系)的情形中發(fā)現(xiàn)此類l7陽性細(xì)胞的出現(xiàn)。此外，在共同培養(yǎng)的第110天(總天數(shù)145)，可能觀察到浦肯野細(xì)胞樹突棘特異性glurdelta2的表達(dá)和樹突棘的形態(tài)學(xué)清楚的形成(圖5c，d)。也可能證實(shí)在樹突棘中表達(dá)的glurdelta2與其配體cbln1結(jié)合(圖5e)。在該共同培養(yǎng)系統(tǒng)中，分離的kirrel2陽性細(xì)胞主要分化成浦肯野細(xì)胞，但是它們中的一些在長期的共同培養(yǎng)后(58–113天)分化成類似的kirrel2陽性的γ-氨基丁酸能中間神經(jīng)元高爾基細(xì)胞(圖5f，神經(jīng)顆粒蛋白陽性的細(xì)胞)、小清蛋白陽性的中間神經(jīng)元。

[實(shí)施例4]在人多能干細(xì)胞衍生的小腦板組織中形成神經(jīng)上皮和菱唇組織

(方法)

按照實(shí)施例1和2的方法培養(yǎng)人多能干細(xì)胞聚集體，并且，在培養(yǎng)的第35天，通過免疫熒光法分析組織分化。

(結(jié)果)

在培養(yǎng)的第35天，在kirrel2陽性的神經(jīng)上皮組織中觀察到小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞特異性的atoh1陽性細(xì)胞(圖6a，c)。atoh1陽性細(xì)胞還表達(dá)其他小腦顆粒細(xì)胞標(biāo)記，如barhl1，sox2和zic1(圖6b，d，e)。小腦神經(jīng)細(xì)胞從kirrel2陽性的腦室區(qū)和atoh1陽性的菱唇產(chǎn)生。結(jié)果表明，按照實(shí)施例1和2的方法，誘導(dǎo)了人多能干細(xì)胞向kirrel2陽性的腦室區(qū)和atoh1陽性的菱唇的分化，并且形成了小腦板組織。

盡管從fgf2-處理的小鼠es細(xì)胞-衍生的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)atoh1陽性的細(xì)胞需要添加bmp4(muguruma等人，natureneurosci.，13，1171-1180，2010)，但是從人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)atoh1陽性的細(xì)胞無需添加bmp4。

[實(shí)施例5]從衍生自人多能干細(xì)胞的小腦板組織分化小腦顆粒細(xì)胞和小腦核細(xì)胞

(方法)

按照實(shí)施例1和2的方法培養(yǎng)人多能干細(xì)胞聚集體，并且在第21天及以后在神經(jīng)培養(yǎng)基(neurobasal/glutamaxi/n2)中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第28天及以后，通過每周一次更換全部量的培養(yǎng)基來連續(xù)培養(yǎng)所述聚集體，并且在培養(yǎng)的第35天和第53天通過免疫熒光法分析。

另外，通過重聚培養(yǎng)系統(tǒng)分析人多能干細(xì)胞衍生的atoh1陽性細(xì)胞向小腦顆粒細(xì)胞的分化。即，按照上文提及的方法培養(yǎng)人多能干細(xì)胞，并且在第42–49天，使用細(xì)胞分散劑(tryple，lifetechnologies)分散成單個(gè)細(xì)胞。將pcag-gfp電穿孔到細(xì)胞中，從而標(biāo)記所述細(xì)胞。另一方面，將從2日齡icr系統(tǒng)小鼠分離的小腦分散成單個(gè)細(xì)胞，并取其20個(gè)體積與1體積的用gfp標(biāo)記的人多能干細(xì)胞衍生的神經(jīng)祖先細(xì)胞混合。將細(xì)胞混合物離心形成細(xì)胞聚集體，將所述細(xì)胞聚集體在用聚d-賴氨酸/層粘連蛋白包被的蓋玻片上在dmem/f12/n2/10％fbs(5％co2，37℃)中培養(yǎng)(muguruma等人，natureneurosci.，13，1171-1180，2010)。在重聚培養(yǎng)后，在第5天和第8天，通過免疫熒光法分析所述細(xì)胞。

(結(jié)果)

在培養(yǎng)的第35天，barhl1單個(gè)細(xì)胞位于神經(jīng)上皮組織中共表達(dá)barhl1和atoh1的細(xì)胞的外側(cè)，并且lhx2陽性的細(xì)胞進(jìn)一步位于其最外側(cè)(圖7a，b)。這表示atoh1陽性的菱唇衍生的小腦神經(jīng)祖先細(xì)胞在人多能干細(xì)胞衍生的小腦板組織中移動，并且向顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞(barhl1)和小腦核祖先細(xì)胞(lhx2)的分化持續(xù)進(jìn)行。此外，在培養(yǎng)的第53天，共表達(dá)菱唇衍生的小腦核細(xì)胞祖先細(xì)胞標(biāo)記tbr1和smi32的大細(xì)胞位于所述聚集體中(圖7c)。

在重聚培養(yǎng)的第5天，gfp-標(biāo)記的人多能干細(xì)胞衍生的細(xì)胞延伸長的神經(jīng)突伸出所述細(xì)胞聚集體外(圖8a)。gfp陽性細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記map2陽性的，并且發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞體(cellsoma)表達(dá)小腦顆粒細(xì)胞祖先細(xì)胞特異性的標(biāo)記barhl1、pax6，并且沿著神經(jīng)突移動(圖8b，c)。在第8天，細(xì)胞體的移動方向從切線方向變?yōu)榇怪狈较?圖8d)。證實(shí)所述改變移動方向的細(xì)胞也表達(dá)map2和pax6。這些結(jié)果表明，由于在重聚培養(yǎng)系統(tǒng)中它們重現(xiàn)來自菱唇的小腦顆粒細(xì)胞在小腦板表面層上以切線方向的移動，以及按照發(fā)育移動方向由所述切線方向變?yōu)橹赶蛐∧X板更深部分的垂直方向的變化，因而可以誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞向小腦顆粒細(xì)胞的分化。

[實(shí)施例6]通過添加fgf19促進(jìn)具有背腹軸模式的小腦板組織和其周圍組織的形成

(方法)

按照實(shí)施例1和2的方法培養(yǎng)人多能干細(xì)胞聚集體。在培養(yǎng)的第14天，以100ng/ml的終濃度添加fgf19。在第21天及以后，將細(xì)胞在神經(jīng)培養(yǎng)基(neurobasal/glutamaxi/n2)中培養(yǎng)。在第28天，將全部量的培養(yǎng)基更換為相同的培養(yǎng)基，并且在第35天，通過免疫熒光法分析組織分化。

(結(jié)果)

當(dāng)不添加fgf19時(shí)，在第35天在細(xì)胞聚集體中觀察到兩種不同類型的kirrel2陽性神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)。大部分細(xì)胞聚集體具有小玫瑰花結(jié)樣神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)(圖9a)。其余的細(xì)胞聚集體(-30％)包含少量更大的扁平-卵形神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)(圖9b)。后一種類型的神經(jīng)上皮是連續(xù)的并且更厚。有趣的是，關(guān)于每個(gè)細(xì)胞聚集體，作為小腦板神經(jīng)上皮標(biāo)記的kirrel2表達(dá)在扁平-卵形神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)的最外側(cè)(圖9b)。相反，細(xì)胞聚集體中的小玫瑰花結(jié)沒有表現(xiàn)出具有明確的極性的kirrel2的定位(圖9a)。

添加fgf19促進(jìn)細(xì)胞聚集體中連續(xù)的扁平-卵形神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)的形成(圖9c)。添加fgf19導(dǎo)致在人多能干細(xì)胞衍生的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)中形成具有沿著神經(jīng)管背腹軸的極性的結(jié)構(gòu)。即，作為小腦神經(jīng)祖先細(xì)胞標(biāo)記并且表達(dá)在神經(jīng)管背側(cè)的kirrel2-、ptf1a-、skor2-陽性的細(xì)胞位于細(xì)胞聚集體的最外側(cè)，并且占據(jù)每個(gè)神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)的1/3-1/2的區(qū)域。atoh1也在最外側(cè)表達(dá)。相反，腹側(cè)標(biāo)記nkx6.1、foxa2在相對的區(qū)域(細(xì)胞聚集體的內(nèi)側(cè))上表達(dá)(圖10)。這些結(jié)果表明，在人多能干細(xì)胞的第三階段培養(yǎng)中，fgf19促進(jìn)具有背側(cè)表面明確的背-腹極性的吻側(cè)后腦神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)的自形成(圖11)。

盡管fgf19甚至在50ng/ml的濃度促進(jìn)神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)中具有沿著神經(jīng)管背腹軸的極性的結(jié)構(gòu)的形成，但是，其效果(頻率)約為在100ng/ml時(shí)的1/3。300ng/mlfgf19類似地促進(jìn)背腹軸模式的形成。其效果(頻率)是與在100ng/ml時(shí)相同的水平。甚至當(dāng)在培養(yǎng)的第10天添加fgf19時(shí)，促進(jìn)背腹軸模式的形成，但是效率低。當(dāng)使用fgf8或fgf17替代fgf19時(shí)，如fgf19一樣，促進(jìn)背腹軸模式形成，但是效果弱于fgf19。

[實(shí)施例7]通過添加gdf7促進(jìn)小腦板組織中菱唇的形成

(方法)

按照實(shí)施例6的方法培養(yǎng)人多能干細(xì)胞聚集體。在第21天，以100ng/ml的終濃度添加gdf7。將細(xì)胞在神經(jīng)培養(yǎng)基(neurobasal/glutamaxi/n2)中連續(xù)培養(yǎng)。在第28天，將全部量的培養(yǎng)基更換為不含gdf7的相同的培養(yǎng)基，并且在第35天，通過免疫熒光法和定量pcr法分析所述細(xì)胞。

(結(jié)果)

添加gdf7促進(jìn)人多能干細(xì)胞衍生的神經(jīng)祖先組織中atoh1陽性細(xì)胞的表達(dá)(圖12左圖，中間圖)。在基因水平上，其增加至添加fgf2的約220-倍，并且增加至添加fgf2的1.5-倍(圖12，右圖)。這些結(jié)果表明在培養(yǎng)的第21天添加gdf7促進(jìn)菱唇的形成。

甚至在自培養(yǎng)的第14天添加gdf7時(shí)，誘導(dǎo)atoh1陽性的細(xì)胞；然而，細(xì)胞聚集體的生長被抑制，細(xì)胞聚集體的尺寸變小，并且神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)趨向瓦解。在第28天及以后，甚至在沒有從培養(yǎng)基中去除gdf7的條件下，沒有發(fā)現(xiàn)對菱唇形成的不利影響。

在小鼠中，已知bmp4促進(jìn)菱唇的形成。然而，在上文提及的檢測系統(tǒng)中，使用bmp4替代gdf7不能誘導(dǎo)從人多能干細(xì)胞形成菱唇。這表明，在小鼠與人之間，在體外從多能干細(xì)胞誘導(dǎo)菱唇所需要的因子是不同的，并且gdf7對于在人中形成菱唇是重要的，并且gdf7不能用bmp4替代。

[實(shí)施例8]通過添加sdf1促進(jìn)小腦板組織中菱唇的形成和小腦板3層結(jié)構(gòu)的形成

(方法)

按照實(shí)施例6的方法培養(yǎng)人多能干細(xì)胞聚集體。在第21天及以后，將細(xì)胞在神經(jīng)培養(yǎng)基(neurobasal/glutamaxi/n2)中培養(yǎng)。在第28天，將全部量的培養(yǎng)基更換為相同的培養(yǎng)基，并且以300ng/ml的終濃度添加sdf1。在第35天，通過免疫熒光法分析組織分化。

(結(jié)果)

在不添加sdf1的條件下，檢查在大的扁平-卵形神經(jīng)上皮的自形成中的時(shí)程變化(時(shí)間方面)。在第21天，在細(xì)胞聚集體中形成的神經(jīng)組織幾乎不表現(xiàn)出上皮形成或頂端-基底極性(圖13a)。直到第24-28天，形成具有頂端-基底極性的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)；然而，大部分是小玫瑰花結(jié)(圖13b，c)。到第35天，神經(jīng)上皮玫瑰花結(jié)轉(zhuǎn)變?yōu)榇蟮谋馄?卵形結(jié)構(gòu)，其頂端側(cè)位于內(nèi)側(cè)(頂端朝內(nèi))(圖13d)。

添加sdf1促進(jìn)連續(xù)的kirrel2陽性神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)的形成(圖14a-c)。與不用sdf1處理的神經(jīng)上皮不同，sdf1處理的小腦神經(jīng)上皮(kirrel2+)在細(xì)胞聚集體的表面區(qū)域上連續(xù)形成，頂端側(cè)位于最外側(cè)(頂端朝外)(圖14a和b；與該觀點(diǎn)一致，sox2+腦室區(qū)細(xì)胞位于神經(jīng)上皮的表面?zhèn)?，并且shor2+浦肯野祖先細(xì)胞位于更深的部分；圖14c)。在kirrel2陽性神經(jīng)上皮的邊緣，形成包含sox2陽性神經(jīng)祖先細(xì)胞的卷曲的組織，并且atoh1、barhl1陽性細(xì)胞位于此(圖14d-f)。這些結(jié)果表明，添加sdf1促進(jìn)由人多能干細(xì)胞形成kirrel2陽性的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)，并且能夠允許菱唇的連續(xù)構(gòu)造。其進(jìn)一步闡明，在連續(xù)的神經(jīng)上皮中，從頂端表面連續(xù)自形成包括腦室區(qū)(kirrel2，sox2，ptf1a陽性的)、浦肯野細(xì)胞層(lhx5，oligo2陽性的)、和衍生自神經(jīng)細(xì)胞層的菱唇(atoh1，barh1陽性的)的3層結(jié)構(gòu)(圖14g-l)。

sdf1在濃度為100ng/ml和500ng/ml時(shí)也促進(jìn)小腦板組織中菱唇的形成和3層小腦板結(jié)構(gòu)的形成。甚至在自第21天添加sdf1時(shí)，觀察到與在自第28天添加的效果相似的效果?；|(zhì)膠(matrigel)或?qū)诱尺B蛋白不能替代sdf1。

從上述表明用fgf2和fgf19處理的人多能干細(xì)胞衍生的聚集體能夠自形成具有背-腹極性的連續(xù)的神經(jīng)上皮，并且另外的sdf1處理促進(jìn)atoh+/barhl1+菱唇-樣結(jié)構(gòu)和層狀小腦神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)(如在早期小腦發(fā)育中觀察到的那些)的自發(fā)形成(圖15)。

[實(shí)施例9]由人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的浦肯野細(xì)胞的功能分析

(方法)

按照實(shí)施例3的方法，由人多能干細(xì)胞聚集體分化成熟的浦肯野細(xì)胞。使用膜片鉗技術(shù)，分析其電生理反應(yīng)。

(結(jié)果)

可以觀察浦肯野細(xì)胞特有的四個(gè)電生理反應(yīng)(圖16)。第一個(gè)是自發(fā)動作電位的反復(fù)觸發(fā)。第二個(gè)是超極化-激活的陽離子通道電流(ih電流)。第三個(gè)是通過ampa受體抑制劑(nbqx)抑制微小的興奮性突觸后電流。第四個(gè)是微小的興奮性突觸后電流不受nmda受體抑制劑抑制。這些特征表明“谷氨酸接收不受nmda受體調(diào)控但是依賴于ampa受體”，這是浦肯野細(xì)胞的特征。

[工業(yè)適用性]

按照本發(fā)明，可以在體外從人多能干細(xì)胞有效地誘導(dǎo)小腦祖先組織。本發(fā)明可用于篩選用于由小腦紊亂導(dǎo)致的疾病的治療藥，檢測副作用和毒性，并且開發(fā)用于所述疾病的新治療方法等。

盡管已經(jīng)著重于優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是所述優(yōu)選的實(shí)施方案可以進(jìn)行改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。本發(fā)明旨在本發(fā)明可以通過除了本說明書中詳細(xì)描述的那些之外的方法實(shí)施。因此，本發(fā)明包括附上的“權(quán)利要求書”的精神和范圍所涵蓋的所有改進(jìn)。

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本申請是基于在日本提交的專利申請?zhí)?014-182758(申請日：2014年9月8日)，其內(nèi)容完整地結(jié)合于此。