用于擴(kuò)增細(xì)胞群的方法、試劑盒及裝置與流程

本發(fā)明要求于2014年4月16日向美國(guó)專利商標(biāo)局提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/980,506“用于擴(kuò)增細(xì)胞群的方法、試劑盒及裝置(Methods,Kits And Apparatus For Expanding A Population Of Cells)”的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，其內(nèi)容特此出于所有目的通過(guò)引用整體并入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞群諸如淋巴細(xì)胞群的擴(kuò)增(增殖)。本發(fā)明大體上提供了一種用于細(xì)胞群擴(kuò)增(增殖)的新方法及試劑，其需要受體結(jié)合分子(諸如文本所述的第一試劑)與細(xì)胞表面的受體分子結(jié)合，從而向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)。本發(fā)明采用一種多聚化劑，其具有固定(結(jié)合)結(jié)合于其上的、向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑。這種初級(jí)激活信號(hào)可足以激活細(xì)胞以擴(kuò)增/增殖。此種第一試劑能可逆或不可逆地與多聚化劑結(jié)合。該多聚化劑還可以具有固定(結(jié)合)于其上的、刺激細(xì)胞表面輔助分子的第二試劑。該第二試劑當(dāng)與細(xì)胞表面的輔助分子結(jié)合時(shí)，可由此刺激已激活的細(xì)胞擴(kuò)增。此外，第二試劑能可逆或不可逆地與多聚化劑結(jié)合。多聚化劑可以被固定在固體載體上或是可溶的。一方面，本文所公開的方法是細(xì)胞群的連續(xù)擴(kuò)增，其中一個(gè)完整的淋巴細(xì)胞群被刺激/擴(kuò)增，然后在適合的固定相中通過(guò)層析除去擴(kuò)增所必需的試劑，被擴(kuò)增/刺激的細(xì)胞任選地用如T細(xì)胞受體或嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并用與所引入的T細(xì)胞受體或嵌合抗原受體結(jié)合的不同刺激分子進(jìn)行二次刺激擴(kuò)增。本發(fā)明還涉及一種用于選定細(xì)胞群擴(kuò)增的裝置。

背景技術(shù)：

體外增殖T細(xì)胞群技術(shù)的發(fā)展對(duì)T細(xì)胞識(shí)別抗原和T細(xì)胞激活理解方面的許多進(jìn)展是至關(guān)重要的。用于人抗原特異性T細(xì)胞克隆繁殖的培養(yǎng)方法的開發(fā)已經(jīng)用于界定被T細(xì)胞識(shí)別的由病原體和腫瘤表達(dá)的抗原，從而建立免疫療法以治療多種人類疾病?？乖禺愋訲細(xì)胞可在體外擴(kuò)增用于過(guò)繼性細(xì)胞免疫療法或癌癥療法，其中輸注這樣的T細(xì)胞已在荷瘤宿主中顯示出抗腫瘤活性。此外，過(guò)繼性免疫療法也被用于治療免疫妥協(xié)個(gè)體的病毒感染。

近幾年已建立的在缺乏外源性生長(zhǎng)因子和佐細(xì)胞的情況下體外擴(kuò)增人T細(xì)胞的方法在美國(guó)專利US 6,352,694 B1和歐洲專利EP 0 700 430 B1中有所描述。這些專利中公開了一種用于誘導(dǎo)T細(xì)胞群增殖的體外方法。該方法包括使T細(xì)胞群與固體表面接觸，所述固體表面具有直接固定于其上的：(a)第一試劑，其向T細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)，從而激活T細(xì)胞；和(b)第二試劑，其刺激T細(xì)胞表面的輔助分子，從而刺激已激活的T細(xì)胞。第一試劑和第二試劑與T細(xì)胞的結(jié)合誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖/擴(kuò)增。在美國(guó)專利US 6,352,694 B1和歐洲專利EP 0 700 430 B1中所述的優(yōu)選第一試劑是單克隆抗CD3抗體，其在T細(xì)胞中與TCR/CD3(TCR＝T細(xì)胞受體(T cell receptor))復(fù)合物結(jié)合，從而刺激TCR/CD3復(fù)合物相關(guān)的信號(hào)。根據(jù)這兩篇專利所述的優(yōu)選第二試劑是與T細(xì)胞呈遞的輔助分子CD28結(jié)合的單克隆抗CD28抗體。該第二試劑與CD28輔助分子的結(jié)合提供了對(duì)激活的T細(xì)胞擴(kuò)增/增殖所必需的必要共刺激。同時(shí)，市售的CD3/CD28(Invitrogen)可用于T細(xì)胞擴(kuò)增。CD3/CD28CTS^TM是均質(zhì)的、4.5μm超順磁性無(wú)菌無(wú)熱原的、涂覆有抗人T細(xì)胞的CD3和CD28細(xì)胞表面分子的經(jīng)親和純化的單克隆抗體混合物的聚苯乙烯珠。

然而，這種磁珠，例如，在臨床試驗(yàn)或治療目的所要求的條件下，難以整合到擴(kuò)增細(xì)胞的方法中，因?yàn)楸仨毐ＷC這些磁珠在向患者施用擴(kuò)增的T細(xì)胞于之前被完全去除。因此，本發(fā)明的目的在于為研究、診斷特別是治療的目的提供一種用于擴(kuò)增細(xì)胞群諸如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞或中樞記憶T細(xì)胞的替代方法。理想地，這種新方法也應(yīng)當(dāng)適于整合到可用于快速簡(jiǎn)便擴(kuò)增為治療應(yīng)用所需的細(xì)胞群的自動(dòng)化過(guò)程中。

這一目的是通過(guò)獨(dú)立權(quán)利要求的主題，尤其是獨(dú)立權(quán)利要求中所述的方法、試劑盒、排布和裝置實(shí)現(xiàn)的。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了用于體外擴(kuò)增所需細(xì)胞群的方法、試劑盒、排布和裝置，所述細(xì)胞表面具有受體分子，其一旦與合適的試劑結(jié)合便會(huì)向細(xì)胞群提供初級(jí)激活信號(hào)，并從而激活細(xì)胞群擴(kuò)增(增殖)。因此，本發(fā)明的方法也可用于誘導(dǎo)細(xì)胞群增殖。

第一方面，本發(fā)明提供了一種擴(kuò)增細(xì)胞群的體外方法，其包括使包含細(xì)胞群的樣品與多聚化劑接觸，

其中所述多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑；

其中所述多聚化劑包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1用于第一試劑的可逆結(jié)合，

其中所述第一試劑包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠可逆地與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1結(jié)合，其中所述第一試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點(diǎn)Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，以及

其中所述第一試劑與細(xì)胞表面的受體分子結(jié)合，由此向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)從而激活細(xì)胞。

第二方面，本發(fā)明提供了一種擴(kuò)增細(xì)胞群的體外方法，其包括使包含細(xì)胞群的樣品與多聚化劑接觸，

其中所述多聚化劑是可溶形式的，并且具有固定(結(jié)合)于其上的、向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑；

其中所述多聚化劑包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1用于第一試劑的結(jié)合，

其中所述第一試劑包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1結(jié)合，其中所述第一試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點(diǎn)Z1之間形成的鍵與多聚化劑相結(jié)合，以及

其中所述第一試劑與細(xì)胞表面的受體分子結(jié)合，由此向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)從而激活細(xì)胞。

第三方面，本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增細(xì)胞群的試劑盒，所述試劑盒包括：

(i)多聚化劑，

其中，所述多聚化劑包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z用于第一試劑的可逆結(jié)合，

(ii)第一試劑，其與細(xì)胞表面受體分子結(jié)合，由此向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)從而激活細(xì)胞，

其中所述第一試劑包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠可逆地與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1結(jié)合，其中所述第一試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點(diǎn)Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，以及

(iii)第二試劑，其刺激細(xì)胞表面的輔助分子，

其中所述第二試劑包含結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠可逆地與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z2結(jié)合，其中所述第二試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點(diǎn)Z2之間形成的鍵與多聚化劑相結(jié)合，

其中所述第二試劑與細(xì)胞表面的輔助分子結(jié)合，從而刺激已激活的細(xì)胞。

第四方面，本發(fā)明提供了一種用于擴(kuò)增細(xì)胞群的試劑盒，所述試劑盒包括：

(i)多聚化劑，

其中所述多聚化劑是可溶形式的，并且包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z用于第一試劑的可逆結(jié)合,

(ii)第一試劑，其與細(xì)胞表面的受體分子結(jié)合，由此向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)從而激活細(xì)胞，

其中所述第一試劑包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1結(jié)合，其中所述第一試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點(diǎn)Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合。

第五方面，本發(fā)明提供了一種連續(xù)擴(kuò)增淋巴細(xì)胞群的體外方法，其中所述淋巴細(xì)胞群包含T細(xì)胞，所述方法包括：

使含有包含T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞群樣品與多聚化劑接觸，

其中所述多聚化劑是可溶形式，并且具有可逆固定于其上的(i)向T細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑和(ii)刺激T細(xì)胞表面輔助分子的第二試劑，

其中所述多聚化劑包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1用于第一試劑的可逆結(jié)合,

其中所述第一試劑包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠可逆地與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1結(jié)合，其中所述第一試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點(diǎn)Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，

其中所述多聚化劑包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z2用于第二試劑的可逆結(jié)合,

其中所述第二試劑包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠可逆地與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z2結(jié)合，其中所述第二試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點(diǎn)Z2之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，

其中所述第一試劑與T細(xì)胞表面的受體分子結(jié)合，由此向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)從而激活T細(xì)胞，

其中所述第二試劑與T細(xì)胞表面的輔助分子結(jié)合，由此刺激已激活的細(xì)胞，從而所述第一試劑和所述第二試劑一同誘導(dǎo)T細(xì)胞擴(kuò)增。

第六方面，本發(fā)明提供了一種包含生物反應(yīng)器和層析固定相的排布，

其中所述生物反應(yīng)器適于細(xì)胞的擴(kuò)增，

其中所述固定相適于細(xì)胞分離和試劑去除，所述固定相為凝膠過(guò)濾基質(zhì)和/或親和層析基質(zhì)，其中所述凝膠過(guò)濾和/或親和層析基質(zhì)包括親和試劑，其中所述親和試劑包含與第一試劑中所含結(jié)合配偶體C1特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)Z1，和/或所述親和試劑包含與第二試劑中所含結(jié)合配偶體C2特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)Z2，由此適于將第一試劑和/或第二試劑、第一結(jié)合配偶體C1和/或游離的第二結(jié)合配偶體C2固定于固定相上，

其中，所述生物反應(yīng)器和所述固定相是流體連接的。

第七方面，本發(fā)明提供了一種用于純化和擴(kuò)增細(xì)胞群的裝置，所述裝置包含至少一個(gè)根據(jù)第六方面所述的包含生物反應(yīng)器和層析固定相的排布。

第八方面，本發(fā)明提供了一種能夠擴(kuò)增細(xì)胞群的多聚化劑，

其中所述多聚化劑是可溶形式的，并且包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1用于向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑的可逆結(jié)合，

其中所述多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)所述第一試劑，

其中所述第一試劑包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠可逆地與多聚化劑的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1結(jié)合，

其中所述第一試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點(diǎn)Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合。

第九方面，本發(fā)明提供了一種能夠擴(kuò)增細(xì)胞群的組合物，所述組合物包含：

(i)第一多聚化劑，

其中所述第一多聚化劑是可溶形式的，并且包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1用于向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑的可逆結(jié)合，

其中所述第一多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)所述第一試劑；

其中所述第一試劑包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠可逆地與多聚化劑的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1結(jié)合，其中所述第一試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點(diǎn)Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，以及

(ii)第二多聚化劑，

其中所述第二多聚化劑是可溶形式的，并且包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z2用于對(duì)細(xì)胞表面輔助分子進(jìn)行刺激的第二試劑的可逆結(jié)合，

其中所述多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、刺激細(xì)胞表面輔助分子的所述第二試劑，

其中所述第二試劑包含結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠與多聚化劑的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z2結(jié)合，其中所述第二試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點(diǎn)Z2之間形成的鍵與多聚化劑相結(jié)合。

附圖說(shuō)明

參考以下詳細(xì)描述并結(jié)合考慮非限制性實(shí)施例和附圖，將能更好得理解本發(fā)明。附圖示出了本發(fā)明方法的具體實(shí)施方式。不希望受到理論的束縛，附圖包括了關(guān)于下述擴(kuò)增機(jī)制的結(jié)論。所給出的結(jié)論僅用于說(shuō)明的目的，并僅僅用于使擴(kuò)增方法在分子水平上可實(shí)現(xiàn)可視化。

圖1示出了一種擴(kuò)增細(xì)胞群的體外方法的實(shí)施方式，所述細(xì)胞群具有細(xì)胞表面受體，其與第一試劑的結(jié)合可提供細(xì)胞擴(kuò)增的激活信號(hào)。

如圖1a所示，包含攜帶表面受體分子(30)的細(xì)胞群(2)的樣品與多聚化劑(4)接觸。細(xì)胞群(2)是與其它缺乏表面受體分子(30)的細(xì)胞群(22)混合在一起的。多聚化劑(4)具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑(6)。多聚化劑(4)包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1(42)用于第一試劑(6)的可逆結(jié)合，而第一試劑(6)包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C1(6a)，其中，結(jié)合配偶體C1(6a)能夠可逆地與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1(44)結(jié)合。因此，為了固定，第一試劑(6)通過(guò)結(jié)合配偶體C1(6a)和結(jié)合位點(diǎn)Z1(42)之間形成的可逆鍵與多聚化劑(4)相結(jié)合。在圖1所示的實(shí)施例中，多聚化劑(4)具有該實(shí)施例中未使用的第二結(jié)合位點(diǎn)Z2(44)。多聚化劑(4)本身被固定在固體載體(10)上，例如磁珠、聚合珠、細(xì)胞培養(yǎng)板或反應(yīng)器的表面。細(xì)胞群(2)例如諸如B細(xì)胞群的淋巴細(xì)胞群可以通過(guò)CD40受體而被激活(參見例如Carpenter等人，Journal of Translational Medicine 2009,7:93“Activation of human B cells by the agonist CD40antibody CP-870,893and augmentation with simultaneous toll-like receptor 9stimulation)。在這個(gè)示例中，細(xì)胞表面分子(30)是CD40，第一試劑(6)可以是任何提供所需激活信號(hào)的CD40結(jié)合分子，例如，單克隆抗體CP-870,893或其抗體結(jié)合片段，諸如單價(jià)Fab片段。第一試劑(6)的結(jié)合配偶體C1可以是例如與例如抗體分子兩條多肽鏈(重鏈或輕鏈)其中一條的C端融合或綴合的任何親和肽。結(jié)合配偶體C1(6a)可以是例如，諸如肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:01)的鏈霉親和素結(jié)合肽，也稱為美國(guó)專利US 5,506,121中所描述的“Strep標(biāo)記”(Strep-)，或者例如，具有包含兩個(gè)或多個(gè)單獨(dú)結(jié)合模塊的連續(xù)排布的鏈霉親和素結(jié)合肽，如國(guó)際專利公開WO 02/077018或美國(guó)專利US 7,981,632中所描述的。當(dāng)使用鏈霉親和素結(jié)合肽作為結(jié)合配偶體C1時(shí)，多聚化劑(4)是與鏈霉親和素肽(＝第一結(jié)合配偶體C1(6a))經(jīng)由其(生物素)如圖示于圖1的結(jié)合位點(diǎn)Z1(42)可逆結(jié)合的任意鏈霉親和素突變蛋白。這種多聚化劑可以是在野生型鏈霉親和素序列位點(diǎn)第44至47位上包含氨基酸序列Va1⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:02)的鏈霉親和素突變蛋白(類似物)，或者是在野生型鏈霉親和素序列位點(diǎn)第44至47位上包含氨基酸序列l(wèi)le⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:03)的鏈霉親和素突變蛋白(類似物)，這兩者均在例如美國(guó)專利US 6,103,493中有所描述，并且可以商標(biāo)Strep-購(gòu)得。在圖1的實(shí)施例中，多聚化劑(4)可以進(jìn)一步包括多聚鈣調(diào)蛋白或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，兩者均與鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽或谷胱甘肽形成可逆鍵。因此，結(jié)合位點(diǎn)Z2(44)可由鈣調(diào)蛋白或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶構(gòu)成。這種例如鈣調(diào)蛋白與鏈霉親和素突變蛋白形成的蛋白綴合物可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)化學(xué)制備，例如，通過(guò)使用雙功能接頭。

如圖1b中所示，在使細(xì)胞群(2)與多聚化劑(4)接觸并通常是用多聚化劑(4)孵育細(xì)胞群后，細(xì)胞群(2)經(jīng)由第一試劑(6)與多聚化劑形成復(fù)合物/相結(jié)合。第一試劑與細(xì)胞表面受體分子諸如該實(shí)施例中的CD40特異性結(jié)合，并提供例如B細(xì)胞擴(kuò)增的細(xì)胞擴(kuò)增激活信號(hào)。包含在初始樣品中的、缺乏特異性細(xì)胞表面分子(30)的其它細(xì)胞群(22)無(wú)法與多聚化劑結(jié)合。在這方面，應(yīng)當(dāng)注意的是，細(xì)胞群(2)通常在其表面具有多個(gè)拷貝的細(xì)胞表面分子(30)，并且這些多個(gè)重拷貝的結(jié)合通常是激活所需要的。因此，多聚化劑(4)通常提供不止一個(gè)的結(jié)合位點(diǎn)Z1，這樣使得多個(gè)第一試劑(6)可以可逆地結(jié)合以實(shí)現(xiàn)第一試劑的“多聚化”，即意味著將足夠密度的第一試劑呈現(xiàn)給細(xì)胞群(2)(未在圖1的圖式中示出)。在這方面，應(yīng)當(dāng)注意的是，本文使用的多聚化試劑本身可具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1，例如，鏈霉親和素突變蛋白(為同源四聚體)其天然態(tài)具有四個(gè)這樣的結(jié)合位點(diǎn)Z1。然而也有可能是，多聚化劑是基于一種本身僅有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1用于結(jié)合配偶體C1可逆結(jié)合的化合物。這樣的實(shí)例是多聚鈣調(diào)蛋白。鈣調(diào)蛋白本身僅具有一個(gè)鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽的結(jié)合位點(diǎn)。然而，鈣調(diào)蛋白可以被生物素化，然后與鏈霉親和素寡聚物發(fā)生反應(yīng)(也參見下文)，從而提供其中多個(gè)鈣調(diào)蛋白分子在“支架(scaffold)”上以高濃度呈現(xiàn)的多聚化劑，由此提供多聚鈣調(diào)蛋白。

如圖1c所示，孵育(通常進(jìn)行一段適宜的時(shí)間以實(shí)現(xiàn)所需細(xì)胞群的擴(kuò)增)后，第一試劑(6)的結(jié)合配偶體C1(6a)和多聚化劑(4)的結(jié)合位點(diǎn)Z1之間的結(jié)合通過(guò)破壞各自的可逆鍵而被破壞?？梢酝ㄟ^(guò)向含有與多聚化劑結(jié)合的細(xì)胞群(2)的孵育/反應(yīng)混合物中加入競(jìng)爭(zhēng)物來(lái)實(shí)現(xiàn)這種破壞。為了競(jìng)爭(zhēng)性破壞(可以理解為競(jìng)爭(zhēng)性洗脫)第一試劑的結(jié)合配偶體C1(6a)和多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1(22)之間的可逆鍵，孵育混合物/細(xì)胞群可以與游離的第一結(jié)合配偶體C1(20)或所述第一結(jié)合配偶體C的類似物接觸，所述第一結(jié)合配偶體C的類似物能夠破壞第一結(jié)合配偶體C1(6a)和結(jié)合位點(diǎn)Z1(22)之間的鍵。在結(jié)合配偶體C1為與鏈霉親和素的生物素結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合的鏈霉親和素結(jié)合肽的實(shí)施例中，第一游離配偶體C1(20)可以是相應(yīng)的游離鏈霉親和素結(jié)合肽或者是競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的類似物。這樣的類似物可以是例如生物素或諸如脫硫生物素的生物素衍生物。

如圖1d所示，第一游離配偶體(20)或其類似物的加入導(dǎo)致結(jié)合配偶體C1(6a)從多聚化劑(4)上被置換下來(lái)，由于結(jié)合配偶體C1被包含在第一試劑(6)中，從而導(dǎo)致第一試劑(6)從多聚化劑(4)上被置換下來(lái)。第一試劑(6)的這種置換轉(zhuǎn)而導(dǎo)致第一試劑(6)從細(xì)胞表面受體(30)上解離，特別是，如果第一試劑和細(xì)胞表面受體(30)之間的鍵的結(jié)合親和力解離常數(shù)(K_d)在10^-2M至10^-13M的范圍內(nèi)并因此也是可逆的。由于這種解離，細(xì)胞群(2)的刺激也被終止。因此，本發(fā)明提供了這樣的優(yōu)勢(shì)：細(xì)胞群的刺激或擴(kuò)增的時(shí)間段可被精確控制，因此細(xì)胞群的功能狀態(tài)也可被嚴(yán)密控制。關(guān)于這點(diǎn)，應(yīng)當(dāng)注意的是，抗體分子對(duì)其抗原(包括例如細(xì)胞表面受體分子，諸如該實(shí)施例中的CD40)的結(jié)合親和力通常處于K_d為10^-7M至10^-13M的親和力值范圍內(nèi)。因此，常規(guī)的單克隆抗體可用作本發(fā)明中的第一試劑(當(dāng)然也可用作如下文所述的第二試劑)。為了避免導(dǎo)致更強(qiáng)結(jié)合的任何不期望的親和作用，單克隆抗體也可以以其單價(jià)抗體片段例如Fab片段或單鏈Fv片段的形式使用。

此外，由于第一試劑從細(xì)胞表面分子(30)解離，本發(fā)明還具有附加的優(yōu)勢(shì)：被刺激的細(xì)胞群在刺激期結(jié)束時(shí)不含刺激試劑和本方法中使用的所有其它試劑，也就是說(shuō)第一試劑(6)以及結(jié)合配偶體C1或其類似物的游離第一配偶體(20)可通過(guò)國(guó)際專利申請(qǐng)WO 2013/124474中所述的“去除筒(removal cartridge)”從被刺激的細(xì)胞群(2)上被輕易去除，而被固定于固體載體諸如生物反應(yīng)器表面或磁珠上的多聚化劑(4)被保留。因此，回到游離試劑(6)和游離第一配偶體(20)的去除，依照WO 2013/124474中對(duì)“去除筒”的描述(參見例如其中的圖4)，本文圖1d中獲得的洗脫樣品可上樣到WO 2013/124474中所述的第二層析柱上。該層析柱具有合適的固定相，其既是親和層析基質(zhì)，同時(shí)也能作為凝膠滲透基質(zhì)。該親和層析基質(zhì)具有固定于其上的親和試劑。在當(dāng)前實(shí)施例中，該親和試劑可以是例如鏈霉親和素、鏈霉親和素突變蛋白、親和素、親和素突變蛋白或其混合物。第一試劑(6)、結(jié)合配偶體C1的游離第一配偶體(20)(在此也被稱為“競(jìng)爭(zhēng)試劑”)與親和試劑結(jié)合，由此被固定在層析基質(zhì)上。結(jié)果，含有已分離的擴(kuò)增細(xì)胞群(2)的洗脫樣品正耗盡第一試劑(6)和競(jìng)爭(zhēng)試劑(20)。不含任何試劑的擴(kuò)增的細(xì)胞群(2)此時(shí)處于留待進(jìn)一步使用的條件下，例如，用于診斷應(yīng)用(例如，進(jìn)一步的FACS^TM分選)或者用于任何基于細(xì)胞的治療應(yīng)用。

圖2示出了本發(fā)明擴(kuò)增方法的另一個(gè)實(shí)施方式。如圖2a所示，樣品包含攜帶兩個(gè)特異性細(xì)胞表面分子(30)和(32)的細(xì)胞群(2)。細(xì)胞表面分子(30)參與向細(xì)胞群提供初級(jí)激活信號(hào)，而細(xì)胞表面分子(32)是參與向細(xì)胞提供刺激的細(xì)胞表面的輔助分子。所述細(xì)胞群可以是，例如，細(xì)胞表面分子(30)為TCR/CD3復(fù)合物且細(xì)胞表面分子(32)為輔助分子CD28的T細(xì)胞群。作為初級(jí)激活信號(hào)的TCR/CD3復(fù)合物的結(jié)合和作為共刺激物的CD28的結(jié)合對(duì)于T細(xì)胞的擴(kuò)增/增殖是必要的。T細(xì)胞群(2)是與其它缺乏表面受體分子(30)和(32)的細(xì)胞群(22)混合在一起的。另外，在本實(shí)施方式中，細(xì)胞群(2)與多聚化劑(4)相接觸。多聚化劑(4)具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑(6)。此外，多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、刺激作為細(xì)胞表面輔助分子的CD28的第二試劑(8)。

多聚化劑(4)包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1(42)用于第一試劑(6)的可逆結(jié)合，并且第一試劑(6)包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C1(6a)，其中結(jié)合配偶體C1(6a)能夠可逆地與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1(44)結(jié)合。因此，為了固定，第一試劑(6)通過(guò)結(jié)合配偶體C1(6a)和結(jié)合位點(diǎn)Z1(42)之間形成的可逆鍵與多聚化劑(4)相結(jié)合。此外，在圖2所述的實(shí)施例中，第二試劑(8)包含結(jié)合配偶體C2(8a)，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠被可逆地與多聚化劑(4)的結(jié)合位點(diǎn)Z2(44)結(jié)合。第二試劑(8)通過(guò)結(jié)合配偶體C2(8a)和結(jié)合位點(diǎn)Z2(44)之間形成的可逆鍵與多聚化劑(4)相結(jié)合。在本實(shí)施例中，第一試劑(6)可能是單克隆抗CD3抗體或其抗原結(jié)合片段如Fab片段。第二試劑(8)可能是單克隆抗CD28抗體或其抗原結(jié)合片段如Fab片段。第一結(jié)合配偶體(6a)可能是與抗CD3抗體或抗CD3抗體片段融合或綴合的鏈霉親和素結(jié)合肽(6a)。第二結(jié)合配偶體(8a)可能是也與CD28抗體或CD28結(jié)合抗體片段綴合或融合的鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽。關(guān)于這點(diǎn)，應(yīng)當(dāng)注意的是，抗例如CD3或CD28的單克隆抗體是眾所周知的(參見例如，如上所述的美國(guó)專利US 6,352,694 B或歐洲專利EP 0 700 430 B1)并且可購(gòu)自許多供應(yīng)商例如Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA)、Life Technologies(Carlsbad,CA,USA)、BD Biosciences(San Jose,CA,USA)、Biolegend(San Diego,CA,USA)或者M(jìn)iltenyi Biotec(Bergisch Gladbach,Germany)，僅僅舉幾個(gè)例子。因此，這種單克隆抗體可用作第一試劑和第二試劑，并且可以與例如結(jié)合配偶體C1或C2化學(xué)偶聯(lián)(綴合)?；蛘?，也可以從雜交瘤細(xì)胞系克隆可變結(jié)構(gòu)域的基因或者使用氨基酸序列已知的抗體，重組產(chǎn)生各自的抗體片段例如Fab片段或者Fv。當(dāng)在關(guān)于產(chǎn)生單克隆抗CD3抗體的雜交瘤細(xì)胞系OKT3(CRL-8001^TM，如美國(guó)專利US 4,361,549所描述的)和抗CD28抗體28.3(如Vanhove等人BLOOD,15July 2003，Vol.102,No.2,pages 564-570和基因庫(kù)(GenBank)登錄號(hào)AF451974.1中所描述)兩者的實(shí)施例部分中使用本文所述的這種方法時(shí)，通過(guò)用于重組生產(chǎn)的各自表達(dá)載體很方便地提供結(jié)合配偶體C1和C2，這樣抗體片段在輕鏈或重鏈的C端攜帶作為融合肽的結(jié)合配偶體C1或C2(關(guān)于這點(diǎn)，如Arakawa等人J.Biochem.120,657-662(1996)中所描述的抗體OKT3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列出于說(shuō)明的目的以SEQ ID NO 17和18及所附序列表示出，而如上述Vanhove等人中所描述的抗CD28抗體28.3的可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在所附序列表中以SEQ ID NO 19(VH)和20(VL)示出)?？寺】贵w分子的可變結(jié)構(gòu)域并重組生產(chǎn)各自抗體片段的這種方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員而言所熟知的，參見例如，Skerra,A.(1994)A general vector,pASK84,for cloning,bacterial production,and single-step purification of antibody Fab fragments.Gene 141,79-84,或者Skerra,A.(1993)Bacterial expression of immunoglobulin fragments.Curr Opin Immunol.5,256-562。最后，如圖2實(shí)施例中所述，還可以通過(guò)下列眾所周知的進(jìn)化方法來(lái)產(chǎn)生具有抗給定靶物諸如CD3或CD28的抗體樣特性人工結(jié)合分子的抗體分子，諸如噬菌體展示(例如，Kay,B.K.等人(1996)Phage Display of Peptides and Proteins–A Laboratory Manual,1^st Ed.,Academic Press,New York NY；Lowman,H.B.(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26,401–424，或者Rodi,D.J.和Makowski,L.(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10,87–93中所綜述的)、核糖體展示(Amstutz,P.等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12,400-405中所綜述的)或者如Wilson,D.S.等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98,3750-3755中所報(bào)道的mRNA展示。

在圖2所示的實(shí)施例中，多聚化劑(4)具有兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)Z1(42)和Z2(44)。當(dāng)結(jié)合配偶體C1(6a)是鏈霉親和素結(jié)合肽時(shí)，多聚化劑(4)的結(jié)合位點(diǎn)Z1(42)由合適的與鏈霉親和素肽(6a)可逆結(jié)合的鏈霉親和素突變蛋白提供。由于結(jié)合配偶體C2是鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽，多聚化劑(4)的結(jié)合位點(diǎn)Z2(44)由多聚鈣調(diào)蛋白提供。多聚化劑(4)可以是單個(gè)分子，例如多聚鈣調(diào)蛋白與鏈霉親和素的綴合物(該替代選擇可能通常是在可溶性多聚化的情況下采用)，或者也可以由兩個(gè)獨(dú)立分子組成。當(dāng)多聚化劑(44)被固定于如圖2所示的固體載體時(shí)，后一種選擇是優(yōu)選的。在這種情況下，鏈霉親和素突變蛋白和鈣調(diào)蛋白的混合物被涂覆(固定)在固體載體上，例如，按結(jié)合位點(diǎn)Z1和Z2為1:1的摩爾比。關(guān)于這點(diǎn)，應(yīng)當(dāng)注意的是，由于鈣調(diào)蛋白固定在固體載體上，無(wú)需再制備如上所述的多聚鈣調(diào)蛋白，但是鈣調(diào)蛋白固定在表面上足以呈現(xiàn)足夠高密度的鈣調(diào)蛋白(如上所述，鈣調(diào)蛋白僅有一個(gè)鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽的結(jié)合位點(diǎn))，以確保細(xì)胞群(2)的結(jié)合。例如，在這種情況下，具有兩個(gè)抗CD28結(jié)合位點(diǎn)的二價(jià)抗體片段或者自身具有兩個(gè)相同結(jié)合位點(diǎn)的完整抗體可以用作第二試劑(8)。

如圖2b所示，在使T細(xì)胞群(2)與多聚化劑(4)接觸并通常用多聚化劑(4)孵育細(xì)胞群之后，T細(xì)胞群(2)經(jīng)由第一試劑(6)和第二試劑(8)與多聚化劑形成復(fù)合物/相結(jié)合。第一試劑(6)和第二試劑(8)與TCR/CD3復(fù)合物和輔助分子CD28特異性結(jié)合，由此誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖/擴(kuò)增。

如圖2c所示，在孵育(通常進(jìn)行一段適宜的時(shí)間以實(shí)現(xiàn)所需細(xì)胞群的擴(kuò)增)之后，第一試劑(6)的結(jié)合配偶體C1(6a)和多聚化劑(4)的結(jié)合位點(diǎn)Z1之間的結(jié)合通過(guò)破壞各自的可逆鍵而被破壞。同樣地，第二試劑(8)的結(jié)合配偶體C2(8a)和多聚化劑(4)的結(jié)合位點(diǎn)Z2之間的結(jié)合通過(guò)破壞各自的可逆鍵而被破壞。第一試劑(6)的結(jié)合配偶體C1(6a)和結(jié)合位點(diǎn)Z1之間的可逆鍵可被生物素(其充當(dāng)游離的第一配偶體的類似物(20))破壞，而由于鈣調(diào)蛋白與鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽的結(jié)合是鈣離子(Ca²⁺)依賴型，因此第二試劑(8)的結(jié)合配偶體C2(8a)和結(jié)合位點(diǎn)Z2之間的可逆鍵可通過(guò)加入金屬螯合劑(鈣離子螯合劑)諸如EDTA或EGTA(其充當(dāng)游離的第二配偶體的類似物(20))而被破壞。當(dāng)然，這意味著與細(xì)胞群(2)的接觸是在含Ca²⁺的緩沖液中進(jìn)行。

如圖2d所示，第一游離配偶體和第二游離配偶體的類似物(20)的加入，分別導(dǎo)致結(jié)合配偶體C1(6a)和C2(8a)從多聚化劑(4)上被置換下來(lái)，因而導(dǎo)致第一試劑(6)和第二試劑(8)從多聚化劑(4)上被置換下來(lái)。第一試劑(6)和第二試劑(8)的這種置換轉(zhuǎn)而導(dǎo)致第一試劑(6)和第二試劑(8)從TCR/CD3復(fù)合物和輔助分子CD28上解離，由此終止細(xì)胞群(2)的刺激/擴(kuò)增。因此，如上所述，本發(fā)明提供了可精確控制T細(xì)胞群刺激或擴(kuò)增的時(shí)間段從而嚴(yán)密控制T細(xì)胞群功能狀態(tài)的優(yōu)勢(shì)。在如圖1d所示的洗脫細(xì)胞后，第一試劑(6)、第二試劑(8)以及結(jié)合配偶體C1的游離第一配偶體和結(jié)合配偶體C2的第二游離配偶體的類似物(20)可經(jīng)由如國(guó)際專利申請(qǐng)WO 2013/124474中所述的”去除筒”從被刺激過(guò)的細(xì)胞群(2)上被輕易地除去。此外，重要的是，假使初始樣品是例如由聚蔗糖(Ficoll)梯度得到的PMBC形式的淋巴細(xì)胞群，那么T細(xì)胞群(2)此時(shí)便可用于如本文所定義的連續(xù)擴(kuò)增。由于擴(kuò)增的細(xì)胞群(例如，通過(guò)CD3/CD28的初始刺激)在擴(kuò)增期間可用例如T細(xì)胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR，也被稱為人造T細(xì)胞受體)轉(zhuǎn)染，然后經(jīng)基因修飾的細(xì)胞可從初始刺激中釋放出來(lái)，并隨后被第二類刺激例如重新引入的受體所刺激。這些第二刺激可以包括以肽/MHC分子形式存在的抗原刺激物、遺傳引入受體的同源(交聯(lián))配體(例如，CAR的天然配體)或在新受體的框架內(nèi)直接結(jié)合(例如，通過(guò)在受體內(nèi)識(shí)別恒定區(qū))的任意配體(例如抗體)。因此，從這種連續(xù)擴(kuò)增中獲得的T細(xì)胞群可用于過(guò)繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

圖3示出了本發(fā)明擴(kuò)增方法的又一個(gè)實(shí)施方式。此外，該實(shí)施例所用的樣品包含攜帶兩個(gè)特異性細(xì)胞表面分子(30)和(32)的T細(xì)胞群(2)，其中細(xì)胞表面分子(30)是TCR/CD3復(fù)合物且細(xì)胞表面分子(32)是輔助分子CD28。在圖3a中，示出的是與多聚化劑(4)接觸后的T細(xì)胞群(2)。此外，在該實(shí)施例中，多聚化劑(4)具有可逆固定(結(jié)合)于其上作為第一試劑(6)的、向T細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的抗CD3抗體或其抗原結(jié)合片段，以及作為第二試劑(8)的、刺激輔助分子CD28的抗CD28抗體或其抗原結(jié)合片段。

圖3實(shí)施例中所示的多聚化劑(4)僅包括一類結(jié)合位點(diǎn)Z1(42)用于第一試劑(6)和第二試劑(8)兩者的可逆結(jié)合。第一試劑(6)和第二試劑(8)兩者都包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C1(6a、8a)，其中結(jié)合配偶體C1(6a)和結(jié)合配偶體(8a)兩者都能夠可逆地與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1(44)結(jié)合。因此，為了固定，第一試劑(6)和第二試劑(8)通過(guò)結(jié)合配偶體C1(6a)和結(jié)合配偶體C2與結(jié)合位點(diǎn)Z1(42)之間形成的可逆鍵分別與多聚化劑(4)相結(jié)合。結(jié)合配偶體C1和C2可以是不同的或相同的。例如，結(jié)合配偶體C1可以是序列為Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys((SEQ ID NO:01)，“Strep標(biāo)記(Strep-)”)的鏈霉親和素結(jié)合肽，而結(jié)合配偶體C2可以是序列為Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₃-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys((SEQ ID NO:04)，也被稱為“di-tag3”)或?yàn)門rp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys((SEQ ID NO:05)，也被稱為“the di-tag2”)的鏈霉親和素結(jié)合肽，如Junttila等人,Proteomics 5(2005),1199-1203或美國(guó)專利7,981,632中所描述的。所有這些鏈霉親和素結(jié)合肽都與相同的結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，即鏈霉親和素的生物素結(jié)合位點(diǎn)。如果一個(gè)或多個(gè)這種鏈霉親和素結(jié)合肽用作結(jié)合配偶體C1和C2，那么多聚化劑(4)是一種鏈霉親和素突變蛋白。如圖3所示，可溶性多聚化劑(4)被使用。在鏈霉親和素突變蛋白的情況下，這種可溶性多聚化劑可以是例如鏈霉親和素或親和素的寡聚物或聚合物，或者鏈霉親和素或親和素的任意突變蛋白(類似物)的寡聚物或聚合物。所述寡聚物可以包含三個(gè)或更多個(gè)鏈霉親和素、親和素或其突變蛋白的單體。所述寡聚物或聚合物可通過(guò)多糖交聯(lián)。這種鏈霉親和素或親和素的寡聚物或聚合物、或鏈霉親和素或親和素突變蛋白的寡聚物或聚合物可通過(guò)在第一步中將羧基殘基引入多糖例如葡聚糖來(lái)制備，基本上如“Noguchi,A.,Takahashi,T.,Yamaguchi,T.,Kitamura,K.,Takakura,Y.,Hashida,M.&Sezaki,H,(1992).Preparation and properties of the immunoconjugate composed of anti-human colon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextran conjugate.Bioconjugate Chemistry 3,132-137”中所述。在第二步中，采用常規(guī)的碳二亞胺化學(xué)方法，鏈霉親和素或親和素或其突變蛋白經(jīng)由內(nèi)部賴氨酸殘基和/或游離N端的伯氨基基團(tuán)與葡聚糖骨架上的羧基基團(tuán)偶聯(lián)?？商娲?，鏈霉親和素或親和素或任意鏈霉親和素或親和素的突變蛋白的交聯(lián)寡聚物或聚合物也可以經(jīng)由雙功能接頭諸如戊二醛通過(guò)交聯(lián)或通過(guò)文獻(xiàn)中所述的其它方法獲得。

作為結(jié)合配偶體C1和C2使用，與多聚化劑的相同結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合(42)相結(jié)合的部分具有的優(yōu)勢(shì)在于，如圖3b所示，(第一結(jié)合配偶體C1以及第二結(jié)合配偶體C2的)相同游離配偶體或其類似物可用于終止T細(xì)胞群(2)的擴(kuò)增，并將T細(xì)胞群(2)從多聚化劑上釋放出來(lái)。在圖3的實(shí)施例中，第一和第二配偶體C1和C2的類似物諸如生物素或生物素的衍生物(亞氨基生物素或脫硫生物素)可方便地用于T細(xì)胞群(2)的擴(kuò)增終止和洗脫。

如圖3c所示，在如圖1d所示洗脫細(xì)胞后，第一試劑(6)、第二試劑(8)以及生物素作為結(jié)合配偶體C1的游離第一配偶體和結(jié)合配偶體C2的游離第二配偶體的類似物，可以通過(guò)如國(guó)際專利申請(qǐng)WO 2013/124474中所述的”去除筒”從被刺激的細(xì)胞群(2)上輕易地去除。此外，使用可溶性多聚化劑(4)的實(shí)施方式具有另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即能夠避開任何固體載體諸如磁珠。這意味著將不存在已激活的T細(xì)胞被這種磁珠污染的風(fēng)險(xiǎn)。這也意味著符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的過(guò)程與已知的方法相比更容易建立，諸如使用則必須采用額外的措施以確保最終的擴(kuò)增T細(xì)胞群不含磁珠。此外，可溶性多聚化劑的使用使得其極易從已激活的細(xì)胞群(T細(xì)胞、B細(xì)胞或天然殺傷細(xì)胞)中去除，因?yàn)榧?xì)胞可通過(guò)離心簡(jiǎn)單沉淀，而含有可溶性多聚化劑的上清液則可棄除?？商娲兀扇苄远嗑刍瘎┛稍趪?guó)際專利申請(qǐng)WO 2013/124474的去除筒的凝膠滲透基質(zhì)中從已擴(kuò)增的細(xì)胞群中被去除。由于不存在固相(例如磁珠)，本發(fā)明還提供了一種用于細(xì)胞擴(kuò)增的自動(dòng)封閉系統(tǒng)，其可整合到已知的細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)中，諸如可購(gòu)于GE Healthcare(Little Chalfont,Buckinghamshire,United Kingdom)的W25型Xuri細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)(Xuri Cell Expansion System W25)和WAVE生物反應(yīng)器2/10系統(tǒng)(WAVE Bioreactor2/10System)，或者可購(gòu)于TerumoBCT Inc.(Lakewood,CO,USA)的細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)(Cell Expansion System)。

圖4示出了CD3+ T應(yīng)答細(xì)胞在體外用可逆固定于涂覆有鏈霉親和素突變蛋白Strep-的磁珠上的αCD3和αCD28 Fab片段刺激后增殖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖4A是示出了被刺激細(xì)胞大小分布(前向散射)的直方圖，圖4B示出了代表?yè)?jù)每次細(xì)胞分裂時(shí)的細(xì)胞數(shù)所示的增殖程度的直方圖，細(xì)胞分裂次數(shù)如圖4B頂部所標(biāo)示(0代表未分裂的細(xì)胞；5代表經(jīng)歷了至少5次分裂的細(xì)胞)，圖4C示出了刺激4天后的培養(yǎng)皿照片。

圖5示出了Jurkat細(xì)胞內(nèi)不同的細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員的結(jié)果，所述Jurkat細(xì)胞是用αCD3抗體OKT3或用Strep-多聚化的OKT3的Fab片段(本文中也稱為Fab多聚體)標(biāo)記的。圖5A：Jurkat細(xì)胞與鈣敏染料Indo-1-AM一起上樣，通過(guò)注入αCD3mAb(黑色正方形)觸發(fā)鈣釋放，或者在進(jìn)行或不進(jìn)行預(yù)先D-生物素破壞(分別為深灰色三角形和淺灰色圓形)下通過(guò)注入αCD3OKT3 Fab多聚體(衍生自親本細(xì)胞系OKT3)觸發(fā)鈣釋放，與注入PBS(白色倒三角形)相比較。離子霉素(ionomycine)的應(yīng)用為陽(yáng)性對(duì)照。基于FL6/FL7比率的變化，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺濃度的時(shí)間分辨變化。圖5B：經(jīng)Indo-1-AM標(biāo)記的Jurkat細(xì)胞被如圖4a所述的不同的αCD3刺激所激活(OKT3：上方曲線圖，αCD3 Fab多聚體：中間曲線圖)，隨后(t＝140s)進(jìn)行D-生物素介導(dǎo)的αCD3 Fab多聚體信號(hào)的破壞。注射PBS(下方曲線圖)或離子霉素作為陰性或陽(yáng)性對(duì)照。數(shù)據(jù)代表三個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)。

圖6示出了用抗CD3OKT3 Fab多聚體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行可逆染色的結(jié)果。新鮮分離的PBMC用單克隆抗體(左側(cè)散點(diǎn)圖，F(xiàn)ab多聚體的親本克隆)或同源的PE標(biāo)記的Fab多聚體染色，并在用D-生物素處理之前(左二列)或之后(中間列)進(jìn)行分析。在后續(xù)的清洗步驟后，使用新鮮的PE標(biāo)記的Strep-(右二列)檢測(cè)剩余的Fab單體。進(jìn)行二次Fab多聚體染色的可逆染色細(xì)胞作為對(duì)照(右列)。只有活(PI^陰性)細(xì)胞才能顯示出來(lái)。散點(diǎn)圖中的數(shù)字表示柵極內(nèi)的細(xì)胞百分比。

圖7示出了通過(guò)抗CD28 Fab片段的可逆結(jié)合所分離的細(xì)胞，所述抗CD28 Fab片段與Strep-多聚化，并用熒光標(biāo)記藻紅蛋白進(jìn)行標(biāo)記。CD28+細(xì)胞通過(guò)如國(guó)際專利申請(qǐng)WO2013/011011中所述的Fab多聚體磁性細(xì)胞選擇法從新鮮分離的PMBC中被選擇/分離出來(lái)。在選擇之前，用同源的熒光αCD28多聚體(左側(cè)散點(diǎn)圖)或者用直接抗免疫球蛋白κ輕鏈的抗體(左二散點(diǎn)圖，α-IgκmAb)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行對(duì)照染色。在選擇之后，用D-生物素處理細(xì)胞，隨后清洗去除磁珠和Fab單體。隨后用CD28 Fab多聚體(右二散點(diǎn)圖)或用α-IgκmAb(右散點(diǎn)圖)對(duì)被釋放的CD28+細(xì)胞進(jìn)行(重新)染色，以檢測(cè)可能殘余的Fab單體。只有活的(PI^陰性)CD3+細(xì)胞才能顯示出來(lái)。散點(diǎn)圖中的數(shù)字表示柵極內(nèi)的細(xì)胞百分比。

圖8示出了CD3+ T應(yīng)答細(xì)胞在體外用可逆固定于充當(dāng)可溶性多聚化劑的可溶性寡聚Strep-上的可逆性αCD3/αCD28 Fab片段刺激后增殖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)于圖8所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，300.000個(gè)CD3+應(yīng)答T細(xì)胞(Tresp)用2μM羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)進(jìn)行標(biāo)記，并用不同量的固定有αCD3 Fab片段和αCD28 Fab組合的可溶性Streptactin寡聚物制劑進(jìn)行刺激，所述αCD3 Fab片段和αCD28 Fab兩者均在重鏈上攜帶充當(dāng)鏈霉親和素結(jié)合肽的Strep標(biāo)記的。(“1x”對(duì)應(yīng)于用0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab功能化的3μg多聚Strep-tactin；數(shù)字表示“1x”的倍數(shù))。剩余的未經(jīng)刺激的或用空白Strep-tactin多聚體(無(wú)Fab)進(jìn)行刺激的Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照。將Tresp細(xì)胞一式兩份連同300.000個(gè)CD3陰性自飼養(yǎng)細(xì)胞(經(jīng)30Gy輻照)一起接種到48孔板上1ml添加有20U/ml白細(xì)胞介素2(IL-2)的細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃下進(jìn)行孵育，不更換培養(yǎng)基，5天后根據(jù)CFSE稀釋法通過(guò)FACS分析對(duì)增殖情況進(jìn)行分析(圖8B)。圖8A示出了培養(yǎng)5天后細(xì)胞的大小分布。直方圖示出了活的CD3+細(xì)胞，而圖8C示出培養(yǎng)后用1mM D-生物素處理并清洗后由刺激試劑釋放的細(xì)胞。通過(guò)使用熒光標(biāo)記藻紅蛋白標(biāo)記的Strep-(ST-PE)進(jìn)行重新染色來(lái)分析單體Fab片段的解離和去除，并示出了代表性直方圖。圖8D示出了使用Neubauer計(jì)數(shù)室計(jì)算出的5天后活(臺(tái)盼藍(lán)陰性)細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)，并按各自的刺激條件繪圖。中位細(xì)胞數(shù)在圖8D中示出；誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。圖8E示出了刺激5天后培養(yǎng)板的照片。

圖9示出了本發(fā)明的連續(xù)擴(kuò)增方法的圖解(圖9a)，而圖9b簡(jiǎn)單介紹了連續(xù)擴(kuò)增的一些特征和優(yōu)勢(shì)。

圖10示出了可與本發(fā)明的擴(kuò)增方法一同使用的本發(fā)明的一種排布。這種排布(100)包括生物反應(yīng)器(50)、第一“去除筒”(70)和第二“去除筒”(90)。生物反應(yīng)器(50)與第一去除筒(70)流體式連接，而第一去除筒與第二去除筒(90)為流體連接。這種排布(100)可以是本文所述的自動(dòng)化細(xì)胞擴(kuò)增純化設(shè)備的一部分。

本文所述的擴(kuò)增方法在生物反應(yīng)器(50)中進(jìn)行，例如，圖3中所述的使用可溶性多聚化劑的擴(kuò)增方法。在這種情況下，在通過(guò)加入競(jìng)爭(zhēng)物(20)(結(jié)合配偶體C1的游離配偶體或其類似物)終止細(xì)胞群(2)的激活/擴(kuò)增之后，從生物反應(yīng)器中釋放的反應(yīng)混合物包含擴(kuò)增的細(xì)胞群(2)、第一試劑(6)、第二試劑(8)以及可溶性多聚化劑(4)。在該實(shí)施例中，第一試劑(6)是包括作為結(jié)合配偶體C1的鏈霉親和素結(jié)合肽在內(nèi)的CD3結(jié)合抗體片段，第二試劑(8)是包括作為結(jié)合配偶體C1的鏈霉親和素結(jié)合肽在內(nèi)的CD28結(jié)合抗體片段，以及競(jìng)爭(zhēng)物(20)(結(jié)合配偶體C1的游離類似物)是生物素。這種反應(yīng)混合物被施加到去除筒(70)上。這種第一去除筒(70)是如國(guó)際專利申請(qǐng)WO 2013/124474所述的去除筒，其包括具有合適固定相的層析柱。所述固定相可用作親和層析基質(zhì)，并且同時(shí)可用作凝膠滲透基質(zhì)。這種親和層析基質(zhì)具有固定于其上的親和試劑。在本實(shí)施例中，所述親和試劑可以是例如鏈霉親和素、鏈霉親和素突變蛋白、親和素、親和素突變蛋白或其混合物。因此，第一試劑(6)和第二試劑(8)通過(guò)其鏈霉親和素結(jié)合肽與親和試劑結(jié)合。此外，生物素作為競(jìng)爭(zhēng)物(20)與親和試劑結(jié)合。因此，這三種試劑全部被固定在第一去除筒的層析基質(zhì)上，而擴(kuò)增的細(xì)胞群(2)和可溶性多聚化劑(4)通過(guò)固定相。然后這種“流經(jīng)物”被施加到第二去除筒(90)上。此外，這種第二去除筒(90)包括固定相。這種固定相其上包含能夠與多聚化劑(4)的結(jié)合位點(diǎn)Z1(42)結(jié)合的第二親和試劑。這種親和試劑可能是例如與固定相共價(jià)結(jié)合的生物素。這種固定相可能是例如獲自Affiland S.A.(Ans-Liege，Belgium)的D-生物素Sepharose^TM瓊脂糖凝膠。因此，可溶性多聚化劑(4)將被結(jié)合(保留)在第二去除筒(90)的固定相上，而擴(kuò)增的細(xì)胞群(2)通過(guò)固定相且不含任何試劑。細(xì)胞群(2)此時(shí)處于留待進(jìn)一步使用的狀態(tài)下，例如，用于診斷應(yīng)用(例如，進(jìn)一步FACS^TM分選)或者用于任何基于細(xì)胞的治療應(yīng)用。這里應(yīng)當(dāng)注意的是，改變排布(100)中第一“去除筒”(70)和第二“去除筒”(90)的順序當(dāng)然也是可以的，這樣，生物反應(yīng)器(50)與第二去除筒(90)(直接)流體連接在，而將第一去除筒(70)安排在其后并與第二去除筒(90)流體式連接。在此排布中，多聚化劑(4)將首先從細(xì)胞群(2)中去除，隨后是第一試劑(6)、第二試劑(8)和例如競(jìng)爭(zhēng)物(20)被去除。這樣的排布也被包含在本發(fā)明中并且也可以是本文所述的自動(dòng)化細(xì)胞擴(kuò)增純化設(shè)備的一部分。

圖11示出了可與本發(fā)明的擴(kuò)增方法一同使用的本發(fā)明排布的另一個(gè)實(shí)施方式。這種排布(110)包括生物反應(yīng)器(50)、第一“去除筒”(70)和第二“去除筒”(90)。生物反應(yīng)器(50)與第一去除筒(70)流體式連接，且第一去除筒與第二去除筒(90)流體式連接。此外，第二去除筒(90)與生物反應(yīng)器(50)流體式連接。這種排布(110)也可以是本文所述的自動(dòng)化細(xì)胞擴(kuò)增純化設(shè)備的一部分。當(dāng)例如與采用可溶性多聚化劑(4)的擴(kuò)增方法一同使用時(shí)，經(jīng)純化的擴(kuò)增細(xì)胞群(2)以第二去除筒(90)的洗脫液獲得。由于去除筒(90)與生物反應(yīng)器(50)流體式連接，因此細(xì)胞群(2)可轉(zhuǎn)回至生物反應(yīng)器(50)，例如進(jìn)行本文所述的連續(xù)克隆擴(kuò)增，通過(guò)例如用T細(xì)胞受體基因?qū)?xì)胞群進(jìn)行轉(zhuǎn)染，隨后采用本發(fā)明的擴(kuò)增方法進(jìn)一步(二次)擴(kuò)增。

圖12示出了可與本發(fā)明的擴(kuò)增方法一同使用的本發(fā)明的排布的又一個(gè)實(shí)施方式。這種排布(120)包括生物反應(yīng)器(50)、第一“去除筒”(70)和第二“去除筒”(90)。生物反應(yīng)器(50)與第一去除筒(70)流體式連接，并且第一去除筒與第二去除筒(90)流體式連接。類似于圖11中所示的實(shí)施方式，第二去除筒(90)與生物反應(yīng)器(50)流體式連接。然而，如國(guó)際專利申請(qǐng)WO 2013/124474中所述的“選擇筒”(92)被排布在第二去除筒(90)和生物反應(yīng)器(50)之間。因此，細(xì)胞群(2)中包含的細(xì)胞亞群(2a)可通過(guò)這種如WO 2013/124474中所述的“選擇筒”(92)被選擇/富集。這種細(xì)胞亞群(2a)可或被轉(zhuǎn)移至生物反應(yīng)器(50)，例如以進(jìn)行本文所述的連續(xù)擴(kuò)增。作為替代地(未示出)，這種細(xì)胞亞群(2a)可用于基于細(xì)胞的治療。這里再次需要注意的是，使用本文所述的可溶性多聚化劑得以設(shè)計(jì)出功能性封閉的、且由此不易受污染的自動(dòng)化細(xì)胞純化擴(kuò)增設(shè)備。此外，由于可溶性多聚化劑避免了對(duì)固相材料諸如磁珠的需要，因此這種細(xì)胞純化設(shè)備可設(shè)計(jì)為連續(xù)流動(dòng)設(shè)備。

圖13示出了純化的CD4+和CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞(Tresp)在體外被可逆固定于作為可溶性多聚化劑的兩種可溶性寡聚Strep-突變蛋白上的αCD3/αCD28 Fab片段或αCD3/αCD28/αCD8刺激而增殖的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)。第一種寡聚Strep-是實(shí)施例5中獲得的寡聚鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)的一部分(也被稱為“常規(guī)骨架”，在圖13中以尖端朝下的三角形符號(hào)表示)，第二種用做可溶性多聚化劑的寡聚鏈霉親和素突變蛋白是一種通過(guò)使可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白與生物素化的人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)發(fā)生反應(yīng)而得到寡聚物。這種基于HSA的可溶性多聚化劑在本文中也被稱為“大骨架”。在圖13的實(shí)驗(yàn)中，擴(kuò)增是在不更換培養(yǎng)基的情況下進(jìn)行的。CD4+ T應(yīng)答細(xì)胞的結(jié)果在圖13A中示出，CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞的結(jié)果在圖13B中示出。關(guān)于這點(diǎn)，應(yīng)當(dāng)注意的是，實(shí)驗(yàn)上使用的可溶性多聚化劑通過(guò)可逆地與第一試劑、任選地與第二和第三試劑結(jié)合而被功能化，在圖中被稱為“多聚體”。

圖14示出了純化的CD4+和CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞(Tresp)在體外被可逆固定于作為可溶性多聚化劑的兩種可溶性寡聚Strep-上的αCD3/αCD28Fab片段刺激而增殖的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)。第一種寡聚Strep-是實(shí)施例5中獲得的寡聚鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)的一部分(也被稱為“常規(guī)骨架”，在圖14中以尖端朝上的三角形符號(hào)表示)，第二種用做可溶性多聚化劑的寡聚鏈霉親和素突變蛋白是基于HSA的可溶性多聚化劑(上述的“大骨架”。在圖14的實(shí)驗(yàn)中，擴(kuò)增是在更換培養(yǎng)基的情況下進(jìn)行的。CD4+ T應(yīng)答細(xì)胞的結(jié)果在圖14A中示出，CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞的結(jié)果在圖14B中示出。

圖15示出了圖13和14中純化的CD4+和CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞增殖的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)所得結(jié)果的綜合數(shù)據(jù)，其中，圖15A示出了CD4+ T細(xì)胞的結(jié)果，圖15B示出了CD8+ T細(xì)胞的結(jié)果。在第3天更換培養(yǎng)基的情況下的培養(yǎng)用直線表示，而虛線示出了第3天不更換培養(yǎng)基的情況下的擴(kuò)增程度的值。圖15中所示的數(shù)據(jù)用輸入的細(xì)胞數(shù)歸一化。只有用寡聚鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)刺激的Tresp、用市售Dynabeads(陽(yáng)性對(duì)照)刺激的Tresp以及未經(jīng)刺激的T細(xì)胞(陰性對(duì)照)的數(shù)據(jù)被示出，而具有“大骨架”的多聚化劑卻沒有數(shù)據(jù)。

圖16示出了純化的CD4+和CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞在體外被可逆固定于如實(shí)施例5中所述的可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)上的αCD3/αCD28Fab片段刺激而激活后T細(xì)胞的早期群簇形成。圖16A示出了CD4+ T細(xì)胞的結(jié)果，而圖16B示出了CD8+ T細(xì)胞的結(jié)果。用可溶性多聚化劑(寡聚鏈霉親和素突變蛋白)刺激的Tresp、用市售Dynabeads刺激的Tresp(陽(yáng)性對(duì)照)以及未經(jīng)刺激的T細(xì)胞(陰性對(duì)照)的數(shù)據(jù)被示出。

圖17示出了在體外被與實(shí)施例5中所述的可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)可逆結(jié)合的αCD3/αCD28 Fab片段所多克隆刺激的CD3+中樞記憶T細(xì)胞(Tcm)(CD3+CD62L+CD45RA-Tcm)的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)和表型。圖17中示出的曲線圖代表了據(jù)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上收獲的細(xì)胞數(shù)所示的增殖程度，其中，圖17A示出了只添加IL-2的培養(yǎng)基中的增殖，圖17B示出了添加了IL-2和IL-15的培養(yǎng)基中的增殖。圖17C示出了在這些可變細(xì)胞因子環(huán)境中培養(yǎng)14后CD62L和CD127的表面表達(dá)水平的流式細(xì)胞分析。

圖18示出了從大量純化的CD3+CD62L+CD45RA-Tcm應(yīng)答細(xì)胞中進(jìn)行選擇性抗原特異性(Ag特異性)擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)，其中，所述CD3+CD62L+CD45RA-Tcm應(yīng)答細(xì)胞在體外被肽:MHC分子復(fù)合物(充當(dāng)向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑)和αCD28 Fab片段(充當(dāng)與細(xì)胞表面輔助分子結(jié)合的第二試劑)二者刺激，未刺激的T細(xì)胞(陰性對(duì)照)也被示出?？乖禺愋噪呐cMHC分子的復(fù)合物和αCD28 Fab片段兩者可逆固定于同一種如實(shí)施例5中所述的可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)。用于圖18A中抗原特異性擴(kuò)增的肽為肽CRVLCCYVL(SEQ ID NO:06)和被HLA-C702MHC分子(如Ameres等人,PLOS Pathogens,May 2013,vol.9,issue 5,e1003383所述)限制的即刻早期1蛋白的第309-317位氨基酸，代表對(duì)巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus,CMV)具有特異性的HLA-C7/IE-1抗原表位。呈遞肽的MHC I分子在其重鏈C端攜帶鏈霉親和素結(jié)合肽(SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:07)，也就是從IBA GmbH(Germany)購(gòu)得的“雙Strep標(biāo)記(Twin-Strep-)”。圖18A示出了對(duì)用肽:MHC-I復(fù)合物來(lái)增殖的部分Ag特異性細(xì)胞的示例性流式細(xì)胞分析，其中所述肽:MHC-I復(fù)合物對(duì)HLA-C7/IE-1抗原表位具有特異性，并作為第一試劑可逆固定于可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白，并向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)。圖18B至圖18E中的曲線圖示說(shuō)明了據(jù)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上收獲的特異性肽:MHCI多聚體-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所示的其他Ag特異性的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)，這與圖18A類似，即使用抗原特異性肽與MHC I分子的不同復(fù)合物作為可逆固定于可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白上、向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑。更詳細(xì)地，圖18B示出了使用對(duì)CMV的pp65抗原表位有特異性的肽:MHC-I復(fù)合物(被HLA-A2402限制的第341-350位氨基酸(QYDPVAALF,(SEQ ID NO:08)))進(jìn)行擴(kuò)增的Ag特異性細(xì)胞的擴(kuò)增結(jié)果，圖18C示出了使用另一種對(duì)CMV的pp65抗原表位具有特異性的肽:MHC-I復(fù)合物(被HLA-B702限制的第265-274位氨基酸RPHERNGFTV,(SEQ ID NO:09))進(jìn)行增殖的Ag特異性細(xì)胞的擴(kuò)增結(jié)果，圖18D示出了使用對(duì)腺病毒的Hexon 5抗原表位具有特異性的肽:MHC-I復(fù)合物(被HLA-B702限制的第114-124位氨基酸(CPYSGTAYNSL,(SEQ ID NO:10)))進(jìn)行增殖的Ag特異性細(xì)胞的擴(kuò)增結(jié)果，圖18E示出了使用對(duì)CMV的HLA-B7/IE-1_309-317抗原表位具有特異性的肽:MHC-I復(fù)合物進(jìn)行增殖的Ag特異性細(xì)胞的擴(kuò)增結(jié)果(示例性的FACS數(shù)據(jù)可參見上圖18A)。所有承載雙標(biāo)記的肽:MHC分子均可從IBA GmbH購(gòu)得。關(guān)于這點(diǎn)，攜帶“雙Strep標(biāo)記(Twin-Strep-)”作為其C端的HLA-A*2402、HLA-B*0702和HLA-C*0702分子的氨基酸序列在所附序列表中的SEQ ID NO:21、22和23中示出，而β₂微球蛋白的氨基酸序列(其與α鏈一起形成，這意味著HLA編碼相應(yīng)的MHC I分子(HLA encoded molecules the respective MHC I molecule))在所附序列表中的SEQ ID NO:24中示出。此外，圖18F示出了對(duì)來(lái)自圖18D的、經(jīng)HLA-B7/Hexon5_114-124刺激/擴(kuò)增的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)14天后，CD62L和CD127表面表達(dá)水平的示例性流式細(xì)胞分析。

圖19示出了從純化的CD3+CD62L+CD45RA-Tcm應(yīng)答細(xì)胞中進(jìn)行選擇性Ag特異性擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)，其中，所述CD3+CD62L+CD45RA-Tcm應(yīng)答細(xì)胞在體外被可逆固定于可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白上作為第一和第二試劑的a)抗原特異性肽MHC I復(fù)合物和b)αCD28 Fab片段刺激。為了這個(gè)目的，使用3μl的被0.5μg配有鏈霉親和素結(jié)合肽的肽:MHC I類復(fù)合物(特異性肽表示被HLA-B0702限制的腺病毒的Hexon 5蛋白的第114-124位氨基酸(CPYSGTAYNSL,SEQ ID NO:10)，見上文)和0.5μgαCD28 Fab功能化的Streptactin多聚化劑制劑對(duì)500.000個(gè)CD3+CD62L+CD45RA-應(yīng)答Tcm細(xì)胞(Tresp)進(jìn)行Ag特異性刺激。作為替代，4.5μl Streptactin多聚化劑制劑負(fù)載有0.5μg肽:MHC I類復(fù)合物、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab。為了比較，使用3μl負(fù)載有0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab組合的Streptactin多聚化劑制劑(1mg/ml)進(jìn)行多克隆刺激。作為上述刺激條件的另一種替代方案，使用了4.5μl負(fù)載有0.5μgαCD3 Fab、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab的Streptactin多聚體制劑。未經(jīng)處理(未經(jīng)刺激的)的Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照，而經(jīng)Dynabeads多克隆刺激的Tresp細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。Tresp細(xì)胞被接種到48孔板上添加有30U/ml IL-2和5ng/ml IL-15的1ml細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃下孵育，每3天更換一次培養(yǎng)基，并于7天和14天后分析細(xì)胞計(jì)數(shù)。圖19中所示的照片代表在Ag特異性刺激第5天時(shí)群簇形成的程度，以腺病毒HLA-B7/Hexon 5抗原表位為例證。

圖20示出了純化CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞的擴(kuò)增產(chǎn)量和表型，其中所述CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞在體外用可逆固定于兩種起可溶性多聚化劑作用的可溶性寡聚Strep-上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激。第一種寡聚Strep-是實(shí)施例5中獲得的寡聚鏈霉親和素突變蛋白(常規(guī)骨架)的一部分，第二種用作可溶性多聚化劑的寡聚鏈霉親和素突變蛋白是上文所述的可溶性寡聚物，在此被稱為“大”骨架。在這些實(shí)驗(yàn)中，寡聚常規(guī)鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)的一部分也被用作多聚化劑，其可被單一的Fab片段(圖20A和圖20B中的第三根柱)或者αCD3和αCD28 Fab片段組合所功能化。除了用αCD3/αCD28 Fab片段組合刺激之外，還有額外的αCD8 Fab片段(從IBA GmbH購(gòu)得，Germany)被固定，以測(cè)試是否可能優(yōu)先刺激特定T細(xì)胞亞群。圖20A示出了代表?yè)?jù)第6天收獲的細(xì)胞數(shù)所示的增殖程度的柱狀圖，其中，所述細(xì)胞數(shù)與陰性對(duì)照(未經(jīng)刺激的純化CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞)相比較，并以陽(yáng)性對(duì)照(用市售Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28單克隆抗體的磁珠)刺激的純化CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞)進(jìn)行歸一化。圖20B示出了對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)后CD8和T細(xì)胞表面分子CD45RO(這是T細(xì)胞增殖和激活的指征)的表面表達(dá)水平的流式細(xì)胞分析。采用單因素方差分析法對(duì)各種刺激條件進(jìn)行比較，并未檢測(cè)到顯著性差異(n.s.)。

圖21示出了純化的CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞擴(kuò)增的產(chǎn)量和表型，其中，所述CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞在體外被可逆固定于起可溶性多聚化劑作用的可溶性寡聚Strep-上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激，所述可溶性寡聚Strep-被單一的Fab片段或Fab片段組合(上文已有描述)所功能化。在這些實(shí)驗(yàn)中，CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞被可溶性多聚化劑(實(shí)施例5中的可溶性寡聚Strep-(1mg/ml))刺激，所述可溶性多聚化劑被不同量的αCD3和αCD28 Fab片段(任選地連同上述αCD8 Fab片段)所功能化。術(shù)語(yǔ)“1x”對(duì)應(yīng)于被0.5μgαCD3 Fab片段單獨(dú)功能化的1.5μg多聚化Streptactin和被0.5μgαCD28 Fab單獨(dú)功能化的1.5μg多聚化Streptactin，或負(fù)載有0.5μgαCD3 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab的3μl寡聚Streptactin制劑，或負(fù)載0.5μg strep標(biāo)記的αCD3、0.5μg strep標(biāo)記的αCD8和0.5μg strep標(biāo)記的αCD28 Fab的4.5μl Streptactin多聚體制劑。相應(yīng)地，術(shù)語(yǔ)“2x”對(duì)應(yīng)于被1μgαCD3 Fab片段單獨(dú)功能化的3.0μg多聚化Streptactin和被1μgαCD28 Fab單獨(dú)功能化的3.0μg多聚化Streptactin，這意味著使用了兩倍于固定化αCD3 Fab片段化的量。未經(jīng)處理的Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照，而經(jīng)市售Dynabeads(其上不可逆地固定有αCD3和αCD28單克隆抗體的磁珠)刺激的純化CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。圖21A示出了代表?yè)?jù)第5天收獲的細(xì)胞數(shù)所示的增殖程度的柱狀圖，其中所述細(xì)胞數(shù)與陰性對(duì)照相比較，并以陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行歸一化。圖21B示出了細(xì)胞培養(yǎng)后CD8和CD45RO表面表達(dá)水平的FACS分析。

圖22示出了轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞被修飾以表達(dá)αCD19嵌合抗原受體(CAR)，并被實(shí)施例5中用作可溶性多聚化劑的寡聚Strep-刺激。CAR的特異性通常來(lái)源于由單克隆抗體(mAb)抗原結(jié)合區(qū)組裝的scFv部位，所述單克隆抗體(mAb)與靶物/腫瘤相關(guān)抗原諸如CD19特異性結(jié)合，并使其與T細(xì)胞特異性信號(hào)相連(如Hudecek等人,Clin Cancer Res.2013June 15；19(12):3153–3164所述)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，含有αCD19CAR天然配體的CD19胞外域(extracellular domain,ECD)以及識(shí)別αCD19-CAR中IgG4間隔區(qū)的多克隆αIgG F(ab)₂片段(從Jackson Immuno Research商購(gòu)獲得的驢抗人F(ab)₂)也被用作向Jurkat細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑。與可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白的可逆固定由與CD19的ECD的C端融合的鏈霉親和素肽SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:07)提供，或由生物素化的αIgG的(Fab)₂片段提供(由于鏈霉親和素突變蛋白“m2”以降低的親和力與生物素結(jié)合，這種結(jié)合是可逆的并且可例如被加入的過(guò)量的游離生物素所置換)。在圖22A的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，300.000個(gè)CD3+Jurkat應(yīng)答細(xì)胞(Jresp)用不同量的、被αCD3 Fab和αCD28 Fab功能化(“x1”對(duì)應(yīng)于被0.5μg aCD3-和0.5μg aCD28 Fab功能化的3μg多聚化Streptactin——多克隆Streptamer多聚體)的寡聚Streptactin(1mg/ml)制劑的混合物進(jìn)行刺激。在圖22B的實(shí)驗(yàn)中，3μl寡聚Streptactin制劑被0.5μg(x1)或1μg(x2)的CD19胞外域(ECD)功能化，或3μl寡聚Streptactin制劑負(fù)載有0.5μg(x1)或1μg(x2)識(shí)別IgG4間隔區(qū)的αIgG(二者均為CAR特異性多聚體)。經(jīng)Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28單克隆抗體的磁珠)或PMA和離子霉素刺激的Jresp作為陽(yáng)性對(duì)照。Jresp細(xì)胞被接種在1.5ml Eppendorf管的200μl添加有30U/ml IL-2的細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃下孵育，并在刺激0min至20min后，置于冰上裂解。

圖23示出了在體外被αCD3/αCD28 Fab片段刺激的純化CD3⁺ T應(yīng)答細(xì)胞的擴(kuò)增，所述αCD3/αCD28 Fab片段可逆地固定于實(shí)施例5中被用作可溶性多聚化劑的可溶性寡聚Strep-上。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，除αCD3/αCD28 Fab片段以外，從IBA GmbH(Germany)商購(gòu)獲得的αCD8 Fab片段(目錄編號(hào) 6-8000-203)也被固定于鏈霉親和素突變蛋白的可溶性寡聚物，以測(cè)試是否可能用其上還可逆固定有αCD8 Fab片段的本發(fā)明多聚化劑在體外優(yōu)先刺激大量CD3⁺培養(yǎng)物中的CD8⁺ T細(xì)胞亞群。更詳細(xì)地，使用負(fù)載有0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab組合的3μl寡聚鏈霉親和素制劑(1mg/ml)對(duì)500.000個(gè)純化的CD3⁺應(yīng)答T細(xì)胞(Tresp)進(jìn)行刺激。作為一種替代方法，4.5μl Streptactin寡聚物負(fù)載有如上所述的0.5μgαCD3、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab。未經(jīng)刺激的Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照，經(jīng)Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28單克隆抗體的磁珠)刺激的Tresp細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。

圖24示出了產(chǎn)生可被用作本發(fā)明的可溶性多聚化劑的寡聚鏈霉親和素突變蛋白的示例性策略。圖24A示出了，在第一步中，使用在野生型鏈霉親和素序列位點(diǎn)第44至47位上包含氨基酸序列l(wèi)le⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:03)的鏈霉親和素突變蛋白“m2”(SAm2)用于產(chǎn)生具有“常規(guī)骨架”的寡聚鏈霉親和素突變蛋白。在第二步中，具有“大骨架”的寡聚可溶性鏈霉親和素突變蛋白可通過(guò)鏈霉親和素突變蛋白與生物素化的載體蛋白諸如人血清白蛋白(HSA)的偶聯(lián)或通過(guò)鏈霉親和素突變蛋白與合成載體諸如PEG的偶聯(lián)而產(chǎn)生。圖24B：人血清白蛋白(HSA)的生物素化。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增細(xì)胞群或用于誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖的方法、試劑盒和裝置。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞群”包括所有可通過(guò)細(xì)胞表面受體與向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑結(jié)合而擴(kuò)增的細(xì)胞。還可能的是，為了擴(kuò)增細(xì)胞群，可能需要第二試劑與第二細(xì)胞表面受體(輔助因子)結(jié)合以產(chǎn)生擴(kuò)增細(xì)胞所需的共刺激信號(hào)。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞群可以是淋巴細(xì)胞群，包括但不限于B細(xì)胞群、T細(xì)胞群或天然殺傷細(xì)胞群。細(xì)胞群的示例性實(shí)例是攜帶CD40或CD137的B細(xì)胞(這兩種細(xì)胞群僅結(jié)合提供激活信號(hào)的第一試劑配體就可以進(jìn)行增殖，例如4-1BB，或者αCD40抗體分子或者αCD137抗體分子(參見例如Zhang等人,2010,J Immunol,184:787-795))。可用于B細(xì)胞擴(kuò)增的試劑(第一或第二試劑)的其他示例性實(shí)例是與IgG、CD19、CD28或CD14，例如αCD19、αIgG、αCD28或αCD14抗體分子結(jié)合的試劑。還可設(shè)想，用于B細(xì)胞擴(kuò)增的第一或第二試劑可以包括toll樣受體或白細(xì)胞介素諸如IL-21的配體(參見例如Dienz O,等人 2009.J.Exp.Med.206:69)。應(yīng)當(dāng)注意的是，B細(xì)胞的脂多糖依賴性激活也包括在本發(fā)明中，因?yàn)橹嗵且部捎米鞯谝辉噭?，并且可用如文本所述的結(jié)合配偶體C1裝配。合適細(xì)胞群的其它示例性實(shí)例包括T細(xì)胞，其通過(guò)第一試劑與TCR/CD3的結(jié)合以及第二試劑與T細(xì)胞上的輔助分子諸如CD28的結(jié)合而被激活后擴(kuò)增。在這種情況下，第一試劑刺激T細(xì)胞中的TCR/CD3復(fù)合物相關(guān)信號(hào)，而第二試劑通過(guò)與作為輔助因子的CD28結(jié)合而提供次級(jí)刺激。可用于T細(xì)胞擴(kuò)增的試劑可包括白細(xì)胞介素，諸如IL-2、IL-7、IL-15或IL-21(參見例如Cornish等人 2006,Blood.108(2):600-8、Bazdar和Sieg,2007,Journal of Virology,2007,81(22):12670-12674、Battalia等人,2013,Immunology,139(1):109-120)?？捎糜赥細(xì)胞擴(kuò)增的試劑的其它示例性實(shí)例為與CD8、CD45或CD90，諸如αCD8、αCD45或αCD90抗體結(jié)合的試劑。T細(xì)胞群的示例性實(shí)例包括抗原特異性T細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞(記憶T細(xì)胞的一個(gè)示例性實(shí)例是CD62L⁺CD8⁺特異性中樞記憶T細(xì)胞)或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg的一個(gè)示例性實(shí)例是CD4⁺CD25⁺CD45RA+ Treg細(xì)胞)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“T細(xì)胞(群)”也可以包括含有嵌合抗原受體(CAR)的T細(xì)胞，嵌合抗原受體(CAR)又稱為人造T細(xì)胞受體或嵌合T細(xì)胞受體。因此，包含嵌合抗原受體的T細(xì)胞群也可以使用本發(fā)明的方法、試劑及設(shè)備進(jìn)行擴(kuò)增。這一點(diǎn)也可參見實(shí)施例15，其中，表達(dá)嵌合CD19特異性抗原受體(CAR)的JurkaT細(xì)胞通過(guò)使用本發(fā)明的可溶性多聚化劑而被刺激。合適細(xì)胞群的另一個(gè)示例性實(shí)例包括天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)，其例如可使用與CD16或CD56，諸如αCD16或αCD56抗體相結(jié)合的試劑進(jìn)行擴(kuò)增。這種αCD16抗體的示例性實(shí)例是具有SEQ ID NO:25中所列的VH序列和SEQ ID NO:26中所列的VL序列的抗體3G8(參見例如Hoshino等人,Blood.1991Dec 15；78(12):3232-40)。用于NK細(xì)胞擴(kuò)增的另一種試劑可以是IL-15(參見例如Vitale等人 2002.The Anatomical Record.266:87-92)。合適細(xì)胞群的又一個(gè)示例性實(shí)例包括單核細(xì)胞，其可以例如使用與CD14諸如αCD14抗體分子相結(jié)合的試劑進(jìn)行擴(kuò)增。細(xì)胞群可以是任意哺乳動(dòng)物來(lái)源，包括但不限于人、兔、豚鼠、松鼠、倉(cāng)鼠、貓、狗、狐猴、山羊、豬、馬、恒河猴，獼猴或黑猩猩。

因此，根據(jù)上文所述，本發(fā)明涉及在缺乏外源性生長(zhǎng)因子諸如淋巴因子和佐細(xì)胞的情況下選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞群諸如B細(xì)胞、T細(xì)胞或天然殺傷細(xì)胞的離體擴(kuò)增方法。此外，這些細(xì)胞諸如B細(xì)胞或T細(xì)胞的增殖可在不需要抗原的情況下進(jìn)行誘導(dǎo)，由此提供了具有多克隆反應(yīng)性的擴(kuò)增細(xì)胞群諸如T細(xì)胞群。本文公開的方法可以在延長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)提供選定T細(xì)胞群例如CD4+或CD8+ T細(xì)胞的持續(xù)擴(kuò)增，以產(chǎn)生這些細(xì)胞相對(duì)于初始T細(xì)胞群的數(shù)量的成倍增長(zhǎng)。一般而言，在如本文所述的淋巴細(xì)胞群的(克隆)擴(kuò)增的情況下，所有子代可以與被選定擴(kuò)增的細(xì)胞群共享相同的抗原特異性。

同樣，根據(jù)上文所述，本發(fā)明提供了用于抗原特異性T細(xì)胞群擴(kuò)增的方法。為了產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞群，T細(xì)胞與適當(dāng)形式的抗原相接觸以觸發(fā)T細(xì)胞中的初級(jí)激活信號(hào)，即抗原被呈遞到T細(xì)胞中以致于信號(hào)在T細(xì)胞中經(jīng)TCR/CD3復(fù)合物被觸發(fā)。例如，抗原可通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞與MHC分子一起被呈遞到T細(xì)胞?？乖蔬f細(xì)胞，諸如B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞或其它可以向T細(xì)胞呈遞抗原的細(xì)胞，可與T細(xì)胞在抗原(例如可溶性抗原)存在下進(jìn)行孵育，抗原這樣抗原呈遞細(xì)胞將呈遞至T細(xì)胞?？商娲兀磉_(dá)感興趣抗原的相關(guān)的細(xì)胞可與T細(xì)胞一起孵育。例如，表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的腫瘤細(xì)胞可與T細(xì)胞一起孵育以誘導(dǎo)腫瘤特異性應(yīng)答。類似地，被病原體例如病毒感染的、呈遞病原體抗原的細(xì)胞可與T細(xì)胞一起孵育。在T細(xì)胞群的抗原特異性激活之后，可依照本發(fā)明的方法擴(kuò)增細(xì)胞。例如，在抗原特異性建立以后，T細(xì)胞可根據(jù)本文所述的方法通過(guò)與抗CD3抗體(用作第一試劑)和抗CD28抗體(用作第二試劑)一起培養(yǎng)而進(jìn)行擴(kuò)增。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一試劑可以是MHC I:肽復(fù)合物，其可與抗原特異性T細(xì)胞群結(jié)合。在這樣一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用任何已知的且可與各自MHC I分子復(fù)合的抗原特異性肽。這一點(diǎn)可參見實(shí)施例11和12，其中例證了針對(duì)四種不同的抗原特異性細(xì)胞，從大量CD3+中樞記憶T細(xì)胞中選擇性抗原特異性擴(kuò)增Tcm應(yīng)答細(xì)胞?；蛘?，觸發(fā)細(xì)胞擴(kuò)增的受體的天然配體也可以用作第一試劑。這一點(diǎn)可參見實(shí)施例15，其中，CD19胞外域?qū)е陆?jīng)改造得以表達(dá)嵌合CD19結(jié)合抗原受體(CAR)的轉(zhuǎn)導(dǎo)Jurkat細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)激活。

細(xì)胞群樣品可以來(lái)自任何合適的來(lái)源，通?？梢允巧眢w組織或者體液諸如血液的全部樣品。在后一種情況中，樣品可以是例如外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononucleated cell，PBMC)群，其可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分離方法如血細(xì)胞的聚蔗糖梯度獲得。然而，待擴(kuò)增的細(xì)胞群也可以是純化的形式，并且可以使用如美國(guó)專利US 7,776,562、US 8,298,782、國(guó)際專利申請(qǐng)WO02/054065或國(guó)際專利申請(qǐng)WO2013/011011中所述的可逆細(xì)胞染色/分離技術(shù)進(jìn)行分離。或者，細(xì)胞群也可以通過(guò)細(xì)胞分選經(jīng)由負(fù)磁性免疫細(xì)胞粘連獲得，正如美國(guó)專利US 6,352,649 B1或歐洲專利EP 0 700 430 B1中所述的。如果本文所述的分離方法用于基礎(chǔ)研究，那么樣品可以是體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞。樣品通常被制備成流體的形式，例如溶液或分散液。

根據(jù)上文所述，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種擴(kuò)增細(xì)胞群的體外方法，其包括使含有細(xì)胞群的樣品與多聚化劑接觸。多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑，其中所述多聚化劑包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1用于第一試劑的可逆結(jié)合。第一試劑包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1可逆結(jié)合，其中所述第一試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點(diǎn)Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合。第一試劑與細(xì)胞表面的受體分子結(jié)合，由此向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)從而激活細(xì)胞。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種方法，其中所述多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、刺激細(xì)胞表面輔助分子的第二試劑。第二試劑包含結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z2可逆結(jié)合，其中所述第二試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點(diǎn)Z2之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合。第二試劑與細(xì)胞表面輔助分子結(jié)合，由此刺激已激活的細(xì)胞。在這個(gè)實(shí)施方式中，第一試劑可刺激T細(xì)胞中的TCR/CD3復(fù)合物相關(guān)信號(hào)，并且可以是特異性結(jié)合CD3的結(jié)合劑。在這個(gè)實(shí)施方式中，T細(xì)胞上的輔助分子可以是CD28，而與輔助分子結(jié)合的第二試劑是特異性結(jié)合CD28的結(jié)合劑。在這種情況下，特異性結(jié)合CD3的第一試劑可以選自抗CD3抗體、抗CD3抗體的二價(jià)抗體片段、抗CD3抗體的單價(jià)抗體片段和具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)CD3結(jié)合分子。此外，特異性結(jié)合CD28的第二試劑可以選自抗CD28抗體、抗CD28抗體的二價(jià)抗體片段、抗CD28抗體的單價(jià)抗體片段和具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)CD28結(jié)合分子。所述二價(jià)抗體片段可以是(Fab)₂’片段，或二價(jià)單鏈Fv片段，而單價(jià)抗體片段可以選自Fab片段、Fv片段和單鏈Fv片段(scFv)。具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)CD3或CD28結(jié)合分子可以是適體、基于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(lipocalin)家族多肽的突變蛋白、glubody、基于錨蛋白支架的蛋白、基于晶體支架的蛋白、adnectin和親和多聚體(avimer)。

一般而言，本發(fā)明使用的第一和第二試劑可以是例如抗體、抗體片段和具有抗體樣功能的蛋白質(zhì)結(jié)合分子。(重組)抗體片段的實(shí)例是Fab片段、Fv片段、單鏈Fv片段(scFv)、二價(jià)抗體片段諸如(Fab)2'片段、雙特異抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)(Iliades,P.,等人,FEBS Lett(1997)409,437-441)、十鏈抗體(decabody)(Stone,E.,等人,Journal of Immunological Methods(2007)318,88-94)以及其它結(jié)構(gòu)域抗體(Holt,L.J.,等人,.Trends Biotechnol.(2003),21,11,484-490)。在一些實(shí)施方式中，第一或第二試劑的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可以是二價(jià)蛋白質(zhì)人造結(jié)合分子，諸如也稱為“雙運(yùn)載蛋白(duocalin)”的二聚脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白。在一些實(shí)施方式中，受體結(jié)合劑可以具有單個(gè)第二結(jié)合位點(diǎn)，即它可以是單價(jià)的。單價(jià)第一或第二試劑的實(shí)例包括但不限于單價(jià)抗體片段、具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)結(jié)合分子或MHC分子。單價(jià)抗體片段的實(shí)例包括但不限于Fab片段、Fv和單鏈Fv片段(scFv)片段，包括二價(jià)單鏈Fv片段。

如上所述，具有抗體樣功能的蛋白質(zhì)結(jié)合分子的實(shí)例是基于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族多肽的突變蛋白(參見例如，WO 03/029462、Beste等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)96,1898-1903)。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，諸如膽汁三烯結(jié)合蛋白、人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、人載脂蛋白D或人淚液脂質(zhì)運(yùn)載蛋白具有的天然配體結(jié)合位點(diǎn)，其可被修飾以使它們與給定靶物結(jié)合?？捎米魈禺愋越Y(jié)合受體分子的受體結(jié)合劑的、具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)結(jié)合分子的其他實(shí)例是包括但不限于所謂的glubody(參見例如，國(guó)際專利申請(qǐng)WO 96/23879)、基于錨蛋白支架的蛋白(Mosavi,L.K.,等人,Protein Science(2004)13,6,1435-1448)或基于晶體支架的蛋白(例如，國(guó)際專利申請(qǐng)WO 01/04144)、如Skerra,J.Mol.Recognit.(2000)13,167-187中所述的蛋白、AdNectin、tetranectin和親和多聚體(avimer)。親和多聚體，包括由人類受體結(jié)構(gòu)域家族經(jīng)外顯子改組進(jìn)化而來(lái)的多價(jià)親和多聚體蛋白，包含作為若干細(xì)胞表面受體多域串出現(xiàn)的所謂A結(jié)構(gòu)域(Silverman,J.,等人,Nature Biotechnology(2005)23,1556-1561)。Adnectin，衍生自人纖連蛋白結(jié)構(gòu)域，包含三個(gè)可被工程化成用于免疫球蛋白樣結(jié)合至靶物的三個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)(loop)(Gill,D.S.&Damle,N.K.,Current Opinion in Biotechnology(2006)17,653-658)。Tetranectin，衍生自相應(yīng)的人同源三聚體蛋白，同樣在C型凝集素結(jié)構(gòu)域中包含可被工程化成用于所需結(jié)合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)域(出處同上)。可作為蛋白質(zhì)配體的類肽，是不同于多肽的寡聚(N-烷基)甘氨酸，其側(cè)鏈與酰胺氮連接而不是α碳原子。類肽通常對(duì)蛋白酶及其它修飾酶耐受，并且比多肽具有高得多的細(xì)胞滲透性(參見例如，Kwon,Y.-U.和Kodadek,T.,J.Am.Chem.Soc.(2007)129,1508-1509)。合適的蛋白質(zhì)結(jié)合分子的另外一些實(shí)例是EGF樣結(jié)構(gòu)域、三環(huán)結(jié)構(gòu)域(Kringle-domain)、I型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域、II型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域、III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域、PAN結(jié)構(gòu)域、G1a結(jié)構(gòu)域、SRCR結(jié)構(gòu)域、Kunitz/牛胰胰蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域、淀粉酶抑肽(tendamistat)、Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域、三葉型(P型)結(jié)構(gòu)域、C型血管假性血友病因子(von Willebrand factor)結(jié)構(gòu)域、過(guò)敏毒素樣結(jié)構(gòu)域、CUB結(jié)構(gòu)域、I型甲狀腺球蛋白重復(fù)、A型LDL受體結(jié)構(gòu)域、Sushi結(jié)構(gòu)域、Link結(jié)構(gòu)域、I型血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(例如，結(jié)構(gòu)域抗體或駱駝重鏈抗體)、C型凝集素結(jié)構(gòu)域、MAM結(jié)構(gòu)域、A型血管假性血友病因子結(jié)構(gòu)域、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素B結(jié)構(gòu)域、WAP型四二硫核心結(jié)構(gòu)域、C型F5/8結(jié)構(gòu)域、血液結(jié)合素結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域、層粘連蛋白型EGF樣結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域、“κ抗體(Kappabody)”(參見Ill.等人,Protein Eng(1997)10,949-57)、所謂的“微抗體(minibody)”(Martin等人,EMBO J(1994)13,5303-5309)、雙特異抗體(參見Holliger等人,PNAS USA(1993)90,6444-6448)、所謂的“Janusis”(參見Traunecker等人,EMBO J(1991)10,3655-3659,或者Traunecker等人,Int J Cancer(1992)Suppl 7,51-52)、納米抗體(nanobody)、微體(microbody)、affilin、親和體(affibody)、打結(jié)素(knottin)、泛素、鋅指蛋白、自體熒光蛋白或富亮氨酸重復(fù)蛋白。具有抗體樣功能的核酸分子的實(shí)例是適體。適體折疊成確定的三維基序，并顯示出對(duì)給定靶結(jié)構(gòu)的高親和性。

現(xiàn)在轉(zhuǎn)向多聚化劑，多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1和Z2可以是相同的(也可參見圖3的實(shí)施例3)。在這種情況下，可以使用單一的多聚化劑。

在使用可逆結(jié)合的第一試劑和任選第二試劑的實(shí)施方式中，多聚化劑可以固定在固體表面上。任何固體表面(載體)可用于固定多聚化劑?？晒潭ǘ嗑刍瘎┑墓腆w表面的示例性實(shí)例包括磁珠、聚合珠、細(xì)胞培養(yǎng)板、微量滴定板、膜或中空纖維。中空纖維例如用作購(gòu)自TerumoBCT Inc.(Lakewood,CO,USA)的細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)中的生物反應(yīng)器。多聚化劑通常與固體載體共價(jià)連接，但是如果需要，非共價(jià)相互作用也可用于固定化，例如固定于塑料基質(zhì)上。如下文更詳細(xì)的說(shuō)明，多聚化劑可以是例如與鏈霉親和素結(jié)合肽可逆結(jié)合的鏈霉親和素或親和素突變蛋白。這種鏈霉親和素突變蛋白可與任何表面共價(jià)連接，例如用于層析純化樹脂(珠)，并且可以從IBA GmbH,商業(yè)購(gòu)得這種形式，例如，Strep-瓊脂糖凝膠、Strep-大容量Strep-或Strep-易商業(yè)購(gòu)得的多聚化劑的其它示例性實(shí)例是固定化金屬離子親和層析(immobilized metal affinity chromatography,IMAC)樹脂，諸如樹脂(Westburg,Leusden,The Netherlands)，其一般可用于可逆固定寡聚組氨酸標(biāo)記的(his標(biāo)記的)蛋白，在這里意指，用于攜帶第一結(jié)合配偶體C1或第二結(jié)合配偶體C2的第一或第二試劑與低聚組氨酸標(biāo)記物諸如五組氨酸或六組氨酸標(biāo)記物的可逆結(jié)合。多聚化劑的其它實(shí)例是可購(gòu)于GE Life Sciences鈣調(diào)蛋白瓊脂糖凝膠，其可與含有鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽作為結(jié)合配偶體C1或C2或瓊脂糖凝膠的第一或第二試劑一起使用，并與谷胱甘肽偶聯(lián)。在這種情況下，結(jié)合配偶體C1或C2是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶。

在本發(fā)明方法的其它實(shí)施方式中，多聚化劑可以是可溶形式。原則上，可以使用與固定于固體載體上的多聚化劑相同的多聚化劑?？扇苄问降亩嗑刍瘎┛梢岳缡擎溍褂H和素突變蛋白寡聚物、鈣調(diào)蛋白寡聚物、提供至少兩個(gè)螯合基團(tuán)K的化合物(寡聚物)，其中所述至少兩個(gè)螯合基團(tuán)能夠與過(guò)渡金屬離子結(jié)合，由此使A部分能夠與寡聚組氨酸親和標(biāo)記物、多聚谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶或生物素化的載體蛋白結(jié)合。

如上所述，所述第一和第二試劑除具有能夠與各自細(xì)胞表面受體分子結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)以外，還具有結(jié)合配偶體C1或C2(為便于參考，以下將其稱為“結(jié)合配偶體C”)。此結(jié)合配偶體C能夠與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z結(jié)合(Z表示多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1或結(jié)合位點(diǎn)Z2)。包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體C和多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z之間形成的非共價(jià)鍵可以具有任何期望的強(qiáng)度和親和力，只要其在進(jìn)行本發(fā)明方法的條件下是可被破壞的或可逆的。包括在受體結(jié)合劑中的結(jié)合配偶體C和多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合力的解離常數(shù)(K_D)可以是在約10^-2M至約10^-13M的范圍內(nèi)的值。因此，這種可逆鍵K_D值可以例如為約10^-2M至約10^-13M、或約10^-3M至約10^-12M、或約10^-4M至約10^-11M、或約10^-5M至約10^-10M。這種鍵的K_D值以及受體結(jié)合劑的結(jié)合位點(diǎn)B和受體分子之間形成的鍵的K_D、k_off和k_on率可通過(guò)任何合適的手段確定，例如，通過(guò)熒光滴定、平衡透析或表面等離子體共振。所述受體分子結(jié)合劑可以包括至少一個(gè)，包括兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)第二結(jié)合配偶體C，所述親和試劑可以包括至少兩個(gè)，諸如三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)或更多個(gè)針對(duì)受體分子結(jié)合劑中包括的結(jié)合配偶體的結(jié)合位點(diǎn)。如美國(guó)專利US 7,776,562、US 8,298,782或國(guó)際專利申請(qǐng)WO 2002/054065中所述，可以選擇結(jié)合配偶體C和具有一個(gè)或更多相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)Z的親和試劑的任意組合，只要結(jié)合配偶體C和親和試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z能夠可逆地結(jié)合或多聚化成(多價(jià))復(fù)合物，這通常伴隨著親和力效應(yīng)。

包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體可以是寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖、寡糖或多糖。這樣的結(jié)合配偶體對(duì)多聚化劑結(jié)合位點(diǎn)的親和力比其它物質(zhì)高。各自結(jié)合配偶體的實(shí)例包括但不限于免疫球蛋白分子及其片段和具有抗體樣功能的蛋白質(zhì)結(jié)合分子。

在一些實(shí)施方式中，包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體C包括生物素，而親和試劑包括與生物素可逆結(jié)合的鏈霉親和素類似物或親和素類似物。

在一些實(shí)施方式中，包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體C包括與鏈霉親和素或親和素可逆結(jié)合的生物素類似物，而親和試劑包括包括與各自生物素類似物可逆結(jié)合的鏈霉親和素、親和素、鏈霉親和素類似物或親和素類似物。

在一些進(jìn)一步的實(shí)施方式中，包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體C包括鏈霉親和素或親和素結(jié)合肽，而親和試劑包括包括與各自鏈霉親和素或親和素結(jié)合肽可逆結(jié)合的鏈霉親和素、親和素、鏈霉親和素類似物或親和素類似物。

在一些實(shí)施方式中，包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體可以包括鏈霉親和素結(jié)合肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:01)，而親和試劑可以包括在野生型鏈霉親和素序列位點(diǎn)第44至47位上含有氨基酸序列Va1⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:02)的鏈霉親和素突變蛋白(類似物)，或者在野生型鏈霉親和素序列位點(diǎn)第44至47位上含有氨基酸序列l(wèi)le⁴⁴-Gly45-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:03)的鏈霉親和素突變蛋白(類似物)，兩者均如例如美國(guó)專利US 6,103,493中所述，并且以商標(biāo)名Strep-可商業(yè)購(gòu)得。鏈霉親和素結(jié)合肽可以例如是單一的肽，諸如如美國(guó)專利US 5,506,121中所述的“Strep標(biāo)記(Strep-)”，或者是具有兩個(gè)或多個(gè)獨(dú)立結(jié)合分子連續(xù)排布的鏈霉親和素結(jié)合肽，正如國(guó)際專利申請(qǐng)WO 02/077018或美國(guó)專利US 7,981,632中所述的。

在一些實(shí)施方式中，第一或第二試劑的結(jié)合配偶體C包括技術(shù)人員已知為親和標(biāo)記物的部分。在這樣的實(shí)施方式中，親和試劑包括已知能與親和標(biāo)記物結(jié)合的相應(yīng)結(jié)合配偶體，例如，抗體或抗體片段。作為已知親和標(biāo)記物的一些示例性實(shí)例，包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體可以包括寡聚組氨酸、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、甲殼質(zhì)結(jié)合蛋白(chitin binding protein,CBP)或硫氧還蛋白、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽(CBP)、FLAG’肽、HA標(biāo)記物(序列：Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala,(SEQ ID NO:11))、VSV-G標(biāo)記物(序列：Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys,(SEQ ID NO:12))、HSV標(biāo)記物(序列：Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp,(SEQ ID NO:13))、T7抗原表位(Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly,(SEQ ID NO:14))、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、序列為Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp(SEQ ID NO:13)的單純皰疹病毒糖蛋白D的HSV抗原表位、序列為Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu(SEQ ID NO:15)的轉(zhuǎn)錄因子c-myc的“myc”抗原表位、V5標(biāo)記物(序列：Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr,SEQ ID NO:16)，或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。在這樣的實(shí)施方式中，多聚化劑的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(在這種情況下，是抗體或抗體片段)與抗原形成的復(fù)合物可通過(guò)添加游離的抗原即游離肽(抗原表位標(biāo)記物)或游離的蛋白質(zhì)(諸如MBP或CBP)而被競(jìng)爭(zhēng)性破壞。親和標(biāo)記物也可以是寡核苷酸標(biāo)記物。這種寡核苷酸標(biāo)記物可例如用于與連接至或包括在親和試劑中的、具有互補(bǔ)序列的寡核苷酸雜交。

在一些實(shí)施方式中，包括在第一或第二試劑的結(jié)合配偶體C和多聚化劑的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合在二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)陽(yáng)離子存在時(shí)發(fā)生。在這一點(diǎn)上，在一些實(shí)施方式中，多聚化劑包含通常借助于合適的螯合劑容納(例如，與之復(fù)合)的二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)陽(yáng)離子。在這樣的實(shí)施方式中，包括在受體結(jié)合劑中的結(jié)合配偶體可以包括含有(例如，復(fù)合有)二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)陽(yáng)離子。各自金屬螯合劑的實(shí)例包括但不限于乙二胺、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、N,N-雙(羧甲基)甘氨酸(也稱為次氮基三乙酸，NTA)、或1,2-雙(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)。作為一個(gè)實(shí)例，EDTA與大多數(shù)一價(jià)、二價(jià)、三價(jià)和四價(jià)的金屬離子形成復(fù)合物，諸如，鈣(Ca²⁺)、錳(Mn²⁺)、銅(Cu²⁺)、鐵(Fe²⁺)、鈷(Co³⁺)和鋯(Zr⁴⁺)，而BAPTA對(duì)Ca²⁺有特異性。作為一個(gè)示例性實(shí)例，本領(lǐng)域使用的標(biāo)準(zhǔn)方法是使寡聚組氨酸標(biāo)記物與銅(Cu²⁺)、鎳(Ni²⁺)、鈷(Co²⁺)或鋅(Zn²⁺)之間形成復(fù)合物，這通過(guò)螯合劑次氮基三乙酸(NTA)實(shí)現(xiàn)。

在一些實(shí)施方式中，包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體C包括鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽，而親和試劑包括如美國(guó)專利US 5,985,658或者如本文參照例如圖2所述的多聚鈣調(diào)蛋白。在一些實(shí)施方式中，包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體C包括FLAG肽，而親和試劑包括與FLAG肽結(jié)合的抗體，例如，與如美國(guó)專利US 4,851,341中所述的單克隆抗體4E11結(jié)合的FLAG肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，包括在第一或第二試劑中結(jié)合配偶體C包括寡聚組氨酸標(biāo)記物，而親和試劑包括與寡聚組氨酸標(biāo)記物結(jié)合的抗體或過(guò)渡金屬離子。所有這些結(jié)合復(fù)合物的破壞可以通過(guò)金屬離子螯合作用完成，例如鈣螯合，例如通過(guò)添加EDTA或EGTA(同上所述)完成。鈣調(diào)蛋白、抗體諸如4E11或螯合金屬離子或游離螯合劑可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行多聚化，例如，第一步，通過(guò)與鏈霉親和素或親和素或其聚合物的生物素化和絡(luò)合作用或者通過(guò)將羧基殘基引入多糖例如葡聚糖，基本上如Noguchi,A,等人Bioconjugate Chemistry(1992)3,132-137中所述；第二步，使用常規(guī)碳二亞胺化學(xué)法，將鈣調(diào)蛋白或抗體或螯合金屬離子或游離螯合劑經(jīng)由伯氨基連接到多糖例如葡聚糖主鏈的羧基上。在這樣的實(shí)施方式中，包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體C與多聚化劑的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z之間的結(jié)合可通過(guò)金屬離子螯合作用而破壞。金屬螯合作用可例如通過(guò)添加EGTA或EDTA而完成。

在一些實(shí)施方式中，尤其是，如果多聚化劑是可溶形式的并且是基于鏈霉親和素或親和素的，那么它可以是鏈霉親和素或親和素的寡聚物或聚合物或者鏈霉親和素或親和素的任意突變蛋白(類似物)的寡聚物或聚合物。結(jié)合位點(diǎn)Z是親和素或鏈霉親和素的天然生物素結(jié)合。各自的寡聚物或聚合物可以通過(guò)多糖交聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方式中，在第一步中，通過(guò)將羧基殘基引入多糖例如葡聚糖中制備鏈霉親和素的寡聚物或聚合物、或親和素的寡聚物或聚合物、或鏈霉親和素類似物的寡聚物或聚合物、或親和素類似物的寡聚物或聚合物，基本上如Noguchi,A,等人,Bioconjugate Chemistry(1992)3,132-137中所述。然后在第二步中，使用常規(guī)碳二亞胺化學(xué)法，可將鏈霉親和素或親和素或其類似物可以經(jīng)由其內(nèi)部的賴氨酸殘基和/或游離N端的伯氨基連接到葡聚糖主鏈的羧基上。此外，鏈霉親和素或親和素的交聯(lián)寡聚物或聚合物、或者鏈霉親和素或親和素的任意突變蛋白(類似物)的交聯(lián)寡聚物或聚合物也可以經(jīng)由諸如戊二醛的雙官能分子作為接頭，通過(guò)交聯(lián)單獨(dú)的鏈霉親和素或親和素分子(本文中鏈霉親和素或親和素的四聚同源二聚物被稱為“單獨(dú)分子”或各自寡聚物或聚合物的最小結(jié)構(gòu)單元)，或者通過(guò)本領(lǐng)域的其它方法獲得。例如，通過(guò)第一步將硫醇基引入鏈霉親和素突變蛋白(這可例如通過(guò)鏈霉親和素突變蛋白和2-亞氨基噻吩(iminothiolane)(Trauts試劑)發(fā)生反應(yīng)而實(shí)現(xiàn))，并且在單獨(dú)的反應(yīng)中激活鏈霉親和素突變蛋白中可獲得的氨基，可以產(chǎn)生鏈霉親和素突變蛋白的寡聚物。氨基的激活可通過(guò)鏈霉親和素突變蛋白與市售異源雙功能交聯(lián)劑諸如磺基琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(磺基SMCC)或琥珀酰亞胺基-6-[(β-馬來(lái)酰亞胺丙酰氨基)己酸酯(SMPH)發(fā)生反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)。在第二步中，將如此獲得兩個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物混合在一起，導(dǎo)致包含在一批經(jīng)修飾的鏈霉親和素突變蛋白中的硫醇基與另一批經(jīng)修飾的鏈霉親和素突變蛋白中已激活的(通過(guò)馬來(lái)酰亞胺的功能)氨基發(fā)生反應(yīng)。通過(guò)這個(gè)反應(yīng)，鏈霉親和素突變蛋白的多聚物/寡聚物形成。這些寡聚物可以具有大于3的任何合適數(shù)目的“單獨(dú)分子”或“鏈霉親和素結(jié)構(gòu)單元”，并且寡聚反應(yīng)程度可根據(jù)反應(yīng)條件變化(參見圖24)。這兩批經(jīng)修飾的鏈霉親和素突變蛋白發(fā)生反應(yīng)后，寡聚可溶性多聚化劑通常通過(guò)體積排阻色譜法進(jìn)行分離，并且任何所期望的部分都可用作多聚化劑。通常，寡聚物不具有(且無(wú)需具有)單一的分子量，但它們通常遵循統(tǒng)計(jì)重量分布諸如高斯分布。任何具有多于三個(gè)鏈霉親和素同源四聚體(結(jié)構(gòu)單元；(n≥3))的寡聚物可用作可溶性多聚化劑。寡聚物可以具有例如3至25個(gè)鏈霉親和素突變蛋白同源四聚體。具有分子量為約50kDa的鏈霉親和素突變蛋白，諸如下文更詳細(xì)描述的突變蛋白“m1”或“m2”，這些可溶性寡聚物的分子量為約150kDa至約1250kDa。由于每個(gè)鏈霉親和素分子/突變蛋白具有四個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，因此這樣的多聚化劑提供12至100個(gè)如本文所述的結(jié)合位點(diǎn)Z1(和Z2)。

根據(jù)以上公開內(nèi)容，除了這種只包含交聯(lián)的鏈霉親和素同源四聚體的寡聚多聚化劑以外，可以使四聚鏈霉親和素突變蛋白與載體發(fā)生反應(yīng)而獲得本發(fā)明所用的多聚化劑。除了上述與多糖的反應(yīng)以外，也可以使用生理學(xué)上或藥學(xué)上可接受的蛋白質(zhì)諸如血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA))作為載體蛋白。在這種情況下，鏈霉親和素突變蛋白(無(wú)論是單個(gè)同源四聚體，還是n≥3的寡聚物形式)可與載體蛋白經(jīng)由非共價(jià)相互作用偶聯(lián)。為了這個(gè)目的，生物素化的BSA(其可購(gòu)自多個(gè)供應(yīng)商例如ThermoFisher Scientific、Sigma Aldrich或Vectorlabs，這里僅舉幾個(gè)例子)可與鏈霉親和素突變蛋白發(fā)生反應(yīng)。當(dāng)這樣做時(shí)，一些鏈霉親和素寡聚物將會(huì)經(jīng)由幾個(gè)或多個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)(Z1、Z2)與生物素化的載體蛋白非共價(jià)結(jié)合，留下大部分寡聚物結(jié)合位點(diǎn)(Z1、Z2)可用于結(jié)合諸如第一試劑和任選第二試劑以及任何如本文所述的另外的試劑。因此，通過(guò)這種方法，可方便地制備具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1的可溶性多聚化劑(參見圖24)。或者，鏈霉親和素突變蛋白(無(wú)論是單個(gè)同源四聚體，還是n≥3的寡聚物形式)可與合成載體諸如聚乙二醇(PEG)分子共價(jià)偶聯(lián)。任何適合的PEG分子均可用于此目的，只要這些PEG分子和各自的多聚化劑是可溶的。通常，分子量高達(dá)1000Da的PEG分子均可溶于水或本發(fā)明可用的培養(yǎng)基。這種基于PEG的多聚化劑通過(guò)使用市售已激活的PEG分子(例如，可購(gòu)自NOF North America Corporation,Irvine,California,USA的PEG-NHS衍生物，或可購(gòu)自Creative PEGWorks,Chapel Hills,North Carolina,USA的已激活的PEG衍生物)與鏈霉親和素突變蛋白中的氨基可以很容易制備。

在鏈霉親和素或野生型鏈霉親和素(wt-鏈霉親和素)中，Argarana等人,Nucleic Acids Res.14(1986)1871-1882中所公開的氨基酸序列被提及。鏈霉親和素突變蛋白是通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替換、缺失或添加而有別于野生型鏈霉親和素序列的多肽，但其保留了野生型鏈霉親和素的結(jié)合特性。鏈霉親和素樣多肽和鏈霉親和素突變蛋白是與野生型鏈霉親和素基本上免疫學(xué)等同的多肽，并且特別能夠以與野生型鏈霉親和素相同或不同的親和力結(jié)合生物素、生物素衍生物或生物素類似物。鏈霉親和素樣多肽或鏈霉親和素突變蛋白可以含有不是野生型鏈霉親和素一部分的氨基酸，或者其可僅包括野生型鏈霉親和素的一部分。鏈霉親和素樣多肽也可以是與野生型鏈霉親和素的多肽不完全相同的多肽，因?yàn)樗拗鞑痪哂袑⑺拗鳟a(chǎn)生的多肽轉(zhuǎn)化成野生型鏈霉親和素的結(jié)構(gòu)所需的酶。術(shù)語(yǔ)“鏈霉親和素”也包括鏈霉親和素四聚體和鏈霉親和素二聚體，特別是鏈霉親和素同源四聚體、鏈霉親和素同源二聚體、鏈霉親和素異源四聚體和鏈霉親和素異源二聚體。每個(gè)亞基通常具有生物素或生物素類似物的結(jié)合位點(diǎn)，或者鏈霉親和素結(jié)合肽的結(jié)合位點(diǎn)。鏈霉親和素或鏈霉親和素突變蛋白的實(shí)例在例如WO 86/02077、DE 19641876Al、US 6,022,951、WO 98/40396或WO 96/24606中有所提及。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，用作多聚化劑的鏈霉親和素突變蛋白是那些如美國(guó)專利US 6,103,493和德國(guó)專利DE 196 41 876.3中所述的鏈霉親和素突變蛋白?；谝吧玩溍褂H和素的氨基酸序列，這些鏈霉親和素突變蛋白在氨基酸位點(diǎn)第44至53位的區(qū)域內(nèi)具有至少一個(gè)突變。最小鏈霉親和素的突變蛋白是優(yōu)選的，其N端起始于野生型鏈霉親和素第10至16位氨基酸區(qū)域，C端終止于野生型鏈霉親和素第133至142位氨基酸區(qū)域。這樣的優(yōu)選鏈霉親和素突變蛋白的實(shí)例具有第44位的疏水性脂肪族氨基酸而非Glu、第45位的任意氨基酸、第46位的疏水性脂肪族氨基酸或/和第47位的堿性氨基酸而非Val。鏈霉親和素突變蛋白可以是在野生型鏈霉親和素序列位點(diǎn)第44至47位上包含氨基酸序列Va1⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:02)的突變蛋白，或者是在野生型鏈霉親和素序列位點(diǎn)第44至47位上包含氨基酸序列l(wèi)le⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:03)的鏈霉親和素突變蛋白(類似物)。這種突變蛋白在例如美國(guó)專利US 6,103,493中有所描述，并且可以從IBA GmbH以突變蛋白“m1”和突變蛋白“m2”的形式商業(yè)購(gòu)得，其商標(biāo)為Strep-

在一些實(shí)施例中，可以使用根據(jù)本發(fā)明的方法來(lái)排除先前用于細(xì)胞擴(kuò)增的試劑樣品。第一或第二試劑以及各自的游離配偶體(競(jìng)爭(zhēng)試劑)可以例如存在于上述擴(kuò)增方法的洗脫液中。使用本發(fā)明的方法，這樣的試劑可被至少基本上(包括完全地)從樣品(例如從細(xì)胞群)中去除。作為一個(gè)示例性實(shí)例，如上所定義的第一或第二試劑可從樣品中排除至低于例如FACS或Western Blot印跡法檢出限的水平。競(jìng)爭(zhēng)試劑(游離的第一或第二結(jié)合配偶體或其類似物)可用于終止并控制擴(kuò)增，將細(xì)胞群從多聚化劑中釋放出來(lái)。這種競(jìng)爭(zhēng)試劑可以具有能夠在WO 2013/124474中所述的“去除筒”中與親和試劑的結(jié)合位點(diǎn)Z特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)。在這個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的各方法也可用于排除第一和第二試劑以及競(jìng)爭(zhēng)試劑，包括去除它們。

根據(jù)本發(fā)明所述的方法可在細(xì)胞群生存力至少基本不受影響的任何溫度下進(jìn)行。當(dāng)在本文中提及至少基本上無(wú)害或無(wú)毒或至少基本上不影響生存力的條件時(shí)，是指這樣的條件，即在其中進(jìn)行擴(kuò)增的、具有完全生存力的細(xì)胞群百分比不低于至少70％，包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明所述的方法在約20℃或更高的溫度下進(jìn)行。根據(jù)待擴(kuò)增的細(xì)胞群，合適的溫度范圍可以例如是從約20℃至約45℃，包括從約25℃至約40℃，或從約32℃至37℃。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明所述的方法在恒定的溫度下進(jìn)行，或在選定的溫度值上±約5℃、±約4℃、±約3℃、±約2℃、±約1℃或±約0.5℃。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠根據(jù)經(jīng)驗(yàn)并考慮細(xì)胞特性和擴(kuò)增條件來(lái)確定合適的溫度。通常人類細(xì)胞是在例如37℃溫度下進(jìn)行擴(kuò)增。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種擴(kuò)增細(xì)胞群的體外方法，其包括使含有細(xì)胞群的樣品與多聚化劑接觸，其中所述多聚化劑是可溶形式的，并且具有固定(結(jié)合)于其上的、向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑。多聚化劑包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1用于結(jié)合第一試劑，其中所述第一試劑包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1結(jié)合。第一試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點(diǎn)Z1之間形成的鍵與多聚化劑相結(jié)合，并且第一試劑與細(xì)胞表面受體分子結(jié)合，由此向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)從而激活細(xì)胞。這里應(yīng)明確指出的是，當(dāng)使用可溶性多聚化劑時(shí)，結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點(diǎn)Z1之間的鍵無(wú)需是可逆的。

在第二種方法的一個(gè)實(shí)施方式中，多聚化劑具有固定(結(jié)合)于其上的、刺激細(xì)胞表面輔助分子的第二試劑，其中所述第二試劑包含結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z2結(jié)合。第二試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點(diǎn)Z2之間形成的鍵與多聚化劑相結(jié)合，其中所述第二試劑與細(xì)胞表面輔助分子結(jié)合，由此刺激已激活的細(xì)胞。

在第二種方法的一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點(diǎn)Z1之間形成的鍵可以是不可逆的和/或結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點(diǎn)Z2之間形成的鍵也可以是不可逆的。

在第二種方法的一個(gè)不同的實(shí)施方式中，結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點(diǎn)Z1之間形成的鍵可以是可逆的。結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點(diǎn)Z2之間形成的鍵也可以是可逆的。在這種情況下，所述結(jié)合位點(diǎn)Z1和所述結(jié)合配偶體C1之間的可逆結(jié)合和/或所述結(jié)合位點(diǎn)Z2和所述結(jié)合配偶體C2之間的可逆結(jié)合的解離常數(shù)(K_d)在10^-2M至10^-13M的范圍內(nèi)。

在基于可溶性多聚化劑的第二種方法中，第一和第二試劑、多聚化劑和所有其它試劑以及細(xì)胞群也可以以與上述利用第一或第二試劑和多聚化劑間可逆結(jié)合的方法相同的方式使用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于擴(kuò)增細(xì)胞群的試劑盒，所述試劑盒包括：

(i)多聚化劑，其中所述多聚化劑包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z用于第一試劑的可逆結(jié)合，

(ii)第一試劑，其與細(xì)胞表面受體分子結(jié)合，由此向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)從而激活細(xì)胞，其中所述第一試劑包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1可逆結(jié)合，其中所述第一試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點(diǎn)Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，和

(iii)第二試劑，其刺激細(xì)胞表面輔助分子，其中所述第二試劑包含結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z2可逆結(jié)合，其中所述第二試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點(diǎn)Z2之間形成的鍵與多聚化劑相結(jié)合，其中所述第二試劑與細(xì)胞表面輔助分子結(jié)合從而刺激已激活的細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增細(xì)胞群的試劑盒，所述試劑盒包括：

(i)多聚化劑，其中所述多聚化劑是可溶形式的并且包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z用于第一試劑的可逆結(jié)合，

(ii)第一試劑，其與細(xì)胞表面受體分子結(jié)合，由此向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)從而激活細(xì)胞，其中所述第一試劑包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1結(jié)合，其中所述第一試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點(diǎn)Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合。

這第二種試劑盒可以進(jìn)一步包括：(iii)第二試劑，其刺激細(xì)胞表面輔助分子，其中所述第二試劑包含結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z2結(jié)合，其中所述第二試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點(diǎn)Z2之間形成的鍵與多聚化劑相結(jié)合。

本文所公開的試劑盒特別地用于當(dāng)細(xì)胞群是淋巴細(xì)胞群時(shí)。

根據(jù)上文公開的內(nèi)容，本發(fā)明還提供了新型多聚化劑和包含能夠擴(kuò)增細(xì)胞群的多聚化劑的新型組合物。這種能夠擴(kuò)增細(xì)胞群的多聚化劑是可溶形式的，并且包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1用于可逆結(jié)合向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑，其中所述多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的所述向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑；其中所述第一試劑包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1可逆結(jié)合，其中所述第一試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點(diǎn)Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合。這里應(yīng)當(dāng)注意的是，這種多聚化劑可以具有固定于其上的本文所述的任何第一試劑。

本發(fā)明的多聚化劑可以進(jìn)一步包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z2用于可逆結(jié)合刺激細(xì)胞表面輔助分子的第二試劑，其中，所述多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、刺激細(xì)胞表面輔助分子的第二試劑，其中所述第二試劑包含結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠與多聚化劑的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z2結(jié)合。在這個(gè)實(shí)施方式中，第二試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點(diǎn)Z2之間形成的鍵與多聚化劑相結(jié)合。

同樣根據(jù)上方公開的內(nèi)容，這種多聚化劑能夠擴(kuò)增淋巴細(xì)胞群或包含在淋巴細(xì)胞群中的亞群。待擴(kuò)增的淋巴細(xì)胞群可以是任何合適的細(xì)胞群，例如，B細(xì)胞群、T細(xì)胞群或天然殺傷細(xì)胞群。T細(xì)胞群可以是抗原特異性T細(xì)胞群、輔助T細(xì)胞群、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群或天然殺傷T細(xì)胞群。因此，在這種多聚化劑的實(shí)施方式中，第一試劑能夠刺激T細(xì)胞中的TCR/CD3復(fù)合物相關(guān)信號(hào)。因此，多聚化劑中存在的第一試劑可以是與CD3特異性結(jié)合的結(jié)合劑，而與輔助分子結(jié)合的第二試劑可以是與CD28或CD137特異性結(jié)合的結(jié)合劑。

在多聚化劑的實(shí)施方式中，與CD3特異性結(jié)合的第一試劑可以是抗CD3抗體、抗CD3抗體的二價(jià)抗體片段、抗CD3抗體的單價(jià)抗體片段、和/或具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)CD3結(jié)合分子。在這些實(shí)施方式中，與CD28或CD137特異性結(jié)合的第二試劑可以是抗CD28抗體、抗CD28抗體的二價(jià)抗體片段、抗CD28抗體的單價(jià)抗體片段、具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)CD28結(jié)合分子、抗CD137抗體、抗CD137抗體的二價(jià)抗體片段、抗CD137抗體的單價(jià)抗體片段、具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)CD137結(jié)合分子、4-1BB配體及其任意混合物。因此，本發(fā)明的多聚化劑一般可具有固定于其上的一種第一試劑和一種第二試劑混合物，例如，抗CD3抗體作為第一試劑，以及例如，抗CD28抗體和4-1BB配體作為(聯(lián)合)第二試劑。

如果多聚化劑被用于擴(kuò)增B細(xì)胞，那么固定在多聚化劑上的第一試劑可以是與CD40或CD137特異性結(jié)合的結(jié)合劑。根據(jù)本文公開的內(nèi)容，在這樣的實(shí)施方式中，與CD40或CD137特異性結(jié)合的第一結(jié)合劑可選自抗CD40抗體、抗CD40抗體的二價(jià)抗體片段、抗CD40抗體的單價(jià)抗體片段和具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)CD40結(jié)合分子，或者抗CD137抗體、抗CD137抗體二價(jià)抗體片段、抗CD137抗體的單價(jià)抗體片段、具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)CD137結(jié)合分子和CD40配體(CD154)。

此外，根據(jù)本發(fā)明的大致公開內(nèi)容，在如本文所述的多聚化劑中，多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1和Z2可以是完全相同的。如上所述，這樣的多聚化劑可以包括鏈霉親和素的寡聚物或聚合物、親和素的寡聚物或聚合物、可逆結(jié)合生物素的鏈霉親和素類似物的寡聚物或聚合物、可逆結(jié)合生物素的親和素類似物的寡聚物或聚合物、含有至少兩個(gè)螯合基團(tuán)K的試劑，其中所述至少兩個(gè)螯合基團(tuán)能夠與過(guò)渡金屬離子結(jié)合，由此使所述試劑能夠與寡聚組氨酸親和標(biāo)記物、多聚谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、多聚鈣調(diào)蛋白和生物素化的載體蛋白結(jié)合。

本文提供了一種能夠擴(kuò)增細(xì)胞群的新型組合物，其可包括：

(i)第一多聚化劑，其中所述第一多聚化劑是可溶形式的，并且包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1用于向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑的可逆結(jié)合，其中所述第一多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的所述向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑，其中所述第一試劑包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1可逆結(jié)合，其中所述第一試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點(diǎn)Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，和

(ii)第二多聚化劑，其中所述第二多聚化劑是可溶形式的，并且包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z2用于對(duì)細(xì)胞表面輔助分子進(jìn)行刺激的第二試劑的可逆結(jié)合，其中所述多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的所述刺激細(xì)胞表面輔助分子的第二試劑，其中所述第二試劑包含結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠與多聚化劑的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z2結(jié)合，其中所述第二試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點(diǎn)Z2之間形成的鍵與多聚化劑相結(jié)合。

這樣的新型組合物是例如實(shí)施例13中使用的反應(yīng)混合物，其中兩種單獨(dú)的多聚化劑單獨(dú)用αCD3 Fab片段或單獨(dú)用αCD28 Fab片段功能化。關(guān)于這點(diǎn)應(yīng)注意的是，這樣的組合物在實(shí)施例13中顯示出具有與其上共同固定有第一試劑和第二試劑兩者的單一多聚化劑相同的擴(kuò)增效率。因此，聯(lián)合使用兩種或多種僅被一種試劑(例如，一種第一試劑或一種第二試劑)單獨(dú)功能化的多聚化劑與使用一種具有固定于其上的第一試劑和第二試劑兩者的聯(lián)合多聚化劑在用于擴(kuò)增上功能等同。關(guān)于這點(diǎn)，應(yīng)當(dāng)指出的是，本發(fā)明的多聚化劑可被多種意在用于擴(kuò)增選定細(xì)胞群的試劑(例如，一種、兩種、三種、四種或甚至更多種的試劑)所功能化。第三或第四試劑可以例如提供用于擴(kuò)增所期望細(xì)胞亞群的刺激。關(guān)于這點(diǎn)可參見例如實(shí)施例13，其中可溶性多聚化劑被三種試劑可逆地功能化，即αCD3 Fab片段作為第一試劑、αCD28 Fab片段作為第二試劑和αCD8 Fab片段作為第三試劑以富集在CD3+ T細(xì)胞群(淋巴細(xì)胞)樣品中的CD8+ T細(xì)胞亞群。通過(guò)使用這種全都可逆固定于同一個(gè)多聚化劑上的試劑組合，本發(fā)明允許存在從樣品例如含有多種不同細(xì)胞亞群的樣品中優(yōu)選擴(kuò)增或選擇性富集任何所期望的細(xì)胞(亞)群的可能性。然而關(guān)于這點(diǎn)應(yīng)當(dāng)注意的是，出于此目的也可以使用三種不同的多聚化劑，例如，僅被αCD3 Fab片段功能化的第一多聚化劑、被αCD28 Fab片段功能化的第二多聚化劑和被αCD8 Fab。同樣地，可以僅用兩種不同的多聚化劑，即僅被αCD3 Fab片段多功能化的第一多聚化劑和被αCD28 Fab片段和αCD8 Fab片段兩者功能化的第二多聚化劑。因此，本發(fā)明允許以模塊化的方式設(shè)計(jì)任何種類的想要的擴(kuò)增試劑。

本發(fā)明還提供了一種連續(xù)擴(kuò)增淋巴細(xì)胞群的體外方法，其中所述淋巴細(xì)胞群包括T細(xì)胞。這種方法包括：

使含有包含T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞群樣品與多聚化劑接觸，

其中，所述多聚化劑是可溶形式的，并且具有可逆固定于其上的(i)向T細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑和(ii)刺激T細(xì)胞表面輔助分子的第二試劑，

其中，所述多聚化劑包含至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z1用于第一試劑的可逆結(jié)合，

其中，所述第一試劑包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1可逆結(jié)合，其中所述第一試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點(diǎn)Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，

其中，所述多聚化劑包括至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Z2用于第二試劑的可逆結(jié)合，

其中，所述第二試劑包含至少一個(gè)結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z2可逆結(jié)合，其中所述第一試劑通過(guò)結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點(diǎn)Z2之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，

其中，所述第一試劑與T細(xì)胞表面的受體分子結(jié)合，由此向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)從而激活細(xì)胞T細(xì)胞，

其中，所述第二試劑與T細(xì)胞表面的輔助分子結(jié)合，從而刺激已激活的細(xì)胞，由此所述第一試劑和所述第二試劑一同誘導(dǎo)T細(xì)胞擴(kuò)增。

在這個(gè)方法中，使含有淋巴細(xì)胞群進(jìn)而包含T細(xì)胞的樣品與具有固定于其上的第一和第二試劑的可溶性多聚化劑接觸，導(dǎo)致T細(xì)胞與多聚化劑特異性結(jié)合。

含有包含T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞群樣品與多聚化劑的接觸可在生物反應(yīng)器中進(jìn)行，諸如中空纖維生物反應(yīng)器(例如，細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的中空纖維生物反應(yīng)器)或塑料袋生物反應(yīng)器(例如，來(lái)自GE Healthcare的Xuri細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)W25中使用的)。

這個(gè)方法進(jìn)一步包括使淋巴細(xì)胞群(含有經(jīng)由第一試劑和第二試劑與多聚化劑結(jié)合的T細(xì)胞的反應(yīng)混合物)與以下項(xiàng)接觸：(i)能夠破壞第一結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點(diǎn)Z1間鍵的游離第一結(jié)合配偶體C1或其類似物和(ii)能夠破壞第二結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點(diǎn)Z2間鍵的游離第二結(jié)合配偶體C2或其類似物。通過(guò)這樣做，所述第一試劑結(jié)合配偶體C1和所述結(jié)合位點(diǎn)Z1之間的可逆鍵以及所述第二試劑結(jié)合配偶體C2和所述多聚化劑結(jié)合位點(diǎn)Z2之間的可逆鍵被破壞，從而在洗脫液中釋放經(jīng)由第一試劑和第二試劑與多聚化劑結(jié)合的T細(xì)胞并停止T細(xì)胞的擴(kuò)增。

在這個(gè)方法中，含有擴(kuò)增T細(xì)胞群的洗脫液(反應(yīng)混合物，其中擴(kuò)增反應(yīng)已通過(guò)加入游離第一配偶體或其類似物被終止)可在合適的(第一)固定相上進(jìn)行層析。所述(第一)固定相可以是如國(guó)際專利申請(qǐng)WO 2013/124474中所述的凝膠過(guò)濾基質(zhì)和/或親和層析基質(zhì)。這種凝膠過(guò)濾和/或親和層析基質(zhì)包含親和試劑，其中所述親和試劑包含與第一試劑或第二試劑中所包含的結(jié)合配偶體C1和/或C2特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)Z1和/或Z2。通過(guò)這樣做，第一試劑、第二試劑、第一結(jié)合配偶體C1和/或游離第二結(jié)合配偶體C2被固定在固定相上。在這種方法中，所述第一固定相與生物反應(yīng)器流體式連接。

在這種連續(xù)擴(kuò)增的一個(gè)實(shí)施方式中，多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1和Z2是相同的。此外，可以使用單一的多聚化劑。當(dāng)使用可溶性多聚化劑時(shí)，T細(xì)胞群(或一般的擴(kuò)增T細(xì)胞群)從可溶性多聚化劑中分離。分離/除去可以利用第二固定相進(jìn)行。為此，在施加到上述第一固定相之前或之后，含有T細(xì)胞和可溶性多聚化劑的混合物在合適的固定相上進(jìn)行層析。這種第二固定相可以是凝膠過(guò)濾基質(zhì)和/或親和層析基質(zhì)，其中所述凝膠過(guò)濾和/或親和層析基質(zhì)包含親和試劑。包含在層析樹脂上的親和試劑包括與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1和/或結(jié)合位點(diǎn)Z2(如果存在的話)(特異性地)結(jié)合的結(jié)合配偶體D，從而將多聚化劑固定在固定相上。如果使用基于鏈霉親和素的多聚化劑并且第一和第二試劑兩者都具有鏈霉親和素結(jié)合肽作為結(jié)合配偶體C1或C2，那么這種第二固定相上的親和試劑中所包含的結(jié)合配偶體D可以是生物素。用作多聚化劑的鏈霉親和素的可溶性寡聚物或鏈霉親和素突變蛋白的可溶性寡聚物然后和通常與層析基質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)的生物素結(jié)合，諸如市售的生物素瓊脂糖凝膠(biotin-sepharose^TM)。

在這種連續(xù)擴(kuò)增的方法中，第一試劑可以刺激T細(xì)胞中的TCR/CD3復(fù)合物相關(guān)信號(hào)，并且第一試劑可以因此是與CD3特異性結(jié)合的結(jié)合劑。此外，T細(xì)胞上的輔助分子可以是CD28。在這種情況下，與輔助分子結(jié)合的第二試劑是與CD28特異性結(jié)合的結(jié)合劑。

在這種連續(xù)擴(kuò)增的方法中，T細(xì)胞可以在擴(kuò)增期間或者之后用例如T細(xì)胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR，也稱為人造T細(xì)胞受體)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。這種用于引入所需受體基因的轉(zhuǎn)染可以用例如任何合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行。經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞群然后從初始刺激物(例如，CD3/CD28刺激物)中釋放出來(lái)，隨后被第二類的刺激物刺激，例如通過(guò)重新引入的受體。這種第二類刺激物可以包括肽/MHC分子形式的抗原刺激物、經(jīng)遺傳引入的受體的同源(交聯(lián))配體(例如，CAR的天然配體)、或在新受體的框架內(nèi)直接結(jié)合(例如，通過(guò)識(shí)別受體內(nèi)的恒定區(qū))的任意配體(諸如抗體)。這方面參閱Cheadle等人的“Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66或者Barrett等人的Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol.65:333-347(2014).

在這種方法中，包含T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞群可以是外周血單核細(xì)胞(PBMC)群或經(jīng)富集或經(jīng)純化的T細(xì)胞群。淋巴細(xì)胞群可以例如源自全血、或源自非流動(dòng)的血液分離產(chǎn)品或冷凍組織制品。

在這種基于可溶性多聚化劑的連續(xù)擴(kuò)增方法中，第一和第二試劑、多聚化劑以及所有其它試劑和細(xì)胞群也可以以與上述利用第一或第二試劑和多聚化劑間可逆結(jié)合的方法相同的方式使用。

本發(fā)明進(jìn)一步指向一種包含生物反應(yīng)器和用于層析的第一固定相的排布。生物反應(yīng)器適用于細(xì)胞擴(kuò)增，所述固定相適用于細(xì)胞分離和去除試劑。第一固定相是凝膠過(guò)濾基質(zhì)和/或親和層析基質(zhì)，其中所述凝膠過(guò)濾和/或親和層析基質(zhì)包含親和試劑，其中所述親和試劑包含與第一試劑中所含的結(jié)合配偶體C1特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)Z1，和/或所述親和試劑包含與第二試劑中所含的結(jié)合配偶體C2特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)Z2。所述第一固定相由此適合于將第一試劑和/或第二試劑、第一結(jié)合配偶體C1和/或游離第二結(jié)合配偶體C2固定于其上。此外，生物反應(yīng)器和固定相是流體式連接的。這種排布可用于上述連續(xù)擴(kuò)增，并且可以整合到已知細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)中，諸如細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)或Xuri細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)W25。

在這種排布中，第一固定相被包括在層析柱中或是平面固定相。這種排布可以進(jìn)一步包括與第一固定相流體式連接的第二固定相。第二固定相可以是凝膠過(guò)濾基質(zhì)和/或親和層析基質(zhì)，其中所述凝膠過(guò)濾和/或親和層析基質(zhì)包含親和試劑。這種親和試劑可以包含與多聚化劑的結(jié)合位點(diǎn)Z1(特異性地)結(jié)合的結(jié)合配偶體D，由此適于將多聚化劑固定在固定相上。

本發(fā)明進(jìn)一步指向一種用于純化和擴(kuò)增細(xì)胞群的裝置，所述裝置包括至少一個(gè)如上所定義的包含生物反應(yīng)器和用于層析的第一固定相或第二固定相的排布。

所述裝置還可以進(jìn)一步包括流體式連續(xù)連接的多個(gè)包含生物反應(yīng)器的裝置和固定相的排布。

所述裝置可以包括樣品入口，其與包含生物反應(yīng)器和層析固定相的排布中的生物反應(yīng)器流體式連接。所述裝置還可以包括已純化擴(kuò)增的靶細(xì)胞的樣品出口，所述樣品出口與至少一個(gè)包含生物反應(yīng)器和層析固定相的排布中最后一個(gè)排布的固定相流體式連接。

最后，所述裝置可被設(shè)計(jì)成功能性封閉的系統(tǒng)。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員從本發(fā)明公開的內(nèi)容將容易理解，同樣可能根據(jù)本發(fā)明利用目前存在或之后開發(fā)的、與本文所述的相應(yīng)的示例性實(shí)施方式發(fā)揮基本相同功能或取得基本相同結(jié)果的物質(zhì)、手段、用途、方法或步驟的其他組合。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例

實(shí)施例1：用可逆固定于涂覆有鏈霉親和素突變蛋白Strep-磁珠上的αCD3/αCD28 Fab片段進(jìn)行的CD3+ T應(yīng)答細(xì)胞的刺激/擴(kuò)增。

用3μM CFSE對(duì)300.000個(gè)CD3+CD62L應(yīng)答T細(xì)胞(Tresp，通過(guò)連續(xù)磁富集從非流動(dòng)供體血液分離產(chǎn)品中分離得到)進(jìn)行標(biāo)記，并用 15μl磁珠制劑(10mg磁性微粒/ml，負(fù)載有35μg磁珠)中的5μl對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，其中所述磁珠制劑負(fù)載有單獨(dú)的0.5μgαCD3 Fab片段、單獨(dú)的0.5μgαCD28 Fab片段、或0.5μgαCD3 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab的混合物。

所用的αCD3 Fab片段來(lái)源于由雜交瘤細(xì)胞系OKT3產(chǎn)生的CD3結(jié)合單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞系OKT3和OKT3抗體在美國(guó)專利US 4,361,549中有所描述，細(xì)胞系以登錄號(hào)CRL-8001^TM保藏。所用的CD28 Fab來(lái)源于單克隆抗人CD28抗體CD28.3(Vanhove等人,BLOOD,15July 2003,Vol,102,No.2,pages 564-570)。這種抗體CD28.3可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列以合成單鏈Fv構(gòu)建抗人CD28抗體scFv28.3的形式保藏于基因庫(kù)中，登錄號(hào)AF451974.1。

如國(guó)際專利申請(qǐng)WO2013/011011和WO 2013/124474中所述，兩種Fab片段在E.coli中重組生產(chǎn)，其攜帶IgG1保守序列作為恒定結(jié)構(gòu)域(CH1和Cκ)。兩種Fab片段的重鏈在羧基端與兩個(gè)鏈霉親和素結(jié)合模塊(SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:07)，可以“雙Strep標(biāo)記(Twin-Strep-)”購(gòu)于IBA GmbH,Germany)的順序排列相融合。所述αCD3 Fab片段用作第一試劑，其具有用作結(jié)合配偶體C1的鏈霉親和素結(jié)合肽，而所述αCD28 Fab片段用作第二試劑，其具有用作結(jié)合配偶體C2的鏈霉親和素結(jié)合肽。所述(四聚)鏈霉親和素突變蛋白“Strep-”作為其上可逆固定有兩種Fab片段多聚化劑。

在擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，以用空白磁珠(無(wú)Fab)刺激的Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照。將Tresp細(xì)胞連同300.000個(gè)CD3自飼養(yǎng)細(xì)胞(經(jīng)30Gy輻照)一起一式三份接種到48孔板上3ml添加有10U/ml白細(xì)胞介素2(IL-2)的完全細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI(Gibco)，添加有10％(v/v)胎牛血清、L-谷氨酰胺、b-巰基乙醇、HEPES、青霉素、鏈霉素和慶大霉素)中。細(xì)胞在37°下孵育，不更換培養(yǎng)基，并在4天后通過(guò)FACS分析法進(jìn)行分析。用100μM D-生物素孵育10分鐘后進(jìn)行FACS染色和分析。每種情況的代表曲線在圖4中示出。曲線示出了活的CD3+細(xì)胞，其中CD3+細(xì)胞用碘化丙啶(PI)染色以區(qū)分活/死。圖4A是示出了被刺激細(xì)胞大小分布(前向散射)的直方圖。圖4A示出了，當(dāng)在其上固定有0.5μgαCD3 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab混合物的磁珠存在下進(jìn)行孵育，并在體外被可逆固定于涂覆有鏈霉親和素突變蛋白Strep-的磁珠上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激后，Tresp細(xì)胞的特定細(xì)胞群被刺激和擴(kuò)增(與未經(jīng)刺激的“僅磁珠”對(duì)照相比較，其大小/數(shù)量增加)。圖4B示出了代表?yè)?jù)每次細(xì)胞分裂的細(xì)胞數(shù)(如于圖4B頂部所標(biāo)識(shí)，0代表未分裂的細(xì)胞；5代表經(jīng)歷了至少5次分裂的細(xì)胞)所示增殖程度的增殖染料CFSE稀釋度直方圖。從圖4B可以看出，被其上固定有0.5μgαCD3 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab混合物的磁珠所刺激的T細(xì)胞群大多經(jīng)歷了三次細(xì)胞分裂，并表現(xiàn)出比單獨(dú)的單一刺激更為均勻的增殖模式(未分裂的峰“0”內(nèi)細(xì)胞數(shù)較少)。增加的增殖絕對(duì)數(shù)(更多的細(xì)胞在用αCD3和αCD28功能化的磁珠刺激4天均勻增殖)也可以通過(guò)更多的培養(yǎng)基消耗示出，如圖4C所示，指示劑顏色變?yōu)辄S色。

實(shí)施例2：對(duì)Jurkat細(xì)胞中不同的細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員的分析

在此檢測(cè)了用αCD3抗體克隆OKT3或與Strep-多聚化的OKT3的Fab片段標(biāo)記的Jurkat細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)的不同的細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員的實(shí)時(shí)流式細(xì)胞分析(low-cytometric analysis)。

為此，Jurkat細(xì)胞負(fù)載有鈣敏染料Indo-1-AM，通過(guò)注射αCD3單克隆抗體OKT3(由雜交瘤細(xì)胞系OKT3產(chǎn)生，見上文，黑色正方形)或αCD3Fab片段(源自親本細(xì)胞系OKT3)觸發(fā)鈣釋放，其中，αCD3 Fab片段通過(guò)其鏈霉親和素結(jié)合肽與熒光綴合有藻紅蛋白的可溶性Strep-Tactin的可逆結(jié)合而多聚化。在完整的多聚OKT3 Fab-Strep-Tactin復(fù)合物的情況下，鈣釋放觸發(fā)持續(xù)一段與親本抗體克隆(深灰色三角形)相同的時(shí)間。細(xì)胞的激活可以通過(guò)注射經(jīng)的D-生物素處理的、預(yù)解離的Fab-Strep-Tactin復(fù)合物(淺灰色圓形)而完全避免，等同于注射PBS陰性對(duì)照(白色倒三角形)。應(yīng)用離子霉素作為鈣內(nèi)流的陽(yáng)性對(duì)照?；贔L6/FL7比率的變化，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺濃度的時(shí)間解析的變化進(jìn)行監(jiān)控。從圖5A中可以看出，親本抗體OKT3以及OKT3的多聚單價(jià)Fab片段兩者均影響鈣釋放，這意味著OKT3的多聚單價(jià)Fab片段基本上具有與親本抗體相同的功能。值得注意的是，如果在加入Streptactin-OKT3 Fab片段之前，將生物素添加到固定有OKT3 Fab片段的Strep-tactin中，那么多聚OKT3 Fab片段無(wú)法觸發(fā)鈣釋放。在這種情況下，生物素破壞了作為多聚化劑的Strep-tactin和OKT3 Fab片段之間形成的可逆鍵。因此單價(jià)Fab片段從多聚化劑上被置換出來(lái)，并且解離后其不能再通過(guò)與Jurkat細(xì)胞的CD3結(jié)合而觸發(fā)鈣釋放。

在圖5B所示的實(shí)驗(yàn)中，indo-1-AM標(biāo)記的Jurkat細(xì)胞被源自O(shè)KT3的αCD3 Fab-Strep-Tactin復(fù)合物所激活，如圖5A中所示。注射完整的(上圖)或預(yù)解離的復(fù)合物(下圖)分別作為陽(yáng)性或陰性對(duì)照。此外，用完整的Fab-Strep-Tactin復(fù)合物刺激細(xì)胞后接著注射D-生物素(在t＝140s近激活峰處)，導(dǎo)致αCD3 Fab多聚體信號(hào)傳導(dǎo)的突然中斷(中圖)。將離子霉素注射入預(yù)解離的Fab復(fù)合物群作為陽(yáng)性對(duì)照。數(shù)據(jù)代表三不同的實(shí)驗(yàn)。重要的是，圖5B示出了加入樣品中的D-生物素迅速將Fab片段從Strep-tactin多聚化劑中置換出來(lái)，從而有效地終止鈣釋放，即便是在正在進(jìn)行的鈣刺激下，并且證明了解離的OKT3 Fab片段不再具有生物學(xué)活性。同樣地，在將Streptactin-OKT3 Fab樣品加入Jurkat細(xì)胞之前，將生物素添加到Strep-tactin-OKT3 Fab片段多聚體中，多聚OKT3 Fab片段也無(wú)法觸發(fā)鈣釋放。

實(shí)施例3：經(jīng)CD3 Fab多聚體進(jìn)行的細(xì)胞可逆染色

本實(shí)施例檢測(cè)了經(jīng)CD3 Fab多聚體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行的可逆染色。新鮮分離的PBMC用αCD3單克隆抗體克隆OKT3(左側(cè)散點(diǎn)圖，F(xiàn)ab多聚體的親本克隆)或同源藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的OKT3 Fab多聚體進(jìn)行染色，并在D-生物素處理之前(左二列)或之后(中間列)進(jìn)行分析。在后續(xù)的清洗步驟后，使用新鮮PE標(biāo)記的Strep-(右二列)檢測(cè)剩余的Fab單體。對(duì)經(jīng)可逆染色的細(xì)胞進(jìn)行二次Fab多聚體染色作為對(duì)照(右列)。只有在用于區(qū)分活/死的碘化丙啶(propidium iodide PI)染色中為陰性的活CD3細(xì)胞在圖6中示出。散點(diǎn)圖中的數(shù)字表示柵極內(nèi)的細(xì)胞百分比。這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，用與多聚化劑Streptactin多聚化的抗CD3 Fab片段對(duì)CD3+ PBMC進(jìn)行的染色通過(guò)加入D-生物素完全可逆，并且單獨(dú)的單價(jià)Fab片段無(wú)法與存在于PBMC上的CD3分子結(jié)合。

實(shí)施例4：通過(guò)CD28 Fab多聚體進(jìn)行的細(xì)胞可逆分離

本實(shí)施例示出了通過(guò)與Strep-磁性顆粒(磁性微粒購(gòu)自IBA GmbHGermany)多聚化的抗CD28 Fab片段的可逆結(jié)合進(jìn)行細(xì)胞分離。為此目的，使用了來(lái)源于上文實(shí)施例1所述的抗體CD28.3的Fab片段。通過(guò)Fab多聚體磁性細(xì)胞選擇法將CD28+細(xì)胞從新鮮分離的PMBC中選擇/分離出來(lái)，基本上正如國(guó)際專利申請(qǐng)WO2013/011011中所述。在選擇之前，用同源熒光αCD28多聚體(左側(cè)散點(diǎn)圖)或用直接抗免疫球蛋白κ輕鏈的抗體(左二散點(diǎn)圖，α-IgκmAb)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行對(duì)照染色作為染色對(duì)照。在選擇之后，細(xì)胞用D-生物素處理，隨后清洗去除磁珠和Fab單體。被釋放CD28+細(xì)胞隨后用CD28 Fab多聚體(右二散點(diǎn)圖)或用α-IgκmAb(右側(cè)散點(diǎn)圖)(重新)進(jìn)行染色，以檢測(cè)可能殘余的Fab單體。只有活的(PI^陰性)CD3+細(xì)胞被顯示出來(lái)。散點(diǎn)圖中的數(shù)字表示柵極內(nèi)的細(xì)胞百分比。圖7表明使用這種多聚抗CD28 Fab片段可以將CD28+細(xì)胞能夠從PMBC中分離出來(lái)，并且所有分離試劑包括抗CD28 Fab單體可以在選擇后被去除。

實(shí)施例5：用可逆固定于可溶性Strep-tactin上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激/擴(kuò)增CD3+ T應(yīng)答細(xì)胞

在本實(shí)施例中，CD3+ T應(yīng)答細(xì)胞(通過(guò)磁性選擇法從由聚蔗糖梯度得到的新鮮PBMC樣品中分離的)在體外被可逆固定于充當(dāng)可溶性多聚化劑的可溶性寡聚Strep-上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激后擴(kuò)增。寡聚Strep-是根據(jù)制造商(Thermo Scientific)的方法流程，通過(guò)使Strep-與磺基SMCC(磺基琥珀酰亞胺基4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯，產(chǎn)品#22122，Thermo Scientific)與亞氨基噻吩(iminothiolane)(產(chǎn)品#26101，Thermo Scientific)聚合而獲得的。寡聚鏈霉親和素可通過(guò)體積排阻色譜法與單體(未反應(yīng)的)和二聚鏈霉親和素突變蛋白分離，并將如此得到的寡聚鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)部分用作可溶性多聚化劑。

為了體外擴(kuò)增，300.000個(gè)CD3+應(yīng)答T細(xì)胞(Tresp)用2μM羥基熒光素琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)標(biāo)記，并用不同量的可溶性Strep-寡聚物制劑進(jìn)行刺激，所述可溶性Strep-寡聚物制劑上固定有上述αCD3OKT3 Fab片段和抗體28.3的αCD28 Fab片段(兩者在重鏈上都攜帶上述作為鏈霉親和素結(jié)合肽的雙Strep標(biāo)記(Twin-Strep-))的組合(“1x”對(duì)應(yīng)于被0.5μgαCD3-和0.5μgαCD28單體Fab片段功能化的3μg多聚化Streptactin，數(shù)字“0.5x”、“2x”和“5x”表示分別為“1x”的n倍量)。剩余的未被刺激的Tresp細(xì)胞或用空白Strep-tactin多聚體(無(wú)Fab)刺激的Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照。將Tresp細(xì)胞連同300.000個(gè)CD3陰性自飼養(yǎng)細(xì)胞(經(jīng)30Gy輻照)一式兩份接種到48孔板上1ml添加有20U/ml IL-2的細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃下孵育，不更換培養(yǎng)基，并在5天后通過(guò)FACS分析法按照CFSE稀釋度來(lái)對(duì)增殖情況進(jìn)行分析。圖8A示出了在5天后與陰性對(duì)照相比培養(yǎng)物中增殖細(xì)胞的大小分布增加。圖8B示出了當(dāng)與其上固定有αCD3 Fab和αCD28 Fab片段混合物的可溶性寡聚Strep-(與圖4中的固體Streptactin磁性顆粒相比)一起孵育時(shí)，CD3+Tresp細(xì)胞被適當(dāng)?shù)卮碳げ≡鲋?。圖8A和圖8B的結(jié)果表明，在這些體外條件下，大多數(shù)CD3+ T應(yīng)答細(xì)胞在表面CD28和TCR/CD3復(fù)合物與可逆固定于可溶性Strep-寡聚物上的αCD3和αCD28 Fab片段結(jié)合之后進(jìn)行分裂(2至5次細(xì)胞分裂)。在體外擴(kuò)增后，可溶性Fab-Strep-Tactin刺激試劑在D-生物素處理后被解離并去除。通過(guò)用藻紅蛋白標(biāo)記的Strep-(ST-PE)對(duì)細(xì)胞重新染色而對(duì)單體Fab片段的解離和去除進(jìn)行流式細(xì)胞分析。與適當(dāng)?shù)膬H用ST-PE標(biāo)記的陰性對(duì)照(淺灰色直方圖)相比，代表性的直方圖(深灰色直方圖)被示出。從圖8C中可以看出，兩種Fab片段都已經(jīng)完全地解離并已從擴(kuò)增的細(xì)胞中完全去除。圖8D示出了5天后活(臺(tái)盼藍(lán)陰性)細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)。該絕對(duì)數(shù)通過(guò)使用Neubauer計(jì)數(shù)室計(jì)數(shù)得到，并按各自的刺激條件繪圖。中位細(xì)胞數(shù)在圖8D中示出；誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。圖8D表明，所有固定于可溶性Strep-tactin多聚化劑上的αCD3 Fab片段和αCD28 Fab片段的混合物在擴(kuò)增CD3+細(xì)胞上同樣有效，并導(dǎo)致絕對(duì)細(xì)胞數(shù)的約4倍增長(zhǎng)。

實(shí)施例6：在體外被可逆的aCD3/aCD28 Fab-Streptamer多聚體刺激的純化CD4+和CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞增殖(不更換培養(yǎng)基)的動(dòng)力學(xué)

本實(shí)施例中檢測(cè)了在體外被可逆固定于可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激的純化CD4+和CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞(Tresp)增殖的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)。為此，兩種不同大小的可溶性寡聚Strep-突變蛋白被用作可溶性多聚化劑。第一種寡聚Strep-是在實(shí)施例5中獲得的寡聚鏈霉親和素突變蛋白的一部分(n≥3)(也被稱為“常規(guī)骨架”，如圖13中尖端朝下的三角形符號(hào)所示)。用作可溶性多聚化劑第二種寡聚鏈霉親和素突變蛋白是與生物素化的人血清白蛋白反應(yīng)的寡聚鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)(也被稱為“大骨架”)。

在本實(shí)施例中，分別用如上所述的這兩種不同的Streptamer多聚體，即實(shí)施例5所述的Streptactin骨架(使用濃度為1mg寡聚鏈霉親和素突變蛋白/ml的溶液)或大Streptactin骨架(0.1mg/ml)刺激500.000個(gè)純化的CD4+或CD8+應(yīng)答T細(xì)胞(Tresp)。3μl兩種不同的骨架都負(fù)載有前述實(shí)施例中使用的0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab的組合，其在Fab片段重鏈的C端攜帶鏈霉親和素結(jié)合肽SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:07)。此外，4.5μl常規(guī)Streptactin骨架負(fù)載有0.5μgαCD3 Fab片段、0.5μgαCD8 Fab片段(IBA GmbH在其Fab片段的C端也攜帶有鏈霉親和素結(jié)合肽SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:07))和0.5μgαCD28 Fab片段。未經(jīng)處理的(未刺激的)Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照，經(jīng)市售Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28單克隆抗體的磁珠)刺激的Tresp細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。將Tresp細(xì)胞一式兩份接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI 1640(Gibco)，添加有10％(v/v)胎牛血清、0.025％(w/v)L-谷氨酰胺、0.025％(w/v)L-精氨酸、0.1％(w/v)HEPES、0.001％(w/v)慶大霉素、0.002％(w/v)鏈霉素、0.002％(w/v)青霉素)中。細(xì)胞在37℃下孵育，不更換培養(yǎng)基，并在1、3和6天后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。在圖13的實(shí)驗(yàn)中，擴(kuò)增在不更換培養(yǎng)基的情況下進(jìn)行。CD4+ T應(yīng)答細(xì)胞的結(jié)果在圖13A中示出，CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞的結(jié)果在圖13B中示出，其中曲線圖代表?yè)?jù)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集的CD4+ Tresp(圖13A)和CD8+ Tresp(圖13B)的細(xì)胞數(shù)所示的增殖程度。

從圖13A中可以看出，所述其上可逆固定有αCD3和αCD28 Fab片段的“較小”可溶性多聚化劑提供了與Dynabeads(其是目前為止用于擴(kuò)增T細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)試劑)相同量的CD4+ T細(xì)胞的擴(kuò)增，而所述“較大”寡聚可溶性Streptactin提供了與Dynabeads相比甚至更好的擴(kuò)增。這種改善可能是由以下導(dǎo)致的：可溶性“較大寡聚多聚化劑”能夠同時(shí)結(jié)合比“較小”可溶性寡聚物更多的T細(xì)胞，由此能夠比“較小”寡聚物刺激更多的CD4+ T細(xì)胞。

從圖13B中可以明顯看出，使用本發(fā)明的可溶性多聚化劑，CD8+ T細(xì)胞可以在最初的3天內(nèi)至少與Dynabeads一樣有效地?cái)U(kuò)增。值得注意的是，在這個(gè)時(shí)間段中，使用了除αCD3和αCD28 Fab片段(作為第一和第二試劑)以外還攜帶可逆固定于其上的αCD8 Fab片段的可溶性多聚化劑的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)在這些培養(yǎng)條件下顯示出了最佳的擴(kuò)增程度。這表明有可能通過(guò)使用對(duì)特定亞細(xì)胞群具有特異性的刺激物(這里是αCD8 Fab片段)來(lái)提高或調(diào)整擴(kuò)增的選擇性，從而能獲得大量所需的(亞)細(xì)胞群。

因此，綜上所述，實(shí)施例6表明本發(fā)明所用的可溶性多聚化劑的功能就觸發(fā)T細(xì)胞擴(kuò)增而言，與用于此目的的、使用Dynabeads的現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法相當(dāng)。然而，由于可通過(guò)加入競(jìng)爭(zhēng)劑控制(并且終止，如果需要)刺激，諸如在第一和第二試劑與多聚化劑之間基于鏈霉親和素的可逆相互作用的情況下加入生物素，因此本發(fā)明提供了顯著優(yōu)于Dynabeads技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)閿U(kuò)增條件可進(jìn)行優(yōu)化(例如可以在3天后停止圖13B實(shí)驗(yàn)中的刺激)。此外，由于可溶性多聚化劑可以很容易地從反應(yīng)中去除(例如，在擴(kuò)增反應(yīng)后，通過(guò)將試劑固定在生物素化的柱子上)，本發(fā)明的擴(kuò)增方法可在封閉系統(tǒng)中實(shí)施并自動(dòng)化，而不必處理磁珠諸如Dynabeads的去除問(wèn)題，該封閉系統(tǒng)例如是用于治療目的的細(xì)胞的GMP生產(chǎn)所需的。

實(shí)施例7：在體外被可逆的aCD3/aCD28 Fab-Streptamer多聚體刺激的純化CD4+和CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞增殖(更換培養(yǎng)基)的動(dòng)力學(xué)

本實(shí)施例中也檢測(cè)了在體外被可逆固定于可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激的純化CD4+和CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞(Tresp)增殖的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)。為此，兩種不同大小的可溶性寡聚Strep-突變蛋白被用作可溶性多聚化劑。第一種寡聚Strep-是在實(shí)施例5中獲得的寡聚鏈霉親和素突變蛋白的一部分(n≥3)(也被稱為“常規(guī)骨架”，如圖13中以尖端朝下的三角形符號(hào)所示)。被用作可溶性多聚化劑的第二種寡聚鏈霉親和素突變蛋白通過(guò)使實(shí)施例5中獲得的寡聚Strep-tactin(n≥3)與生物素化的人血清白蛋白發(fā)生反應(yīng)而獲得。這種可溶性寡聚多聚化劑也被稱為“大骨架”。

在本實(shí)施例中，分別用如上所述的這兩種不同的Streptamer多聚體，即用實(shí)施例5所述的Streptactin骨架(1.0mg/ml)或用大Streptactin骨架(0.1mg/ml)刺激400.000個(gè)純化的CD4+或CD8+應(yīng)答T細(xì)胞(Tresp)。3μl兩種不同的骨架都負(fù)載有如上所述的0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab片段的組合。此外，4.5μl實(shí)施例5所述的Streptactin骨架負(fù)載有0.5μgαCD3 Fab片段、0.5μgαCD8 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab片段，如上文所述。未經(jīng)處理的(未刺激的)Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照，用Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28單克隆抗體)刺激的Tresp細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。將Tresp細(xì)胞一式兩份接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃下孵育，在第3天更換培養(yǎng)基，并在1、3和6天后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。CD4+ T應(yīng)答細(xì)胞的結(jié)果在圖14A中示出，CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞的結(jié)果在圖14B中示出，其中曲線圖代表了據(jù)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集的CD4+ Tresp(圖14A)和CD8+ Tresp(圖14B)的細(xì)胞數(shù)所示的增殖程度。

從圖14A中可以看出，本發(fā)明的其上可逆固定有αCD3和αCD28 Fab片段的可溶性多聚化劑提供了比Dynabeads更好的CD4+ T細(xì)胞的擴(kuò)增。

從圖14B中可以明顯看出，使用本發(fā)明的可溶性多聚化劑，CD8+ T細(xì)胞可以在最初6天內(nèi)至少與Dynabeads一樣有效地?cái)U(kuò)增。值得注意的是，在這個(gè)時(shí)間段中，使用攜帶有αCD3和αCD28 Fab片段(作為第一和第二試劑)的較大可溶性多聚化劑的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)在這些培養(yǎng)條件下顯現(xiàn)出了最佳的擴(kuò)增程度。這可能也是由以下導(dǎo)致的：可溶性“較大寡聚多聚化劑”能夠同時(shí)結(jié)合比“較小”可溶性寡聚物更多的T細(xì)胞，由此能夠比“較小”寡聚物刺激更多的CD4+ T細(xì)胞。

實(shí)施例8：更換或不更換培養(yǎng)基情況下純化CD4+和CD8+ T細(xì)胞培養(yǎng)物的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)

在本實(shí)施例中，將實(shí)施例6和實(shí)施例7中關(guān)于“較小”可溶性多聚化劑以及陽(yáng)性和陰性對(duì)照的的綜合數(shù)據(jù)用輸入的細(xì)胞數(shù)歸一化。并未獲取關(guān)于“較大”多聚化劑的歸一化數(shù)據(jù)。如實(shí)施例6和實(shí)施例7中所釋，400.000至500.000個(gè)CD4+或CD8+應(yīng)答T細(xì)胞(Tresp)被3μl的Streptactin多聚體制劑(1mg/ml；其上固定有0.5μgαCD3 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab片段)刺激。未經(jīng)處理的(未刺激的)Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照，經(jīng)Dynabeads刺激的Tresp細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。將Tresp細(xì)胞一式兩份接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的細(xì)胞培養(yǎng)基中。Tresp細(xì)胞被一式兩份接種在48孔板中1ml補(bǔ)充以30U/ml IL-2的細(xì)胞培養(yǎng)基上。細(xì)胞在37℃下孵育，在第3天更換培養(yǎng)基(圖15中的直線)或不更換培養(yǎng)基(圖15中的虛線)，并在1、3和6天后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。從圖15A的歸一化數(shù)據(jù)可以看出，可逆固定有αCD3和αCD28 Fab片段的“較小”可溶性多聚化劑產(chǎn)生了約2.5倍的CD4+T細(xì)胞擴(kuò)增，而使用Dynabeads的擴(kuò)增產(chǎn)生了約1.8倍的擴(kuò)增率。因此，使用本發(fā)明的可溶性多聚化劑甚至還提供了在CD4+ T細(xì)胞擴(kuò)增方面超過(guò)Dynabeads的改善。類似地，圖15B確認(rèn)了通過(guò)使用本發(fā)明的可溶性多聚化劑，CD8+ T細(xì)胞可以在最初3天內(nèi)至少與使用Dynabeads一樣有效地?cái)U(kuò)增。

實(shí)施例9：在體外被可逆的aCD3/aCD28 Fab Streptamer多聚體刺激的純化CD4+和CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞激活后的早期群簇形成

在本實(shí)施例中，用3μl負(fù)載有0.5μgαCD3-和0.5μgαCD28 Fab組合的寡聚Streptactin多聚化劑制劑(1mg/ml)刺激400.000個(gè)CD4+或CD8+應(yīng)答T細(xì)胞(Tresp)。未經(jīng)處理的(未刺激的)Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照，經(jīng)Dynabeads刺激的Tresp細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。將Tresp細(xì)胞一式兩份接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃下孵育并在1天和2天后通過(guò)顯微鏡進(jìn)行分析。CD4+ Tresp(圖16A)和CD8+ Tresp(圖16B)針對(duì)Dynabeads(中間一行)和Streptamer多聚體(下邊一行)的刺激被分別示出。照片表示群簇形成的程度：為了更好的可視性，在圖16A和圖16B中用圓圈標(biāo)出了經(jīng)可溶性鏈霉親和素突變蛋白寡聚物刺激的示例性群簇。Dynabeads刺激中的群簇經(jīng)深色刺激顆粒的積聚變得明顯易見。顯然，對(duì)于CD4+和CD8+ T細(xì)胞兩者而言，當(dāng)使用本發(fā)明的采用可溶性寡聚多聚化劑的擴(kuò)增方法時(shí)，早期群簇形成。

實(shí)施例10：多克隆刺激/擴(kuò)增的大量CD3+中樞記憶T細(xì)胞(Tcm)的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)和表型

在本實(shí)施例中，用3μl負(fù)載有0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab組合的如實(shí)施例5所述的可溶性寡聚Streptactin的制劑(1mg/ml)刺激500.000個(gè)CD3+CD62L+CD45RA應(yīng)答Tcm細(xì)胞(Tresp)。此外，使用4.5μl負(fù)載有0.5μgαCD3、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab的Streptactin多聚體制劑作為額外的刺激條件。未經(jīng)處理的(未刺激的)Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照，經(jīng)Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28單克隆抗體)刺激的Tresp細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。將Tresp細(xì)胞一式兩份接種到48孔板上1ml僅添加有30U/ml IL-2或添加有30U/ml IL-2和5ng/ml IL-15的細(xì)胞培養(yǎng)基上。細(xì)胞在37℃下孵育，每3天更換一次培養(yǎng)基，并在7天和14天后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。曲線圖代表了據(jù)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收獲的細(xì)胞數(shù)所示的擴(kuò)增程度，圖17A中為僅添加有IL-2的培養(yǎng)基，圖17B中為添加有IL-2和IL-15的培養(yǎng)基。在圖17A和圖17B兩圖中可以看出，具有可逆結(jié)合于其上的CD3 Fab片段和αCD28 Fab片段的可溶性多聚化劑產(chǎn)生了比Dynabeads更好的細(xì)胞擴(kuò)增。如圖17C中對(duì)在可變細(xì)胞因子環(huán)境中培養(yǎng)14天后的CD62L和CD127表面表達(dá)水平進(jìn)行的流式細(xì)胞分析進(jìn)一步所示，使用本發(fā)明的可溶性多聚化劑的實(shí)驗(yàn)方法，在此選擇的兩種條件下，保持著比使用Dynabeads的擴(kuò)增更高含量的CD127表達(dá)型長(zhǎng)期存活的記憶T細(xì)胞。這闡明了本發(fā)明方法的又一個(gè)優(yōu)勢(shì)。

實(shí)施例11：從大量CD3+中樞記憶T細(xì)胞中對(duì)Tcm應(yīng)答細(xì)胞進(jìn)行的選擇性抗原特異性擴(kuò)增(動(dòng)力學(xué)和表型)

本實(shí)施例中檢測(cè)了從純化的CD3+CD62L+CD45RA-Tcm應(yīng)答細(xì)胞中進(jìn)行的選擇性抗原特異性(Ag特異性)擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)和表型。

更詳細(xì)地，在體外用肽:MHC分子復(fù)合物(作為向細(xì)胞提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑)和αCD28 Fab片段(作為刺激細(xì)胞表面輔助分子的第二試劑)兩者刺激CD3+CD62L+CD45RA-Tcm應(yīng)答細(xì)胞?？乖禺愋噪呐cMHC分子的復(fù)合物和αCD28 Fab片段兩者均被可逆地固定在實(shí)施例5所述的可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)上。用于抗原特異性擴(kuò)增的肽為肽CRVLCCYVL(SEQ ID NO:06)，即刻早期蛋白1的第309-317位氨基酸(如Ameres等人,PLOS Pathogens,May 2013,vol.9,issue 5,e1003383所述)，其呈現(xiàn)對(duì)巨細(xì)胞病毒(CMV)具有特異性的HLA-C7/IE-1抗原表位。呈遞所述肽的MHC I分子在α鏈(重鏈)的C端攜帶鏈霉親和素結(jié)合肽(SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK,(SEQ ID NO:07),可以“雙Strep標(biāo)記(Twin-Strep-)”購(gòu)于IBA GmbH,Germany)。

為此，使用3μl被0.5μg配有鏈霉親和素結(jié)合肽的肽:MHC I類復(fù)合物和0.5μg上述αCD28 Fab所功能化的可溶性寡聚Streptactin多聚化劑制劑對(duì)500.000個(gè)CD3+CD62L+CD45RA應(yīng)答Tcm細(xì)胞(Tresp)進(jìn)行Ag特異性刺激。作為替代，4.5μl Streptactin多聚化劑制劑負(fù)載有0.5μg這些肽:MHC I類復(fù)合物、0.5μg CD8αFab和0.5μgαCD28 Fab。為了比較，使用3μl負(fù)載有0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab組合的Streptactin多聚化劑制劑(1mg/ml)進(jìn)行多克隆刺激。同樣作為上述刺激條件的替代，使用4.5μl可逆負(fù)載有0.5μgαCD3 Fab、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab的Streptactin多聚化劑制劑。未經(jīng)處理的(未刺激的)Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照，經(jīng)Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28單克隆抗體的磁珠)多克隆刺激的Tresp細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。將Tresp細(xì)胞接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2和5ng/ml IL-15的細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃下孵育，每3天更換一次培養(yǎng)基，并在7天和14天后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。對(duì)經(jīng)可溶性strept-tactin寡聚物刺激/擴(kuò)增的Ag特異性細(xì)胞的一部分進(jìn)行示例性流式細(xì)胞分析(圖18A)，其中所述可溶性strept-tactin寡聚物上固定有含HLA-C7/IE-1抗原表位(針對(duì)CMV)的肽:MHC-I復(fù)合物，表明這些抗原特異性T細(xì)胞被特異性擴(kuò)增。圖18B至圖18E的曲線圖(其代表?yè)?jù)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收獲的肽:MHCI多聚體陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)所示的不同Ag特異性的擴(kuò)增程度，類似于圖18A中所示的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn))表明，使用相應(yīng)Ag特異性肽和MHC I分子復(fù)合物的多聚化劑提供了最多數(shù)目的擴(kuò)增細(xì)胞(范圍從對(duì)于識(shí)別被HLA-A2402限制的CMV的pp65抗原表位(第341-350位氨基酸(QYDPVAALF,(SEQ ID NO:08))的Ag特異性細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的20倍增長(zhǎng)(參見圖18B)到識(shí)別CMV的HLA-B7/IE-1_309-317抗原表位(CRVLCCYVL(SEQ ID NO:06))的Ag特異性細(xì)胞數(shù)的98倍增長(zhǎng)(參見圖18E))，由此表明本發(fā)明的擴(kuò)增方法完全適用于Ag特異性細(xì)胞的擴(kuò)增。最后，圖18F中示出了HLA-B7/Hexon5抗原表位(針對(duì)腺病毒)培養(yǎng)14天后對(duì)CD62L和CD127表面表達(dá)水平進(jìn)行的示例性流式細(xì)胞分析，其進(jìn)一步確認(rèn)了使用本發(fā)明可溶性多聚化劑的實(shí)驗(yàn)方法，在多克隆且Ag特異性刺激的條件下，保持了更高含量的CD127表達(dá)型長(zhǎng)期存活的記憶T細(xì)胞。

實(shí)施例12：大量中樞記憶T細(xì)胞的選擇性Ag特異性擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)和表型

本實(shí)施例檢測(cè)了從使用可逆固定于可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白上的、作為第一和第二試劑的a)抗原特異性肽MHC I復(fù)合物和b)αCD28 Fab片段體外刺激的純化CD3+CD62L+CD45RA-Tcm應(yīng)答細(xì)胞中的選擇性Ag抗原特異性擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)。

為此，使用3μl被0.5μg配有鏈霉親和素結(jié)合肽(該特異性肽代表被HLA-B07限制的腺病毒Hexon 5蛋白的第 114-124位氨基酸(CPYSGTAYNSL,SEQ ID NO:10))的肽:MHC I類復(fù)合物和0.5μgαCD28 Fab所功能化的Streptactin多聚化劑制劑對(duì)500.000個(gè)CD3+CD62L+CD45RA應(yīng)答Tcm細(xì)胞(Tresp)進(jìn)行Ag特異性刺激。作為替代，4.5μl Streptactin多聚化劑制劑負(fù)載有0.5μg這種肽:MHC I類復(fù)合物、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab。為了比較，使用3μl負(fù)載有0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab組合的Streptactin多聚化劑制劑(1mg/ml)進(jìn)行多克隆刺激。同樣作為上述刺激條件的替代，使用4.5μl負(fù)載有0.5μgαCD3 Fab、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab的Streptactin多聚化劑制劑。未經(jīng)處理的(未刺激的)Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照，經(jīng)Dynabeads多克隆刺激的Tresp細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。將Tresp細(xì)胞接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2和5ng/ml IL-15的細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃下孵育，每3天更換一次培養(yǎng)基經(jīng)歷，并在7天和14天后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。圖19中示出的照片代表了在第5天時(shí)群簇形成的程度，示出了示例性的針對(duì)腺病毒的HLA-B7/Hexon 5抗原表位的Ag特異性刺激。從圖19中可以看出，這樣的腺病毒抗原特異性細(xì)胞可從最初的CD3+CD62L+CD45RA-Tcm應(yīng)答細(xì)胞群中被特異性地?cái)U(kuò)增出來(lái)。

實(shí)施例13：擴(kuò)增的CD8+ T細(xì)胞的產(chǎn)量和表型——可溶性多聚化劑的大小變化和用于刺激的αCD8-Fab的加入

本實(shí)施例檢測(cè)了在體外被可逆固定于可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白上αCD3/αCD28 Fab片段刺激的純化CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞的擴(kuò)增。此外，本實(shí)施例還檢測(cè)了多聚化劑中添加αCD8-Fab對(duì)提高CD8+ T細(xì)胞擴(kuò)增特異性的影響。

為此，分別使用兩種不同的基于Streptactin的多聚化劑，即實(shí)施例5所述的小寡聚Streptactin多聚化劑(1mg/ml)或上述較大Streptactin寡聚物(0.1mg/ml)刺激300.000個(gè)純化的CD8+應(yīng)答T細(xì)胞(Tresp)。3μl的兩種不同的多聚化劑(骨架)均負(fù)載有上述0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab片段組合。此外，4.5μl較小Streptactin多聚化劑(骨架)負(fù)載有上述的0.5μgαCD3、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab片段。此外，使用3μl僅被0.5μgαCD3 Fab片段單獨(dú)功能化或0.5μgαCD28 Fab片段單獨(dú)功能化的“較小”Streptactin多聚化劑(骨架)。未經(jīng)刺激的Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照，經(jīng)Dynabeads刺激的Tresp作為陽(yáng)性對(duì)照。將Tresp細(xì)胞一式兩份接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃下孵育，每3天更換一次培養(yǎng)基，并在6天后進(jìn)行分析。圖20A示出了據(jù)第6天收獲的細(xì)胞數(shù)所示的增殖程度，其中所述細(xì)胞數(shù)與陰性對(duì)照相比較，并以陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行歸一化。圖20A示出了使用本發(fā)明的可溶性多聚化劑的CD8+ T細(xì)胞擴(kuò)增比使用Dynabeads擴(kuò)增產(chǎn)生了更高產(chǎn)量的CD8+ T細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)后CD8表面表達(dá)水平(圖20B)和CD45RO表面表達(dá)水平(圖20C)的FACS分析表明，本發(fā)明的多聚化劑或Dynabeads擴(kuò)增了相同表型的CD8+T細(xì)胞(使用單因素ANOVA分析對(duì)不同的刺激條件進(jìn)行比較，并未檢測(cè)到顯著性差異(n.s.))。與使用Dynabeads相比，使用本發(fā)明擴(kuò)增方法的CD8+細(xì)胞產(chǎn)量的提高可能是由于可溶性多聚化劑比固定在Dynabeads上的抗體可以更好地接近其位于細(xì)胞表面的靶受體。當(dāng)從初始樣品中擴(kuò)增稀少的細(xì)胞群時(shí)，這種產(chǎn)量提高會(huì)變得十分有利。

此外，將使用其上聯(lián)合固定有0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab片段兩者的多聚化劑所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)量(圖20B中的左二列)與使用兩種僅被αCD3 Fab片段單獨(dú)功能化或αCD28 Fab片段單獨(dú)功能化的多聚化劑所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)量(圖20B中左三列)進(jìn)行比較，可以看出兩個(gè)實(shí)驗(yàn)具有相同的擴(kuò)增效率。因此，這些實(shí)驗(yàn)表明使用一種其上聯(lián)合固定有第一試劑和第二試劑兩者的多聚化劑在用于擴(kuò)增的功能上等同于使用兩種分別僅負(fù)載有第一試劑或第二試劑的單獨(dú)多聚化劑。

實(shí)施例14：擴(kuò)增的CD8+ T細(xì)胞的產(chǎn)量和表型——其上固定有不同比例的αCD3-和αCD28 Fab片段的單獨(dú)可溶性多聚化劑的滴定

本實(shí)施例中檢測(cè)了在體外被片段以不同量可逆固定于可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激的擴(kuò)增CD8+ T應(yīng)答細(xì)胞(Tresp)的產(chǎn)量和表型。

為此，使用不同量的被αCD3 Fab單獨(dú)功能化或αCD28 Fab單獨(dú)功能化的“小”寡聚Streptactin多聚化劑制劑(1mg/ml)的混合物(“1x”對(duì)應(yīng)于被0.5μgαCD3單獨(dú)功能化的1.5μg Streptactin多聚化劑和被0.5μgαCD28 Fab片段單獨(dú)功能化的1.5μg多聚化Streptactin)、或3μl負(fù)載有0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab的Streptactin多聚化劑制劑、或4.5μl負(fù)載有0.5μgαCD3、0.5μg strep-標(biāo)記的αCD8和0.5μgαCD28 Fab的Streptactin多聚化劑制劑對(duì)300.000個(gè)CD8+應(yīng)答T細(xì)胞(Tresp)進(jìn)行刺激。未經(jīng)處理的Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照，經(jīng)Dynabeads刺激的Tresp作為陽(yáng)性對(duì)照。將Tresp細(xì)胞接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃下孵育，不更換培養(yǎng)基，并在5天后進(jìn)行分析。圖21A示出了據(jù)第6天收獲的細(xì)胞數(shù)所示的增殖程度，其中，所述細(xì)胞數(shù)與與陰性對(duì)照相比較，并以陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行歸一化。圖21A表明使用本發(fā)明的不同可溶性多聚化劑的CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增比使用Dynabeads的擴(kuò)增產(chǎn)生了更高產(chǎn)量的CD8+T細(xì)胞(特別是5x條件中的累計(jì)試劑總量導(dǎo)致細(xì)胞的最佳擴(kuò)增，特別是隨著時(shí)間的推移，或者隨著由開始細(xì)胞分裂引起的細(xì)胞總數(shù)的增加)。在細(xì)胞培養(yǎng)后CD8表面表達(dá)水平(圖21B)和CD45RO表面表達(dá)水平(圖21C)的FACS分析表明，本發(fā)明的不同多聚化劑或市售Dynabeads擴(kuò)增了相同表型的CD8+ T細(xì)胞。

實(shí)施例15：Streptamer多聚體刺激aCD19-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞后胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活

本實(shí)施例檢測(cè)了轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活，所述Jurkat細(xì)胞被修飾以表達(dá)腫瘤特異性嵌合抗原受體(CAR)即這里的CD19，并使用作為可溶性多聚化劑的如實(shí)施例5所述的寡聚Strep-進(jìn)行刺激。

為此，用以下試劑對(duì)300.000個(gè)JurkaT應(yīng)答細(xì)胞(Jresp)進(jìn)行刺激：(A)不同量的被本文所述的αCD3 Fab和αCD28 Fab片段功能化的Streptactin多聚化劑制劑(1mg/ml)的混合物(“x1”對(duì)應(yīng)于被0.5μgαCD3-和0.5μgαCD28 Fab功能化的3μg Streptactin多聚化劑——這提供了“基于Streptactin的多克隆多聚化劑”)，或(B)3μl被0.5μg(x1)或1μg(x2)CD19胞外域(ECD)功能化的Streptactin多聚化劑制劑(CD19胞外域是αCD19-CAR的天然配體——這提供了“基于Streptactin的CAR特異性多聚化劑”)，或3μl負(fù)載有0.5μg(x1)或1μg(x2)αIgG的Streptactin多聚化劑制劑(αIgG識(shí)別αCD19-CAR中的IgG4間隔區(qū)——這也提供了“基于鏈霉親和素突變蛋白的CAR特異性多聚化劑)。裝配有六組氨酸標(biāo)記物的CD19的ECD從Sino Biological/Life technologies(SEQ ID NO:27)獲得，并通過(guò)將CD19的ECD與銜接分子His-STREPPER(IBA GmbH,Germany,訂單編號(hào)2-0920-005)按分子比率1:1混合并于室溫下孵育15分鐘而被功能化成可與基于鏈霉親和素的多聚化劑結(jié)合。該His-STREPPER銜接分子含有與六組氨酸標(biāo)記物結(jié)合的螯合部分和鏈霉親和素結(jié)合肽，從而臨時(shí)性提供靶分子，在此CD19的ECD具有可與基于鏈霉親和素突變蛋白的多聚化劑可逆結(jié)合的鏈霉親和素結(jié)合肽。用Dynabeads(具有不可逆固定于其上的αCD3-和αCD28-單克隆抗體的磁珠)或用PMA和離子霉素刺激的Jresp作為陽(yáng)性對(duì)照。將Jresp細(xì)胞接種到1.5ml Eppendorf離心管的200μl添加有30U/ml IL-2的細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃下孵育，并在刺激0至20分鐘后置于冰上進(jìn)行裂解。檢測(cè)到磷酸化的ERK表明MAPK信號(hào)傳導(dǎo)活躍，對(duì)管家β-肌動(dòng)蛋白的染色表明在每種條件下和在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)上樣的總蛋白量相同。圖22A示出了Jurkat細(xì)胞經(jīng)“多克隆Streptactin多聚化劑”的激活情況，圖22B示出了Jurkat細(xì)胞經(jīng)兩種“基于Streptactin的CAR特異性多聚化劑”的激活情況，從圖22A和圖22B的比較中可以看出，Jurkat細(xì)胞可以通過(guò)CD19胞外域與CD19特異性嵌合抗原受體結(jié)合而被激活/擴(kuò)增。由于對(duì)T細(xì)胞的基因下游加工幾乎僅僅在預(yù)先選定的細(xì)胞群中進(jìn)行，因此，所引入的CAR經(jīng)IgG4間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域(在各種具有不同特異性的CAR內(nèi)是保守的)發(fā)生交聯(lián)引起的一般性激活拓寬了可逆細(xì)胞刺激/擴(kuò)增在這些體外細(xì)胞處理情況下的適用性。

因此，這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，原則上任何通過(guò)向細(xì)胞群提供初級(jí)激活信號(hào)的試劑(配體)的結(jié)合而被激活的細(xì)胞群都可以使用如本文所述的可逆固定在多聚化劑上的第一試劑進(jìn)行擴(kuò)增。

實(shí)施例16：加入αCD8-Fab刺激擴(kuò)增的CD3+ T細(xì)胞的產(chǎn)量和亞群組成

本實(shí)驗(yàn)示出了純化的CD3⁺ T應(yīng)答細(xì)胞在體外經(jīng)可逆固定于實(shí)施例5所述作為可溶性多聚化劑的可溶性寡聚Strep-上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激的擴(kuò)增情況。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，除了αCD3/αCD28 Fab片段以外，從IBA GmbH,Germany購(gòu)得的αCD8 Fab片段(目錄編號(hào)6-8000-203)可被固定在鏈霉親和素突變蛋白的可溶性寡聚物上，以檢測(cè)是否可能在體外用可逆的αCD3/αCD28 Fab-Streptamer多聚體優(yōu)先刺激特定的T細(xì)胞亞群。更詳細(xì)地，用3μl負(fù)載有0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab組合的寡聚鏈霉親和素制劑(1mg/ml)對(duì)500.000個(gè)純化的CD3⁺應(yīng)答T細(xì)胞(Tresp)進(jìn)行刺激。作為一種替代的方法，4.5μl Streptactin寡聚物負(fù)載有0.5μgαCD3、0.5μg strep-標(biāo)記的αCD8 Fab和0.5μg strep-標(biāo)記的αCD28 Fab。未經(jīng)刺激的Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照，經(jīng)Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28單克隆抗體的磁珠)刺激的Tresp細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。從圖23A中可以看出，可逆負(fù)載有αCD3 Fab片段、αCD28 Fab片段以及還有αCD8 Fab片段的多聚化劑提供了最高數(shù)量的擴(kuò)增CD3+ T細(xì)胞。擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)為1.1x10⁶的產(chǎn)量比使用市售Dynabeads對(duì)這些T細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增高約30％。此外更重要的是，如圖23B所示，與使用Dynabeads或本發(fā)明的如本文所述僅攜帶αCD3 Fab片段和αCD28 Fab作為第一和第二試劑的可溶性多聚化劑進(jìn)行的兩種擴(kuò)增相比，使用攜帶αCD3 Fab片段、αCD28 Fab片段和αCD8 Fab片段的多聚化劑的CD8+ T細(xì)胞量是最高的。因此，本實(shí)驗(yàn)還表明了本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于除了向所期望的細(xì)胞群提供初級(jí)激活信號(hào)的第一試劑以及可選地提供共刺激信號(hào)的第二試劑以外，另一種用于特異性激活所期望細(xì)胞群的試劑也可以固定在多聚化劑上。因此，通過(guò)這樣做，本發(fā)明提供了從例如包含各種不同亞群的樣品中優(yōu)先擴(kuò)增或選擇性富集任何所期望的(亞)細(xì)胞群的可能性。

實(shí)施例17：從單個(gè)細(xì)胞池中對(duì)Tcm應(yīng)答細(xì)胞進(jìn)行的平行抗原特異性擴(kuò)增

本實(shí)施例檢測(cè)了從在體外經(jīng)多種可逆的肽:MHC/αCH28 Fab Streptamer多聚體刺激的T應(yīng)答細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行的平行抗原特異性(Ag特異性)擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)。

使用3μl被相應(yīng)的攜帶有鏈霉親和素結(jié)合肽的肽:MHC I類復(fù)合物以及0.5μg也攜帶有鏈霉親和素結(jié)合肽的αCD28 Fab所功能化的Streptactin多聚體，對(duì)500.000個(gè)CD3+CD62L+CD45RA應(yīng)答Tcm細(xì)胞(Tresp)同時(shí)進(jìn)行用于每種特異性的多重特異性的刺激。作為一種替代方法，對(duì)每種特異性使用4.5μl被如本文所述的0.5μg攜帶有鏈霉親和素結(jié)合肽的肽:MHC I、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab所功能化的基于Streptactin的多聚化劑。為了比較，使用3μl可逆負(fù)載有0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab組合的基于Streptactin的多聚化劑制劑(1mg/ml)進(jìn)行多克隆刺激。同樣，作為上述刺激條件的替代，可以使用4.5μl可逆負(fù)載有0.5μgαCD3 Fab、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab(其中每以個(gè)都攜帶有鏈霉親和素結(jié)合肽)的基于Streptactin的多聚化劑制劑。未經(jīng)處理的(未刺激的)Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照，經(jīng)Dynabeads(涂覆有αCD3-和αCD28-mAb的磁珠)多克隆刺激的Tresp細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。將Tresp細(xì)胞接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2和5ng/ml IL-15的細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃下孵育，每3天更換一次培養(yǎng)基，并在7天和14天后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。

實(shí)施例18：在體外用被αCD3/αCD8/αCD28 Fab片段可逆功能化的基于鏈霉親和素的多聚化劑所刺激的CD3+T應(yīng)答細(xì)胞中優(yōu)選擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞

使用以下試劑對(duì)300.000個(gè)CD3+應(yīng)答T細(xì)胞(Tresp)進(jìn)行刺激：3μl負(fù)載有0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab組合的多聚化Streptactin制劑(1mg/ml)或使用大Streptactin骨架的多聚化劑制劑，或者4.5μl負(fù)載有0.5μgαCD3、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab的基于Streptactin的多聚化劑制劑，或者3μl僅具有0.5μgαCD3 Fab或僅具有0.5μgαCD28 Fab的基于Streptactin的多聚化劑制劑的混合物(各Fab片段也攜帶鏈霉親和素結(jié)合肽)。未經(jīng)處理的Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照，經(jīng)Dynabeads(涂覆有αCD3-和αCD28-mAb的磁珠)刺激的Tresp作為陽(yáng)性對(duì)照。將Tresp細(xì)胞一式兩份接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃下孵育，3天后更換培養(yǎng)基，6天后進(jìn)行分析。

實(shí)施例19：在體外用被αCD3和αCD28 Fab片段可逆功能化的基于鏈霉親和素的多聚化劑所刺激的CD3+T應(yīng)答細(xì)胞中優(yōu)選擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞

使用以下試劑對(duì)300.000個(gè)CD3+應(yīng)答T細(xì)胞(Tresp)進(jìn)行刺激：不同量的被αCD3 Fab片段單獨(dú)功能化和被αCD28 Fab片段單獨(dú)功能化的基于Streptactin的多聚化劑制劑(1mg/ml)的混合物(1.5μg基于Streptactin的多聚化劑被0.5μgαCD3 Fab單獨(dú)功能化，1.5μg基于Streptactin的多聚化劑被0.5μgαCD28 Fab片段單獨(dú)功能化)，或者不同量的被αCD3 Fab片段和αCD28 Fab片段具有或不具有αCD8 Fab片段(各Fab片段也攜帶有鏈霉親和素結(jié)合肽)功能化的基于Streptactin的多聚化劑制劑的混合物(3μg基于Streptactin的多聚化劑被0.5μgαCD3-和0.5μgαCD28 Fab片段功能化——無(wú)αCD8 Fab片段)，或者4.5μl負(fù)載有0.5μgαCD3 Fab片段、0.5μgαCD8 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab片段(其中Fab片段也攜帶有鏈霉親和素結(jié)合肽)的Streptactin多聚化劑制劑。未經(jīng)處理的Tresp細(xì)胞作為陰性對(duì)照，經(jīng)Dynabeads(涂覆有αCD3-和αCD28-mAb的磁珠)刺激的Tresp作為陽(yáng)性對(duì)照。將Tresp細(xì)胞接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃下孵育，3天后更換培養(yǎng)基，并在6天后進(jìn)行分析。

在本說(shuō)明書中列舉或討論在先出版的文獻(xiàn)不應(yīng)當(dāng)?shù)乇灰暈槌姓J(rèn)該文獻(xiàn)是現(xiàn)有技術(shù)的一部分或是公知常識(shí)。

本文示例性描述的本發(fā)明以適當(dāng)?shù)卦谌狈Ρ疚奈淳唧w公開的任何一個(gè)或多個(gè)元件、一個(gè)或多個(gè)限制的情況下實(shí)施。因此，例如，術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”、“含有”等應(yīng)該在廣義上理解且沒有限制。此外，本文使用的術(shù)語(yǔ)和表述被用作描述而非限制，并且在使用這些術(shù)語(yǔ)和表述時(shí)，沒有意圖排除所示和所述特征或其部分的任何等同物，而應(yīng)認(rèn)識(shí)到各種修改均可能在發(fā)明要求保護(hù)的范圍內(nèi)。因此，應(yīng)當(dāng)理解，盡管已經(jīng)通過(guò)示例性實(shí)施方案和可選特征具體公開了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以尋求對(duì)本文所公開和體現(xiàn)的本發(fā)明做出修改和變化，這樣的修改和變化被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本文已經(jīng)全面且一般性地描述了本發(fā)明。屬于一般公開內(nèi)容中的每個(gè)更窄的種類和亞屬組也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這包括本發(fā)明的一般性描述，其具有從該屬中去除任何主題的附帶條件或否定限制，無(wú)論所排除的材料是否在本文有具體描述。

其他實(shí)施方權(quán)利要求范圍內(nèi)。此外，在本發(fā)明的特征或方面以馬庫(kù)什組的方式進(jìn)行描述時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明也由此以馬庫(kù)什組的任何個(gè)體成員或成員亞組的形式進(jìn)行描述。

序列表

<110> 朱諾治療有限公司

<120> 用于擴(kuò)增細(xì)胞群的方法、試劑盒及裝置

<130> LC16310021P

<150> US 61/980,506

<151> 2014-04-16

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> Strep-標(biāo)記

<400> 1

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鏈霉親和素突變蛋白 (類似物) 1

<400> 2

Val Thr Ala Arg

1

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鏈霉親和素突變蛋白 (類似物) 2

<400> 3

Ile Gly Ala Arg

1

<210> 4

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> di-標(biāo)記3

<400> 4

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25

<210> 5

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> di-標(biāo)記2

<400> 5

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 即刻早期1蛋白 (第309-317位氨基酸)

<400> 6

Cys Arg Val Leu Cys Cys Tyr Val Leu

1 5

<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙Strep-標(biāo)記

<400> 7

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25 30

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> CMV的pp65抗原表位 (第341-350位氨基酸)

<400> 8

Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe

1 5

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> CMV的pp65抗原表位 (第265-274位氨基酸)

<400> 9

Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe Thr Val Leu

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 腺病毒的hexon5抗原表位 (第114-124位氨基酸)

<400> 10

Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Leu

1 5 10

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> HA-標(biāo)記

<400> 11

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> VSV-G-標(biāo)記

<400> 12

Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys

1 5 10

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> HSV-標(biāo)記

<400> 13

Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp

1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> T7 抗原表位

<400> 14

Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly

1 5 10

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> myc 抗原表位

<400> 15

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 16

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> V5-標(biāo)記

<400> 16

Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr

1 5 10

<210> 17

<211> 119

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 106

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 18

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn

100 105

<210> 19

<211> 116

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 19

Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg

1 5 10 15

Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Ile His

20 25 30

Trp Ile Lys Leu Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Phe

35 40 45

Tyr Pro Gly Ser Asn Asp Ile Gln Tyr Asn Ala Lys Phe Lys Gly Lys

50 55 60

Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu

65 70 75 80

Thr Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg

85 90 95

Asp Asp Phe Ser Gly Tyr Asp Ala Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val

115

<210> 20

<211> 108

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr His Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Thr Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Cys

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 21

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> HLA-A*2402

<400> 21

Met Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Thr Ser Val Ser Arg Pro

1 5 10 15

Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr

20 25 30

Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro

35 40 45

Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Glu Glu

50 55 60

Thr Gly Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr Asp Arg Glu Asn Leu Arg

65 70 75 80

Ile Ala Leu Arg Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu

85 90 95

Gln Met Met Phe Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Arg Phe Leu Arg

100 105 110

Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys

115 120 125

Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr

130 135 140

Lys Arg Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Gln Arg Ala Tyr

145 150 155 160

Leu Glu Gly Thr Cys Val Asp Gly Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly

165 170 175

Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro Pro Lys Thr His Met Thr His

180 185 190

His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly

195 200 205

Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp

210 215 220

Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly

225 230 235 240

Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln

245 250 255

Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr

260 265 270

Leu Arg Trp Glu Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro

275 280 285

Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

290 295 300

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

305 310

<210> 22

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> HLA-B*0702

<400> 22

Met Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Tyr Thr Ser Val Ser Arg Pro

1 5 10 15

Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr

20 25 30

Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Glu Glu Pro

35 40 45

Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Asn

50 55 60

Thr Gln Ile Tyr Lys Ala Gln Ala Gln Thr Asp Arg Glu Ser Leu Arg

65 70 75 80

Asn Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu

85 90 95

Gln Ser Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg

100 105 110

Gly His Asp Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn

115 120 125

Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Thr

130 135 140

Gln Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Glu Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr

145 150 155 160

Leu Glu Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly

165 170 175

Lys Asp Lys Leu Glu Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His

180 185 190

His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly

195 200 205

Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp

210 215 220

Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg

225 230 235 240

Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln

245 250 255

Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr

260 265 270

Leu Arg Trp Glu Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro

275 280 285

Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

290 295 300

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

305 310

<210> 23

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> HLA-C*0702

<400> 23

Met Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Cys Ser His Ser Met Arg Tyr Phe

1 5 10 15

Asp Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser

20 25 30

Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala

35 40 45

Ala Ser Pro Arg Gly Glu Pro Arg Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly

50 55 60

Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr Gln Lys Tyr Lys Arg Gln Ala Gln

65 70 75 80

Ala Asp Arg Val Ser Leu Arg Asn Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser

85 90 95

Glu Asp Gly Ser His Thr Leu Gln Arg Met Ser Gly Cys Asp Leu Gly

100 105 110

Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Asp Gln Ser Ala Tyr Asp Gly

115 120 125

Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala

130 135 140

Asp Thr Ala Ala Gln Ile Thr Gln Arg Lys Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu

165 170 175

Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Ala Glu Pro

180 185 190

Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Leu Ser Asp His Glu Ala Thr

195 200 205

Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr

210 215 220

Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu

225 230 235 240

Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val

245 250 255

Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Met Gln His Glu

260 265 270

Gly Leu Gln Glu Pro Leu Thr Leu Ser Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro

275 280 285

Thr Ile Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly

290 295 300

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu

305 310 315 320

Lys

<210> 24

<211> 100

<212> PRT

<213> 人

<400> 24

Met Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala

1 5 10 15

Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His

20 25 30

Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu

35 40 45

Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr

50 55 60

Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala

65 70 75 80

Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp

85 90 95

Asp Arg Asp Met

100

<210> 25

<211> 118

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 25

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 111

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 26

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 27

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 具有His-標(biāo)記的人CD19胞外域

<400> 27

Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val

1 5 10 15

Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr

20 25 30

Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly

35 40 45

Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe

50 55 60

Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro

65 70 75 80

Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val

85 90 95

Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly

100 105 110

Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro

115 120 125

Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg

130 135 140

Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser

145 150 155 160

Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr

165 170 175

Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro

180 185 190

Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser

195 200 205

Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu

210 215 220

Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr

245 250 255

Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys

260 265 270

Ala His His His His His His His His His His

275 280