本發(fā)明涉及新的氨基取代的稠合的嘧啶、其制備方法、其單獨或以結合物的形式用于治療和/或預防疾病的用途，及其用于制備用于治療和/或預防疾病的藥物的用途，特別是用于制備用于治療和/或預防心血管病癥的藥物的用途。
哺乳動物細胞中最重要的細胞傳遞系統(tǒng)之一是環(huán)磷酸鳥苷(cgmp)。其連同一氧化氮(no)一起形成no/cgmp系統(tǒng)，一氧化氮由內(nèi)皮釋放并且傳遞激素和機械信號。鳥苷酸環(huán)化酶催化由鳥苷三磷酸(gtp)生物合成cgmp。目前已知的鳥苷酸環(huán)化酶家族的代表可以根據(jù)結構特征或配體類型分為兩組：可由利鈉肽激發(fā)的顆粒狀鳥苷酸環(huán)化酶和可由no激發(fā)的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶?？扇苄曾B苷酸環(huán)化酶由兩個亞基構成，并且很可能每個異源二聚體含有一個血紅素，其是調(diào)控中心的一部分。這對于激活機制來說是至關重要的。no能夠與血紅素的鐵原子結合并因此顯著增加酶的活性。相比之下，不含血紅素的制劑不能被no激發(fā)。一氧化碳(co)也能夠與血紅素的中心鐵原子結合，但是由co引起的激發(fā)遠小于由no引起的激發(fā)。
通過形成cgmp，以及由于所引起的對磷酸二酯酶、離子通道和蛋白激酶的調(diào)節(jié)，鳥苷酸環(huán)化酶在各種生理過程中起著重要作用，特別是在平滑肌細胞的松弛和增殖中、在血小板凝集和血小板粘附中、在神經(jīng)元信號傳遞中以及在基于上述過程中斷的病癥中。在病理生理條件下，no/cgmp系統(tǒng)可被抑制，這會導致例如高血壓、血小板激活、增加的細胞增殖、內(nèi)皮功能障礙、動脈硬化、心絞痛、心力衰竭、心肌梗塞、形成血栓、中風和性功能障礙。
由于預期的高效率和低水平的副作用，通過靶向生物體內(nèi)cgmp信號通路的影響，可行的用于這類病癥的no非依賴性治療是一種有前景的方法。
迄今為止，對于治療性激發(fā)可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，僅使用作用基于no的化合物，例如有機硝酸酯。no通過生物轉化形成，并且通過攻擊血紅素的中心鐵原子來激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶。除了副作用外，耐受性的增長也是這種治療模式的關鍵缺點之一。
幾年前，已經(jīng)記載了直接激發(fā)可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的一些物質(zhì)，即不預先釋放no，例如3-(5'-羥甲基-2'-呋喃基)-1-芐基吲唑[yc-1；wu等人，blood84(1994)，4226；mülsch等人，brit.j.pharmacol.120(1997)，681]。最近的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的刺激物包括bay41-2272、bay41-8543和riociguat(bay63-2521)(參見，例如staschj.-p.等人，nat.rev.drugdisc.2006；5：755-768；staschj.-p.等人，chemmedchem2009；4：853-865.staschj.-p.等人，circulation2011；123：2263-2273)。令人感興趣的是，除了直接的鳥苷酸環(huán)化酶激發(fā)以外，這些sgc刺激物的一些(例如yc-1或bay41-2272)還表現(xiàn)出pde-5-抑制作用。為了使cgmp通路最大化，在藥理學上希望刺激cgmp的合成同時抑制經(jīng)pde-5的降解。這種雙重原理在藥理學方面是特別有利的(參見，例如oudout等人，eur.urol.2011；60，1020-1026；albersen等人，jsexmed.2013；10，1268-1277)。
在本發(fā)明的上下文中，當本發(fā)明的化合物表現(xiàn)出對重組鳥苷酸環(huán)化酶報道細胞系有效(根據(jù)b-2中的研究，最小有效濃度(mec)≤3μm)，并且表現(xiàn)出對人類磷酸二酯酶-5(pde5)的抑制(根據(jù)b-3中的研究，ic50<100nm)時，滿足雙重原理。
磷酸二酯酶-5(pde5)是一種切斷cgmp中的磷酸酯鍵并形成5'-一磷酸鳥苷(5′-gmp)的酶的名稱。在人類中，磷酸二酯酶-5主要存在于陰莖海綿體和肺動脈的平滑肌中。通過抑制pde5來阻斷cgmp降解(使用例如西地那非、伐地那非或他達拉非)導致松弛信號通道的信號增加，特別是導致陰莖海綿體中的血液供應增加和肺血管中的壓力降低。它們用于治療勃起功能障礙和肺動脈高壓。除了pde5之外，還存在切斷cgmp的磷酸二酯酶(stasch等人circulation2011；123，2263-2273)。
作為可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的刺激物，wo00/06568和wo00/06569公開了稠合的吡唑衍生物，以及wo03/095451公開了氨基甲酸酯取代的3-嘧啶基吡唑并吡啶。具有苯基酰胺取代基的3-嘧啶基吡唑并吡啶記載于e.m.becker等人，bmcpharmacology1(13)，2001。wo2004/009590記載了用于治療cns病癥的具有取代基4-氨基嘧啶的吡唑并吡啶。wo2010/065275和wo2011/149921公開了作為sgc激活劑的取代的吡咯并嘧啶和二氫吡啶并嘧啶。作為sgc的刺激物，wo2012/004259記載了稠合的氨基嘧啶，以及wo2012/004258、wo2012/143510和wo2012/152629記載了稠合的嘧啶和三嗪。wo2012/28647公開了用于治療心血管病癥的具有各種氮雜環(huán)的吡唑并吡啶。
本發(fā)明的目的是提供用作可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的刺激物的新物質(zhì)，其還用作可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的刺激物和磷酸二酯酶-5的抑制劑(雙重原理)，并且與現(xiàn)有技術已知的化合物相比，所述物質(zhì)具有相同或改進的治療特征，例如關于它們的體內(nèi)特性(例如它們的藥代動力學和藥效動力學特性)、它們的溶解性和/或它們的代謝特征和/或它們的劑量-活性關系。
本發(fā)明的化合物的顯著特征在于改進的溶解性，同時高的細胞滲透性。
本發(fā)明涉及通式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物
其中
a表示氮或碳，
r1表示苯基、吡啶基、3,3,3-三氟丙-1-基、4,4,4-三氟丁-1-基或3,3,4,4,4-五氟丁-1-基，
其中苯基被1至3個取代基取代，所述取代基彼此獨立地選自氟、氯、(c1-c4)-烷基、環(huán)丙基和(c1-c4)-烷氧基，
并且
其中吡啶基被1或2個取代基取代，所述取代基彼此獨立地選自氟、(c1-c4)-烷基、環(huán)丙基和(c1-c4)-烷氧基，
r2表示氫或(c1-c4)-烷基，
r3表示(c1-c6)-烷基，
其中(c1-c6)-烷基被氨基取代并且被氟取代至多5次，
r4表示(c1-c4)-烷基，
其中(c1-c4)-烷基可被氟取代至多五次，
r5表示(c1-c4)-烷基，
其中(c1-c4)-烷基可被氟取代至多五次，
或
r4和r5連同與它們連接的碳原子一起形成3至6元碳環(huán)，
r6表示氫，
r7表示氫或氟，
r8表示氫、氯、氟或(c1-c4)-烷基。
本發(fā)明的化合物為式(i)的化合物及其鹽、其溶劑合物以及其鹽的溶劑合物，包含于式(i)的下文所述式的化合物及其鹽、其溶劑合物以及其鹽的溶劑合物，及包含于式(i)并在下文中作為工作實施例示出的化合物及其鹽、其溶劑合物及其鹽的溶劑合物，在這個意義上，包含于式(i)并在下文中示出的化合物并不已經(jīng)是鹽、溶劑合物及鹽的溶劑合物。
在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選的鹽為本發(fā)明的化合物的生理上可接受的鹽。還包括其本身不適于藥學應用但可用于例如分離或純化本發(fā)明的化合物的鹽。
本發(fā)明的化合物的生理上可接受的鹽包括無機酸、羧酸和磺酸的酸加成鹽，例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、苯磺酸鹽、萘二磺酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、蘋果酸鹽、檸檬酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽和苯甲酸鹽。
本發(fā)明的化合物的生理上可接受的鹽還包括常規(guī)堿的鹽，例如且優(yōu)選堿金屬鹽(例如鈉鹽和鉀鹽)、堿土金屬鹽(例如鈣鹽和鎂鹽)，和衍生自氨或具有1至16個碳原子的有機胺的銨鹽，所述有機胺例如且優(yōu)選乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二異丙基胺、單乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二環(huán)己胺、二甲基氨基乙醇、普魯卡因、二芐基胺、n-甲基嗎啉、精氨酸、賴氨酸、乙二胺和n-甲基哌啶。
在本發(fā)明的上下文中，溶劑合物是指本發(fā)明的化合物通過與溶劑分子配位而形成固態(tài)或液態(tài)的絡合物的那些形式。水合物是一種具體形式的溶劑合物，其中配位是與水發(fā)生的。在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選的溶劑合物是水合物。
根據(jù)其結構，本發(fā)明的化合物可以不同的立體異構體的形式存在，即以構型異構體的形式存在或如果合適作為構象異構體(對映異構體和/或非對映異構體，包括阻轉異構體的那些)的形式存在。因此，本發(fā)明包括對映異構體和非對映異構體，以及其各自的混合物?？梢杂靡阎姆椒◤倪@些對映異構體和/或非對映異構體的混合物中分離出立體異構的均一組分；為此，優(yōu)選使用色譜法，特別是在非手性相或手性相上的hplc色譜法。
如果本發(fā)明的化合物可以互變異構的形式存在，則本發(fā)明包括所有互變異構形式。
本發(fā)明還包括本發(fā)明化合物的所有適合的同位素變體。在本文中，本發(fā)明化合物的同位素變體應理解為意指這樣的化合物：其中本發(fā)明的化合物中的至少一個原子被替換為原子序數(shù)相同但原子質(zhì)量與在自然界中通?；蛑饕嬖诘脑淤|(zhì)量不同的另一原子?？梢氡景l(fā)明的化合物的同位素的實例為氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的同位素，例如2h(氘)、3h(氚)、13c、14c、15n、17o、18o、32p、33p、33s、34s、35s、36s、18f、36cl、82br、123i、124i、129i和131i。本發(fā)明的化合物的特定的同位素變體，尤其是其中已引入一種以上的放射性同位素的那些變體可以有利于例如研究作用機制或活性化合物在機體內(nèi)的分布；由于相對容易的可制備性和可檢測性，用3h或14c同位素標記的化合物特別適于此目的。此外，引入同位素(例如氘)可因化合物的代謝穩(wěn)定性更高而產(chǎn)生特別的治療益處，例如延長在機體中的半衰期或降低所需的活性劑量；因此，在一些情況下，本發(fā)明的化合物的這種改性還可構成本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本發(fā)明化合物的同位素變體可通過本領域技術人員已知的方法來制備，例如通過下文描述的方法以及在工作實施例中描述的步驟，通過使用相應同位素修飾的特定試劑和/或原料來制備。
另外，本發(fā)明還包括本發(fā)明的化合物的前藥。在本發(fā)明的上下文中，術語“前藥”是指這樣的化合物：其本身可以是生物活性的或無生物活性的，但其在體內(nèi)停留的期間反應(例如代謝或水解)得到本發(fā)明的化合物。
在本發(fā)明的上下文中，除非另有說明，取代基具有以下定義：
在本發(fā)明的上下文中，烷基為具有指定的特定碳原子數(shù)的直鏈或支鏈烷基基團。例如且優(yōu)選地可述及以下基團：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、1-甲基丙基、叔丁基、正戊基、異戊基、1-乙基丙基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,4-二甲基戊基、4,4-二甲基戊基和1,4,4-三甲基戊基。
在本發(fā)明的上下文中，烷氧基為具有1至4個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基基團。例如且優(yōu)選地可述及以下基團：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基和叔丁氧基。
在本發(fā)明的上下文中，環(huán)烷基或碳環(huán)為具有各自指定的環(huán)碳原子數(shù)的單環(huán)飽和烷基。例如且優(yōu)選地可述及以下基團：環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)庚基。
在本發(fā)明的上下文中，鹵素包括氟、氯、溴和碘。優(yōu)選氯或氟。
在r1和r3可代表的基團的式中，由符號#或##標記的線的端點不代表碳原子或ch2基團，而是與r1或r3鍵合的各原子的鍵的一部分。
當本發(fā)明的化合物中的基團被取代時，所述基團可被單取代或多取代，除非另有說明。在本發(fā)明的上下文中，出現(xiàn)大于一次的所有基團以彼此獨立的方式進行定義。優(yōu)選被一個或兩個相同或不同的取代基取代。非常特別優(yōu)選被一個取代基取代。
在本發(fā)明的上下文中，術語“治療(treatment或treating)”包括抑制、延遲、阻止、緩解、減輕、限制、降低、壓制、消退或治愈疾病、病癥、障礙、損傷或健康問題，或所述狀態(tài)和/或所述狀態(tài)的癥狀的發(fā)展、進程或演進。在本文中，術語“治療(therapy)”應理解為術語“治療(treatment)”的同義詞。
在本發(fā)明的上下文中，術語“預防(prevention)”、“預防(prophylaxis)”或“阻止(preclusion)”同義使用，并且是指避免或降低感染、經(jīng)受、遭受或患有疾病、病癥、障礙、損傷或健康問題的風險，或避免或降低所述狀態(tài)和/或所述狀態(tài)的癥狀的發(fā)展或演進的風險。
可以部分或完全治療或預防疾病、病癥、障礙、損傷或健康問題。
在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
a表示氮或碳，
r1表示苯基或吡啶基，
其中苯基被1至3個彼此獨立地選自氟和甲基的取代基取代，
并且
其中吡啶基被1或2個彼此獨立地選自氟和甲基的取代基取代，
r2表示氫或甲基，
r3表示
其中
##表示與氮原子連接的點，
r4表示甲基或乙基，
其中甲基和乙基可被氟取代至多三次，
r5表示甲基或乙基，
其中甲基和乙基可被氟取代至多三次，
r6表示氫，
r7表示氫或氟，
r8表示氫、氯、甲基或乙基。
在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
a表示氮，
r1表示苯基或吡啶基，
其中苯基被1至3個氟取代基取代，
并且
其中吡啶基被氟取代，
r2表示氫，
r3表示
其中
##表示與氮原子連接的點，
r4表示甲基或三氟甲基，
r5表示甲基或三氟甲基，
r6表示氫，
r7表示氫或氟，
r8表示氫、甲基或乙基。
在本發(fā)明的上下文中，特別優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
a表示氮，
r1表示下式的苯基
其中
#表示與亞甲基連接的點，
并且
r9表示氫或氟，
r10表示氟，
r11表示氫或氟，
或
表示3-氟吡啶-2-基，
r2表示氫，
r3表示
其中
##表示與氮原子連接的點，
r4表示甲基，
r5表示甲基或三氟甲基，
r6表示氫，
r7表示氫或氟，
r8表示氫或甲基。
在本發(fā)明的上下文中，還優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
a表示氮或碳。
在本發(fā)明的上下文中，還優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
a表示碳。
在本發(fā)明的上下文中，還特別優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
a表示氮。
在本發(fā)明的上下文中，還優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
r1表示下式的苯基
其中
#表示與亞甲基連接的點，
并且
r9表示氫或氟，
r10表示氟，
r11表示氫或氟，
或
表示3-氟吡啶-2-基。
在本發(fā)明的上下文中，還優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
r1表示下式的苯基
其中
#表示與亞甲基連接的點，
并且
r9表示氫或氟，
r10表示氟，
r11表示氫或氟。
在本發(fā)明的上下文中，還優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
r1表示3-氟吡啶-2-基。
在本發(fā)明的上下文中，還優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
r3表示
其中
##表示與氮原子連接的點。
在本發(fā)明的上下文中，還優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
r4表示甲基。
在本發(fā)明的上下文中，還優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
r5表示甲基或三氟甲基。
在本發(fā)明的上下文中，還優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
r5表示甲基。
在本發(fā)明的上下文中，還優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
r5表示三氟甲基。
在本發(fā)明的上下文中，還優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
r7表示氫或氟。
在本發(fā)明的上下文中，還優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
r7表示氫。
在本發(fā)明的上下文中，還優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
r7表示氟。
在本發(fā)明的上下文中，還優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
r8表示氫或甲基。
在本發(fā)明的上下文中，還優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
r8表示氫。
在本發(fā)明的上下文中，還優(yōu)選式(i)的化合物及其n-氧化物、其鹽、其溶劑合物、其n-氧化物的鹽以及其n-氧化物和鹽的溶劑合物，其中
r8表示甲基。
在基團的各個組合或優(yōu)選的組合中，具體說明的各基團的定義還視需要獨立于所述基團的各個組合而被其他組合的基團定義替代。
非常特別優(yōu)選上述優(yōu)選范圍的兩個以上的結合。
指定為優(yōu)選、特別優(yōu)選和非常特別優(yōu)選的基團定義同時適用于式(i)的化合物并相應地適用于所有中間體。
此外，本發(fā)明提供了一種制備本發(fā)明的式(i)的化合物的方法，其特征在于，式(ii)的化合物
其中r1、r6、r7和r8各自具有上文給出的含義，
在惰性溶劑中，任選地在合適的堿的存在下與式(iii)的化合物反應
其中r4和r5各自具有上文給出的含義，并且
t1表示(c1-c4)-烷基，
得到式(iv)的化合物
其中r1、r4、r5、r6、r7和r8各自具有上文給出的含義，
然后，將式(iv)的化合物用亞硝酸異戊酯和碘等價物轉化為式(v)的化合物
其中r1、r4、r5、r6、r7和r8各自具有上文給出的含義，
然后，在惰性溶劑中將式(v)的化合物用式(vi)的化合物進行轉化
其中
r2和r3各自具有上文給出的含義，
并將所得的式(i)的化合物任選地用合適的(i)溶劑和/或(ii)堿或酸轉化成其溶劑合物、其鹽和/或其鹽的溶劑合物。
用于方法步驟(ii)+(iii)→(iv)的惰性溶劑為，例如，醇類，例如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇或叔丁醇；醚類，例如乙醚、二氧雜環(huán)己烷、二甲氧基乙烷、四氫呋喃、乙二醇二甲醚或二甘醇二甲醚；烴類，例如苯、二甲苯、甲苯、己烷、環(huán)己烷或礦物油餾分；或者其他溶劑，例如二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基亞砜(dmso)、n,n'-二甲基亞丙基脲(dmpu)、n-甲基吡咯烷酮(nmp)、吡啶、乙腈、環(huán)丁砜或水。也可以使用所述溶劑的混合物。優(yōu)選叔丁醇、甲醇或乙醇。
用于方法步驟(ii)+(iii)→(iv)的合適的堿為堿金屬氫氧化物，例如氫氧化鋰、氫氧化鈉或氫氧化鉀；堿金屬碳酸鹽，例如碳酸鋰、碳酸鈉、碳酸鉀或碳酸銫；堿金屬碳酸氫鹽，例如碳酸氫鈉或碳酸氫鉀；堿金屬醇鹽，例如甲醇鈉或甲醇鉀、乙醇鈉或乙醇鉀或者叔丁醇鉀；或者有機胺，例如三乙胺、二異丙基乙胺、吡啶、1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu)或1,5-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬-5-烯(dbn)。優(yōu)選叔丁醇鉀或甲醇鈉。
反應(ii)+(iii)→(iv)通常在+20℃至+150℃、優(yōu)選+75℃至+100℃的溫度范圍內(nèi)進行，任選地在微波中進行。轉化可在大氣壓、加壓或減壓(例如0.5至5巴)下進行。通常，所述反應在大氣壓下進行。
在轉化(iv)→(v)中，合適的鹵素來源為，例如，二碘甲烷，碘化銫、碘和碘化亞銅(i)或溴化銅(ii)的混合物。
在二碘甲烷作為鹵素來源的情況下，方法步驟(iv)→(v)使用基于1mol的式(iv)的化合物計5至30mol的亞硝酸異戊酯和5至30mol的碘等價物的摩爾比來進行。
方法步驟(iv)→(v)在存在或不存在溶劑的情況下進行。合適的溶劑為在反應條件下為惰性的全部有機溶劑。優(yōu)選的溶劑為二氧雜環(huán)己烷。
反應(iv)→(v)通常在+20℃至+100℃、優(yōu)選+50℃至+100℃的溫度范圍內(nèi)進行，任選地在微波中進行。所述轉化可在大氣壓、加壓或減壓下進行。
用于方法步驟(v)+(vi)→(i)的惰性溶劑為，例如，醚類，例如乙醚、二氧雜環(huán)己烷、二甲氧基乙烷、四氫呋喃、乙二醇二甲醚或二甘醇二甲醚；烴類，例如苯、二甲苯、甲苯、己烷、環(huán)己烷或礦物油餾分；或者其他溶劑，例如二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基亞砜(dmso)、n,n'-二甲基亞丙基脲(dmpu)、n-甲基吡咯烷酮(nmp)、吡啶、乙腈或環(huán)丁砜。也可以使用所述溶劑的混合物。優(yōu)選nmp或dmso。
反應(v)+(vi)→(i)通常在+20℃至+100℃、優(yōu)選+100℃至+200℃的溫度范圍內(nèi)進行，任選地在微波中進行。所述轉化可在大氣壓、加壓或減壓(例如0.5到5巴)下進行。
所述制備方法可以通過以下合成方案來舉例說明(方案1和方案2)：
方案1
[a):叔丁醇，任選地叔丁醇鉀，回流；b):二碘甲烷，亞硝酸異戊酯，二氧雜環(huán)己烷，85℃]。
方案2
[a):nmp，130℃；微波]。
式(iii)的化合物為市售的、文獻已知的或可通過類似于文獻已知的方法制備，
或者，
在式(iii)中，如果r5表示三氟甲基且r4表示甲基，則式(iii)的化合物可通過在惰性溶劑中使式(vii)的化合物與甲基鹵化鎂反應來制備
式(vii)的化合物是文獻已知的(參見，例如，journaloffluorinechemistry，1991，第51卷，#3，第323–334頁)。
式(ii)的化合物是文獻已知的(參見，例如，wo03/095451，實施例6a；wo2013/104703，實施例52a；wo2013/030288，實施例54a)或可按照下面的合成方案(方案3)制備。
方案3
[a):水合肼，1,2-乙二醇；b):亞硝酸異戊酯，nai，thf；c):cs2co3，dmf；d):cucn，dmso，e):1.naome，meoh，2.nh4cl，乙酸]。
式(viii)的化合物是文獻已知的[wo2007/041052]或可通過類似于文獻已知的方法制備[wo2013/004785和wo2011/149921]。
詳細步驟和其他文獻參考也可參見實驗部分關于制備起始化合物和中間體的部分。
本發(fā)明的其他化合物也可以任選地從通過上述方法獲得的式(i)化合物起始，通過轉化各個取代基的官能團(特別是針對r3列出的那些)來制備。這些轉化通過本領域技術人員已知的常規(guī)方法進行，并且包括，例如，下列反應：例如親核和親電取代、氧化、還原、氫化、過渡金屬催化的偶聯(lián)反應、消去、烷基化、氨基化、酯化、酯水解、醚化、醚裂解、形成羧酰胺(carbonamide)，以及引入和除去臨時保護基團。
本發(fā)明的化合物用作可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的有效刺激物，具有有用的藥理學特性且具有改善的治療特征，例如關于其體內(nèi)特性和/或其藥代動力學特征和/或其代謝特性。因此，它們適用于治療和/或預防人和動物中的疾病。
本發(fā)明的化合物導致血管舒張和抑制血小板凝集，并且導致血壓降低和冠狀血流增加。這些作用是通過直接激發(fā)可溶性鳥苷酸環(huán)化酶和細胞內(nèi)增加cgmp進行介導的。此外，本發(fā)明的化合物增強了增加cgmp水平的物質(zhì)的作用，所述物質(zhì)例如edrf(內(nèi)皮細胞衍生的松弛因子)、no供體、原卟啉ⅸ、花生四烯酸或苯肼衍生物。
本發(fā)明的化合物適用于治療和/或預防心血管、肺、血栓栓塞和纖維化病癥。
因此，本發(fā)明的化合物可以用在用于以下用途的藥物中：用于治療和/或預防心血管病癥，例如高血壓(hypertension)、難治性高血壓、急性和慢性心力衰竭、冠心病、穩(wěn)定型和不穩(wěn)定型心絞痛、外周和心血管疾病、心律不齊、房性和室性心律失常和傳導紊亂(例如i-iii度房室傳導阻滯(ab阻滯i-iii))、室上性快速性心律失常、心房纖維顫動、心房撲動、心室纖顫、心室撲動、室性快速型心律失常、尖端扭轉型室性心動過速、房性和室性期前收縮、房室交接區(qū)性期前收縮、病竇綜合征、暈厥、房室結折返性心動過速、沃-帕-懷綜合征、急性冠狀動脈綜合征(acs)、自身免疫性心臟疾病(心包炎、心內(nèi)膜炎、心瓣炎、主動脈炎、心肌疾病)、休克(例如心源性休克、感染性休克和過敏性休克)、動脈瘤、拳師犬心肌病(心室早發(fā)性收縮(pvc))；用于治療和/或預防血栓栓塞病癥和缺血，例如心肌缺血、心肌梗塞、中風、心臟肥大、短暫的缺血性發(fā)作、先兆子癇、炎性心血管病癥、冠狀動脈和外周動脈痙攣、水腫形成(例如肺水腫、腦水腫、腎水腫或者心力衰竭導致的水腫)、外周循環(huán)障礙、再灌注損傷、動脈和靜脈形成血栓、微白蛋白尿、心肌機能不全、內(nèi)皮功能障礙；用于預防再狹窄，例如溶栓治療、經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(pta)、冠狀動脈經(jīng)腔血管成形術(ptca)、心臟移植和搭橋手術后的再狹窄，以及微血管和大血管損傷(血管炎)、血纖蛋白原和低密度ldl水平升高和纖溶酶原激活物抑制劑1(pai-1)濃度升高；以及用于治療和/或預防勃起機能障礙和雌性性功能障礙。
在本發(fā)明的上下文中，術語“心力衰竭”包括急性和慢性形式的心力衰竭，以及更具體的或相關的疾病類型，例如急性代償失調(diào)性心力衰竭、右心衰竭、左心衰竭、全心衰竭(globalfailure)、缺血性心肌病、擴張型心肌病、肥厚型心肌病、特發(fā)性心肌病、先天性心臟缺陷、與心瓣膜缺陷相關的心力衰竭、二尖瓣狹窄、二尖瓣閉鎖不全、主動脈瓣狹窄、主動脈瓣閉鎖不全、三尖瓣狹窄、三尖瓣閉鎖不全、肺動脈瓣狹窄、肺動脈瓣閉鎖不全、混合性心瓣膜缺陷、心肌炎癥(心肌炎)、慢性心肌炎、急性心肌炎、病毒性心肌炎、糖尿病性心力衰竭、酒精中毒性心肌病、心臟貯積病(cardiacstoragedisease)、舒張性心力衰竭和收縮性心力衰竭，以及已存在的慢性心力衰竭的急性加重期(加重的心力衰竭)。
此外，本發(fā)明的化合物還可用于治療/或預防動脈硬化、受損的脂類代謝、血脂蛋白過少癥、血脂障礙、高甘油三酸酯血癥、高脂血癥、高膽固醇血癥、無β脂蛋白血癥、谷固醇血癥、黃色瘤病、丹吉爾病、肥胖癥，肥胖以及混合性高脂血癥和代謝綜合征。
此外，本發(fā)明的化合物可用于治療和/或預防原發(fā)性和繼發(fā)性雷諾現(xiàn)象、微循環(huán)病癥、跛行、外周和自主神經(jīng)病、糖尿病性微血管病、糖尿病視網(wǎng)膜病、糖尿病性四肢潰瘍、壞疽、crest綜合征、全身性紅斑狼瘡(erythematosis)、甲癬、風濕病，以及用于促進傷口愈合。
此外，本發(fā)明的化合物適用于治療泌尿科病癥，例如良性前列腺綜合征(bps)、良性前列腺增生(bph)、良性前列腺肥大(bpe)、膀胱出口梗阻(boo)、下泌尿道綜合征(luts，包括貓泌尿綜合征(fus))、泌尿生殖系統(tǒng)疾病(包括神經(jīng)原性膀胱過度活動癥(oab)和(ic))、失禁(ui)(例如混合性尿失禁、急迫性尿失禁、壓力性尿失禁或充溢性尿失禁(mui、uui、sui、oui))、骨盆痛、雄性和雌性泌尿生殖系統(tǒng)器官的良性和惡性病癥。
本發(fā)明的化合物還適用于治療和/或預防腎病，特別是急性和慢性腎功能不全以及急性和慢性腎衰竭。在本發(fā)明的上下文中，術語“腎功能不全”涵蓋急性和慢性表現(xiàn)的腎功能不全，以及潛在的或相關的腎病，例如腎血流灌注不足、透析相關性低血壓(intradialytichypotension)、梗阻性尿路病、腎小球病、腎小球腎炎、急性腎小球腎炎、腎小球硬化癥、腎小管間質(zhì)疾病、腎病障礙(nephropathicdisorder)例如原發(fā)性和先天性腎病、腎炎、免疫性腎病(例如腎移植排斥和免疫復合物誘導的腎病、毒性物質(zhì)誘導的腎病、造影劑誘導的腎病)、糖尿病和非糖尿病性腎病、腎盂腎炎、腎囊腫、腎硬化、高血壓性腎硬化以及可通過以下進行診斷性表征的腎病綜合征：例如肌酐和/或水排泄的異常減少；尿素、氮、鉀和/或肌酐的血液濃度的異常升高；腎臟酶(例如谷氨?；铣擅?的活性改變；尿液滲透壓或尿量的改變；微量白蛋白尿、巨量白蛋白尿(macroalbuminuria)的增加；腎小球和小動脈的損傷；腎小管擴張(tubulardilatation)；高磷酸鹽血癥和/或需要透析。本發(fā)明還涵蓋本發(fā)明的化合物用于治療和/或預防腎功能不全后遺癥的用途，例如肺氣腫、心力衰竭、尿毒癥、貧血、電解質(zhì)紊亂(例如高鈣血癥、低鈉血癥)以及骨代謝和碳水化合物代謝失調(diào)。
此外，本發(fā)明的化合物還適用于治療和/或預防哮喘病癥、肺動脈高血壓(pah)以及其他形式的肺高血壓(ph)，包括與左心室疾病、hiv、鐮狀細胞貧血、血栓栓塞(cteph)、結節(jié)病、copd或肺纖維化相關的肺高血壓，慢性梗阻性肺疾病(copd)，急性呼吸窘迫綜合癥(ards)，急性肺損傷(ali)，α1抗胰蛋白酶缺失(aatd)，肺纖維化，肺氣腫(例如由吸煙誘導的肺氣腫)以及囊性纖維化(cf)。
本發(fā)明所述的化合物還為用于控制以no/cgmp系統(tǒng)紊亂為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的活性物質(zhì)。更具體地，它們適用于在認知失調(diào)后改進感知、注意集中能力、學習能力或記憶力，其中認知失調(diào)為例如，特別是與下述狀況/疾病/綜合征相關的那些認知失調(diào)：例如輕度認知損害、年齡相關的學習和記憶力失調(diào)、年齡相關的失憶、血管性癡呆、顱腦損傷、中風、中風后發(fā)生的癡呆(中風后癡呆)、創(chuàng)傷后顱腦損傷、注意力集中的整體失調(diào)、在具有學習和記憶困難的兒童中的注意力集中失調(diào)、阿爾茨海默病、路維小體癡呆、伴隨額葉退化的癡呆(包括皮克綜合征、帕金森病、進行性核性麻痹)、伴隨皮質(zhì)基底節(jié)變性的癡呆、肌萎縮性側索硬化癥(als)、亨廷頓舞蹈病、脫髓鞘、多發(fā)性硬化、丘腦退化、creutzfeld-jacob癡呆、hiv癡呆、伴隨癡呆的精神分裂癥或科爾薩科夫精神病。它們還適用于治療和/或預防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如焦慮、緊張和抑郁狀態(tài)，cns相關的性功能障礙和睡眠失調(diào)，以及適用于控制攝取食物、興奮劑和成癮性藥物的病理性失調(diào)。
此外，本發(fā)明的化合物還適用于控制腦血流并為用于控制偏頭痛的有效試劑。它們還適用于預防和控制腦梗死(腦卒中)后遺癥，例如中風、腦缺血和顱腦損傷。本發(fā)明的化合物還可用于控制疼痛狀態(tài)和耳鳴。
此外，本發(fā)明的化合物具有抗炎作用并因此可用作用于治療和/或預防下述疾病的抗炎藥：敗血癥(sirs)、多器官衰竭(mods、mof)、腎臟的炎性疾病、慢性腸炎癥(ibd、克羅恩氏病、uc)、胰腺炎、腹膜炎、類風濕性疾病、炎性皮膚疾病和炎性眼病。
此外，本發(fā)明的化合物還可用于治療和/或預防自身免疫性疾病。
本發(fā)明的化合物還適用于治療和/或預防內(nèi)臟器官——例如肺、心臟、腎臟、骨髓以及特別是肝臟——的纖維化病癥，以及皮膚病學纖維化和眼的纖維化病癥。在本發(fā)明的上下文上，術語“纖維化病癥”特別涵蓋以下術語：肝纖維化、肝硬化、肺纖維化、心內(nèi)膜心肌纖維化、腎病、腎小球性腎炎、間質(zhì)性腎纖維化、由糖尿病導致的纖維化損傷、骨髓纖維化及相似的纖維化病癥、硬皮病、硬斑病、瘢痕疙瘩、增生性瘢痕(還包括外科手術后)、痣、糖尿病視網(wǎng)膜病、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病及結締組織病癥(例如結節(jié)病)。
本發(fā)明的化合物還適用于控制術后瘢痕，例如由青光眼手術導致的瘢痕。
本發(fā)明的化合物還可在美容上用于老化和角質(zhì)化的皮膚。
此外，本發(fā)明的化合物適用于治療和/或預防肝炎、腫瘤、骨質(zhì)疏松癥、青光眼和胃輕癱。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的化合物用于治療和/或預防病癥——特別是上文提及的病癥——的用途。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的化合物用于治療和/或預防下列病癥的用途：心力衰竭、心絞痛、高血壓、肺高血壓、缺血、血管病癥、腎功能不全、血栓栓塞病癥、纖維化病癥、動脈硬化、癡呆癥和勃起功能障礙。
本發(fā)明還提供了在治療和/或預防下列病癥的方法中使用的本發(fā)明的化合物：心力衰竭、心絞痛、高血壓、肺高血壓、缺血、血管病癥、腎功能不全、血栓栓塞病癥、纖維化病癥和動脈硬化。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的化合物用于制備用于治療和/或預防病癥——特別是上文提及的病癥——的藥物的用途。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的化合物用于制備用于治療和/或預防下列病癥的藥物的用途：心力衰竭、心絞痛、高血壓、肺高血壓、缺血、血管病癥、腎功能不全、血栓栓塞病癥、纖維化病癥、動脈硬化、癡呆癥和勃起功能障礙。
本發(fā)明還提供了一種使用有效量的至少一種本發(fā)明的化合物治療和/或預防病癥——特別是上文提及的病癥——的方法。
本發(fā)明還提供了一種使用有效量的至少一種本發(fā)明的化合物治療和/或預防下列病癥的方法：心力衰竭、心絞痛、高血壓、肺高血壓、缺血、血管病癥、腎功能不全、血栓栓塞病癥、纖維化病癥和動脈硬化。
本發(fā)明的化合物可單獨使用或——如果需要——與其他活性化合物結合使用。本發(fā)明還提供了包含至少一種本發(fā)明的化合物和一種以上的其他活性化合物的藥物，特別是用于治療和/或預防上述病癥的藥物。適用于組合物的活性化合物的優(yōu)選實例包括：
·有機硝酸酯和no供體，例如硝普鈉、硝化甘油、單硝酸異山梨酯、硝酸異山梨酯、嗎多明(molsidomine)或sin-1，以及吸入性no；
·抑制環(huán)磷酸鳥苷(cgmp)分解的化合物，例如磷酸二酯酶(pde)1、2和/或5的抑制劑，特別是pde5抑制劑，例如西地那非、伐地那非和他達拉非；
·抗血栓形成試劑，例如并優(yōu)選血小板聚集抑制劑、抗凝血劑或血纖維蛋白溶酶物(profibrinolyticsubstance)；
·降血壓的活性化合物，例如并優(yōu)選鈣拮抗劑、血管緊張素aii拮抗劑、ace抑制劑、內(nèi)皮素拮抗劑、腎素抑制劑、α-受體阻斷劑、β-受體阻斷劑、鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑以及利尿劑；和/或
·改變脂類代謝的活性化合物，例如并優(yōu)選甲狀腺受體激動劑、膽固醇合成抑制劑，例如并優(yōu)選hmg-coa還原酶抑制劑或鯊烯合成抑制劑、acat抑制劑、cetp抑制劑、mtp抑制劑、ppar-α、ppar-γ和/或ppar-δ激動劑、膽固醇吸收抑制劑、脂肪酶抑制劑、聚合膽汁酸吸附劑、膽汁酸再吸收抑制劑和脂蛋白(a)拮抗劑。
抗血栓形成試劑優(yōu)選地理解為意指選自血小板聚集抑制劑、抗凝血劑或血纖維蛋白溶酶物的化合物。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與血小板聚集抑制劑聯(lián)合給藥，所述血小板聚集抑制劑例如并優(yōu)選阿司匹林、氯吡格雷(clopidogrel)、噻氯匹定(ticlopidin)或雙嘧達莫(dipyridamole)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與凝血酶抑制劑聯(lián)合給藥，所述凝血酶抑制劑例如并優(yōu)選希美加群(ximelagatran)、達比加群(dabigatran)、美拉加群(melagatran)、比伐盧定(bivalirudin)或克賽(clexane)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與gpiib/iiia拮抗劑聯(lián)合給藥，所述gpiib/iiia拮抗劑例如并優(yōu)選替羅非班(tirofiban)或阿昔單抗(abciximab)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與xa因子抑制劑聯(lián)合給藥，所述xa因子抑制劑例如并優(yōu)選利伐沙班(rivaroxaban，bay59-7939)、依度沙班(du-176b)、阿哌沙班(apixaban)、奧米沙班(otamixaban)、非地沙班(fidexaban)、雷扎沙班(razaxaban)、磺達肝癸鈉(fondaparinux)、艾卓肝素(idraparinux)、pmd-3112、ym-150、kfa-1982、emd-503982、mcm-17、mln-1021、dx9065a、dpc906、jtv803、ssr-126512或ssr-128428。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與肝素或低分子量(lmw)肝素衍生物聯(lián)合給藥。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與維生素k拮抗劑聯(lián)合給藥，所述維生素k拮抗劑例如并優(yōu)選香豆素。
降血壓劑優(yōu)選地理解為意指選自以下的化合物：鈣拮抗劑、血管緊張素aii拮抗劑、ace抑制劑、內(nèi)皮素拮抗劑、腎素抑制劑、α-受體阻斷劑、β-受體阻斷劑、鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑和利尿劑。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與鈣拮抗劑聯(lián)合給藥，所述鈣拮抗劑例如并優(yōu)選硝苯地平(nifedipine)、氨氯地平(amlodipine)、維拉帕米(verapamil)或地爾硫卓(diltiazem)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與α-1-受體阻斷劑聯(lián)合給藥，所述α-1-受體阻斷劑例如并優(yōu)選哌唑嗪(prazosin)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與β-受體阻斷劑聯(lián)合給藥，所述β-受體阻斷劑例如并優(yōu)選普萘洛爾(propranolol)、阿替洛爾(atenolol)、噻嗎洛爾(timolol)、吲哚洛爾(pindolol)、阿普洛爾(alprenolol)、氧烯洛爾(oxprenolol)、噴布洛爾(penbutolol)、布拉洛爾(bupranolol)、美替洛爾(metipranolol)、納多洛爾(nadolol)、甲吲洛爾(mepindolol)、卡拉洛爾(carazalol)、索他洛爾(sotalol)、美托洛爾(metoprolol)、倍他洛爾(betaxolol)、塞利洛爾(celiprolol)、比索洛爾(bisoprolol)、卡替洛爾(carteolol)、艾司洛爾(esmolol)、拉貝洛爾(labetalol)、卡維地洛(carvedilol)、阿達洛爾(adaprolol)、蘭地洛爾(landiolol)、奈比洛爾(nebivolol)、依泮洛爾(epanolol)或布新洛爾(bucindolol)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與血管緊張素aii拮抗劑聯(lián)合給藥，所述血管緊張素aii拮抗劑的優(yōu)選實例為洛沙坦(losartan)、坎地沙坦(candesartan)、纈沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisartan)或沙坦(embursatan)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與ace抑制劑聯(lián)合給藥，所述ace抑制劑例如并優(yōu)選依那普利(enalapril)、卡托普利(captopril)、賴諾普利(lisinopril)、雷米普利(ramipril)、地拉普利(delapril)、福辛普利(fosinopril)、奎諾普利(quinopril)、培哚普利(perindopril)或泉多普利(trandopril)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與內(nèi)皮素拮抗劑聯(lián)合給藥，所述內(nèi)皮素拮抗劑例如并優(yōu)選波生坦(bosentan)、達盧生坦(darusentan)、安倍生坦(ambrisentan)或西他生坦(sitaxsentan)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與腎素抑制劑聯(lián)合給藥，所述腎素抑制劑例如并優(yōu)選阿利吉侖(aliskiren)、spp-600或spp-800。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑聯(lián)合給藥，所述鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑例如并優(yōu)選螺內(nèi)酯(spironolactone)或依普利酮(eplerenone)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與下述物質(zhì)聯(lián)合給藥：袢利尿劑，例如呋塞米(furosemide)、托拉塞米(torasemide)、布美他尼(bumetanide)和吡咯他尼(piretanide)；保鉀利尿劑，例如阿米洛利(amiloride)和氨苯蝶啶(triamterene)；醛固酮拮抗劑，例如螺內(nèi)酯(spironolactone)、坎利酸鉀(potassiumcanrenoate)和依普利酮(eplerenone)；以及噻嗪類利尿劑，例如氫氯噻嗪(hydrochlorothiazide)、氯噻酮(chlorthalidone)、希帕胺(xipamide)和吲達帕胺(indapamide)。
脂類代謝調(diào)節(jié)劑優(yōu)選地理解為意指選自以下的化合物：cetp抑制劑、甲狀腺受體激動劑、膽固醇合成抑制劑如hmg-coa還原酶抑制劑或鯊烯合成抑制劑、acat抑制劑、mtp抑制劑，ppar-α、ppar-γ和/或ppar-δ激動劑，膽固醇吸收抑制劑、聚合膽汁酸吸附劑、膽汁酸再吸收抑制劑、脂肪酶抑制劑和脂蛋白(a)拮抗劑。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與cetp抑制劑聯(lián)合給藥，所述cetp抑制劑例如并優(yōu)選達塞曲匹(dalcetrapib)、bay60-5521、安塞曲匹(anacetrapib)或cetp疫苗(ceti-1)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與甲狀腺受體激動劑聯(lián)合給藥，所述甲狀腺受體激動劑例如并優(yōu)選d-甲狀腺素、3,5,3'-三碘甲狀腺原氨酸(t3)、cgs23425或阿昔替羅(axitirome，cgs26214)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與他汀類的hmg-coa還原酶抑制劑聯(lián)合給藥，所述他汀類的hmg-coa還原酶抑制劑例如并優(yōu)選咯伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、羅伐他汀(rosuvastatin)或匹伐他汀(pitavastatin)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與鯊烯合成抑制劑聯(lián)合給藥，所述鯊烯合成抑制劑例如并優(yōu)選bms-188494或tak-475。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與acat抑制劑聯(lián)合給藥，所述acat抑制劑例如并優(yōu)選阿伐麥布(avasimibe)、甲亞油酰胺(melinamide)、帕替麥布(pactimibe)、依魯麥布(eflucimibe)或smp-797。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與mtp抑制劑聯(lián)合給藥，所述mtp抑制劑例如并優(yōu)選英普他派(implitapide)、bms-201038、r-103757或jtt-130。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與ppar-γ激動劑聯(lián)合給藥，所述ppar-γ激動劑例如并優(yōu)選吡格列酮(pioglitazone)或羅格列酮(rosiglitazone)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與ppar-δ激動劑聯(lián)合給藥，所述ppar-δ激動劑例如并優(yōu)選gw501516或bay68-5042。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與膽固醇吸收抑制劑聯(lián)合給藥，所述膽固醇吸收抑制劑例如并優(yōu)選依澤替米貝(ezetimibe)、替奎安(tiqueside)或帕馬苷(pamaqueside)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與脂肪酶抑制劑聯(lián)合給藥，所述脂肪酶抑制劑例如并優(yōu)選奧利司他(orlistat)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與聚合膽汁酸吸附劑聯(lián)合給藥，所述聚合膽汁酸吸附劑例如并優(yōu)選消膽胺(cholestyramine)、考來替泊(colestipol)、考來索文(colesolvam)、考來膠(cholestagel)或考來替蘭(colestimide)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與膽汁酸再吸收抑制劑聯(lián)合給藥，所述膽汁酸再吸收抑制劑例如并優(yōu)選asbt(＝ibat)抑制劑，例如azd-7806、s-8921、ak-105、bari-1741、sc-435或sc-635。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物與脂蛋白(a)拮抗劑聯(lián)合給藥，所述脂蛋白(a)拮抗劑例如并優(yōu)選吉卡賓鈣(gemcabenecalcium)(ci-1027)或煙酸。
本發(fā)明還提供包含至少一種本發(fā)明的化合物且通常連同一種以上的惰性的、非毒性的、藥學上合適的賦形劑一起形成的藥物，以及提供其用于上述目的的用途。
本發(fā)明的化合物可具有全身作用和/或局部作用。為此，它們可以合適的方式給藥，例如通過口服、腸胃外、肺、鼻、舌下、舌、頰、直腸、真皮、透皮、結膜或耳途徑，或作為移植物或支架給藥。
本發(fā)明的化合物可以適于這些給藥途徑的給藥形式給藥。
合適的用于口服給藥的給藥形式為這樣的給藥形式：根據(jù)現(xiàn)有技術起作用且快速和/或以緩和的方式釋放本發(fā)明的化合物，并且含有結晶和/或無定形和/或溶解形式的本發(fā)明的化合物，例如片劑(未包衣或包衣的片劑，例如具有耐胃液包衣或延緩溶解的包衣或不溶性包衣，所述包衣控制本發(fā)明的化合物的釋放)、在口腔中迅速崩解的片劑或膜劑/扁片劑(oblate)、膜劑/凍干劑、膠囊劑(例如硬明膠或軟明膠膠囊)、糖衣片劑、顆粒劑、丸劑、粉劑、乳劑、懸液劑、氣溶膠或溶液劑。
可進行腸胃外給藥，同時避免吸收步驟(例如通過靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、心內(nèi)、椎內(nèi)或腰髓內(nèi)途徑)或包括吸收(例如通過肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、經(jīng)皮或腹膜內(nèi)途徑)。適用于腸胃外給藥的給藥形式包括溶液劑、懸液劑、乳劑、凍干劑或無菌粉劑形式的注射和輸注用制品。
對于其他給藥途徑，合適的實例為吸入藥物形式(包括粉末吸入劑、噴霧劑)、滴鼻劑、溶液劑或噴霧劑；用于舌、舌下或頰給藥的片劑、膜劑/扁片劑或膠囊劑；栓劑、耳部或眼部制劑、陰道膠囊劑、水性懸液劑(洗劑、振蕩合劑(shakingmixture))、親脂性懸液劑、軟膏劑、乳膏劑(cream)、透皮治療系統(tǒng)(例如貼劑)、乳、糊劑、泡沫劑、灑粉劑(sprinklingpower)、移植物或支架。
優(yōu)選口服或腸胃外給藥，特別是口服給藥。
可將本發(fā)明的化合物轉化成所述給藥形式。這可用本身已知的方式通過與惰性的、非毒性的、藥學上合適的賦形劑混合來進行。這些賦形劑包括載體(例如微晶纖維素、乳糖、甘露醇)、溶劑(例如液體聚乙二醇)、乳化劑和分散劑或潤濕劑(例如十二烷基硫酸鈉、聚氧脫水山梨聚糖油酸酯)、粘結劑(例如聚乙烯吡咯烷酮)、合成和天然的聚合物(例如白蛋白)、穩(wěn)定劑(例如抗氧化劑，例如抗壞血酸)、著色劑(例如無機顏料，例如鐵氧化物)以及調(diào)味劑和/或矯味劑。
一般來說，已發(fā)現(xiàn)有利的是，對于腸胃外給藥，給藥量為約0.001至1mg/kg、優(yōu)選約0.01至0.5mg/kg體重以獲得有效的結果。對于口服給藥，劑量為約0.001至2mg/kg、優(yōu)選約0.001至1mg/kg體重。
然而，在一些情況下，可能有必要偏離所述量，特別是隨體重、給藥途徑、對活性成分的個體響應、制劑性質(zhì)及進行給藥的時間或間隔而變化。因此，在一些情況下，小于上述最小量可能是足夠的，而在其他情況下，必須超過所述上限。當給予較大量時，可建議將其在一天內(nèi)分成數(shù)個單獨劑量。
下列工作實施例說明本發(fā)明。
除非另有說明，在下列試驗和實施例中的百分比為重量百分比；份數(shù)為重量份數(shù)。液體/液體溶液的溶劑比例、稀釋比例及濃度數(shù)值各自基于體積計。
a.實施例
縮寫：
abs.絕對
aq.水溶液
calc.計算的
boc叔丁氧基羰基
br.s寬單峰(在nmr中)
cbz芐氧基羰基
δnmr譜中的位移(以ppm表示)
d雙峰(nmr耦合模式)
tlc薄層色譜
dci直接化學電離(在ms中)
dd雙二重峰(nmr耦合模式)
ddt雙雙三重峰(nmr耦合模式)
dmf二甲基甲酰胺
dmso二甲基亞砜
ent對映體純
eq.當量
esi電噴霧電離(在ms中)
et乙基
h小時
hatu(1-[雙(二甲基氨基)亞甲基]-1h-1,2,3-三唑并
[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽)
hplc高壓高效液相色譜
hrms高分辨質(zhì)譜
conc.濃的
lc-ms液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用
m多重峰
me甲基
min分鐘
ms質(zhì)譜
nmr核磁共振譜
pdcl2(dppf)ch2cl21,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵二氯化鈀(ii)/二氯甲
烷復合物
ph苯基
q四重峰(nmr耦合模式)
quint.五重峰(nmr耦合模式)
rac外消旋
rel相對立體化學
rt室溫
rt保留時間(在hplc中)
s單峰(nmr耦合模式)
sfc超臨界流體色譜
t三重峰(nmr耦合模式)
tbtu(苯并三唑-1-基氧基)雙二甲基氨基甲基氟硼酸鹽
tfa三氟乙酸
thf四氫呋喃
uv紫外光譜
v/v(溶液的)體積比
hplc、gcms和lc-ms方法:
方法1(lc-ms):
儀器：watersacquitysqduplcsystem；柱：watersacquityuplchsst31.8μ，50x1mm；流動相a：1l水+0.25ml99％濃度的甲酸，流動相b：1l乙腈+0.25ml99％濃度的甲酸；梯度：0.0min90％a→1.2min5％a→2.0min5％a；柱溫：50℃；流速：0.40ml/min；uv檢測：208–400nm。
方法2(lc-ms):
儀器：watersacquitysqduplcsystem；柱：watersacquityuplchsst31.8μ，50x1mm；流動相a：1l水+0.25ml99％濃度的甲酸，流動相b：1l乙腈+0.25ml99％濃度的甲酸；梯度：0.0min95％a→6.0min5％a→7.5min5％a；柱溫：50℃；流速：0.35ml/min；uv檢測：210–400nm。
方法3(lc-ms):
儀器：micromassquattropremierwithwatersuplcacquity；柱：thermohypersilgold1.9μ50x1mm；流動相a：1l水+0.5ml50％濃度的甲酸，流動相b：1l乙腈+0.5ml50％濃度的甲酸；梯度：0.0min97％a→0.5min97％a→3.2min5％a→4.0min5％a；柱溫：50℃；流速：0.3ml/min；uv檢測：210nm。
方法4(lc-ms):
ms儀器：waters(micromass)quattromicro；hplc儀器：agilent1100系列；柱：ymc-triartc183μ50x3mm；流動相a：1l水+0.01mol碳酸銨，流動相b：1l乙腈；梯度：0.0min100％a→2.75min5％a→4.5min5％a；柱溫：40℃；流速：1.25ml/min；uv檢測：210nm。
方法5(lc-ms):
ms儀器：waters(micromass)qm；hplc儀器：agilent1100系列；柱：agilentzorbaxextend-c183.0x50mm3.5微米；流動相a：1l水+0.01mol碳酸銨，流動相b：1l乙腈；梯度：0.0min98％a→0.2min98％a→3.0min5％a→4.5min5％a；柱溫：40℃；流速：1.75ml/min；uv檢測：210nm。
方法6(gc-ms):
儀器：micromassgct，gc6890；柱：restekrtx-35，15mx200μmx0.33μm；恒定氦氣流速：0.88ml/min；柱溫：70℃；入口溫度：250℃；梯度：70℃，30℃/min→310℃(保持3min)。
方法7(lc-ms):
儀器：agilentmsquad6150；hplc：agilent1290；柱：watersacquityuplchsst31.8μ50x2.1mm；流動相a：1l水+0.25ml99％濃度的甲酸，流動相b：1l乙腈+0.25ml99％濃度的甲酸；梯度：0.0min90％a→0.3min90％a→1.7min5％a→3.0min5％a；柱溫：50℃；流速：1.20ml/min；uv檢測：205–305nm。
方法8(gc-ms):
儀器：thermoscientificdsqii，thermoscientifictracegcultra；柱：restekrtx-35ms，15mx200μmx0.33μm；恒定氦氣流速：1.20ml/min；柱溫：60℃；入口溫度：220℃；梯度：60℃，30℃/min→300℃(保持3.33min)。
方法9(lc-ms):
ms儀器：waterssqd；hplc儀器：watersuplc；柱：zorbaxsb-aq(agilent)，50mmx2.1mm，1.8μm；流動相a：水+0.025％甲酸，流動相b：乙腈(ulc)+0.025％甲酸；梯度：0.0min98％a-0.9min25％a–1.0min5％a-1.4min5％a–1.41min98％a–1.5min98％a；柱溫：40℃；流速：0,600ml/min；uv檢測：dad；210nm。
方法10(制備型hplc):
ms儀器：waters，hplc儀器：waters；柱：watersx-bridgec18，19mmx50mm，5μm，流動相a：水+0.05％氨水，流動相b：梯度乙腈(ulc)；流速：40ml/min；uv檢測：dad；210–400nm)。
或：
ms儀器：waters，hplc儀器：waters(柱phenomenexluna5μc18(2)100a，axiatech.50x21.2mm，流動相a：水+0.05％甲酸，流動相b：梯度乙腈(ulc)；流速：40ml/min；uv檢測：dad；210–400nm)。
方法11(lc-ms):
ms儀器：thermofisherscientificltq-orbitrap-xl；hplc儀器類型：agilent1200sl；柱：agilent，poroshell120，3x150mm，sb-c182.7μm；流動相a：1l水+0.1％三氟乙酸；流動相b：1l乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度：0.0min2％b→1.5min2％b→15.5min95％b→18.0min95％b；柱溫：40℃；流速：0.75ml/min；uv檢測：210nm。
其他詳細內(nèi)容:
在使用上述方法通過制備型hplc純化本發(fā)明的化合物的情況下(其中洗脫液包含添加劑，例如三氟乙酸、甲酸或氨水)，如果本發(fā)明的化合物含有足夠的堿性或酸性官能團，則本發(fā)明的化合物可以鹽的形式獲得，例如以三氟乙酸鹽、甲酸鹽或銨鹽的形式獲得。通過本領域技術人員已知的多種方法可將這種鹽轉化為相應的游離堿或游離酸。
此外，脒可以游離化合物的形式存在，或部分地以乙酸鹽或乙酸鹽溶劑合物的形式存在(這取決于制備過程中是否涉及乙酸)。
在下文描述本發(fā)明的合成中間體和工作實施例的情況下，以相應堿或酸的鹽的形式指定的任何化合物通常為具有未知的精確化學計量組成的鹽，如通過各種制備和/或純化方法獲得的。因此，除非更詳細地說明，添加名稱和結構式例如“鹽酸鹽”、“三氟乙酸鹽”、“鈉鹽”或“xhcl”、“xcf3cooh”、“xna+”不應理解為化學計量意義上的這種鹽，而應理解為對于其中存在的成鹽組分僅具有描述性特征。
這相應地適用于以下情況：如果合成中間體或工作實施例或其鹽通過所述制備和/或純化方法以未知的化學計量組成(如果它們是定義的類型)的溶劑合物(例如水合物)的形式獲得。
此外，本發(fā)明的仲酰胺可以旋轉異構體/異構體混合物的形式存在，特別是在nmr研究中。純度數(shù)字通?；趌c/ms色譜圖中相應的峰積分，但也可另外地借助1hnmr譜來確定。如果未指明純度，則根據(jù)lc/ms色譜圖中自動峰積分，純度通常為100％，或純度未明確測定。
如果指明純度<100％，則以理論值的％表示的所述收率通常針對純度進行校正。在含溶劑或受污染的批次中，正常收率可為“>100％”；在這些情況下，收率未針對溶劑或純度進行校正。
在所有1hnmr譜數(shù)據(jù)中，化學位移δ以ppm表示。
在以下段落中記錄的1hnmr譜中的質(zhì)子信號的多重性表示在每種情況下觀察到的信號形式且不考慮任何更高階的信號現(xiàn)象。通常，所述化學位移是指所述信號的中心位置。在寬的多重峰的情況下，給出間隔。被溶劑或水遮蔽的信號暫時性地指定或未列出。顯著變寬的信號——例如由分子部分的快速轉動或由于交換質(zhì)子導致——同樣暫時性地指定(通常稱為寬多重峰或寬單峰)或未列出。
熔點和熔點范圍——如果說明——未作校正。
其制備未在下文中具體描述的所有反應物或試劑由通?？色@得的來源購得。對于其制備同樣未在下文中描述且其不能購得或不能由通?？色@得的來源獲得的所有其他反應物或試劑，參考其中記載了其制備的公開文獻。
起始化合物和中間體:
實施例1a
5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-胺
首先，將58g(340.03mmol)2-氯-5-氟-6-甲基煙腈(其制備記載于wo2007/041052，實施例u-2，第80頁)加入1,2-乙二醇(580ml)中，然后加入水合肼(24.81ml)和56.09ml(340.03mmol)n,n-二異丙基乙胺。將混合物在80℃下攪拌16h，然后在120℃下攪拌6h。冷卻至室溫后，加入水(2.5l)和乙酸乙酯(2.5l)，并抽濾出所得固體。將所得固體在減壓下干燥。得到28.4g(理論值的47％)目標化合物。
lc-ms(方法4)：rt＝1.77min
ms(esipos)：m/z＝167[m+h]+
實施例2a
5-氟-3-碘-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶
首先，將28g(168.5mmol)來自實施例1a的5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-胺加入1.32lthf中，并將混合物冷卻至0℃。然后緩慢加入41.45ml(337.03mmol)三氟化硼乙醚復合物。將反應混合物冷卻至-10℃。然后緩慢加入25.66g(219.07mmol)亞硝酸異戊酯在166mlthf中的溶液，隨后將混合物繼續(xù)攪拌30min。然后將反應溶液濃縮至約其體積的三分之一。然后加入988ml丙酮，并將溶液冷卻至0℃。向該溶液滴加32.84g(219.07mmol)碘化鈉在412ml丙酮中的溶液，然后將混合物在室溫下攪拌2h。將反應混合物傾入5l冰水中，并且每次用750ml乙酸乙酯萃取三次。將合并的有機相用750ml飽和氯化鈉水溶液洗滌，干燥然后在減壓下濃縮。使用硅膠純化粗產(chǎn)物(硅膠，流動相：環(huán)己烷/乙酸乙酯，梯度9:1至1:1)。得到14.90g(理論值的32％)標題化合物。
lc-ms(方法1)：rt＝0.84min
ms(esipos)：m/z＝278[m+h]+
實施例3a
1-(2,3-二氟芐基)-5-氟-3-碘-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶
首先，將2.60g(9.37mmol)來自實施例2a的5-氟-3-碘-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶加入35mldmf中。然后加入3.67g(11.26mmol)碳酸銫和1.94g(9.37mmol)1-(溴甲基)-2,3-二氟苯在10mldmf中的溶液，隨后將混合物在室溫下攪拌過夜。將反應混合物加入200ml水中并用乙酸乙酯萃取兩次。將合并的有機相用硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。將殘留物通過柱色譜進行純化(硅膠，流動相：石油醚/乙酸乙酯＝10/1)，并將產(chǎn)物餾分濃縮。通過制備型hplc進一步純化(柱：sunfirec18，5μm，250x20mm；流動相：12％水+85％甲醇+3％1％濃度的tfa水溶液；流速：25ml/min；溫度：40℃；波長：210nm)。得到2.67g(理論值的71％)標題化合物。
lc-ms(方法1)：rt＝1.29min
ms(esipos)：m/z＝404[m+h]+
類似于實施例3a，表1a中所示的示例性化合物通過以下方法制備：將來自實施例2a的5-氟-3-碘-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶與1-(溴甲基)-2-氟苯、2-(溴甲基)-1,3,4-三氟苯或2-(氯甲基)-3-氟吡啶鹽酸鹽(1.1-1.5當量)和碳酸銫(1.2-2當量)在dmf中在所述反應條件(反應時間：2-72h；溫度：室溫至60℃)下反應。
反應混合物的示例性后處理：
方法a：將反應混合物加入水中，然后在室溫下攪拌約1h。過濾出所形成的固體，用水洗滌并在高真空下干燥。
方法b：或者，將反應混合物加入水中并用乙酸乙酯萃取。將合并的有機相用硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。將殘留物通過柱色譜在硅膠上進行純化(流動相：石油醚/乙酸乙酯或二氯甲烷/甲醇)。
方法c：或者，將反應混合物用乙腈稀釋并通過制備型hplc進行純化(rp18柱，流動相：乙腈/水(加入0.1％tfa或0.05％甲酸)梯度)。
表1a：
1)該原料已記載于wo2013/104703(實施例50a)。
實施例7a
1-(2,3-二氟芐基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲腈
首先，在已通過加熱干燥的燒瓶中，將2.47g(6.13mmol)來自實施例3a的1-(2,3-二氟芐基)-5-氟-3-碘-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶和0.576g(6.43mmol)氰化銅(i)的混合物加入12.1ml無水dmso中，并將混合物在150℃下攪拌3h。將乙酸乙酯加入冷卻的反應溶液中，并將混合物用半飽和的氯化銨水溶液和濃氨水溶液(3/1)的混合物洗滌三次。將有機相用硫酸鈉干燥，過濾并通過蒸發(fā)濃縮。將粗產(chǎn)物通過快速色譜法進行純化(硅膠，流動相：環(huán)己烷/乙酸乙酯梯度：15/1至10/1；然后二氯甲烷/甲醇：10/1)。得到780mg目標化合物(理論值的42％)。
lc-ms(方法1)：rt＝1.19min
ms(esipos)：m/z＝303[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝2.65(d,3h),5.87(s,2h),7.10-7.25(m,2h),7.39-7.48(m,1h),8.41(d,1h)。
類似于實施例7a，表2a中所示的示例性化合物通過下列方法制備：將合適的碘化物與氰化銅(i)(1.1-1.5當量)在dmso中在所述反應條件下(反應時間:1–5h；溫度:150℃)反應。
反應混合物的示例性后處理：
方法a：在冷卻后，將乙酸乙酯加入反應混合物中，并將混合物用半飽和的氯化銨水溶液和濃氨水溶液(3/1)的混合物洗滌三次。將有機相用硫酸鈉干燥并過濾，并在減壓下除去溶劑。將粗產(chǎn)物通過柱色譜進行純化(硅膠，流動相：環(huán)己烷/乙酸乙酯梯度：或二氯甲烷/甲醇梯度)。
方法b：或者，將反應混合物用乙腈稀釋并通過制備型hplc進行純化(rp18柱，流動相：乙腈/水(加入0.1％tfa或0.05％甲酸)梯度)。
表2a:
1)該原料已記載于wo2013/104703(實施例51a)。
實施例11a
1-(2,3-二氟芐基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲脒
首先，將960mg(3.18mmol)來自實施例7a的1-(2,3-二氟芐基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲腈加入9.47ml甲醇中。加入0.69ml(3.18mmol)甲醇鈉的甲醇溶液，隨后將混合物在室溫下攪拌1h。然后加入另外的10ml甲醇，隨后將反應混合物在60℃下攪拌1h。加入204mg(3.81mmol)氯化銨和0.71ml(12.39mmol)乙酸，并將反應混合物在回流下攪拌7h。在減壓下除去溶劑，并將殘留物在室溫下用38ml的1n氫氧化鈉水溶液攪拌1h。然后濾出沉淀并用水洗滌。得到1.0g目標化合物(理論值的90％，純度90％)。
lc-ms(方法1)：rt＝0.68min
ms(esipos)：m/z＝320[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6)：δ[ppm]＝2.60(d,3h),5.77(s,2h),6.62(br.s,3h),6.91-6.98(m,1h),7.11-7.20(m,1h),7.34-7.44(m,1h),8.29(d,1h)。
類似于實施例11a，表3a中所示的示例性化合物通過下列方法制備：將合適的腈化物與甲醇鈉(1.0-1.2當量)的甲醇溶液反應，隨后與氯化銨(1.2-1.5當量)和乙酸(3.5-5當量)在所述反應條件(在加入氯化銨和乙酸后的反應時間：5-24h；溫度：回流)下反應。
反應混合物的示例性后處理：
蒸發(fā)溶劑并將殘留物在室溫下用1n氫氧化鈉水溶液攪拌0.5-2h。然后濾出沉淀，用水洗滌，隨后干燥。
如果部分合適的話，所得目標化合物可以乙酸鹽或乙酸鹽溶劑合物的形式存在。
表3a:
1)該原料已以乙酸鹽的形式記載于wo2013/104703(實施例52a)。
實施例15a
5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲脒乙酸鹽
該化合物的制備記載于wo2013/004785，實施例14a，第69-70頁。
實施例16a
6-氯-1-(2-氟芐基)-1h-吲唑-3-甲脒乙酸鹽
該化合物的制備記載于wo2013/104598，實施例54a，第97-98頁。
實施例17a
4-氨基-2-[1-(2,3-二氟芐基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5,5-二甲基-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
首先，將2.34g(6.67mmol；純度90％)來自實施例11a的1-(2,3-二氟芐基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲脒加入50.5ml叔丁醇中。然后加入1.33g(8.00mmol)3,3-二氰基新戊酸甲酯，隨后將混合物在回流下攪拌6h。加入另外的8ml叔丁醇，然后將混合物在回流下加熱過夜。冷卻至室溫后，加入水并將反應混合物在室溫下攪拌30min。濾出形成的沉淀并用水洗滌。在高真空下干燥固體。得到3.25g(理論值的99％；純度：92％)標題化合物。
lc-ms(方法1):rt＝1.03min
ms(esipos):m/z＝454[m+h]+
類似于實施例17a，表4a中所示的示例性化合物通過下列方法制備：將合適的甲脒(脒)與3,3-二氰基新戊酸甲酯(1.1-1.5當量)在叔丁醇中[將0.2-1.4當量的叔丁醇鉀加入存在形式為乙酸鹽或乙酸鹽溶劑合物的脒中]在所述反應條件下(反應時間:4-24h)反應。
反應混合物的示例性后處理：
將水加入反應混合物中，并將混合物在室溫下攪拌30min。濾出形成的沉淀并用水洗滌。
表4a:
1)該原料已記載于wo2013/104703(實施例55a)。
實施例23a
3,3-二氰基-2-(三氟甲基)丙烯酸甲酯
該化合物的合成記載于journaloffluorinechemistry1991，第51卷，3，第323-334頁。
實施例24a
2-(二氰基甲基)-3,3,3-三氟-2-甲基丙酸甲酯
將3.00g(14.70mmol)的實施例23a溶于四氫呋喃(30ml)中，并將溶液冷卻至0℃。然后滴加7.35ml(22.05mmol)甲基氯化鎂(3m于thf中)，使得溫度不超過5℃。在結束加入后，將混合物繼續(xù)攪拌10min。然后將1n鹽酸水溶液加入該混合物中，隨后用乙酸乙酯萃取混合物。分離相并用乙酸乙酯萃取水相兩次以上。將合并的有機相用飽和氯化鈉水溶液洗滌，用硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。然后粗產(chǎn)物通過柱色譜進行純化(硅膠，流動相：環(huán)己烷，然后環(huán)己烷:乙酸乙酯9:1(v:v))。濃縮得到3.24g(理論值的63％)標題化合物。
1h-nmr(400mhz,cdcl3):δ[ppm]＝1.81(s,3h),3.95(s,3h),4.48(s,1h)。
實施例25a
rac-4-氨基-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
首先，將23.0g(66.02mmol)來自實施例15a的5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲脒乙酸鹽加入叔丁醇(400ml)中，并加入13.43g(119.68mmol)叔丁醇鉀。隨后，加入21.08g(95.75mmol)來自實施例24a的2-(二氰基甲基)-3,3,3-三氟-2-甲基丙酸甲酯在叔丁醇(100ml)中的溶液，并將混合物加熱回流過夜。冷卻至室溫后，加入水并將反應混合物在室溫下繼續(xù)攪拌30min。濾出形成的沉淀并用水和少量乙醚洗滌。在高真空下干燥固體。得到16.1g標題化合物(理論值的51％)。
lc-ms(方法1):rt＝0.95min；
ms(esipos):m/z＝477[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.72(s,3h),5.96(s,2h),7.10(br.s,2h),7.42-7.48(m,1h),7.75-7.80(m,1h),8.27(d,1h),8.68(dd,1h),8.86(dd,1h),11.60(br.s,1h)。
類似于實施例25a，表5a中所示的示例性化合物表5a中所示的示例性化合物通過下列方法制備：將合適的甲脒(脒)與2-(二氰基甲基)-3,3,3-三氟-2-甲基丙酸甲酯(1.1-1.5當量)在叔丁醇中[將0.2-1.4當量的叔丁醇鉀加入存在形式為乙酸鹽或乙酸鹽溶劑合物的脒中]在所述反應條件下(反應時間:0.5-24h)反應。
或者，反應可在微波[0.5-10h，100℃]中進行。
反應混合物的示例性后處理：
加入水，并將反應混合物在室溫下攪拌30min。濾出形成的沉淀并用水洗滌。
表5a:
實施例30a
2-[1-(2,3-二氟芐基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4-碘-5,5-二甲基-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
首先，將3.25g(6.61mmol；純度92％)來自實施例17a的4-氨基-2-[1-(2,3-二氟芐基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5,5-二甲基-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮加入64ml二氧雜環(huán)己烷中，加入4.42ml(33.04mmol)亞硝酸異戊酯和2.66ml(33.04mmol)二碘甲烷，然后將混合物在85℃下加熱3h。在冷卻后，將混合物在減壓下濃縮，并將殘留物在硅膠上進行色譜純化(流動相：二氯甲烷/甲醇梯度)。在減壓下除去溶劑，得到2.32g(理論值的51％，純度82％)標題化合物。
lc-ms(方法1):rt＝1.34min
ms(esipos):m/z＝565[m+h]+
類似于實施例30a，表6a中所示的示例性化合物通過下列方法制備：將合適的苯胺與二碘甲烷(3-18當量)和亞硝酸異戊酯(3-10當量)在二氧雜環(huán)己烷中在所述反應條件下(溫度:85℃；反應時間:2-10h)反應。
反應混合物的示例性后處理：
將反應混合物濃縮[如果適合的話，在水和有機溶劑之間分配然后濃縮]，并將殘留物在硅膠上進行色譜純化(流動相：二氯甲烷/甲醇或環(huán)己烷/乙酸乙酯梯度)。任選地，通過制備型hplc進一步純化[柱:sunfirec18,5μm,100x30mm；流動相：水/乙腈+0.2％濃度的甲酸]。
表6a:
1)該原料已記載于wo2013/104703(實施例56a)。
實施例36a
rac-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-4-碘-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
將798μl(5.93mmol)亞硝酸異戊酯和286μl(3.56mmol)二碘甲烷加入565mg(1.19mmol)來自實施例25a的rac-4-氨基-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮在15ml二氧雜環(huán)己烷的溶液中，將混合物加熱至85℃持續(xù)4h。在冷卻后，將混合物在減壓下濃縮，將殘留物溶于二氯甲烷中，加入硅藻土，然后將混合物在減壓下濃縮。然后將吸附于硅藻土上的粗化合物通過柱色譜進行純化(硅膠，流動相：環(huán)己烷/乙酸乙酯梯度)。濃縮得到297mg(理論值的42％)標題化合物。
lc-ms(方法1):rt＝1.19min；
ms(esipos):m/z＝588[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.81(s,3h),6.04(s,2h),7.43-7.47(m,1h),7.77-7.82(m,1h),8.26(d,1h),8.47(dd,1h),8.76(dd,1h),12.41(br.s,1h)。
類似于實施例36a，表7a中所示的示例性化合物通過下列方法制備：將合適的苯胺與二碘甲烷(4-18當量)和亞硝酸異戊酯(4-12當量)在二氧雜環(huán)己烷中在所述反應條件下(溫度:85℃；反應時間:2-10h)反應。
反應混合物的示例性后處理：
將反應混合物濃縮并將殘留物在硅膠上進行色譜純化(流動相：二氯甲烷/甲醇梯度)。任選地，通過制備型hplc進一步純化[柱:kinetexc18,5μm,100x300mm；流動相：水/乙腈35:65]。
表7a:
實施例41a
2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙腈
首先，將8.75g(178.6mmol)氰化鈉加入132ml2n氨在甲醇中的溶液中。在室溫下加入15.0g(159.5mmol)1,3-二氟丙酮和9.55g(178.6mmol)氯化銨。將懸浮液在70℃的油浴溫度下攪拌2h。將300ml乙醚加入冷卻的反應混合物中，將混合物攪拌10min并濾出固體。將濾液在減壓下濃縮(50℃，70mbar)。得到19.2g(理論值的100％)目標化合物。將產(chǎn)物進一步反應而無需進一步純化。
gc-ms(方法8):rt＝1.78min
ms(espos):m/z＝121(m+h)+
實施例42a
(2-氰基-1,3-二氟丙-2-基)氨基甲酸芐酯
首先，將5.0g(41.6mmol)來自實施例41a的2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙腈加入14.5ml(83.3mmol)n,n-二異丙基乙胺中。在室溫下，緩慢滴加10.65g(62.5mmol)氯甲酸芐酯，并將混合物在室溫下攪拌3天。將反應混合物用25ml二氯甲烷稀釋，并在0℃下將其滴加至12.9g(124.9mmol)n-(2-氨基乙基)乙烷-1,2-二胺在225ml二氯甲烷中的溶液中，并將混合物攪拌10min。然后在室溫下滴加200ml飽和氯化銨溶液。分離相并用二氯甲烷萃取水相三次。濃縮合并的有機相。然后將粗產(chǎn)物在硅膠上進行色譜純化(流動相：環(huán)己烷：乙酸乙酯梯度)。得到4.40g(理論值的42％)標題化合物。
lc-ms(方法1):rt＝0.92min
ms(espos):m/z＝255(m+h)+
實施例43a
[1-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙-2-基]氨基甲酸芐酯
在室溫下，首先將5.00g(16.32mmol)來自實施例42a的[1-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙-2-基]氨基甲酸芐酯加入80ml無水乙醇中。在室溫下，加入3.09g(81.62mmol)硼氫化鈉，并將混合物在室溫下攪拌2h。在冰冷卻時，非常緩慢地滴加250ml飽和的氯化銨溶液。然后加入1n的鹽酸水溶液直至ph為4(約100ml)。然后用飽和氯化鈉水溶液使反應混合物飽和，并用乙酸乙酯萃取六次。將合并的有機相用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌一次，用硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。將起始化合物在-18℃下儲存。得到4.16g(理論值的83％；純度84％)標題化合物。
lc-ms(方法5):rt＝1.99min
ms(espos):m/z＝259(m+h)+
實施例44a
3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺
首先，將4.16g(13.53mmol)來自實施例43a的[1-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙-2-基]氨基甲酸芐酯加入12ml1-甲基-2-吡咯烷酮中，并在氬氣下加入216mg(0.20mmol)10％活性炭負載鈀。將反應混合物在室溫和標準壓力下進行氫化過夜。用硅藻土過濾反應混合物，然后用2.5ml1-甲基-2-吡咯烷酮洗滌過濾器。將合并的溶液直接用于下一反應。
目標化合物的濃度為1.07mol/l(133mg/ml)。
工作實施例:
實施例1
4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[1-(2,3-二氟芐基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5,5-二甲基-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
將144mg(1.16mmol)來自實施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)中的溶液[假定濃度：1.07mol/l]加入200mg(0.29mmol；純度82％)來自實施例30a的2-[1-(2,3-二氟芐基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4-碘-5,5-二甲基-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并將混合物用0.5ml1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)稀釋。將混合物在130℃下在微波中攪拌3.5h。加入水/乙腈/tfa，并將反應溶液用制備型hplc純化(rp18柱，流動相：乙腈/水(加入0.1％tfa)梯度)。通過蒸發(fā)濃縮產(chǎn)物餾分。將所得殘留物溶于二氯甲烷和少量甲醇中，并用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌兩次。將合并的水相用二氯甲烷萃取兩次。將合并的有機相用硫酸鈉干燥，過濾并通過蒸發(fā)濃縮。得到22mg(理論值的12％；純度92％)標題化合物。
lc-ms(方法1):rt＝0.82min
ms(esipos):m/z＝561[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.36(s,6h),1.84(br.s,2h),2.62(d,3h),3.73(d,2h),4.18-4.48(m,4h),5.82(s,2h),6.49(br.s,1h),6.99-7.06(m,1h),7.11-7.20(m,1h),7.34-7.43(m,1h),8.55(d,1h),11.08(br.s,1h)。
實施例2
4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-1-(2-氟芐基)-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5,5-二甲基-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
將273mg(2.20mmol)來自實施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定濃度：1.07mol/l]加入300mg(0.55mmol)2-[5-氟-1-(2-氟芐基)-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4-碘-5,5-二甲基-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并將混合物用2.7ml1-甲基-2-吡咯烷酮稀釋。將混合物在130℃下攪拌7h。將反應溶液通過制備型hplc直接純化(rp18柱，流動相：甲醇/水(加入0.1％tfa)梯度)。通過蒸發(fā)濃縮產(chǎn)物餾分。通過制備型hplc進一步純化[kinetexc18，5μm，100x21.2mm；流動相：水/乙腈/1％甲酸水溶液＝60/35/5，等度]。得到40mg(理論值的12％；純度86％)標題化合物。
lc-ms(方法7):rt＝1.06min
ms(esipos):m/z＝543[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.38(s,6h),2.62(d,3h),3.76(d,2h),4.21-4.31(m,1h),4.36(d,2h),4.47(d,1h),5.78(s,2h),6.56(t,1h),7.11-7.27(m,3h),7.32-7.40(m,1h),8.53(d,1h),11.07(s,1h)。
實施例3
4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-6-甲基-1-(2,3,6-三氟芐基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5,5-二甲基-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
將256mg(2.06mmol)來自實施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定濃度:1.07mol/l]加入300mg(0.51mmol)來自實施例32a的2-[5-氟-6-甲基-1-(2,3,6-三氟芐基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4-碘-5,5-二甲基-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并將混合物用2.5ml1-甲基-2-吡咯烷酮稀釋。將混合物在130℃下攪拌4h。將反應溶液通過制備型hplc直接純化(rp18柱，流動相：甲醇/水(加入0.1％tfa)梯度)。將產(chǎn)物餾分通過蒸發(fā)濃縮。將所得殘留物溶于二氯甲烷和少量甲醇中，并用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌兩次。將合并的水相用二氯甲烷萃取兩次。將合并的有機相用硫酸鈉干燥，過濾并通過蒸發(fā)濃縮。得到20mg(理論值的6％；純度86％)標題化合物。
lc-ms(方法5):rt＝2.55min
ms(esipos):m/z＝579[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.37(s,6h),1.85(br.s.,2h),2.63(d,3h),3.73(d,2h),4.19(d,1h),4.31(d,2h),4.43(d,1h),5.80(s,2h),6.55(t,1h),7.18(ddt,1h),7.54(ddt,1h),8.52(d,1h),11.05(s,1h)。
實施例4
4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5,5-二甲基-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
將169mg(1.36mmol)來自實施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定濃度：1.07mol/l]加入200mg(0.34mmol)來自實施例33a的2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-4-碘-5,5-二甲基-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并將混合物用0.4ml1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)稀釋。將混合物在130℃下在微波中攪拌5h。加入水/乙腈/tfa，并將反應溶液通過制備型hplc純化(rp18柱,流動相：乙腈/水(加入0.1％tfa)梯度)。通過蒸發(fā)濃縮產(chǎn)物餾分。將所得殘留物溶于二氯甲烷和少量甲醇中，并用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌兩次。將合并的水相用二氯甲烷萃取兩次。將合并的有機相用硫酸鈉干燥，過濾并通過蒸發(fā)濃縮。得到19mg(理論值的10％)標題化合物。
lc-ms(方法1):rt＝0.72min
ms(esipos):m/z＝544[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.37(s,6h),1.83(br.s,2h),2.60(d,3h),3.75(d,2h),4.17-4.47(m,4h),5.91(s,2h),6.51(t,1h),7.40-7.47(m,1h),7.72-7.80(m,1h),8.28(d,1h),8.53(d,1h),11.02(br.s,1h)。
實施例5
4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5,5-二甲基-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
將348mg(2.80mmol)來自實施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)中的溶液[假定濃度:1.07mol/l]加入450mg(0.70mmol；純度83％)來自實施例34a的2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-4-碘-5,5-二甲基-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并將混合物用1.2ml1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)稀釋。將混合物在130℃下在微波中攪拌4h。加入水/乙腈/tfa，并將反應溶液通過制備型hplc純化(rp18柱,流動相：乙腈/水(加入0.1％tfa)梯度)。通過蒸發(fā)濃縮產(chǎn)物餾分。將所得殘留物溶于二氯甲烷和少量甲醇中，并用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌兩次。將合并的水相用二氯甲烷萃取兩次。將合并的有機相用硫酸鈉干燥，過濾并通過蒸發(fā)濃縮。得到43mg(理論值的12％；純度97％)標題化合物。
lc-ms(方法1):rt＝0.66min
ms(esipos):m/z＝530[m+h]+
1h-nmr(500mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.39(s,6h),1.85(br.s,2h),3.76(d,2h),4.20-4.46(m,4h),5.96(s,2h),6.53(t,1h),7.40-7.46(m,1h),7.73-7.80(m,1h),8.25-9.29(m,1h),8.63-8.69(m,2h),11.05(br.s,1h)。
實施例6
rac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[1-(2,3-二氟芐基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
將141mg(1.14mmol)來自實施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定濃度:1.07mol/l]加入200mg(0.29mmol；純度88％)來自實施例39a的rac-2-[1-(2,3-二氟芐基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4-碘-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并將混合物用0.4ml1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)稀釋。將混合物在130℃下在微波中攪拌4.5h。加入水/乙腈/tfa，并將反應溶液通過制備型hplc純化(rp18柱,流動相：乙腈/水(加入0.1％tfa)梯度)。通過蒸發(fā)濃縮產(chǎn)物餾分。將所得殘留物溶于二氯甲烷和少量甲醇中，并用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌兩次。將合并的水相用二氯甲烷萃取兩次。將合并的有機相用硫酸鈉干燥，過濾并通過蒸發(fā)濃縮。得到57mg(理論值的31％；純度95％)標題化合物。
lc-ms(方法1):rt＝0.91min
ms(esipos):m/z＝615[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.66(s,3h),1.87(br.s,2h),2.61(d,3h),3.59-3.68(m,1h),3.73-3.84(m,1h),4.21(d,1h),4.28-4.36(m,2h),4.40-4.47(m,1h),5.83(s,2h),6.24(br.s,1h),6.97-7.05(m,1h),7.09-7.22(m,1h),7.32-7.44(m,1h),8.51(d,1h),11.69(br.s,1h)。
實施例7
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[1-(2,3-二氟芐基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(對映異構體a)
將50mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[1-(2,3-二氟芐基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(實施例6)在手性相上分離成對映異構體[柱:daicelchiralcelox-h,5μm,250x20mm,流動相：80％異己烷,20％乙醇+0.2％二乙胺,流速15ml/min；40℃,檢測:220nm]。將產(chǎn)物餾分收集于干冰上，通過蒸發(fā)濃縮，然后凍干。
對映異構體a:14mg(純度99％,99％ee)
rt＝5.36min[daicelchiralcelox-h,5μm,250x4.6mm；流動相：80％異己烷,20％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；40℃；檢測:220nm]。
實施例8
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[1-(2,3-二氟芐基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(對映異構體b)
將50mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[1-(2,3-二氟芐基)-5-氟-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(實施例6)在手性相上分離成對映異構體[柱:daicelchiralcelox-h,5μm,250x20mm,流動相：80％異己烷,20％乙醇+0.2％二乙胺,流速15ml/min；40℃,檢測:220nm]。將產(chǎn)物餾分收集于干冰上，通過蒸發(fā)濃縮，然后凍干。
對映異構體b:16mg(純度99％,99％ee)
rt＝8.31min[daicelchiralcelox-h,5μm,250x4.6mm；流動相：80％異己烷,20％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；40℃；檢測:220nm]。
實施例9
rac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-1-(2-氟芐基)-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
將165mg(1.33mmol)來自實施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定濃度:1.07mol/l]加入200mg(0.33mmol)來自實施例37a的rac-2-[5-氟-1-(2-氟芐基)-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4-碘-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并將混合物用1.5ml1-甲基-2-吡咯烷酮稀釋。將混合物在130℃下在微波中攪拌5h。將反應溶液通過制備型hplc直接純化(rp18柱,流動相：甲醇/水(加入0.1％tfa)梯度)。將產(chǎn)物餾分從甲醇中分離并用二氯甲烷/甲醇(10/1)的混合物重復萃取。將合并的有機相用飽和碳酸氫鈉水溶液和氯化鈉洗滌，用硫酸鈉干燥，過濾并通過蒸發(fā)濃縮。將殘留物通過制備型hplc再次純化(rp18柱,流動相：甲醇/水(加入0.1％tfa)梯度)。濃縮產(chǎn)物餾分。得到37mg(理論值的16％；純度85％)標題化合物。
lc-ms(方法7):rt＝1.11min
ms(esipos):m/z＝597[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.75(s,3h),1.95(br.s,2h),2.63(d,3h),3.66(dd,1h),3.86(dd,1h),4.22(d,1h),4.30-4.36(m,2h),4.44(dd,1h),5.80(s,2h),6.52(t,1h),7.09-7.27(m,3h),7.32-7.41(m,1h),8.50(d,1h),11.72(br.s,1h)。
實施例10
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-1-(2-氟芐基)-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(對映異構體a)
將36mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-1-(2-氟芐基)-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(實施例9)在手性相上分離成對映異構體[柱:daicelchiralceloz-h,5μm,250x20mm,流動相：80％異己烷,20％乙醇,流速15ml/min；35℃,檢測:220nm]。
對映異構體a:7mg(純度>99％,>99％ee)
rt＝4.15min[daicelchiralceloz-h,5μm,250x4.6mm；流動相：70％異己烷,30％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；30℃；檢測:270nm]。
實施例11
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-1-(2-氟芐基)-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(對映異構體b)
將36mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-1-(2-氟芐基)-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(實施例9)在手性相上分離成對映異構體[柱:daicelchiralceloz-h,5μm,250x20mm,流動相：80％異己烷,20％乙醇,流速15ml/min；35℃,檢測:220nm]。
對映異構體b:11mg(純度95％,>99％ee)
rt＝5.60min[daicelchiralceloz-h,5μm,250x4.6mm；流動相：70％異己烷,30％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；30℃；檢測:270nm]。
實施例12
rac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-6-甲基-1-(2,3,6-三氟芐基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
將156mg(1.26mmol)來自實施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定濃度:1.07mol/l]加入200mg(0.31mmol)來自實施例38a的rac-2-[5-氟-6-甲基-1-(2,3,6-三氟芐基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4-碘-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并將混合物用1.5ml1-甲基-2-吡咯烷酮稀釋。將混合物在130℃下在微波中攪拌5h。將反應溶液通過制備型hplc直接純化(rp18柱,流動相：甲醇/水(加入0.1％tfa)梯度)。濃縮產(chǎn)物餾分，用二氯甲烷/甲醇(10/1)的混合物稀釋，用飽和碳酸氫鈉水溶液和氯化鈉洗滌，用硫酸鈉干燥，過濾并通過蒸發(fā)濃縮。得到84mg(理論值的35％；純度82％)標題化合物。
lc-ms(方法1):rt＝0.86min
ms(esipos):m/z＝633[m+h]+
1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.74(s,3h),1.86(br.s,2h),2.64(d,3h),3.63(dd,1h),3.83(dd,1h),4.20(d,1h),4.27-4.35(m,2h),4.42(dd,1h),5.82(s,2h),6.53(t,1h),7.19(ddt,1h),7.54(ddt,1h),8.48(d,1h),11.71(br.s,1h)。
實施例13
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-6-甲基-1-(2,3,6-三氟芐基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(對映異構體a)
將84mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-6-甲基-1-(2,3,6-三氟芐基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(實施例12)在手性相上分離成對映異構體[柱:daicelchiralceloz-h,5μm,250x20mm,流動相：80％異己烷,20％乙醇,流速15ml/min；35℃,檢測:220nm]。
對映異構體a:18mg(純度>99％,>99％ee)
rt＝4.27min[daicelchiralceloz-h,5μm,250x4.6mm；流動相：70％異己烷,30％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；30℃；檢測:270nm]。
實施例14
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-6-甲基-1-(2,3,6-三氟芐基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(對映異構體b)
將84mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[5-氟-6-甲基-1-(2,3,6-三氟芐基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(實施例12)在手性相上分離成對映異構體[柱:daicelchiralceloz-h,5μm,250x20mm,流動相：80％異己烷,20％乙醇,流速15ml/min；35℃,檢測:220nm]。
對映異構體b:19mg(純度>99％,約98％ee)
rt＝4.99min[daicelchiralceloz-h,5μm,250x4.6mm；流動相：70％異己烷,30％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；30℃；檢測:270nm]。
實施例15
rac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
將132mg(1.06mmol)來自實施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定濃度:1.07mol/l]加入200mg(0.27mmol；純度80％)來自實施例40a的rac-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-4-碘-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并將混合物用0.4ml1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)稀釋。將混合物在130℃下在微波中攪拌4.5h。加入水/乙腈/tfa，并將反應溶液通過制備型hplc純化(rp18柱,流動相：乙腈/水(加入0.1％tfa)梯度)。通過蒸發(fā)濃縮產(chǎn)物餾分。將所得殘留物溶于二氯甲烷和少量甲醇中，并用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌兩次。將合并的水相用二氯甲烷萃取兩次。將合并的有機相用硫酸鈉干燥，過濾并通過蒸發(fā)濃縮。將殘留物通過薄層色譜再次純化(流動相：二氯甲烷/2n氨于甲醇中＝10/1)。得到37mg(理論值的23％)標題化合物。
lc-ms(方法1):rt＝0.81min
ms(esipos):m/z＝598[m+h]+
1h-nmr(500mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.73(s,3h),1.88(br.s,2h),2.61(d,3h),3.63-3.70(m,1h),3.82-3.88(m,1h),4.22(d,1h),4.30-4.36(m,2h),4.40-4.46(m,1h),5.94(s,2h),6.49(t,1h),7.40-7.46(m,1h),7.73-7.79(m,1h),8.28(d,1h),8.50(d,1h),11.68(br.s,1h)。
實施例16
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(對映異構體a)
將32mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(實施例15)在手性相上分離成對映異構體[柱:daicelchiralpakaz-h，5μm，250x30mm，流動相：70％異己烷，30％乙醇+0.2％二乙胺，流速30ml/min；40℃，檢測:220nm]。將產(chǎn)物餾分收集于干冰上，通過蒸發(fā)濃縮，然后凍干。
對映異構體a:14mg(純度99％，99％ee)
rt＝3.97min[daicelchiralpakaz-h，5μm，250x4.6mm；流動相：30％異己烷，70％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；40℃；檢測:220nm]。
實施例17
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(對映異構體b)
將32mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-6-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(實施例15)在手性相上分離成對映異構體[柱:daicelchiralpakaz-h，5μm，250x30mm，流動相：70％異己烷，30％乙醇+0.2％二乙胺，流速30ml/min；40℃，檢測:220nm]。將產(chǎn)物餾分收集于干冰上，通過蒸發(fā)濃縮，然后凍干。
對映異構體b:15mg(純度95％，98％ee)
rt＝6.33min[daicelchiralpakaz-h，5μm，250x4.6mm；流動相：30％異己烷，70％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；40℃；檢測:220nm]。
實施例18
rac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮
將148mg(1.20mmol)來自實施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定濃度:1.07mol/l]加入200mg(0.34mmol)來自實施例36a的rac-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-4-碘-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并將混合物用0.4ml1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)稀釋。將混合物在130℃下在微波中攪拌4.5h。加入水/乙腈/tfa，并將反應溶液通過制備型hplc純化(rp18柱，流動相：乙腈/水(加入0.1％tfa)梯度)。通過蒸發(fā)濃縮產(chǎn)物餾分。將所得殘留物溶于二氯甲烷和少量甲醇中，并用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌兩次。將合并的水相用二氯甲烷萃取兩次。將合并的有機相用硫酸鈉干燥，過濾并通過蒸發(fā)濃縮。得到49mg(理論值的25％；純度約92％)標題化合物。
lc-ms(方法1):rt＝0.77min
ms(esipos):m/z＝584[m+h]+
1h-nmr(500mhz，dmso-d6):δ[ppm]＝1.74(s,3h),1.89(br.s,2h),3.64-3.71(m,1h),3.81-3.88(m,1h),4.22(d,1h),4.30-4.36(m,2h),4.40-4.46(m,1h),5.98(s,2h),6.52(t,1h),7.40-7.46(m,1h),7.73-7.79(m,1h),8.26(d,1h),8.59-8.63(m,1h),8.68-8.71(m,1h),11.70(br.s,1h)。
實施例19
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(對映異構體a)
將36mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(實施例18)在手性相上分離成對映異構體[柱:daicelchiralpakaz-h，5μm，250x30mm，流動相：40％異己烷，60％乙醇+0.2％二乙胺，流速30ml/min；40℃，檢測:220nm]。將產(chǎn)物餾分收集于干冰上，通過蒸發(fā)濃縮，然后凍干。
對映異構體a:13mg(純度99％，99％ee)
rt＝4.05min[daicelchiralpakaz-h，5μm，250x4.6mm；流動相：30％異己烷，70％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；40℃；檢測:220nm]。
實施例20
ent-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(對映異構體b)
將36mgrac-4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-{5-氟-1-[(3-氟吡啶-2-基)甲基]-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基}-5-甲基-5-(三氟甲基)-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮(實施例18)在手性相上分離成對映異構體[柱:daicelchiralpakaz-h，5μm，250x30mm，流動相：40％異己烷，60％乙醇+0.2％二乙胺，流速30ml/min；40℃，檢測:220nm]。將產(chǎn)物餾分收集于干冰上，通過蒸發(fā)濃縮，然后凍干。
對映異構體b:17mg(純度約92％，97％ee)
rt＝5.56min[daicelchiralpakaz-h，5μm，250x4.6mm；流動相：30％異己烷，70％乙醇+0.2％二乙胺；流速1.0ml/min；40℃；檢測:220nm]。
實施例21
4-{[2-氨基-3-氟-2-(氟甲基)丙基]氨基}-2-[6-氯-1-(2-氟芐基)-1h-吲唑-3-基]-5,5-二甲基-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮三氟乙酸鹽
將70mg(0.57mmol)來自實施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定濃度:1.07mol/l]加入80mg(0.14mmol)來自實施例35a的2-[6-氯-1-(2-氟芐基)-1h-吲唑-3-基]-4-碘-5,5-二甲基-5,7-二氫-6h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-酮中，并將混合物用0.2ml1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)稀釋。將混合物在130℃下在微波中攪拌4h。然后加入另一35mg(0.28mmol)來自實施例44a的3-氟-2-(氟甲基)丙烷-1,2-二胺在1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液[假定濃度:1.07mol/l]，并將混合物在130℃下在微波中攪拌2h。加入水/乙腈/tfa，并將反應溶液通過制備型hplc純化(rp18柱，流動相：乙腈/水(加入0.1％tfa)梯度)。得到3mg(理論值的3％；純度約93％)標題化合物。
lc-ms(方法1):rt＝0.84min
ms(esipos):m/z＝544.4[m+h]+
1h-nmr(400mhz，dmso-d6):δ[ppm]＝1.38(s,6h),3.75-3.81(m,2h),4.58-4.69(m,2h),4.71-4.82(m,2h),5.83(s,2h),6.90(t,1h),7.06-7.11(m,1h),7.12-7.18(m,1h),7.21-7.28(m,1h),7.32-7.42(m,2h),7.94(s,1h),8.50(d,1h),8.98(br.s,3h),11.22(s,1h)。
b.藥效評估
在下文中使用以下縮寫：
bsa牛血清白蛋白
edta乙二胺四乙酸
μci微居里
tris三(羥甲基)氨基甲烷
本發(fā)明的化合物的藥理活性可在下述測定中證實：
b-1.體外血管舒張作用
本發(fā)明的化合物在分離的血管上進行舒張活性測定，如記載于jpstasch等人，brjpharmacol.2002；135，333-343。將兔通過重擊頸部打昏，并放血。取出主動脈，除去粘附組織，并分割成1.5mm寬的環(huán)，在37℃下，將所述環(huán)在預應力下單獨地放置于含有卡波金沖洗(carbogen-sparged)的krebs-henseleit溶液的5ml器官浴槽中，所述溶液具有下述組成(各自以mm計)：氯化鈉：119；氯化鉀：4.8；二水合氯化鈣：1；七水合硫酸鎂：1.4；磷酸二氫鉀：1.2；碳酸氫鈉：25；葡萄糖：10。用stathamuc2細胞測定收縮力，使用a/d轉換器(das-1802hc，keithleyinstrumentsmunich)放大并數(shù)字化，然后平行記錄在線性記錄器(linerecorder)中。
為了產(chǎn)生收縮，將苯腎上腺素以增加的濃度累積地加入浴槽中。在幾輪對照循環(huán)后，將待研究的物質(zhì)在每下一輪中以每次增加的劑量加入，并且將收縮程度與在緊鄰的上一輪中獲得的收縮程度進行比較。這用于計算將對照值的幅度減小50％所需的濃度(ic50值)。標準給藥體積為5μl；在浴槽溶液中的dmso含量相當于0.1％。
b-2.對重組鳥苷酸環(huán)化酶報告細胞系的作用
本發(fā)明的化合物的細胞活性使用重組鳥苷酸環(huán)化酶報告細胞系測定，如f.wunder等人，anal.biochem.339，104-112(2005)所述。
本發(fā)明的化合物的代表值(mec＝最小有效濃度)在下表中示出(表1；在一些情況下作為單獨測量的平均值)：
表1:
b-3.人磷酸二酯酶5(pde5)的抑制
pde5制劑通過以下方式獲得：將人血小板破裂(
為測定其對人pde5的體外作用，將測試物質(zhì)溶于100％dmso中并連續(xù)稀釋。通常，制備從200μm至0.091μm稀釋系列(1:3)(在測試中所得最終濃度：4μm至0.0018μm)。在每種情況下，將2μl稀釋的物質(zhì)溶液置于微量滴定板的孔中(isoplate-96/200w；perkinelmer)。隨后，加入50μl上述pde5制劑的稀釋液。選擇pde5制劑的稀釋液，使得在之后的孵育過程中小于70％的物質(zhì)被轉化(典型的稀釋：1:100；稀釋緩沖液：50mmtris/鹽酸ph7.5、8.3mm氯化鎂、1.7mmedta、0.2％bsa)。使用測定緩沖液(50mmtris/鹽酸ph7.5、8.3mm氯化鎂、1.7mmedta)將物質(zhì)[8-3h]環(huán)鳥苷酸-3',5'-單磷酸鹽(1μci/μl；perkinelmer)以1:2000稀釋至濃度為0.0005μci/μl。通過加入50μl(0.025μci)稀釋的底物，最后啟動酶反應。將測試混合物在室溫下孵育60min，并通過加入25μl18mg/ml釔閃爍親近珠的水懸浮液(用于spa測定的磷酸二酯酶珠，rpnq0150，perkinelmer)停止反應。將微量滴定板用膜密封并在室溫下放置60min。隨后，將板在microbeta閃爍計數(shù)器(perkinelmer)中以每孔30s進行分析。使用物質(zhì)濃度隨pde5抑制百分比變化的繪制圖來測定ic50值。
本發(fā)明的化合物的代表性ic50值在下表中示出(表2；在一些情況下作為單獨測量的平均值)：
表2:
b-4.對有意識的、自發(fā)性高血壓大鼠血壓的無線電遙測測量
使用市售的來自datasciencesinternationaldsi，usa的遙測系統(tǒng)對下文描述的有意識的大鼠進行血壓測量。
所述系統(tǒng)由3個主要組件組成：
-可植入發(fā)射器(
-接收器(
-所述遙測系統(tǒng)使得可以連續(xù)記錄有意識的動物在其通常的棲息地中的血壓、心率和身體動作。
動物材料
在體重>200g的成年雌性自發(fā)性高血壓大鼠(shrokamoto)中進行研究。來自okamotokyotoschoolofmedicine，1963的shr/ncrl是具有大大升高的血壓的雄性wistarkyoto大鼠與具有稍微升高的血壓的雌性大鼠的雜交種，且將其在f13遞送至美國國立衛(wèi)生研究院(u.s.nationalinstitutesofhealth)。
在將發(fā)射器植入后，試驗動物被單獨圈養(yǎng)在3型makrolon籠中。它們可自由攝取標準飼料和水。
在實驗室內(nèi)的晝/夜節(jié)律由在6:00am以及在7:00pm的室內(nèi)照明改變。
發(fā)射器植入
在第一次實驗應用至少14天之前，將所用的ta11pa-c40遙測發(fā)射器在無菌條件下手術植入到試驗動物中。以這種方式安裝儀器的動物可在傷口愈合以及安放植入物后被重復使用。
對于植入，將禁食的動物用戊巴比妥(耐波他(nembutal)，sanofi：50mg/kg腹膜內(nèi)給藥)麻醉，然后在其腹部的一大塊面積上剃毛并消毒。在沿著腹白線打開腹腔后，將該系統(tǒng)的裝滿液體的測量導管在二根分叉部上方沿顱骨方向插入到降主動脈中并用組織膠(vetbondtm，3m)固定。發(fā)射器外殼在腹膜內(nèi)被固定至腹壁肌肉，且傷口被一層層地閉合。
為了預防感染，在術后給予抗生素(tardomyocelcomp，bayer，1ml/kg，皮下注射)。
物質(zhì)和溶液
除非另有說明，將待研究的物質(zhì)各自通過管飼法口服給予一組動物(n＝6)。按照5ml/kg體重的給藥體積，將測試物質(zhì)溶于合適的溶劑混合物中或懸浮在0.5％的甲基纖維素(tylose)中。
溶劑處理組的動物用作對照。
試驗方法
將所述遙測測量裝置分配給24只動物。每個實驗以實驗編號(v年月日)記錄。
在所述系統(tǒng)中生存的安裝儀器的每只大鼠被分配單獨的接收天線(1010receiver，dsi)。
所述植入的發(fā)射器可通過內(nèi)置式磁開關在外部激活。在實驗啟動階段將其切換到傳輸。發(fā)射的信號可通過數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(dataquesttma.r.t.forwindows，dsi)在線檢測并相應地處理。數(shù)據(jù)被各自儲存在為此目的創(chuàng)建的文件中并帶有實驗編號。
在標準程序中，在每種情況下以10秒為周期測量下述指標：
-收縮壓(sbp)
-舒張壓(dbp)
-平均動脈壓(map)
-心率(hr)
-活性(act)。
在計算機控制下以5分鐘間隔重復采集測量值。作為絕對值獲得的源數(shù)據(jù)在圖表中用當前測量的氣壓校正(環(huán)境壓力參考監(jiān)視器；apr-1)并作為單獨數(shù)據(jù)儲存。其他技術細節(jié)記載于制造商公司(dsi)的大量文件中。
除非另有說明，在實驗當天的9.00am給予測試物質(zhì)。在給藥后，在24小時內(nèi)測量上述參數(shù)。
評估
在實驗結束后，使用分析軟件(dataquesttma.r.t.tmanalysis)分類所采集的單個數(shù)據(jù)。在此，將給藥前2小時設定為空白值，因此所選擇的數(shù)據(jù)集包括從實驗當天上午7.00至第二天上午9.00的時期。
通過測定平均值(15分鐘平均)使數(shù)據(jù)在預先定義的時間上平滑，并作為文本文檔轉移至儲存介質(zhì)中。將以此方式預分類并壓縮的測量值轉移到excel模板中并制表。對于每日的實驗，將所獲得的數(shù)據(jù)儲存在帶有實驗編號的專用文件中。將結果和測試方案以按編號分類的紙件形式歸檔。
參考文獻
klauswitte，kaihu，johannaswiatek，claudiamüssig，georgertland
b-5.在長期實驗中對大鼠的器官保護作用的測定
本發(fā)明的化合物的器官保護作用示于大鼠中的治療相關的“低一氧化氮(no)/高腎素”高血壓模型中。該研究的進行類似于最近發(fā)表的文章(sharkovskay等人jhypertension2010；28:1666-1675)。其涉及處理腎素轉基因大鼠(tgr(mren2)27)，通過數(shù)周同時飲用水與本發(fā)明的化合物或賦形劑來向所述大鼠給予no合酶抑制劑l-name。在處理過程中測定血液動力學和腎參數(shù)。在長期研究結束時，通過組織病理學研究、生物指標、表達分析和心血管血漿參數(shù)來表明器官保護(腎臟、肺、心臟、主動脈)。
b-6.在缺氧條件下對有意識的犬的肺動脈壓(pap)的測量
例如，使用來自datasciencesinternationaldsi，usa的遙測系統(tǒng)對下文描述的有意識的犬進行血壓測量。所述系統(tǒng)由可植入血壓發(fā)射器、接收器和數(shù)據(jù)采集計算機組成。所述遙測系統(tǒng)使得可以連續(xù)監(jiān)測有意識的動物的血壓和心率。在第一次實驗應用之前，將所用的遙測發(fā)射器在無菌條件下手術植入到試驗動物中。以該方式安裝儀器的動物可在傷口愈合以及安放植入物后被重復使用。該測試使用成年雄性比格犬進行。技術細節(jié)可參見制造商公司(dsi)的文件。
物質(zhì)和溶液
將待測試的物質(zhì)各自通過明膠膠囊口服或在合適的溶劑混合物中通過靜脈注射給予一組犬(n＝3-6)。將用載體處理的一組動物用作對照。
試驗方法
對于在缺氧條件下的測量，將動物轉移至缺氧氣氛(氧氣含量約10％)的室內(nèi)。這種缺氧氣氛使用市售的缺氧發(fā)生器(hypoxiagenerators)(購自hoehenbalance，cologne，germany)建立。在標準試驗中，例如在給予物質(zhì)1小時和5小時后，將犬轉移至缺氧室內(nèi)30min。在進入缺氧室之前和之后約10min，以及在缺氧室中停留期間，通過遙測測量血壓和心率。
評估
在健康的犬中，在缺氧情況下，其pap快速增加。通過給予物質(zhì)，可降低這種增加。為了量化pap增加以及心率和全身血壓的變化，對在缺氧之前和期間的數(shù)據(jù)(通過測定平均值來平滑)進行比較。使用prism軟件(graphpad，usa)以圖形方式示出測量參數(shù)的過程。
b-7.靜脈和口服給藥后的藥物代謝動力學參數(shù)的測定
本發(fā)明的化合物的藥物代謝動力學參數(shù)是在雄性cd-1小鼠、雄性wistar大鼠、雌性比格犬和雌性獼猴中測定的。對于小鼠和大鼠，靜脈給藥通過物種特異性的血漿/dmso制劑進行，對于犬和猴通過水/peg400/乙醇制劑進行。在所有物種中，口服給予基于水/peg400/乙醇制劑溶解的物質(zhì)是通過管飼法進行的。在給予物質(zhì)之前，通過將硅酮導管插入右側頸外靜脈中以簡化大鼠采血。手術是在使用異氟醚麻醉并給予止痛劑(阿托品/卡布洛芬(rimadyl)(3/1)0.1ml皮下給藥)的實驗之前至少一天時進行的。在包括給予物質(zhì)后至少24小時至最長72小時的終末時間點的時間窗內(nèi)采血(通常超過10個時間點)。將血液轉移到肝素化的管中。然后通過離心獲得血漿；如果需要，可將其儲存在-20℃下直至進一步處理。
將內(nèi)標(其也可以是化學上不相關的物質(zhì))加入本發(fā)明的化合物的樣品、校準樣品和合格品(qualifier)中，然后使用過量乙腈沉淀蛋白質(zhì)。加入與lc條件匹配的緩沖溶液，隨后渦旋，然后以1000g離心。通過lc-ms/ms使用c18反相柱和可變流動相混合物分析上清液。通過具體選擇的離子監(jiān)測實驗或高分辨lc-ms實驗的提取離子色譜圖的峰高或峰面積來量化所述物質(zhì)。
使用所測定的血漿濃度/時間曲線以經(jīng)驗證的藥物代謝動力學計算程序來計算藥物代謝動力學參數(shù)，例如auc、cmax、f(生物利用度)、t1/2(終末半衰期)、mrt(平均滯留時間)和cl(清除率)。
由于物質(zhì)量化是在血漿中進行的，因此有必要測定所述物質(zhì)的血液/血漿分布，從而能夠相應調(diào)節(jié)藥物代謝動力學參數(shù)。為此，在滾輥混合器(rockingrollermixer)中，將限定量的物質(zhì)在所述物種的肝素化全血中孵育20min。通過以1000g離心而獲得血漿。在測量血漿和血液濃度后(通過lc-ms(/ms)；參見上文)，通過形成的商來測定c血液/c血漿值。
b-8.代謝研究
為了測定本發(fā)明的化合物的代謝特性，將它們用重組人細胞色素p450(cpy)酶、肝微體或來自各種動物物種(例如大鼠、犬)及人來源的原代新鮮肝細胞孵育，以獲得并比較基本上非常完整的i期和ii期肝代謝的信息以及參與代謝的酶的信息。
將本發(fā)明的化合物以約0.1-10μm的濃度孵育。為此，制備濃度為0.01-1mm的本發(fā)明的化合物在乙腈中的儲備液，然后以1:100的稀釋度移液到孵育混合物中。在37℃下，將肝微體和重組酶在50mm磷酸鉀緩沖液(ph7.4)中孵育，所述磷酸鉀緩沖液具有或不具有由1mmnadp+、10mm葡萄糖-6-磷酸和1個單位的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成的nadph生成系統(tǒng)。同樣在37℃下，將原代肝細胞懸浮孵育在williamse培養(yǎng)基中。在孵育0-4h后，用乙腈(終濃度為約30％)終止孵育混合物，并且以約15000xg將蛋白質(zhì)離心出來。直接分析由此終止的樣品，或將其儲存在-20℃下直至進行分析。
所述分析通過帶有紫外和質(zhì)譜檢測的高效液相色譜法(hplc-uv-ms/ms)進行。為此，將孵育樣品的上清液用合適的c18反相柱和可變的流動相混合物(乙腈和10mm甲酸銨水溶液或0.05％甲酸)進行色譜分析。uv色譜圖結合質(zhì)譜數(shù)據(jù)用于對代謝物進行鑒定、結構解析和定量測定，以及用于在孵育混合物中本發(fā)明的化合物的定量代謝降低。
b-9.caco-2滲透性測試
借助于caco-2細胞系測定測試物質(zhì)的滲透性，caco-2細胞系是一種用于在胃腸屏障處預測滲透性而建立的體外模型[artursson，p.andkarlsson，j.(1991)correlationbetweenoraldrugabsorptioninhumansandapparentdrugpermeabilitycoefficientsinhumanintestinalepithelial(caco-2)cells.biochem.biophys.175(3)，880-885]。將caco-2細胞(accno.169，dsmz，deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturen，braunschweig，germany)接種在具有插入物的24孔板中并孵育15至16天。對于滲透性研究，將測試物質(zhì)溶于dmso中并用輸送緩沖液(hanksbufferedsaltsolution，gibco/invitrogen，具有19.9mm葡萄糖和9.8mmhepes)稀釋至最終測試濃度。為了測定測試物質(zhì)的頂端至基底外側的滲透性(pappa-b)，將包含測試物質(zhì)的溶液施用至caco-2細胞單層的頂側，并將輸送緩沖液施用至基底側。為了測定測試物質(zhì)的基底外側至頂端的滲透性(pappb-a)，將包含測試物質(zhì)的溶液施用至caco-2細胞單層的基底側，并將輸送緩沖液施用至頂端。在試驗開始時，從相應的供體隔室(donorcompartment)取樣以確保質(zhì)量平衡。在37℃下，在孵育2小時后，將樣品從兩個隔室中取出。通過lc-ms/ms分析樣品并計算表觀滲透系數(shù)(papp)。對于各細胞單層，測定熒光黃的滲透性以確保細胞層的完整性。在每次測試運行時，還測定阿替洛爾(低滲透性標記物)和柳氮磺胺吡啶(主動分泌的標記物)的滲透性作為品質(zhì)對照。
b-10.測定物質(zhì)在ph6.5的緩沖液中的溶解度
將40μldmso加入2mg測試物質(zhì)中[50g/l]。移出10μl該溶液并將其引入990μlph6.5的pbs緩沖液中(c＝500μg/ml)。將該溶液/懸浮液在室溫下?lián)u晃24h。在114000g下超速離心30min后，移出上清液，用8:2的acn/水稀釋并通過lc-msms分析。
對于校準，同樣從dmso儲備液中移出10μl并將其引入823μldmso中(c＝600μg/ml)。使用五點校準曲線進行量化。
lc-msms量化的儀器：
absciextriplequad4500；agilent1260，具有初始泵(g1312binfinity)、脫氣器(g4225ainfinity)、柱恒溫器(g1316cinfinity)；ctcanalyticspal注射系統(tǒng)thc-xt
hplc方法:
流動相:
a:0.5ml甲酸(50％濃度)/l水
b:0.5ml甲酸(50％濃度)/l乙腈
梯度:
流速:2.5ml
注射體積:5μl
柱:watersoasishlb，2.1x20mm，25μ
柱溫:30℃
分離器(ms的上游)1:20
ms方法:
用于優(yōu)化的流動注射分析(fia)
用于量化的多重反應監(jiān)測(mrm)
流動相:
a:0.5ml甲酸(50％濃度)/l水
b:0.5ml甲酸(50％濃度)/l乙腈
流速:0.25ml
注射體積:5μl
柱:不銹鋼毛細管
毛細管溫度:22℃
本發(fā)明的化合物的代表性溶解度示于表3。
表3
b-11.在具有不同ph值的緩沖液中測定物質(zhì)的溶解度
每種物質(zhì)和緩沖液，各自精確稱重0.5-0.6mg(8個稱重部分)。對于dmso校準溶液，需要0.5-0.6mg的另一稱重部分(稱重部分9)。在每種情況下，將緩沖液加入樣品中，以獲得c＝500μg/ml的濃度。將該樣品溶液在室溫和1400rpm下?lián)u晃24h。
將具有用于校準的稱重部分的eppendorf容器用dmso填充至濃度c＝600μg/ml。由該儲備液制備2種校準溶液。首先，將1000μldmso加入2mleppendorf容器中，并吸取34.4μl儲備液(c＝20μg/ml)。在另一2mleppendorf容器中，將71.4μl該溶液(c＝20μg/ml)加入500μldmso(c＝2.5μg/ml)中。將兩種校準溶液轉移至hplc小瓶。
在搖晃樣品溶液后，在每種情況下，將200μl上清液轉移至離心管中，并在114000g下離心30min。然后移取150μl上清液，用dmso以1:5和1:100稀釋并轉移至hplc小瓶。通過hplc分析兩種校準溶液和經(jīng)稀釋的樣品溶液。使用各峰面積進行量化。
溶劑和緩沖液
蒸餾水
高氯酸(fluka；77227)
乙腈(tap品質(zhì))
dmso(merck；8.02912.2500)
緩沖液
儀器
agilent1100或具有uv檢測、可變波長(如二極管陣列)的類似儀器
超聲波浴
janke&kunkelvibromix
eppendorfthermomixer
hplc方法:
流動相a:5mlhclo4/l水
流動相b:乙腈
梯度:
柱：kromasil100c18，60x2.1mm，3.5μm
柱溫：30℃
流速：0.75ml/min
檢測器：210nm
注射體積：60μl
c.藥物組合物的工作實施例
可將本發(fā)明的化合物轉化成以下藥物制劑：
片劑:
組分:
100mg本發(fā)明的化合物、50mg乳糖(一水合物)、50mg玉米淀粉(天然)、10mg聚乙烯吡咯烷酮(pvp25)(basf，ludwigshafen，germany)和2mg硬脂酸鎂。
片劑重量212mg。直徑8mm，曲率半徑12mm。
制備:
將本發(fā)明的化合物、乳糖和淀粉的混合物使用5％(重量/重量)的pvp水溶液制粒。將顆粒干燥，然后與硬脂酸鎂混合5分鐘。使用常規(guī)的壓片機壓片該混合物(對于片劑形式，參見上文)。用于壓片的指導值為15kn壓力。
用于口服給藥的懸浮劑:
組成：
1000mg本發(fā)明的化合物、1000mg乙醇(96％)、400mg
10ml口服懸液劑相當于100mg本發(fā)明的化合物的單次劑量。
制備：
將rhodigel懸浮在乙醇中；將本發(fā)明的化合物加入懸浮液中。在攪拌下加入水。將所述混合物攪拌約6h直到rhodigel完全溶脹。
用于口服給藥的溶液劑：
組成：
500mg本發(fā)明的化合物、2.5g聚山梨酸酯和97g聚乙二醇400。20g口服溶液劑相當于100mg本發(fā)明的化合物的單次劑量。
制備：
在攪拌下，將本發(fā)明的化合物懸浮在聚乙二醇和聚山梨酸酯的混合物中。持續(xù)攪拌操作直至本發(fā)明的化合物完全溶解。
靜脈給藥溶液劑：
將本發(fā)明的化合物以低于飽和溶解度的濃度溶于生理上可接受的溶劑(例如等滲生理鹽水、5％葡萄糖溶液和/或30％peg400溶液)中。將該溶液進行無菌過濾并分配到無菌且無熱原的注射容器中。