使用重疊非等位基因特異性引物和等位基因特異性阻斷劑寡核苷酸的組合物進行等位基因特異性擴增的制作方法

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背景技術：

DNA和RNA中的微小差異可導致包括人類在內(nèi)的生物體的總體身體健康和健康狀態(tài)的巨大差異。例如，細菌基因組中的單堿基改變可導致抗生素抗性，以及人類基因組中的一個單堿基改變可導致癌癥進展。隨著基因組學領域的成熟和隨之而來的許多核酸生物標志物序列和分子的發(fā)現(xiàn)，存在來自生物技術工業(yè)的發(fā)展可區(qū)分單堿基改變的可靠、穩(wěn)健、廉價和精確的核酸試驗的強烈需求。具體地，已開發(fā)等位基因特異性的許多基于PCR的試驗。

用于選擇性檢測稀有突變的基于PCR的方法可大體分類為兩類方法：(A)等位基因特異性引物，和(B)利用等位基因特異性阻斷劑的非等位基因特異性引物。

等位基因特異性引物的示例包括擴增阻礙突變系統(tǒng)(ARMS)、等位基因特異性阻斷劑PCR(ASB-PCR)、和競爭性等位基因特異性TaqMan PCR(castPCR)。(B)的示例包括PNA阻斷劑PCR和低變性溫度共擴增PCR(COLD-PCR)。

本發(fā)明之前，等位基因特異性引物通常在檢測已知單堿基突變時具有優(yōu)勢(更高的突變敏感性)，而非等位基因特異性引物與等位基因特異性阻斷劑通常用于檢測多重緊密簇集的突變(熱點)或未知突變序列。

等位基因特異性PCR引物例如ARMS、ASB-PCR、castPCR通常在引物的最3’端具有等位基因特異性核苷酸。等位基因特異性PCR引物使用DNA聚合酶的識別力來特異延伸合適配對的堿基，但是受到下述限制：當發(fā)生不正確的DNA聚合酶延伸事件時，作為引物一部分的稀有等位基因核苷酸被納入模板，隨后擴增循環(huán)變得不再特異。等位基因特異性PCR引物僅在第一不正確擴增事件之前具有特異性。用非等位基因特異性引物進行等位基因特異性檢測需要精確的變性溫度控制以及對更小序列的受限分析。用非等位基因特異性引物進行等位基因特異性檢測的突變敏感性低并且更易于受到聚合酶導入錯誤的影響。

因此，需要具有等位基因擴增特異性更高和突變敏感性改善的非等位基因特異性引物和等位基因特異性阻斷劑寡核苷酸的組合物。因此，開發(fā)適合檢測大量變體中少量靶標的新方法是診斷應用的前提條件。因此，本發(fā)明提供非等位基因特異性引物和等位基因特異性阻斷劑寡核苷酸的組合物，從而提供用于疾病診斷應用例如癌癥診斷等的更精確且高效的工具。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及重疊非等位基因特異性引物寡核苷酸和等位基因特異性阻斷劑寡核苷酸的組合物，用于等位基因特異性擴增。

本發(fā)明提供包含阻斷劑和第一引物寡核苷酸的寡核苷酸組合物。所述阻斷劑寡核苷酸包含具有靶中性子序列和阻斷劑可變子序列的第一序列。然而，在一些示例中，若待測靶核酸用于檢測插入時，阻斷劑寡核苷酸可不包含阻斷劑可變子序列。阻斷劑可變子序列在其3’和5’端被所述靶中性子序列側接，并且與該靶中性子序列連續(xù)。所述第一引物寡核苷酸足以誘導酶促延伸；本文中，第一引物寡核苷酸包含第二序列。所述第二序列與該靶中性子序列的5’端重疊至少5個核苷酸；從而所述第二序列包含重疊子序列和非重疊子序列。第二序列不包含與阻斷劑可變子序列同源的任何序列。

本發(fā)明還涉及擴增靶序列的方法。所述方法包括獲取樣品，所述樣品含一或多拷貝的第一核酸和至少一拷貝的第二核酸，所述第一核酸含變體序列；所述第二核酸含所述靶序列。靶序列和變體序列各自包含同源子序列和可變子序列。所述可變子序列還含至少一個核苷酸。所述靶序列的可變子序列是靶特異性子序列并且所述變體序列的可變子序列是非靶特異性子序列。

獲取樣品后，將阻斷劑寡核苷酸引入樣品。所述阻斷劑寡核苷酸包含具有靶中性子序列和阻斷劑可變子序列的第一序列。所述靶中性子序列與所述同源子序列的部分互補并且所述阻斷劑可變子序列與所述非靶特異性子序列互補。此外，阻斷劑可變子序列在其3’和5’端被所述靶中性子序列側接，并且與該靶中性子序列連續(xù)。

之后，將第一引物寡核苷酸引入所述樣品。所述第一引物寡核苷酸足以誘導酶促延伸。第一引物寡核苷酸包含第二序列，所述第二序列與所述同源子序列的第二部分互補。此外，所述第二序列與該靶中性子序列的5’端重疊至少5個核苷酸；從而所述第二序列包含重疊子序列和非重疊子序列。所述第二序列不包含任何與所述可變子序列互補的序列。

下一步，向所述樣品引入DNA聚合酶、三磷酸核苷、和基于聚合酶的核酸擴增所需的一種或多種試劑；和在足以實現(xiàn)核酸擴增的條件下使樣品反應。

本發(fā)明的一個優(yōu)勢是改善的突變敏感性，其匹配和/或超過等位基因特異性引物方案。

本發(fā)明的另一優(yōu)勢是具有顯著溫度(8℃)穩(wěn)健性的簡單的2步熱循環(huán)方案。

本發(fā)明的另一優(yōu)勢是提供便宜的DNA引物和阻斷劑試劑而無需復雜的骨架或核苷酸修飾。

本發(fā)明的另一優(yōu)勢是與高保真酶相容。

本發(fā)明的另一優(yōu)勢是等位基因特異性阻斷劑與變體的結合比與靶標的結合更強，從而相比結合至變體的阻斷劑，非等位基因特異性引物更有利于替代結合至靶標的阻斷劑。使用非等位基因特異性引物的優(yōu)勢是偽擴增的變體導致擴增產(chǎn)物(擴增子)承載變體序列而不是靶序列。因此，每個循環(huán)都產(chǎn)生(compound)特異性。

此概況以簡化形式提供本發(fā)明的引導描述、某些方面、優(yōu)勢和新特性，后續(xù)詳細描述中進一步闡明。本概述并不旨在標識所要求保護的主題的關鍵特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保護的主題的范圍。

附圖的簡要說明

當結合附圖進行閱讀時，將更好地理解前面的發(fā)明內(nèi)容以及下面的示例性實施方式的詳細說明。為了圖示本發(fā)明，附圖中顯示本發(fā)明的示例性構建。然而，本發(fā)明并不局限于本文所述的具體方法和手段。

圖1顯示用于本發(fā)明所述等位基因特異性擴增的非等位基因特異性引物和等位基因特異性阻斷劑的示意圖。

圖2顯示本發(fā)明所述引物和阻斷劑的熱動力學設計的示意圖。

圖3顯示根據(jù)本發(fā)明序列的ΔG°值計算的示意圖。圖3以出現(xiàn)順序分別公開了SEQ ID NO 1,33,1,34,2,33,2,和34。

圖4顯示根據(jù)實施例1所述的人基因組DNA的稀有等位基因檢測的示意圖。圖4以出現(xiàn)順序分別公開了SEQ ID NO 3-4,35,32,36,和32。

圖5顯示根據(jù)實施例2所述的稀有溫度穩(wěn)健性的示意圖。圖5以出現(xiàn)順序分別公開了SEQ ID NO 5-6和37-38。

圖6A顯示根據(jù)實施例3所述的增加的引物設計靈活性的示意圖。

圖6B顯示根據(jù)實施例3所述擴增人SNP rs3789806的4組引物與阻斷劑對的核酸序列的示意圖。圖6B以出現(xiàn)順序分別公開了SEQ ID NO 5-12和39-40。

圖7A顯示根據(jù)實施例4所述具有固定ΔΔG°＝2kcal/mol的ΔG°_rxn1的效果模擬的示意圖。

圖7B(I)顯示根據(jù)實施例4所述的對SMAD7 rs4939827實驗驗證的示意圖。圖7B(I)以出現(xiàn)順序分別公開了SEQ ID NO 3,13-16,4,17,和35-36。

圖7B(II)顯示根據(jù)實施例4所述的對SMAD7 rs4939827實驗驗證的示意圖。圖7B(I)以出現(xiàn)順序分別公開了SEQ ID NO 3,18-23,36,和35。

圖8顯示根據(jù)實施例5的具有3’非同源區(qū)域的阻斷劑的示意圖。圖8以出現(xiàn)順序分別公開了SEQ ID NO 5,24,和37-38。

圖9A顯示根據(jù)實施例6的使用探針的多重化的示意圖。

圖9B顯示根據(jù)實施例6的使用探針的多重化的示意圖。

圖10顯示根據(jù)實施例7的用于引物和阻斷劑的保護劑的示意圖。

圖11A顯示根據(jù)實施例8的缺失(STAG2 rs200841330)檢測的示意圖。圖11A以出現(xiàn)順序分別公開了SEQ ID NO 25-26和41-42。

圖11B顯示根據(jù)實施例8的插入(STAG2 rs200841330)檢測的示意圖。圖11B以出現(xiàn)順序分別公開了SEQ ID NO 25,43,42,和41。

圖12顯示根據(jù)實施例9所述的上游阻斷劑的示意圖。圖12以出現(xiàn)順序分別公開了SEQ ID NO 27-28和44-45。

圖13顯示根據(jù)實施例10的真菌核糖體RNA編碼DNA的特異擴增的示意圖。

圖14顯示根據(jù)實施例11的雙重NASP的示意圖。圖14以出現(xiàn)順序分別公開了SEQ ID NO 29,10,46-49,和30-31。

發(fā)明詳述

將就具體實施方式并參照某些附圖對本發(fā)明進行描述，但本發(fā)明并不受此限制，僅由權利要求書限定。描述的附圖僅是說明性的且是非限制性的。在附圖中，一些元素的尺寸可能被夸大或扭曲且未按比例尺繪畫以用于說明目的。除非特別指明，本發(fā)明的元件在首次出現(xiàn)時用“一”或“一個”表示，在第二次或后續(xù)出現(xiàn)時用“該”或“所述”表示。

在此將參照附圖更完整地描述本發(fā)明，它們顯示了本發(fā)明的一些而非全部的實施方式。實際上，本發(fā)明可以以多種不同的形式實施，不應被看作僅限于本發(fā)明所述的實施方式；而是，提供這些實施方式用以使本公開內(nèi)容滿足所有法律要求。

定義

除非另外定義，本文中所使用的所有技術和科學術語具有本領域普通技術人員通常所理解的同樣含義。

如本文所用，術語“阻斷劑寡核苷酸”指長度為約12至約100核苷酸的至少一種連續(xù)鏈，并且若在本文中如此述及，其還可在其3’端包括功能性基團或核苷酸序列，其在擴增過程(例如聚合酶鏈式反應)期間阻止酶促延伸。

如本文所用，術語“引物寡核苷酸”指含長度為約12至約100核苷酸的至少一種連續(xù)鏈的分子，其足以在擴增過程(例如聚合酶鏈式反應)期間允許酶促延伸。

如本文所用，術語“靶中性子序列”指與靶核酸和變體核酸中的序列互補的核苷酸序列。例如，用于擴增的待靶向的所需核酸序列(靶序列)可存在于含核酸分子的樣品中，該核酸分子除了可變區(qū)域(可變核酸)之外具有含靶序列的主要同源序列，在一些示例中該可變區(qū)域僅為與靶核酸不同的單核苷酸。在本實施例中，靶中性子序列與兩個核酸共有的同源序列的至少一部分互補，但不是所述可變區(qū)域。因此，本文所述術語“阻斷劑可變子序列”指阻斷劑寡核苷酸的核苷酸序列，其與變體核酸的可變區(qū)域互補。

本文所用術語“重疊子序列”指引物寡核苷酸的至少5個核苷酸的核苷酸序列，其與本文所述組合物中所用的阻斷劑寡核苷酸的一部分同源。引物寡核苷酸的重疊子序列可與阻斷劑寡核苷酸的靶中性子序列的任何部分同源，無論是阻斷劑可變子序列的5’還是3’端。因此，術語“非重疊子序列”指不是重疊子序列的引物寡核苷酸序列。

如本文所用，術語“靶序列”指攜帶所需待擴增、鑒定或分離的等位基因(例如單核苷酸多態(tài)性)的核酸的核苷酸序列。如本文所用，術語“變體序列”指不攜帶所需等位基因的核酸的核苷酸序列。例如，在一些情況中，變體序列攜帶野生型等位基因而靶序列攜帶突變等位基因。因此，在一些情況中，變體序列和靶序列來自基因組中的常見基因座，從而各序列可基本同源，除了攜帶所需等位基因的區(qū)域、兩者之間存在差異的核苷酸或組或多個核苷酸。

本發(fā)明涉及一種寡核苷酸組合物。在本發(fā)明一個實施方式中，寡核苷酸組合物包含用于等位基因擴增的等位基因特異性阻斷劑寡核苷酸和非等位基因特異性引物寡核苷酸。

在本發(fā)明另一個實施方式中，寡核苷酸組合物包括阻斷劑寡核苷酸和第一引物寡核苷酸。所述阻斷劑寡核苷酸包含具有靶中性子序列和阻斷劑可變子序列的第一序列。阻斷劑可變子序列在其3’和5’端被所述靶中性子序列側接，并且與該靶中性子序列連續(xù)。換句話說，阻斷劑可變子序列可將靶中性子序列分為兩部分，一部分至阻斷劑可變子序列的3’端，另一部分至5’端。所述第一引物寡核苷酸足以誘導酶促延伸；這里所述第一引物寡核苷酸包含第二序列。所述第二序列與該靶中性子序列重疊至少5個核苷酸；從而所述第二序列包含重疊子序列和非重疊子序列。第二序列不包括阻斷劑可變子序列。因此，引物寡核苷酸可表征為非等位基因特異性引物。重疊區(qū)域可與所述阻斷劑寡核苷酸的靶中性子序列的一部分在所述阻斷劑可變子序列的5’側或所述阻斷劑可變子序列的3’側同源。如圖1所示，引物寡核苷酸重疊子序列與所述阻斷劑的靶中性子序列在阻斷劑可變子序列的5’側(在阻斷劑上示為“C”)同源。本文中，靶中性子序列是所述阻斷劑在阻斷劑可變子序列C的任一側的部分。圖12顯示一個示例，其中引物的重疊子序列與阻斷劑的靶中性子序列的部分同源，其是阻斷劑可變子序列C的3’端。

在本發(fā)明的另一實施方式中，阻斷劑寡核苷酸在3’端或3’端附近還包含功能基團或非互補序列區(qū)，其阻止酶促延伸。在一個示例中，阻斷劑寡核苷酸的功能基團選自但不限于3-碳間隔子或雙脫氧核苷酸。

所述第二序列產(chǎn)生雜交標準自由能(ΔG°_PT)并且所述第一序列產(chǎn)生雜交標準自由能(ΔG°_BT)，滿足下述條件：

+2kcal/mol≥ΔG°_PT-ΔG°_BT≥-8kcal/mol

所述非重疊子序列產(chǎn)生雜交標準自由能(ΔG°₃)，滿足下述條件：

-4kcal/mol≥ΔG°₃≥-12kcal/mol

在一個示例中，第二序列與靶中性子序列的5’端重疊約5個核苷酸至約40個核苷酸。在另一個示例中，第二序列與靶中性子序列的5’端重疊約7個核苷酸至約30個核苷酸。

在一個示例中，所述阻斷劑寡核苷酸的濃度比所述第一引物寡核苷酸的濃度高約2-約10,000倍。在另一個示例中，所述阻斷劑寡核苷酸的濃度比所述第一引物寡核苷酸的濃度高約5-約1,000倍。

在本發(fā)明另一實施方式中，寡核苷酸組合物還包含足以誘導酶促延伸的第二引物寡核苷酸。所述第二引物寡核苷酸包含第三序列，其中所述第三序列不與所述第一序列或第二序列重疊，并且其是靶中性的并且足以伴隨所述第一引物寡核苷酸使用以通過聚合酶鏈式反應來擴增核酸區(qū)域。

在本發(fā)明另一實施方式中，寡核苷酸組合物還包含第二阻斷劑寡核苷酸。所述第二阻斷劑寡核苷酸包括第四序列，其具有第二靶中性子序列和第二阻斷劑可變子序列。第二阻斷劑可變子序列與靶核酸的非等位基因特異性子序列具有相同序列，鑒于其通常涉及用于結合靶標的反義序列。第二阻斷劑可變子序列在其3’和5’端被第二靶中性子序列側接，并且與該第二靶中性子序列連續(xù)。所述第三序列與第二靶中性子序列的5’端重疊至少5個核苷酸；從而所述第三序列包含第二重疊子序列和第二非重疊子序列。

在本發(fā)明的另一實施方式中，第二阻斷劑寡核苷酸在3’端或3’端附近還包含第二功能基團或第二非互補序列區(qū)，其阻止酶促延伸。在一個示例中，第二阻斷劑寡核苷酸的第二功能基團選自但不限于3-碳間隔子或雙脫氧核苷酸。

所述第三序列產(chǎn)生雜交標準自由能(ΔG°_PT2)并且所述第四序列產(chǎn)生雜交標準自由能(ΔG°_BT2)，滿足下述條件：

+2kcal/mol≥ΔG°_PT2-ΔG°_BT2≥-8kcal/mol

所述第二非重疊子序列產(chǎn)生雜交標準自由能(ΔG°₆)，滿足下述條件：

-4kcal/mol≥ΔG°₆≥-12kcal/mol。

在一個示例中，第三序列與第二靶中性子序列的5’端重疊約5個核苷酸至約40個核苷酸。在另一個示例中，第三序列與第二靶中性子序列的5’端重疊約7個核苷酸至約30個核苷酸。

在上述實施方式的任一中，引物寡核苷酸和阻斷劑寡核苷酸的各自長度可為約12核苷酸至約100核苷酸。在上述實施方式的任一中，引物寡核苷酸和阻斷劑寡核苷酸的各自長度可為約15核苷酸至約90核苷酸。在上述實施方式的任一中，引物寡核苷酸和阻斷劑寡核苷酸的各自長度可為約20核苷酸至約80核苷酸。在上述實施方式的任一中，引物寡核苷酸和阻斷劑寡核苷酸的各自長度可為約20核苷酸至約70核苷酸。在上述實施方式的任一中，引物寡核苷酸和阻斷劑寡核苷酸的各自長度可為約20核苷酸至約60核苷酸。在上述實施方式的任一中，引物寡核苷酸和阻斷劑寡核苷酸的各自長度可為21、22、23、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50核苷酸。

在一個示例中，所述第二阻斷劑寡核苷酸的濃度比所述第二引物寡核苷酸的濃度高約2-約10,000倍。在另一個示例中，所述第二阻斷劑寡核苷酸的濃度比所述第二引物寡核苷酸的濃度高約5-約1,000倍。.在另一個示例中，所述第二阻斷劑寡核苷酸的濃度比所述第二引物寡核苷酸的濃度高約10-約900倍。在另一個示例中，所述第二阻斷劑寡核苷酸的濃度比所述第二引物寡核苷酸的濃度高約20-約800倍。.在另一個示例中，所述第二阻斷劑寡核苷酸的濃度比所述第二引物寡核苷酸的濃度高約30-約700倍。在另一個示例中，所述第二阻斷劑寡核苷酸的濃度比所述第二引物寡核苷酸的濃度高約40-約600倍。在另一個示例中，所述第二阻斷劑寡核苷酸的濃度比所述第二引物寡核苷酸的濃度高約50-約500倍。在另一個示例中，所述第二阻斷劑寡核苷酸的濃度比所述第二引物寡核苷酸的濃度高約60-約400倍。在另一個示例中，所述第二阻斷劑寡核苷酸的濃度比所述第二引物寡核苷酸的濃度高約70-約300倍。在另一個示例中，所述第二阻斷劑寡核苷酸的濃度比所述第二引物寡核苷酸的濃度高約80-約200倍。在另一個示例中，所述第二阻斷劑寡核苷酸的濃度比所述第二引物寡核苷酸的濃度高約90-約100倍。

在本發(fā)明的另一實施方式中，寡核苷酸組合物還包含聚合酶鏈式反應所需的試劑。

在本發(fā)明另一實施方式中，寡核苷酸組合物還包含多種核苷三磷酸。

在本發(fā)明另一實施方式中，寡核苷酸組合物還包含DNA聚合酶或RNA聚合酶。

在本發(fā)明另一實施方式中，寡核苷酸組合物還包含聚合酶鏈式反應所需的試劑、多種核苷三磷酸、DNA酶。

在本發(fā)明另一實施方式中，阻斷劑可變子序列是單核苷酸。

本發(fā)明還涉及擴增靶序列的方法。所述方法包括步驟(a)獲取樣品，所述樣品含一或多拷貝的第一核酸和至少一拷貝的第二核酸，所述第一核酸含變體序列；所述第二核酸含所述靶序列。靶序列和變體序列各自具有同源子序列和可變子序列?？勺冏有蛄羞€可包含至少一個核苷酸，但可包含2-5個核苷酸。所述靶序列的可變子序列是靶特異性子序列并且所述變體序列的可變子序列是非靶特異性子序列。

所述方法還包含步驟(b)將阻斷劑寡核苷酸引入樣品，其中所述阻斷劑寡核苷酸包含具有靶中性子序列和阻斷劑可變子序列的第一序列。所述靶中性子序列與所述同源子序列的部分互補并且所述阻斷劑可變子序列與所述非靶特異性子序列互補。此外，阻斷劑可變子序列在其3’和5’端被所述靶中性子序列側接，并且與該靶中性子序列連續(xù)。

所述方法還包含步驟(c)將第一引物寡核苷酸引入樣品。所述第一引物寡核苷酸足以誘導酶促延伸。所述第一引物寡核苷酸包含第二序列。此外，所述第二序列與所述同源子序列的第二部分互補，并且與所述靶中性子序列重疊至少5個核苷酸，從而所述第二序列包含重疊子序列和非重疊子序列。所述第二序列不包含任何與所述可變子序列互補的序列。

所述方法還包含步驟(d)向所述樣品引入DNA聚合酶、三磷酸核苷、和基于聚合酶的核酸擴增所需的一種或多種試劑；和然后(e)在足以實現(xiàn)核酸擴增的條件下使樣品反應。

在本發(fā)明的一個實施方式中，阻斷劑寡核苷酸在3’端或3’端附近還包含功能基團或非互補序列區(qū)，其阻止酶促延伸。在一個示例中，功能基團選自但不限于3-碳間隔子或雙脫氧核苷酸。

所述第二序列產(chǎn)生雜交標準自由能(ΔG°_PT)并且所述第一序列產(chǎn)生雜交標準自由能(ΔG°_BT)，滿足下述條件：

+2kcal/mol≥ΔG°_PT-ΔG°_BT≥-8kcal/mol

所述非重疊子序列產(chǎn)生雜交標準自由能(ΔG°₃)，滿足下述條件：

-4kcal/mol≥ΔG°₃≥-12kcal/mol

在一個示例中，第二序列與阻斷劑的靶中性子序列的5’端重疊約5個核苷酸至約40個核苷酸(即“重疊子序列”)。換句話說，第二序列包含重疊子序列，其與位于阻斷劑的阻斷劑可變子序列的5’側的阻斷劑的靶中性子序列的5個核苷酸至約40個核苷酸同源。在另一個示例中，第二序列與靶中性子序列的5’端重疊約7個核苷酸至約30個核苷酸。在另一示例中，第二序列包含重疊子序列，其與位于阻斷劑的阻斷劑可變子序列的3’側的阻斷劑的靶中性子序列的部分同源。

在一個示例中，所述阻斷劑寡核苷酸的濃度比被引入所述樣品的第一引物寡核苷酸的濃度高約2-約10000倍。在另一個示例中，所述阻斷劑寡核苷酸的濃度比被引入所述樣品的第一引物寡核苷酸的濃度高約5-約1,000倍。在另一個示例中，所述阻斷劑寡核苷酸的濃度比被引入所述樣品的第一引物寡核苷酸的濃度高約10-約500倍。在另一個示例中，所述阻斷劑寡核苷酸的濃度比被引入所述樣品的第一引物寡核苷酸的濃度高約20-約250倍。在另一個示例中，所述阻斷劑寡核苷酸的濃度比被引入所述樣品的第一引物寡核苷酸的濃度高約40-約125倍。在另一個示例中，所述阻斷劑寡核苷酸的濃度比被引入所述樣品的第一引物寡核苷酸的濃度高約50-約100倍。在另一個示例中，所述阻斷劑寡核苷酸的濃度比被引入所述樣品的第一引物寡核苷酸的濃度高約300-約400倍。在另一個示例中，所述阻斷劑寡核苷酸的濃度比被引入所述樣品的第一引物寡核苷酸的濃度高約500-約600倍。

在本發(fā)明的另一實施方式中，DNA聚合酶是熱穩(wěn)定DNA聚合酶。

在本發(fā)明的另一實施方式中，所述方法包括通過將樣品暴露于至少10個循環(huán)而足以實現(xiàn)核酸擴增的條件。各循環(huán)包括至少2個不同溫度暴露，一個溫度暴露至少85℃，一個溫度暴露不高于75℃。

在本發(fā)明的另一實施方式中，所述方法還包含將選自下組的酶引入所述樣品的步驟：切口酶、重組酶、解旋酶、RNA酶、逆轉錄酶或其任何組合。

在本發(fā)明的另一實施方式中，所述方法還包含向所述樣品引入第二引物寡核苷酸的步驟。所述第二引物寡核苷酸包含第三序列。此外，所述第三序列不與所述可變子序列重疊。此外，所述第三序列是靶中性的并且足以與所述第一引物寡核苷酸使用以擴增含所述靶序列的核酸區(qū)域。

在本發(fā)明的另一實施方式中，所述方法還包含向所述樣品引入第二阻斷劑寡核苷酸的步驟。所述第二阻斷劑寡核苷酸包括第四序列，所述第四序列具有第二靶中性子序列和第二阻斷劑可變子序列。此外，所述第二阻斷劑可變子序列是所述阻斷劑可變子序列的互補序列。此外，第二阻斷劑可變子序列在其3’和5’端被第二靶中性子序列側接，并且與該第二靶中性子序列連續(xù)。此外，所述第三序列與第二靶中性子序列的5’端重疊至少5個核苷酸；從而所述第三序列包含第二重疊子序列和第二非重疊子序列。

在本發(fā)明的另一實施方式中，第二阻斷劑寡核苷酸在3’端或3’端附近還包含第二功能基團或第二非互補序列區(qū)，其阻止酶促延伸。在一個示例中，第二功能基團選自但不限于3-碳間隔子或雙脫氧核苷酸。

所述第三序列產(chǎn)生雜交標準自由能(ΔG°_PT2)并且所述第四序列產(chǎn)生雜交標準自由能(ΔG°_BT2)，滿足下述條件：

+2kcal/mol≥ΔG°_PT2-ΔG°_BT2≥-8kcal/mol

所述第二非重疊子序列產(chǎn)生雜交標準自由能(ΔG°₆)，滿足下述條件：

-4kcal/mol≥ΔG°₆≥-12kcal/mol

在一個示例中，第三序列與第二靶中性子序列的5’端重疊約5個核苷酸至約40個核苷酸。在另一個示例中，第三序列與第二靶中性子序列的5’端重疊約7個核苷酸至約30個核苷酸。

在一個示例中，所述第二阻斷劑寡核苷酸的濃度比被引入所述樣品的第二引物寡核苷酸的濃度高約2-約10000倍。在另一個示例中，所述第二阻斷劑寡核苷酸的濃度比被引入所述樣品的第二引物寡核苷酸的濃度高約5-約1,000倍。

在本發(fā)明的另一實施方式中，用于擴增靶序列的方法還包含從樣品移出等分試樣；和重復上述步驟(b)-(e)的步驟。

圖1顯示用于等位基因特異性擴增的非等位基因特異性引物和等位基因特異性阻斷劑的示意圖。核酸試劑混合物包含兩種寡核苷酸酸物質(zhì)，一種引物(引物寡核苷酸)和變體特異性阻斷劑(阻斷劑寡核苷酸)，它們一起作用，以聯(lián)合基于聚合酶的擴增方法來實現(xiàn)可靠的稀有靶標擴增。阻斷劑可在3'端用不可延伸的修飾方式進行修飾，例如雙脫氧核苷酸或3-碳接頭。引物和阻斷劑的序列基于其與靶核酸序列和變體核酸序列的雜交的熱力學進行合理設計。在一些實施方式中，阻斷劑以比引物顯著更高的濃度存在，從而靶標和變體核酸序列的大多數(shù)在結合引物之前結合阻斷劑。引物與阻斷劑-靶標或阻斷劑-變體分子短暫結合，并且具有替代阻斷劑結合靶標或變體的可能性。由于阻斷劑序列對變體靶標特異，其從變體上的取代(displacement)的熱力學有利性低于其從靶標上的取代。因此，非等位基因特異性引物以比擴增變體序列更高的產(chǎn)量/效率擴增靶序列。引物的非等位基因特異性性質(zhì)表示其虛假擴增含變體等位基因而不是靶等位基因的變體序列，從而后續(xù)擴增循環(huán)也表現(xiàn)出對靶標的擴增偏好。

變體特異性阻斷劑的高濃度導致阻斷劑非常可能在引物有機會結合前與靶標和變體先結合。引物通過不與阻斷劑重疊的獨特區(qū)域起始與靶標阻斷劑或變體阻斷劑復合物的結合，并且后續(xù)可能通過無酶的鏈取代過程來換置阻斷劑。

圖2顯示引物和阻斷劑的熱力學設計的示意圖。引物和阻斷劑的序列經(jīng)合理設計以實現(xiàn)所需的反應熱力學。這里，引物、阻斷劑、靶標和變體核酸序列再分為包含連續(xù)核苷酸的區(qū)域，在圖2中用數(shù)字1-8表示。引物與靶標之間的雜交標準自由能(ΔG°_PT)和阻斷劑與靶標之間的雜交標準自由能(ΔG°_BT)滿足：

+2kcal/mol≥ΔG°_PT-ΔG°_BT≥-8kcal/mol

滿足上述不等式的引物和阻斷劑系統(tǒng)在引物結合靶標和引物結合變體之間的每循環(huán)雜交產(chǎn)量上顯著不同，產(chǎn)生靶特異性擴增。

無酶鏈取代過程通過引物結合與阻斷劑結合的相對熱力學指導。阻斷劑與變體的雜交(結合標準自由能ΔG°_BV)比與靶標的雜交更有利(結合標準自由能ΔG°_BT，ΔG°_BT>ΔG°_BV，因為更負的ΔG°表示更強的有利性)。在本發(fā)明的另一實施方式中，引物阻斷劑與變體的雜交(結合標準自由能ΔG°_PV)和與靶標的雜交等同有利(結合標準自由能ΔG°_PT，ΔG°_PV＝ΔG°_PT)。

引物取代阻斷劑結合靶標的反應的標準自由能ΔG°_rxn1＝ΔG°_PT-ΔG°_BT，其比引物取代阻斷劑結合靶標的反應的標準自由能ΔG°_rxn2＝ΔG°_PV-ΔG°_BV更負。為了實現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)良性能，引物和阻斷劑通常應設計為ΔG°_rxn1≤0和ΔG°_rxn2≥0。然而，由于阻斷劑和引物的相對濃度會影響反應的平衡分配和有效熱力學，對ΔG°_rxn1和ΔG°_rxn2的指導并非絕對。

圖3顯示從序列計算ΔG°值的示意圖。計算不同區(qū)域相互作用的ΔG°有不同常規(guī)模式；圖3所示為基于最鄰近模型的示例性能量計算。ΔG°_1-5、ΔG°_4-7和ΔG°_4-8術語進一步包含雜交起始的標準自由能(ΔG°_init)，和鄰接第六區(qū)域的額外堿基堆疊。用其他方法計算的標準自由能ΔG°可得到相同的ΔG°_PT、ΔG°_PV、ΔG°_BT和ΔG°_BV值。雖然不同個體區(qū)域的熱力學(例如ΔG°_3-6)可能不同。所示示例旨在顯示本發(fā)明所用的ΔG°計算方法，并非旨在提示用于試驗的序列；所列序列對于穩(wěn)定結合來說可能太短。本領域技術人員已知根據(jù)引物序列、阻斷劑序列、靶序列、變體序列、操作溫度和操作緩沖液條件計算ΔG°_PT、ΔG°_PV、ΔG°_BT和ΔG°_BV。

圖4顯示本發(fā)明探針和阻斷劑設計和兩個人類儲存樣品NA18537和NA18562的SMAD7基因座周圍的子序列。引物/阻斷劑組的設計經(jīng)設計用于特異擴增SMAD7單核苷酸多態(tài)性(SNP)的A變體。阻斷劑設計為與含SMAD7 SNP的G變體的變體模板完美互補，并且在3’末端用3-碳接頭(C3)功能化，阻止Taq DNA聚合酶的酶促延伸。反向引物結合正向引物的3’端，并且對兩種等位基因均不特異。為了方面解釋用于描述引物和阻斷劑的各種子序列的術語，寡核苷酸可如下描述。阻斷劑寡核苷酸含靶中性子序列，其包含胞嘧啶核苷酸的5’端和3’端的序列，其被描繪為與所述序列的剩余部分的匹配錯位—該示例中的胞嘧啶核苷酸代表所述阻斷劑的阻斷劑可變子序列。引物寡核苷酸的重疊子序列包含與位于阻斷劑可變子序列(胞嘧啶)5’側的阻斷劑序列同源的序列。

圖5顯示引物-阻斷劑對在退火/延伸溫度范圍56℃-66℃時靶向人SNP rs3789806(C/G)C等位基因的性能。

圖6A和6B顯示具有更多設計空間以避免不需要的相互作用的引物設計。

圖7A和7B顯示通過設計ΔG°_rxn1來控制等位基因特異性PCR行為。圖7A中的模擬表明，當設計引物和阻斷劑從而使ΔG°_rxn1更加正時，ΔCq值更大。然而，在更加正的ΔG°_rxn1值處，靶標的擴增也減慢，得到較大的Cq值。模擬假定固定ΔΔG°為2kcal/mol。上半圖顯示ΔG°_rxn1(星)和ΔG°_rxn2(點)的不同值在雜交產(chǎn)量中的預期效果。下半圖顯示針對各引物和阻斷劑對的靶標和變體的模擬擴增曲線。在所有所述情況中，阻斷劑與引物的濃度比為20:1。圖7B(I)和圖7B(II)顯示ΔG°_rxn1在擴增選擇性上效果的實驗結果。通過加長或縮短阻斷劑的3’端來實現(xiàn)不同ΔG°_rxn1值。如預期所示，對靶標和變體來說，更加正的ΔG°_rxn1產(chǎn)生較大的Cq。觀察到最佳中等ΔG°_rxn1產(chǎn)生最大的ΔCq和靶標的相對小的Cq延遲(Cq<28)。與模擬不同，ΔCq不隨著ΔG°_rxn1而單調(diào)增加。引物-二聚體的形成和非特異性擴增產(chǎn)生Cq上限。

PCR過程的動態(tài)模擬表示如下：

Tfn+1＝Tfn+Pn·[Pn/(Pn+Bn)+Y(ΔG°rxn1)·Bn/(Pn+Bn)]·Trn

Trn+1＝Trn+Rn·Tfn

Vfn+1＝Vfn+Pn·[Pn/(Pn+Bn)+Y(ΔG°rxn2)·Bn/(Pn+Bn)]·Vrn

Vrn+1＝Vrn+Rn·Vfn

其中Tfn是在第n循環(huán)時靶標的正向引物的標準化濃度、Trn是在第n循環(huán)時靶標的反向引物的標準化濃度、Vfn是在第n循環(huán)時變體的正向引物的標準化濃度、Vrn是在第n循環(huán)時變體的反向引物的標準化濃度、Pn是在第n循環(huán)時正向引物的標準化濃度、Bn是在第n循環(huán)時阻斷劑的標準化濃度、Rn是在第n循環(huán)時反向引物的標準化濃度、Y(ΔG°)是給定ΔG°反應標準自由能下的取代反應的雜交產(chǎn)量。模擬結果示于圖7A。

圖8顯示在3’端具有非同源序列而不是不可延伸化學功能化的阻斷劑。因為非同源序列不結合靶標或變體的下游區(qū)域，所以非同源區(qū)域能有效阻止酶促延伸。靶標Cq和ΔCq值與實施例1所示的那些相似，表明與功能基團例如3-碳間隔子或雙脫氧核苷酸類似，3’端的非同源序列能有效阻止酶促延伸。此處fP、rP、和B分別代表正向引物、反向引物和阻斷劑(用于正向引物)。

在標準阻斷PCR中，僅正向引物有偏向地擴增靶序列，而反向引物對靶標和變體的擴增大致等同。如果正向引物和反向引物都偏向以僅擴增靶序列，那么擴增特異性還可得到改善(以及突變敏感性的大約平方級的改善)。為了實現(xiàn)雙重靶特異性擴增，正向引物和反向引物設計為以短距離相隔，從而它們與變體特異阻斷劑重疊。在限制中，引物結合區(qū)域由單核苷酸分開，其相同性在靶標和變體之間不同。正向和反向變體特異阻斷劑彼此部分互補，因為它們結合靶標的互補鏈，并且都跨越變異區(qū)域。阻斷劑設計為，盡管其僅部分互補，但在操作條件下大多數(shù)阻斷劑分子彼此不雜交。

圖9A和9B各顯示設計用于人BRAF rs3789806和IL23R rs1884444 SNP的引物-阻斷劑系統(tǒng)在相同反應中多重化。靶向阻斷劑結合區(qū)域的相應下游的引物經(jīng)設計且用作讀取機制。

圖10顯示引物或阻斷劑與其他引物、阻斷劑或模板的非特異性結合產(chǎn)生非特異性擴增。下圖提供抑制引物和阻斷劑的非特異性結合的保護劑設計。保護劑寡核苷酸與引物和阻斷劑序列部分互補。存在化學計量過量的保護劑使得引物和阻斷劑均位部分雙鏈。阻斷劑具有新區(qū)域11，其序列與核酸序列上的區(qū)域5不互補，并且保護劑具有新區(qū)域10，其序列與區(qū)域11互補。

圖11A和11B各顯示用于檢測缺失和插入的引物和阻斷劑設計。引物為非靶向特異的，該方法還可用于檢測堿基數(shù)量不確定或位置不確定的缺失或插入。

圖12顯示本發(fā)明的較次實施方式，將引物置于SNP位置的3’端并將阻斷劑置于引物的5’端。該實施方式僅在第一循環(huán)產(chǎn)生雜交特異性，從而ΔCq比優(yōu)選設計更小。

圖13證實在同源人DNA大幅過量時，3種病原體真菌物種的真菌18S DNA子序列的選擇性擴增。由于真菌18S子序列及其同源人子序列在多個區(qū)域不同，針對正向引物和反向引物設計相應的阻斷劑物以使擴增特異性最大化。

圖14描述就正向引物和反向引物的靶特異性擴增的應用，使用兩組變體等位基因阻斷劑，各引物使用一種。阻斷劑彼此部分互補，但在操作條件下并不會彼此發(fā)生優(yōu)勢雜交。阻斷劑和引物經(jīng)設計使得正向引物不能延伸反向阻斷劑，并且反向引物不能延伸正向阻斷劑。圖14顯示初步實驗結果。

引物和阻斷劑組合可應用至核酸的其他酶促擴增試驗，包括但不限于切口酶擴增反應(NEAR)、環(huán)介導等溫擴增(LAMP)和滾環(huán)擴增(RCA)。

本發(fā)明尤其適用于檢測大幅過量變體中的小量靶標。對于本發(fā)明的癌癥診斷檢測，變體可指野生型DNA序列，并且靶標可指癌癥DNA序列。對于本發(fā)明的感染性疾病診斷檢測，變體可指病原體DNA序列，并且靶標可指同源人DNA序列。

實施例

實施例1

圖4顯示本發(fā)明實施例1的探針和阻斷劑設計和兩個人類儲存樣品NA18537和NA18562的SMAD7基因座周圍的子序列。選擇SMAD7基因座中健康人單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs4939827(C/T)用于概念驗證。T等位基因作為靶標和C等位基因變體經(jīng)任意指定。人儲庫基因組DNA樣品NA18562(C等位基因的純合子)和NA18537(T等位基因的純合子)購自相應的核苷酸序列從1000基因組網(wǎng)站獲取。為了防止不需要的聚合，阻斷劑在3’端用C3間隔子修飾。qPCR試驗結果區(qū)分0.1％靶標(99.9％變體)與0％靶標(100％變體)。通過混合0.1％NA18537和99.9％NA185620.1％來制備0.1％靶標樣品。100％變體和100％靶標之間的定量循環(huán)的平均差異(ΔCq)為14.8，100％變體(圖中稱為WT)和0.1％靶標之間的定量循環(huán)的平均差異為4.2。所有試驗在Bio-Rad CFX96^TM qPCR儀器中的96孔板中進行。各孔中，在Bio-rad iTaq^TMGreen Supermix中混合200nM引物、2μM阻斷劑和20ng人基因組DNA。在3分鐘的95℃初始處理后，進行65循環(huán)的95℃10秒變性步驟和60℃30秒的退火/延伸步驟。圖5-12中所示的示例性實驗使用相似方案。

表-1

表1顯示人基因組DNA樣品NA18562和NA18537中四組SNP對的等位基因特異性擴增結果的示例，繪自1000基因組數(shù)據(jù)庫。對于各SNP對，設計和測試各等位基因變體的引物和阻斷劑設計物?！白钄鄤睓陲@示的堿基鑒定表示被抑制的等位基因(變體)，并且“-”表示沒有加入阻斷劑。在所有情況中觀察到兩種等位基因之間的大ΔCq值，從7.1-14.6。所有實驗一式三份進行，在Bio-rad iTaq^TMGreen Supermix中使用400nM的各種引物和4μM的阻斷劑。結果顯示熱力學驅動設計的性能而沒有對引物和阻斷劑序列或實驗條件進行任何經(jīng)驗性優(yōu)化。

實施例2

圖5顯示本發(fā)明實施例2所示的引物-阻斷劑對在退火/延伸溫度范圍56℃-66℃時靶向人SNP rs3789806(C/G)C等位基因的性能。實施例2顯示從56℃-64℃有良好的等位基因特異性擴增，并且表明至少8℃的溫度穩(wěn)健性。使用400nM的各種引物和4μM阻斷劑，并且除了退火/延伸溫度之外的其他實驗條件與實施例1所述相同。

實施例3

圖6A和6B顯示本發(fā)明的實施例3。本發(fā)明所示的引物的設計提供更多的設計空間以避免不需要的相互作用。4組引物和阻斷劑對的核酸序列各特異性擴增人SNP rs3789806C等位基因，它們顯示ΔCq>11。使用400nM的各種引物和4μM阻斷劑，并且其他實驗條件與實施例1所述相同。

實施例4

圖7A、7B(I)和7B(II)顯示本發(fā)明實施例4所示的通過ΔG°_rxn1的設計來控制等位基因特異性PCR表現(xiàn)。圖7A中的模擬表明，當引物和阻斷劑設計為ΔG°_rxn1更加正時，ΔCq值更大。然而，在更加正的ΔG°_rxn1值處，靶標的擴增減慢并得到較大的Cq值。將模擬假定為固定ΔΔG°2kcal/mol。上半圖預測ΔG°_rxn1(星)和ΔG°_rxn2(點)的不同值在雜交產(chǎn)量中的效果。下半圖預測針對各引物和阻斷劑對的靶標和變體的模擬擴增曲線。在所有所述案例中，阻斷劑與引物的濃度比為20:1。圖7B(I)和圖7B(II)顯示ΔG°_rxn1在擴增選擇性上效果的實驗結果。通過加長或縮短阻斷劑的3’端來實現(xiàn)不同ΔG°_rxn1值。如預期所示，對靶標和變異來說，更加正的ΔG°_rxn1產(chǎn)生較大的Cq。最佳中等ΔG°_rxn1產(chǎn)生最大的ΔCq和靶標的相對小的Cq延遲(Cq<28)。與模擬不同，ΔCq不隨著ΔG°_rxn1而單調(diào)增加，這是由于Cq上限導致引物-二聚體的形成和非特異性擴增。使用200nM的各種引物和2μM阻斷劑，并且其他實驗條件與實施例1所述相同。

實施例5

圖8顯示本發(fā)明實施例5所示的在3’端具有非同源性序列而不是非可延伸化學功能化的阻斷劑。因為非同源序列不結合靶標或變體的下游區(qū)域，所以非同源區(qū)域能有效阻止酶促延伸。使用400nM的各種引物和4μM阻斷劑，并且其他實驗條件與實施例1所述相同。靶標Cq和ΔCq值與實施例1所示的那些相似，表明與功能基團例如3-碳間隔子或雙脫氧核苷酸類似，3’端的非同源序列能有效阻止酶促延伸。在圖8中，fP、rP、和B分別代表正向引物、反向引物和阻斷劑(用于正向引物)。

實施例6

圖9A和9B顯示本發(fā)明的實施例6.為了我們非等位基因特異性引物和等位基因特異性阻斷劑的實時PCR實施方式，還需要非等位基因特異性的反向引物。Green Supermix和用于該實驗，二者的結果之間沒有顯著差異。設計用于人BRAF rs3789806和IL23R rs1884444 SNP的引物-阻斷劑系統(tǒng)在相同反應中經(jīng)多重化。靶向阻斷劑結合區(qū)域的相應下游的引物經(jīng)設計并且用作讀取機制。BRAF rs3789806擴增子的探針用FAM熒光團、Iowa Black FQ淬滅劑、和內(nèi)部ZEN淬滅劑修飾，并且IL23R rs1884444擴增子的探針用Cy5熒光團和Iowa Black RQ淬滅劑修飾。圖9A顯示BRAF rs3789806G等位基因和IL23R rs1884444 T等位基因的多重檢測的擴增結果。堿基鑒定表示阻斷劑抑制何種等位基因(變體)。圖9B顯示對BRAF rs3789806 C等位基因和IL23R rs1884444 G等位基因的多重檢測。在各實驗中，基因組DNA樣品與400nM各種引物、4μM各種阻斷劑和200nM各種探針在Bio-rad iQ Supermix中混合。qPCR方案與實施例所示相同。

實施例7

圖10顯示本發(fā)明實施例7所示的引物或阻斷劑與其他引物、阻斷劑或模板的非特異性結合。實施例7導致非特異性擴增。下圖提供抑制引物和阻斷劑的非特異性結合的保護劑設計。阻斷劑具有新區(qū)域11，其序列與核酸序列上的區(qū)域5不互補，并且保護劑具有新區(qū)域10，其序列與區(qū)域11互補。

實施例8

圖11A和11B顯示本發(fā)明實施例8所示的用于檢測缺失和插入的引物和阻斷劑設計。Del rs200841330用于顯示概念驗證結果。使用400nM的各種引物和4μM阻斷劑，并且其他實驗條件與實施例1所述相同。由于引物為非等位基因特異的，該方法還可用于檢測堿基數(shù)量不確定或位置不確定的缺失或插入。

實施例9

圖12顯示本發(fā)明的實施例9所示的將引物置于SNP位置的3’端并將阻斷劑置于引物的5’端。實施例9僅在第一循環(huán)產(chǎn)生雜交特異性，從而ΔCq比優(yōu)選設計更小。引物濃度為400nM，阻斷劑濃度為4μM。實驗條件與實施例1所示相同。

實施例10

圖13顯示本發(fā)明實施例10所示的在同源人DNA大幅過量時，3種病原體真菌物種的真菌18S DNA子序列的選擇性擴增。由于真菌18S子序列及其同源人子序列在多個區(qū)域不同，針對正向引物和反向引物設計相應的阻斷劑物以使擴增特異性最大化。3種真菌物種的18S子序列的gBlock片段(經(jīng)驗證的400bp雙鏈DNA序列，IDT)和人中的一致序列用于該實驗。各真菌DNA gBlock片段的60,000拷貝(0.1％)、60拷貝(0.0001％)和0拷貝(100％人)與60,000,000拷貝的人DNA分別混合。在所有情況中，結果檢測稀有序列低至1百萬中的1份。使用200nM的各種引物和1μM的各種阻斷劑，并且其他實驗條件與實施例1所述相同。

實施例11

圖14顯示本發(fā)明的實施例11。圖14描述就正向引物和反向引物的等位基因特異性擴增的應用；使用兩組變體等位基因阻斷劑，各引物使用一種。阻斷劑彼此部分互補，但在操作條件下并不支持彼此發(fā)生優(yōu)勢雜交。阻斷劑和引物經(jīng)設計使得正向引物不能延伸反向阻斷劑，并且反向引物不能延伸正向阻斷劑。圖14顯示初步實驗結果。

以上本發(fā)明的具體實施方式的描述是為了闡述和說明的目的。對這些示例性實施方式進行選擇和描述，以更好地解釋本發(fā)明的原理及其實施，使得本領域其它技術人員能夠更好地利用本發(fā)明和各種實施方式和各種改良，使其適用于預期的特定用途。