丙型肝炎病毒的有效和選擇性抑制劑的制作方法

本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防丙型肝炎病毒(HCV)感染的化合物、方法及組合物。更具體地說，本發(fā)明描述特異地取代的芳族化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽或其它衍生物，以及其在治療HCV感染中的用途。大部分這些化合物靶向HCV NS5A磷蛋白。

背景技術(shù)：

丙型肝炎病毒(HCV)在全世界已經(jīng)感染了超過一億八千萬人口。據(jù)估計(jì)每年有三至四百萬人被新感染，其中70％的人將發(fā)展為慢性肝炎。HCV導(dǎo)致所有的肝癌病例的50-76％，以及發(fā)達(dá)國家中所有肝移植的三分之二。標(biāo)準(zhǔn)療法[聚乙二醇化干擾素α+病毒唑(核苷類似物)]僅在50-60％的患者中有效且與明顯的副作用有關(guān)。因此，迫切需要新的HCV藥物。

丙型肝炎病毒基因組包含包封在核衣殼和脂質(zhì)包膜中的正鏈RNA并且由9.6kb核糖核苷酸組成，并具有編碼約3000個(gè)氨基酸的大多肽的單一的開放閱讀框(ORP)(Dymock等人Antiviral Chemistry&Chemotherapy 2000,11,79)。成熟之后，此多肽通過細(xì)胞和病毒蛋白酶被切割成至少10個(gè)蛋白，以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白。在HCV的情況下，成熟非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B)的產(chǎn)生受到兩種病毒蛋白酶的影響：1)金屬蛋白酶，其在NS2-NS3接合處裂解；和2)包含在NS3的N-末端區(qū)域內(nèi)的絲氨酸蛋白酶(NS3蛋白酶)，其介導(dǎo)在NS3的下游的所有隨后裂解。NS4A蛋白似乎具有多種功能，包括NS4A/NS3復(fù)合體形成，這似乎增強(qiáng)NS3蛋白的蛋白水解效率。NS5B(本文中也稱為HCV聚合酶)具有聚合酶活性并參與從充當(dāng)模板的單鏈病毒RNA基因組合成雙鏈RNA。NS5A是56-58kDa的非結(jié)構(gòu)蛋白，其作為復(fù)制復(fù)合體的組分調(diào)制HCV復(fù)制。NS5A由細(xì)胞蛋白激酶高度磷酸化并且磷酸化位點(diǎn)在HCV基因型之間是保守的(Katze等人，2001；Kim等人，1999)

對于選擇性地抑制HCV復(fù)制的新型抗病毒策略的開發(fā)由于缺乏用于HCV增殖的便利的細(xì)胞培養(yǎng)模型而長期受到阻礙(“Recent Advances in Nucleoside Monophosphate Prodrugs as Anti-hepatitis C Virus Agents"Bobeck,D.R.；Coats,S.J.；Schinazi,R.F.Antivir.Ther.2010；書籍章節(jié):"Approaches for the Development of Antiviral Compounds:The Case of Hepatitis C Virus."Raymond F.Schinazi,Steven J.Coats,Leda C.Bassit,Johan Lennerstrand,James H.Nettles和Selwyn J.Hurwitz在Handbook of Experimental Pharmacology,vol.189,25-51中:Antiviral Strategies；由以下編輯:Hans-Georg Krausslich和Ralf BartenschlagerSpringer-Verlag Berlin Heidelberg 2009”)。這個(gè)障礙首先在1999年通過建立HCV復(fù)制子系統(tǒng)而被克服(Bartenschlager,R.,Nat.Rev.Drug Discov.2002,1,911-916及Bartenschlager,R.,J.Hepatol.2005,43,210-216)，并且在2005年，通過開發(fā)穩(wěn)健的HCV細(xì)胞培養(yǎng)模型而得以發(fā)展(Wakita,T.,等人,Nat.Med.2005,11,791-6；Zhong,J.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2005,102,9294-9；Lindenbach,B.D.,等人,Science 2005,309,623-6)。

有利的是，提供新的抗病毒劑、包含這些劑的組合物以及使用這些劑的治療方法，特別是用于治療HCV或耐藥HCV。本發(fā)明提供這種劑、組合物及方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防宿主中的HCV感染的化合物、方法及組合物。所述方法涉及施用治療或預(yù)防有效量的至少一種如本文所述的化合物來治療或預(yù)防HCV感染，或施用足以降低HCV感染的生物活性的量。藥物組合物包含與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組合的一種或多種本文所述的化合物，所述化合物用于治療具有HCV感染的宿主。這些化合物可以與HCV的核苷和非核苷抑制劑組合使用。所述制劑還可包含至少一種其它治療劑。另外，本發(fā)明包括用于制備這種化合物的方法。

在一個(gè)實(shí)施方案中，活性化合物具有式(I)：

R¹獨(dú)立地為H、C_1-6烷基、芳基-C_1-6-烷基、C_1-6烷基-芳基或芳基，

R²獨(dú)立地為H、C_1-6烷基、芳基-C_1-6-烷基，包括C_3-6支鏈烷基、C_1-6烷基-芳基、芳基、C_1-6烷基-胍、C_1-6烷氨基、C_1-6烷基-S-C_1-6烷基、C_1-6烷基硫醇、C_1-6烷基-羥基、C_1-6烷基-酰胺、C_1-6烷基-苯氧基、C_1-6烷基-羧基雜芳基和雜芳基-C_1-6烷基，其中芳基環(huán)可由如本文所定義的1～3個(gè)取代基Z取代，

R³獨(dú)立地為H或Cl，條件是至少一個(gè)R³為Cl，

R⁴獨(dú)立地為H或-S(O)_x-R¹，條件是至少一個(gè)R⁴為-S(O)_x-R¹，

Z選自由C_1-8烷基(包括環(huán)烷基)、低級烯基(C_2-6)、低級炔基(C_2-6)、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、芳基烷氧基羰基、羧基、鹵素(例如F、CI、Br或I)、鹵代烷基、-OR'、-NR'R"、羥基、羥基-C_1-6烷基、烷氧基烷基(C_2-8)、烷氧基羰基、-CF₃、-CN、-NO₂、-C₂R’、-SR、-N₃、-C(＝O)NRR"、-NR’C(＝O)R"、-C(＝O)R、-C(＝O)OR、-OC(＝O)R、-OC(＝O)NRR"、-NRC(＝O)OR"、-SO₂R、-SO₂NR’R"、-NRSO₂R"、N(R')₂、SR'、OCOR'、N(COR')R'、N(COR')COR'和SCOR'組成的組，

每個(gè)R'和R"獨(dú)立地為H、低級烷基(C_1-6)、低級鹵代烷基(C_1-6)、低級烷氧基(C_1-6)、低級鏈烯基(C_2-6)、低級炔基(C_2-6)、低級環(huán)烷基(C_3-6)、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、烷基芳基、芳基-C_1-6-烷基(如芐基)；或如果兩個(gè)R'位于同一個(gè)氮原子上，它們可以一起形成不含有或含有一個(gè)獨(dú)立地選自N，O和S的雜原子的烷基環(huán)(C_3-6)；其中R'基團(tuán)可以被如上所定義的一個(gè)或多個(gè)取代基取代，例如，羥烷基、氨基烷基和烷氧基烷基，

j是0-4，和

x是0-2。

本文所述的化合物可以是R-或S-構(gòu)型，或它們的混合物，包括它們的外消旋或非對映混合物的形式。

在一個(gè)實(shí)施方案中，R取代基中的一個(gè)或兩個(gè)是苯基或由本文所定義的一個(gè)或多個(gè)取代基Z取代的苯基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，R¹取代基中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)是-CH₃。

在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)R¹是-CH₃且兩個(gè)R²取代基是苯基或由本文所定義的一個(gè)或多個(gè)取代基Z取代的苯基。

式(I)的化合物的子集提供為下式(IA)：

其中R¹、Z、R'、R"、j和X如關(guān)于式(I)中所定義。

代表性的化合物包括如下：

和其所有其它非對映體，以及其-S(O)-CH₃和-S(O)₂-CH₃類似物。

進(jìn)一步的代表性化合物具有下式之一：

和它們的藥學(xué)上可接受的鹽或前藥。

這些化合物可在聯(lián)合療法中使用，例如，使用常規(guī)的利巴韋林(ribavirin)/派羅欣(Pegasys)療法。用于聯(lián)合療法的代表性抗HCV藥劑包括，但不限于，聚乙二醇化干擾素(派羅欣)和利巴韋林的聯(lián)合，聚合酶抑制劑例如IDX-375和IDX-184(Idenix公司)，PSI-7851和PSI-7977(Pharmasset)，丹諾普韋(danoprevir)(InterMune/Genentech)，RG7128(Pharmasset/Genentech)，I ANA598(Anadys制藥公司)，TMN-191(R7227)，RG7128和RG7227(Genentech，Pharmasset和Intermune)的聯(lián)合，ABT-072(雅培)，VX-916，VX-759，VX-222以及VX-500(Vertex)，非利布韋(Filibuvir)(PF-00868554)(Pfizer)，GS 9190(Gilead)，單獨(dú)或具有增強(qiáng)劑(booster)如利托那韋(ritonavir)，以及絲氨酸蛋白酶抑制劑如博賽潑維(Boceprevir)(SCH 503034)(Schering Plough)，BILN-2061，特拉潑維(Telaprevir)(Vertex)，ACH-1625(Achillion)，GS-9256(Gilead)，BI 201335(Boehringer Ingelheim Pharma)，Vaniprevir(MK-7009)(Merck)，SCH900518(Narlaprevir)(Schering/Merck)，TMC435(Medivir/Tibotec)。絲氨酸蛋白酶抑制劑的另外的例子提供在，例如，Reiser和Timm，“Serine protease inhibitors as anti-hepatitis C virus agents，”Expert Review of Anti-infective Therapy,7(5):537-547(June 2009)中，其內(nèi)容在此通過引用并入本文。

參照下面的詳細(xì)描述將更好地理解本發(fā)明。

附圖說明

圖1是化合物30的¹³C NMR譜。

圖2是化合物30的¹H NMR譜。

具體實(shí)施方式

在基于細(xì)胞的測定中，本文所述的化合物顯示針對HCV的抑制活性。因此，所述化合物可用于治療或預(yù)防宿主中的HCV或降低病毒的生物活性。宿主可以是感染了HCV的哺乳動(dòng)物且特別是人。所述方法包括施用有效量的一種或多種本文所述的化合物。

本文還描述了包含與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組合的一種或多種本文所述的化合物的藥物制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑包含至少一種本文所述的化合物和至少一種其它治療劑。

參考以下定義將更好地理解本發(fā)明：

I.定義

術(shù)語“獨(dú)立地”在本文中用于指示獨(dú)立地應(yīng)用的變量在應(yīng)用與應(yīng)用之間獨(dú)立地變化。因此，在如R"XYR"的化合物中，其中R"“獨(dú)立地是碳或氮”，兩個(gè)R"均可是碳，兩個(gè)R"均可是氮，或一個(gè)R"可以是碳且另一個(gè)R"是氮。

如本文所用，術(shù)語“對映異構(gòu)體純的”是指包含至少大約95％且優(yōu)選地大約97％、98％>、99％或100％的化合物的單一對映異構(gòu)體的化合物組合物。

如本文所用，術(shù)語“基本上不含”或“基本上在不存在下”是指包含至少85至90重量％、優(yōu)選地95重量％至98重量％、且甚至更優(yōu)選地99重量％至100重量％的化合物的指定對映異構(gòu)體的化合物組合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本文所述的化合物基本上不含對映異構(gòu)體。

類似地，術(shù)語“分離的”是指包含至少85至90重量％、優(yōu)選地95重量％至98重量％、且甚至更優(yōu)選地99重量％至100重量％的化合物且其余包含其它化學(xué)物種或?qū)τ钞悩?gòu)體的化合物組合物。

除非另作說明，如本文所用的術(shù)語“烷基”是指飽和直鏈、支鏈或環(huán)狀伯烴、仲烴或叔烴，包括取代的和未被取代的烷基。烷基可任選地被不另外干擾反應(yīng)或提供過程中的改善的任何基團(tuán)取代，包括但不限于鹵素、鹵代烷基、羥基、羧基、?；?、芳基、酰氧基、氨基、酰胺基、羧基衍生物、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫醇、亞胺、磺?；?sulfonyl)、硫烷基(sulfanyl)、亞磺酰基(sulfmyl)、氨磺?；?sulfamonyl)、酯、羧酸、酰胺、膦?；?phosphonyl)、氧膦基、磷?；?、磷化氫、硫酯、硫醚、酰鹵、酸酐、肟、肼、氨基甲酸酯、膦酸、膦酸酯，根據(jù)需要是未受保護(hù)的或受保護(hù)的，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，例如如在Greene,等人，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley和Sons，第二版，1991中所教導(dǎo)的，該文獻(xiàn)據(jù)此以引用的方式并入。具體地包括CF₃和CH₂CF₃。

在正文中，每當(dāng)使用術(shù)語C(烷基范圍)，該術(shù)語獨(dú)立地包括那類中的每個(gè)成員，就如同具體地和單獨(dú)地列出一般。術(shù)語“烷基”包括C_1-22烷基，且術(shù)語“低級烷基”包括C_1-6烷基。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，有關(guān)烷基是通過用后綴“-基(yl)”取代后綴“-烷(ane)”來命名。

如本文所用，“橋接烷基”是指雙環(huán)或三環(huán)烷烴，例如2:1:1雙環(huán)己烷。

如本文所用，“螺環(huán)烷基”是指在單個(gè)(季)碳原子處連接的兩個(gè)環(huán)。

術(shù)語“烯基”是指直鏈或支鏈的、程度以致其含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵的不飽和烴基。本文所公開的烯基可任選地被不會(huì)不利地影響反應(yīng)過程的任何基團(tuán)取代，包括但不限于針對烷基上的取代基所述的那些。烯基的非限制性實(shí)例包括乙烯、甲基乙烯、異亞丙基、1,2-乙烷-二基、1,1-乙烷-二基、1,3-丙烷-二基、1,2-丙烷-二基、1,3-丁烷-二基以及1,4-丁烷-二基。

術(shù)語“炔基”是指直鏈或支鏈的、程度以致其含有一個(gè)或多個(gè)三鍵的不飽和無環(huán)烴基。炔基可任選地被不會(huì)不利地影響反應(yīng)過程的任何基團(tuán)取代，包括但不限于如上針對烷基所述的那些。適合的炔基的非限制性實(shí)例包括乙炔基、丙炔基、羥基丙炔基、丁炔-1-基、丁炔-2-基、戊炔-1-基、戊炔-2-基、4-甲氧基戊炔-2-基、3-甲基丁炔-1-基、己炔-1-基、己炔-2-基以及己炔-3-基、3,3-二甲基丁炔-1-基。

術(shù)語“烷基氨基”或“芳基氨基”是指分別具有一個(gè)或兩個(gè)烷基或芳基取代基的氨基。

如本文所用且除非另外指明，術(shù)語“受保護(hù)的”是指添加到氧、氮或磷原子中以防止它的進(jìn)一步反應(yīng)或出于其它目的的基團(tuán)。廣泛多種氧和氮保護(hù)基為有機(jī)合成領(lǐng)域的技術(shù)人員所知且描述于例如上述Greene等人，Protective Groups in Organic Synthesis中。

單獨(dú)或組合的術(shù)語“芳基”意指含有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)環(huán)的碳環(huán)芳族體系，其中這種環(huán)可以懸掛方式連接在一起或可以被稠合。芳基的非限制性實(shí)例包括苯基、聯(lián)苯或萘基、或在從芳族環(huán)上除去氫之后剩余的其它芳族基團(tuán)。術(shù)語芳基包括取代的和未被取代的基團(tuán)。芳基可任選地被不會(huì)不利地影響過程的任何基團(tuán)取代，包括但不限于如上針對烷基所述的那些。取代的芳基的非限制性實(shí)例包括雜芳基氨基、N-芳基-N-烷基氨基、N-雜芳基氨基-N-烷基氨基、雜芳烷氧基、芳基氨基、芳烷基氨基、芳硫基、單芳基酰氨基磺?；⒎蓟酋０被?arylsulfonamido)、二芳基酰氨基磺酰基、單芳基酰氨基磺?；?、芳基亞磺?；?arylsulfmyl)、芳基磺?；?、雜芳硫基、雜芳基亞硫?；?、雜芳基磺?；?、芳?；㈦s芳?；⒎纪轷；?aralkanoyl)、雜芳烷?；?、羥基芳烷基、羥基雜芳烷基、鹵代烷氧基烷基、芳基、芳烷基、芳氧基、芳烷氧基、芳氧基烷基、飽和雜環(huán)基、部分飽和雜環(huán)基、雜芳基、雜芳氧基、雜芳氧基烷基、芳基烷基、雜芳基烷基、芳基烯基以及雜芳基烯基、芳烷氧羰基(carboaralkoxy)。

術(shù)語“烷芳基”或“烷基芳基”是指具有芳基取代基的烷基。術(shù)語“芳烷基”或“芳基烷基”是指具有烷基取代基的芳基。

如本文所用的術(shù)語“鹵基”包括氯、溴、碘及氟。

術(shù)語“?；笔侵隔人狨?，其中酯基的非羰基部分選自直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基或低級烷基、烷氧基烷基，包括但不限于甲氧基甲基；芳烷基，包括但不限于芐基；芳氧基烷基如苯氧基甲基；芳基，包括但不限于苯基，任選地被鹵素(F、Cl、Br、I)取代；烷基(包括但不限于C₁、C₂、C₃及C₄)；烷氧基(包括但不限于C₁、C₂、C₃及C₄)；磺酸酯，如烷基或芳烷基磺?；ǖ幌抻诩谆酋；?；單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯；三苯甲基或單甲氧基三苯甲基、取代的芐基、三烷基甲硅烷基(例如二甲基-叔丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。酯中的芳基最適合包括苯基。術(shù)語“低級酰基”是指其中非羰基部分是低級烷基的?；?。

術(shù)語“烷氧基”和“烷氧基烷基”包含具有烷基部分的直鏈或支鏈含氧基團(tuán)，如甲氧基。術(shù)語“烷氧基烷基”還包括具有連接至烷基以形成單烷氧基烷基和二烷氧基烷基的一個(gè)或多個(gè)烷氧基的烷基。“烷氧基”可進(jìn)一步被一個(gè)或多個(gè)鹵原子如氟、氯或溴取代以提供“鹵代烷氧基”。這種基團(tuán)的實(shí)例包括氟代甲氧基、氯代甲氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟乙氧基、氟代乙氧基、四氟乙氧基、五氟乙氧基及氟代丙氧基。

術(shù)語“烷基氨基”表示分別含有連接至氨基的一個(gè)或兩個(gè)烷基的“單烷基氨基”和“二烷基氨基”。術(shù)語“芳基氨基”表示分別含有連接至氨基的一個(gè)或兩個(gè)芳基的“單芳基氨基”和“二芳基氨基”。術(shù)語“芳烷基氨基”包括連接至氨基的芳烷基。術(shù)語芳烷基氨基表示分別含有連接至氨基的一個(gè)或兩個(gè)芳烷基的“單芳烷基氨基”和“二芳烷基氨基”。術(shù)語芳烷基氨基進(jìn)一步表示含有連接至氨基的一個(gè)芳烷基和一個(gè)烷基的“單芳烷基單烷基氨基”。

如本文所用的術(shù)語“雜原子”是指氧、硫、氮及磷。

如本文所用的術(shù)語“雜芳基”或“雜芳族”是指在芳族環(huán)中包含至少一個(gè)硫、氧、氮或磷的芳族。

術(shù)語“雜環(huán)”、“雜環(huán)基”及“環(huán)雜烷基”是指在環(huán)中存在至少一個(gè)雜原子如氧、硫、氮或磷的非芳族環(huán)狀基團(tuán)。

雜芳基和雜環(huán)基團(tuán)的非限制性實(shí)例包括呋喃基(furyl)、呋喃基(furanyl)、吡啶基、嘧啶基、噻吩基、異噻唑基、咪唑基、四唑基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并苯硫基、喹啉基、異喹啉基、苯并噻吩基、異苯并呋喃基、吡唑基、吲哚基、異吲哚基、苯并咪唑基、嘌呤基、咔唑基、噁唑基、噻唑基、異噻唑基、1,2,4-噻二唑基、異噁唑基、吡咯基、喹唑啉基、噌啉基、酞嗪基、黃嘌呤基、次黃嘌呤基、噻吩、呋喃、吡咯、異吡咯、吡唑、咪唑、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、噁唑、異噁唑、噻唑、異噻唑、嘧啶或噠嗪，及蝶啶基、氮丙啶、噻唑、異噻唑、1,2,3-噁二唑、噻嗪、吡啶、吡嗪、哌嗪、吡咯烷、噁嗪烷(oxazirane)、吩嗪、吩噻嗪、嗎啉基、吡唑基、噠嗪基、吡嗪基、喹喔啉基、黃嘌呤基、次黃嘌呤基、蝶啶基、5-氮雜胞苷基、5-氮雜尿嘧啶基、三唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、腺嘌呤、N⁶-烷基嘌呤、N⁶-芐基嘌呤、N⁶-鹵代嘌呤、N⁶-乙烯嘌呤、N⁶-炔屬嘌呤、N⁶-?；堰?、N⁶-羥烷基嘌呤、N⁶-硫代烷基嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、6-氮雜嘧啶、2-巰基嘧啶、尿嘧啶、N⁵-烷基嘧啶、N⁵-芐基嘧啶、N⁵-鹵代嘧啶、N⁵-乙烯基嘧啶、N⁵-炔屬嘧啶、N⁵-?；奏ぁ⁵-羥烷基嘌呤及N⁶-硫代烷基嘌呤以及異噁唑基。雜芳族基團(tuán)可如上針對芳基所述任選地被取代。雜環(huán)或雜芳族基團(tuán)可任選地被一個(gè)或多個(gè)選自由以下組成的組的取代基取代：鹵素、鹵烷基、烷基、烷氧基、羥基、羧基衍生物、酰胺基、氨基、烷基氨基及二烷基氨基。雜芳族可根據(jù)需要被部分或完全氫化。作為非限制性實(shí)例，二氫吡啶可代替吡啶來使用。在雜環(huán)或雜芳基上的官能性氧和氮基團(tuán)可根據(jù)需要或希望被保護(hù)。適合的保護(hù)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的且包括三甲基甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲基或取代的三苯甲基、烷基、?；缫阴；捅；⒓谆酋；约皩妆交酋；?。雜環(huán)或雜芳族基團(tuán)可被不會(huì)不利地影響反應(yīng)的任何基團(tuán)取代，包括但不限于如上針對芳基所述的那些。

如本文所用的術(shù)語“宿主”是指其中病毒可以復(fù)制的單細(xì)胞或多細(xì)胞有機(jī)體，包括但不限于細(xì)胞系和動(dòng)物且優(yōu)選是人?；蛘?，宿主可攜帶一部分病毒基因組，其復(fù)制或功能可由本發(fā)明化合物改變。術(shù)語宿主具體是指受感染的細(xì)胞、被病毒基因組全部或一部分轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以及動(dòng)物，特別是靈長類動(dòng)物(包括但不限于黑猩猩)和人。在本發(fā)明的大多數(shù)動(dòng)物應(yīng)用中，宿主是人患者。然而，在某些適應(yīng)癥中，本發(fā)明明確地考慮到了獸醫(yī)應(yīng)用(如用于治療黑猩猩)。

術(shù)語“肽”是指含有由一個(gè)氨基酸的羧基連接到另一個(gè)的氨基上的二至一百個(gè)氨基酸的天然或合成化合物。

術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽或前藥”在本說明書通篇中用于描述化合物的任何藥學(xué)上可接受的形式(如酯)，其一旦施用于患者便提供化合物。藥學(xué)上可接受的鹽包括由藥學(xué)上可接受的無機(jī)或有機(jī)堿和酸衍生的那些鹽。適合的鹽包括由堿金屬如鉀和鈉、堿土金屬如鈣和鎂與藥學(xué)領(lǐng)域中熟知的許多其它酸衍生的那些鹽。藥學(xué)上可接受的前藥是指在宿主中代謝，例如水解或氧化以形成本發(fā)明化合物的化合物。前藥的典型實(shí)例包括在活性化合物的官能基團(tuán)上具有生物學(xué)不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)的化合物。前藥包括可被氧化、還原、胺化、脫氨基、羥基化、脫羥基化、水解、脫水、烷基化、脫烷基化、?；?、脫?；?、磷酸化或去磷酸化以產(chǎn)生活性化合物的化合物。本發(fā)明化合物的前藥形式可具有抗病毒活性，可被代謝形成展現(xiàn)這種活性的化合物，或兩者。

II.活性化合物

在一個(gè)實(shí)施方案中，活性化合物具有式(I)：

R¹獨(dú)立地為H、C_1-6烷基、芳基-C_1-6-烷基、C_1-6烷基-芳基或芳基，

R²獨(dú)立地為H、C_1-6烷基、芳基-C_1-6-烷基，包括C_3-6支鏈烷基、C_1-6烷基-芳基、芳基、C_1-6烷基-胍、C_1-6烷基氨基、C_1-6烷基-S-C_1-6烷基、C_1-6烷基硫醇、C_1-6烷基-羥基、C_1-6烷基-酰胺、C_1-6烷基-苯氧基、C_1-6烷基-羧基雜芳基和雜芳基-C_1-6烷基，其中芳基環(huán)可由如本文所定義的1～3個(gè)取代基Z取代，

R³獨(dú)立地為H或Cl，條件是至少一個(gè)R³為Cl，

R⁴獨(dú)立地為H或-S(O)_x-R¹，條件是至少一個(gè)R⁴為-S(O)_x-R¹，

Z選自由C_1-8烷基(包括環(huán)烷基)、低級烯基(C_2-6)、低級炔基(C_2-6)、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、芳基烷氧基羰基、羧基、鹵素(例如F、CI、Br或I)、鹵代烷基、-OR'、-NR'R"、羥基、羥基-C_1-6烷基、烷氧基烷基(C_2-8)、烷氧基羰基、-CF₃、-CN、-NO₂、-C₂R’、-SR'、-N₃、-C(＝O)NR'R"、-NR’C(＝O)R"、-C(＝O)R'、-C(＝O)OR'、-OC(＝O)R'、-OC(＝O)NR'R"、-NR'C(＝O)OR"、-SO₂R'、-SO₂NR’R"、-NR'SO₂R"、N(R')₂、SR'、OCOR'、N(COR')R'、N(COR')COR'和SCOR'組成的組，

每個(gè)R'和R"獨(dú)立地為H、低級烷基(C_1-6)、低級鹵代烷基(C_1-6)、低級烷氧基(C_1-6)、低級鏈烯基(C_2-6)、低級炔基(C_2-6)、低級環(huán)烷基(C_3-6)、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、烷基芳基、芳基-C_1-6-烷基(如芐基)；或如果兩個(gè)R'位于同一個(gè)氮原子上，它們可以一起形成不含有或含有一個(gè)獨(dú)立地選自N，O和S的雜原子的烷基環(huán)(C_3-6)；其中R'基團(tuán)可以被如上所定義的一個(gè)或多個(gè)取代基取代，例如，羥烷基、氨基烷基和烷氧基烷基，

j是0-4，和

x是0-2。

本文所述的化合物可以是R-或S-構(gòu)型，或它們的混合物，包括它們的外消旋或非對映混合物的形式。

在一個(gè)實(shí)施方案中，R取代基中的一個(gè)或兩個(gè)是苯基或由本文所定義的一個(gè)或多個(gè)取代基Z取代的苯基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，R¹取代基中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)是-CH₃。

在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)R¹是-CH₃且兩個(gè)R²取代基是苯基或由本文所定義的一個(gè)或多個(gè)取代基Z取代的苯基。

式(I)的化合物的子集提供為下式(IA)：

其中R¹、Z、R'、R"、j和X如關(guān)于式(I)中所定義。

代表性的化合物包括如下：

和其所有其它非對映體，以及其-S(O)-CH₃和-S(O)₂-CH₃類似物。

進(jìn)一步的代表性化合物具有下式之一：

和它們的藥學(xué)上可接受的鹽或前藥。

III.立體異構(gòu)現(xiàn)象和多晶型現(xiàn)象

本文所述的化合物可具有不對稱中心并且作為外消旋體、外消旋混合物、個(gè)別非對映異構(gòu)體或?qū)τ钞悩?gòu)體存在，其中所有異構(gòu)體形式都包括在本發(fā)明中。具有手性中心的本發(fā)明化合物可以光學(xué)活性和外消旋形式存在和分離。一些化合物可以展現(xiàn)多晶型現(xiàn)象。本發(fā)明包括本發(fā)明化合物的外消旋、光學(xué)活性、多晶型或立體異構(gòu)形式或其混合物，其具有本文所述的有用的特性。光學(xué)活性形式可通過例如以下方式來制備：通過再結(jié)晶技術(shù)拆分外消旋形式，通過從光學(xué)活性起始材料來合成，通過手性合成，或通過使用手性固定相進(jìn)行色譜分離或通過酶促拆分。可純化單獨(dú)的化合物，然后衍生化所述化合物以形成本文所述的化合物，或純化化合物本身。

化合物的光學(xué)活性形式可使用本領(lǐng)域中已知的任何方法來制備，包括但不限于通過再結(jié)晶技術(shù)拆分外消旋形式，通過從光學(xué)活性起始材料來合成，通過手性合成，或通過使用手性固定相進(jìn)行色譜分離。

獲得光學(xué)活性材料的方法的實(shí)例包括至少以下：

i)晶體的物理分離：該技術(shù)手工地分離各個(gè)對映異構(gòu)體的肉眼可見晶體。如果存在單獨(dú)的對映異構(gòu)體的晶體，即所述材料是團(tuán)聚體且晶體在視覺上是不同的，便可使用此技術(shù)；

ii)同時(shí)結(jié)晶：該技術(shù)將各個(gè)對映異構(gòu)體從外消旋體溶液中單獨(dú)結(jié)晶，可能只有當(dāng)后者是呈固態(tài)的團(tuán)聚體時(shí)才發(fā)生；

iii)酶促拆分：該技術(shù)在酶的作用下借助于對于對映異構(gòu)體的不同反應(yīng)速率部分或完全分離外消旋體；

iv)酶促不對稱合成：在該合成技術(shù)中，合成的至少一個(gè)步驟使用酶促反應(yīng)以獲得所需對映異構(gòu)體的對映異構(gòu)純的或富集的合成前體；

v)化學(xué)不對稱合成：該合成技術(shù)在產(chǎn)物中產(chǎn)生不對稱性(即手性)條件下從非手性前體合成所需對映異構(gòu)體，所述合成可使用手性催化劑或手性助劑完成；

vi)非對映異構(gòu)體分離：該技術(shù)通過外消旋化合物與對映異構(gòu)純的試劑(手性助劑)反應(yīng)，將各個(gè)對映異構(gòu)體轉(zhuǎn)化為非對映異構(gòu)體。所得非對映異構(gòu)體然后通過色譜法或結(jié)晶借助于其現(xiàn)在更明顯的結(jié)構(gòu)差異被分離且手性助劑隨后被除去以獲得所需對映異構(gòu)體；

vii)一級和二級不對稱轉(zhuǎn)化：該技術(shù)通過平衡來自外消旋體的非對映異構(gòu)體，使得其在來自所需對映異構(gòu)體的非對映異構(gòu)體溶液中占一定優(yōu)勢，或者來自所需對映異構(gòu)體的非對映異構(gòu)體的優(yōu)先結(jié)晶作用破壞這種平衡，這樣使得所有的物質(zhì)最終幾乎都被轉(zhuǎn)化為來自所需對映異構(gòu)體的結(jié)晶型非對映異構(gòu)體。所需對映異構(gòu)體然后從非對映異構(gòu)體中釋放；

viii)動(dòng)力學(xué)拆分：該技術(shù)是指利用在動(dòng)力學(xué)條件下對映異構(gòu)體和手性、非外消旋試劑或催化劑反應(yīng)的不同反應(yīng)速率，來獲得對外消旋體的部分或完全的拆分(或?qū)Σ糠植鸱值幕衔锏倪M(jìn)一步拆分)；

ix)從非外消旋前體的對映體特異性合成：在該合成技術(shù)中，從非手性起始物質(zhì)獲得所需對映異構(gòu)體，并且在合成過程中，其立體化學(xué)完整性未受到或僅僅受到最低程度的危害；

x)手性液相色譜法：在該技術(shù)中，外消旋體的對映異構(gòu)體在液體流動(dòng)相中借助于它們與固定相不同的相互作用(包括但不限于經(jīng)由手性HPLC)而被分離。固定相可由手性材料制成，或者流動(dòng)相可含有另外的手性材料以誘導(dǎo)不同的相互作用；

xi)手性氣相色譜法：該技術(shù)通過將外消旋體揮發(fā)，然后借助于對映異構(gòu)體在氣態(tài)流動(dòng)相中與含有固定的非外消旋手性吸附相的柱相互作用的程度不同而將對映異構(gòu)體分離出來；

xii)用手性溶劑萃?。?/u>該技術(shù)借助于一種對映異構(gòu)體可以優(yōu)先溶解于特定的手性溶劑中，從而實(shí)現(xiàn)對映異構(gòu)體的分離；

xiii)透過手性膜的轉(zhuǎn)運(yùn)：在該技術(shù)中將外消旋體與薄膜屏障接觸。屏障通常分離兩種互溶液體，一種含有外消旋體，并且驅(qū)動(dòng)力如濃度或壓差使得優(yōu)先轉(zhuǎn)運(yùn)透過膜屏障。由于膜的非外消旋手性性質(zhì)只允許外消旋體的一種對映異構(gòu)體通過，從而實(shí)現(xiàn)分離。

在一個(gè)實(shí)施方案中使用包括但不限于模擬移動(dòng)床色譜法的手性色譜法。廣泛多種手性固定相可商購獲得。

IV.鹽或前藥制劑

在化合物具有足夠堿性或酸性以形成穩(wěn)定的無毒酸或堿鹽的情況下，施用作為藥學(xué)上可接受的鹽形式的化合物可為適當(dāng)?shù)?。藥學(xué)上可接受的鹽的實(shí)例是與形成生理學(xué)上可接受的陰離子的酸形成的有機(jī)酸加成鹽，例如甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、丙二酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、安息香酸鹽、抗壞血酸鹽、α-酮戊二酸鹽以及α-甘油磷酸鹽。還可形成適合的無機(jī)鹽，包括但不限于硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸氫鹽及碳酸鹽。

可利用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如將足夠堿性的化合物，如胺與提供生理學(xué)可接受的陰離子的合適的酸進(jìn)行反應(yīng)來獲得藥學(xué)上可接受的鹽。也可以制備羧酸的堿金屬(例如鈉、鉀或鋰)或堿土金屬(例如鈣)鹽。

前藥是以非活性(或顯著低活性)形式給藥，隨后在體內(nèi)代謝成活性代謝物的藥理學(xué)物質(zhì)。以較低的劑量將更多的藥物送到所需的目標(biāo)常常是使用前藥的背后的基本原理，并通常歸因于更好的吸收，分布，代謝和/或排泄(ADME)的屬性。通常將前藥設(shè)計(jì)成提高口服生物利用度，通常從胃腸道吸收差是限制因素。此外，使用前藥策略可以提高藥物對其預(yù)期目標(biāo)的選擇性從而降低偏離目標(biāo)效應(yīng)的可能性。

V.治療方法

感染了HCV或其基因片段的宿主(包括但不限于人)可通過在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑存在下向所述患者施用有效量的活性化合物或其藥學(xué)上可接受的前藥或鹽來治療?；钚晕镔|(zhì)可通過任何適當(dāng)途徑，例如口服、胃腸外、靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下或局部，以液體或固體形式來施用。

VI.聯(lián)合或交替療法

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物可與選自以下的至少一種其它抗病毒劑一起使用：聚合酶抑制劑、IMPDH抑制劑、蛋白酶抑制劑以及基于免疫的治療劑。

例如，當(dāng)用于治療或預(yù)防HCV感染時(shí)，活性化合物或其前藥或藥學(xué)上可接受的鹽可與另一種抗HCV劑組合或交替施用，所述抗HCV劑包括但不限于上式的那些物質(zhì)。一般說來，在聯(lián)合療法中，有效劑量的兩種或更多種試劑在一起施用，而在交替療法期間，有效劑量的每個(gè)試劑被連續(xù)地施用。劑量將取決于藥物的吸收、失活及排泄率以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。應(yīng)注意，劑量值還將隨有待緩解的病況的嚴(yán)重性而變化。進(jìn)一步應(yīng)理解的是對于任何具體的受試者、具體的給藥方案和安排都應(yīng)該根據(jù)個(gè)體的需要以及施用或監(jiān)督組合物施用的人的專業(yè)判斷并隨著時(shí)間來調(diào)整。

可與本文所公開的化合物組合使用的抗病毒劑的非限制性實(shí)例包括在下表中的那些。

目前的臨床開發(fā)中的抗丙型肝炎化合物的表格

VIII.藥物組合物

感染了HCV的宿主(包括但不限于人)可通過在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑存在下向所述患者施用有效量的活性化合物或其藥學(xué)上可接受的前藥或鹽來治療。活性物質(zhì)可通過任何適當(dāng)途徑，例如口服、胃腸外、靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下或局部，以液體或固體形式來施用。

化合物的優(yōu)選劑量將在以下范圍內(nèi)：在約0.01與約10mg/kg之間、更一般在約0.1與5mg/kg之間、且優(yōu)選地在約0.5與約2mg/kg接受者體重/天之間。藥學(xué)上可接受的鹽和前藥的有效劑量范圍可基于有待遞送的母體化合物的重量來計(jì)算。如果鹽或前藥本身展現(xiàn)活性，那么有效劑量可如上使用鹽或前藥的重量或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方式來估算。

化合物方便地以任何適合的單位劑型施用，包括但不限于含有7至300mg、優(yōu)選地70至140mg活性成分/單位劑型的劑型。5-300mg的口服劑量通常是適宜的。

活性化合物在藥物組合物中的濃度將取決于藥物的吸收、失活及排泄率以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。應(yīng)注意劑量值還將隨有待緩解的病況的嚴(yán)重性而變化。還應(yīng)理解，對于任何具體的受試者而言，具體的劑量方案應(yīng)根據(jù)個(gè)體需要和施用或監(jiān)督組合物施用的人員的職業(yè)判斷隨時(shí)間進(jìn)行調(diào)整，而且本文所列舉的濃度范圍只是示例性的，而不是為限制所要求保護(hù)的組合物的范圍或?qū)嵺`。活性成分可以一次施用，或者可將其分成許多較小的劑量，而以不同的時(shí)間間隔施用。

施用活性化合物的一個(gè)優(yōu)選模式是口服?？诜M合物通常將包含惰性稀釋劑或可食用的載體?？梢詫⑺鼈儼庠诿髂z膠囊中，或者壓制成片劑。為用于口服治療性施用目的，可以將活性化合物加入賦形劑中并以片劑、錠劑或膠囊形式使用。藥學(xué)上相容的粘合劑和/或佐劑物質(zhì)可以作為所述組合物的一部分包括在內(nèi)。

片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可含有任何以下成分或相似性質(zhì)的化合物：粘合劑如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；崩解劑如藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑如膠態(tài)二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或者調(diào)味劑如薄荷、水楊酸甲酯或橙味調(diào)味劑。當(dāng)所述單位劑型為膠囊時(shí)，除上述類型的物質(zhì)外，還可含有液體載體如脂肪油。另外，單位劑型還可含有各種改變劑量單位的物理形式的其它物質(zhì)，例如糖包衣、蟲膠或其它腸溶劑(enteric agent)。

所述化合物可以作為酏劑、混懸液、糖漿劑、干膠片(wafer)、咀嚼膠(chewing gum)等的組分施用。除(多種)活性化合物外，糖漿劑還可以含有作為甜味劑的蔗糖和某些防腐劑、染料和著色劑以及調(diào)味劑。

還可將化合物、其藥學(xué)上可接受的前藥或鹽與不損害所需作用的其它活性物質(zhì)混合，或與補(bǔ)充所需作用的物質(zhì)如抗生素、抗真菌劑、抗炎藥或其它抗病毒化合物混合。用于腸胃外、真皮內(nèi)、皮下或局部施用的溶液或混懸液可包含下列組分：無菌稀釋劑如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細(xì)菌劑如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及張力調(diào)節(jié)劑如氯化鈉或葡萄糖。腸胃外制劑可以被包封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶內(nèi)。

如果靜脈內(nèi)施用，那么優(yōu)選載體是生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述活性化合物與保護(hù)所述化合物免受體內(nèi)快速清除的載體共同制備，如控釋制劑，包括但不限于植入物和微膠囊遞送系統(tǒng)?？墒褂蒙锟山到庑?、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯及聚乳酸。例如，腸溶包衣的化合物可用來保護(hù)胃酸引起的裂解。用于制備這種制劑的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。適合的材料也可以商購獲得。

脂質(zhì)體懸浮液(包括但不限于靶向受感染細(xì)胞、具有針對病毒抗原的單克隆抗體的脂質(zhì)體)也優(yōu)選作為藥學(xué)上可接受的載體。這些可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如如美國專利號4,522,811(以引用的方式并入)中所述來制備。例如，可以如下制備脂質(zhì)體制劑：溶解合適的(多種)脂質(zhì)(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰膽堿、花生酰磷脂酰膽堿和膽固醇)于無機(jī)溶劑中，然后所述無機(jī)溶劑蒸發(fā)，在容器表面留下干脂質(zhì)的薄膜。然后將活性化合物的水溶液引入容器中。隨后用手轉(zhuǎn)動(dòng)容器使脂類物質(zhì)從容器壁上脫落并分散到脂類聚集物中，從而形成脂質(zhì)體混懸液。

描述本發(fā)明中所用的術(shù)語是常用的且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。如本文所用，以下縮寫具有指定含義：

ACN 乙腈

aq 含水

CDI 羰基二咪唑

DIPEA 二異丙基乙胺(Hunig's堿)

DMF N,N-二甲基甲酰胺

DMSO 二甲亞砜

EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽

EtOAc 乙酸乙酯

h 小時(shí)

HOBt N-羥基苯并三唑

M 摩爾

min 分鐘

Ms 甲磺酸

NCS N-氯代琥珀酰亞胺

NBS N-溴代琥珀酰亞胺

NIS N-碘代琥珀酰亞胺

Pyr 吡啶

rt或RT 室溫

TBAT 四丁基銨二氟三苯基硅酸鹽

TBTU O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸鹽

TEA 三乙胺

THF 四氫呋喃

Ts 甲苯磺酸鹽

IX.用于制備活性化合物的一般方案

還提供用于簡易制備活性化合物的方法。本文所公開的化合物可如下所詳細(xì)描述或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法來制備。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解到這些方案決非是限制性的而且在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可對這些方案進(jìn)行各種具體改變。

各種反應(yīng)方案概述如下。

方案1.是合成本發(fā)明活性化合物的一個(gè)非限制性實(shí)例，且特別是三取代咪唑的合成方法。

方案1三取代咪唑的合成

方案1.本發(fā)明的活性化合物的合成的非限制性實(shí)例，并且特別地，三取代咪唑的合成方法

在室溫或溫和加熱下，在諸如二惡烷、THF或乙腈的溶劑中，在合適的堿，諸如氫化鈉，Hunig堿，或TEA的存在下，通過用合適的環(huán)狀或非環(huán)狀氨基酸取代，從雙alpha-LG酮化合物VIII制備一般的酮-酯IX，其中LG基團(tuán)為合適的離去基團(tuán)，如I、Br、Cl、OMS、OTs等(方案2)。在諸如二甲苯、DMF、THF或甲苯的溶劑中用諸如氯化銨、溴化銨或乙酸銨的銨離子源處理IX，伴隨加熱8-36h，導(dǎo)致咪唑衍生物X的形成。

可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種方法在碳或氮原子處執(zhí)行咪唑環(huán)的廣泛取代?？梢酝ㄟ^諸如NBS，NCS和NIS和N-氟代苯磺酰亞胺的試劑引入鹵原子。Suzuki和Stille鈀催化的耦合條件能提供雜芳基衍生物、烯烴和炔衍生物?？捎迷噭┤鏣MSCN或TMSN3引入疊氮基或氰基。可以通過?；?、烷基化或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他方法完成氮取代。

取決于氨基酸保護(hù)基團(tuán)的性質(zhì)，其可以通過強(qiáng)酸或強(qiáng)路易斯酸如鹽酸、三氟乙酸或BBr₃除去。氫解或金屬還原也可以提供保護(hù)基團(tuán)去除。

可以通過?；?、烷基化或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他方法取代來自XI的未掩蔽的氮原子。最終，在標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)試劑如HATU、EDCI或PyBop的存在下，在堿諸如Hunig堿的存在下，通過用適當(dāng)取代的羧酸酰化可以實(shí)現(xiàn)XII型化合物。

在以下非限制實(shí)施例中進(jìn)一步說明本發(fā)明。方案1和實(shí)施例1-3顯示用于合成HCV抑制劑化合物的制備方法，并且實(shí)施例4-8顯示用于它們的生物學(xué)評價(jià)的方法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解這些實(shí)施例決非是限制性的而且在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以進(jìn)行細(xì)節(jié)的改變。

具體實(shí)施例

按照以下實(shí)施例和反應(yīng)順序制備本發(fā)明代表性的具體化合物；作為說明，提供實(shí)施例和描述反應(yīng)順序的示意圖，以幫助理解本發(fā)明，但不能將其解釋為以任何方式限制隨后的權(quán)利要求書中敘述的本發(fā)明。本發(fā)明化合物也可用作隨后的實(shí)施例中的中間體以產(chǎn)生本發(fā)明另外的化合物。沒有必要試圖對任何反應(yīng)中獲得的產(chǎn)率進(jìn)行優(yōu)化。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道如何通過反應(yīng)時(shí)間、溫度、溶劑和/試劑的常規(guī)改變來提高所述產(chǎn)率。

無水溶劑購自Aldrich Chemical Company公司(Milwaukee，WI)和EMD Chemicals公司。試劑購自商業(yè)來源。除非另外指出，否則在實(shí)施例中使用的材料得自易于獲取的商業(yè)供應(yīng)商，或者通過化學(xué)合成領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成。熔點(diǎn)(mp)是在電熱數(shù)字熔點(diǎn)儀上測定，并且未校正。1H和13C NMR譜用Varian Unity Plus 400光譜儀在室溫下測定，且以距離內(nèi)標(biāo)四甲基硅烷低場的ppm報(bào)道。使用氘交換、去耦實(shí)驗(yàn)或2D-COSY以確定質(zhì)子的歸屬。通過以下符號表示信號的多重度：s(單峰)，d(雙重峰)，dd(兩個(gè)雙重峰)，t(三重峰)，q(四重峰)，br(寬峰)，bs(寬單峰)，m(多重峰)。所有J值都以Hz為單位。質(zhì)譜是在Micromass Platform LC分光計(jì)上使用電噴霧技術(shù)測定的。元素分析通過Atlantic Microlab Inc.(Norcross,GA)進(jìn)行。在Whatman LK6F硅膠板上進(jìn)行分析TLC，且在Whatman PK5F硅膠板上進(jìn)行制備TLC。柱色譜法在硅膠上或經(jīng)由反相高效液相色譜法進(jìn)行。

實(shí)施例1

用于化合物30的合成的程序

方案1.中間體7的合成

(2S,4R)-4-((甲基磺?；?氧基)吡咯烷-l,2-二甲酸l-叔丁酯2-甲酯2：在0℃下，向N-Boc-反式-4-羥基-L-脯氨酸(15g，61.1mmol)的吡啶(72mL)溶液中加入甲磺酰氯(5.77ml，74.5mmol)，將反應(yīng)物在同溫度下攪拌反應(yīng)4小時(shí)，升溫至室溫，繼續(xù)攪拌過夜。真空緩慢除去溶劑，然后用乙酸乙酯(60mL)稀釋，用1N HCl水溶液洗滌(兩次)，用pH試紙測試第二次洗滌物以確認(rèn)其保持酸性。然后用水、碳酸氫鈉水溶液、水洗滌有機(jī)層，用硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，殘余物不經(jīng)進(jìn)一步純化用于下一步反應(yīng)，18g，91％。

(2S,4S)-4-(甲硫基)吡咯烷-1,2-二甲酸1-叔丁酯2-甲酯3：在室溫下，將硫代甲醇鈉(1g，14.2mmol)加入4-甲基磺酰氧基脯氨酸2(4g，12.3mmol)在無水DMF(15mL)中的溶液中，然后攪拌過夜，倒入水(40mL)中，用乙酸乙酯(30mL×2)萃取，用水洗滌，用硫酸鈉干燥，過濾并濃縮得到3.2g，94％(該物質(zhì)可以通過短的硅膠柱，用乙酸乙酯：己烷(1:1)純化，或?qū)⒋之a(chǎn)物直接用于下一步驟中)。

(2S,4S)-1-(叔丁氧羰基)-4-(甲硫基)吡咯烷-2-甲酸4：將氫氧化鋰(5g，0.2mol)加入4-甲硫基脯氨酸3(5g，18.2mmol)在甲醇(40mL)和水(40mL)中的溶液中并將所得反應(yīng)混合物攪拌過夜。真空蒸發(fā)甲醇，用乙酸乙酯萃取，棄去分離的有機(jī)層。水層用6N HCl酸化，用乙酸乙酯萃取，用水洗滌，用硫酸鈉干燥，過濾并濃縮，得到4g，85％。

(2S,4S)-2-(5-(4-溴苯基)-1H-咪唑-2-基)-4-(甲硫基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯7：在室溫下，向羧酸衍生物4(2g，7.7mmol)的乙腈(10mL)溶液中加入2-溴-1-(4-溴苯基)乙酮5(2g，7.2mmol)和DIPEA(1.32mL，7.57mmol)，并將所得反應(yīng)混合物攪拌過夜。在18h，將反應(yīng)物倒入水中，用乙酸乙酯(20mL×2)萃取，用硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。所需化合物6無需任何純化即可用于下一步反應(yīng)。

將粗酯6用甲苯(20mL)稀釋，并加入乙酸銨(4g)。將所得反應(yīng)在110℃下加熱過夜，用水稀釋，用乙酸乙酯萃取，用硫酸鈉干燥，過濾，濃縮并通過硅膠色譜法用乙酸乙酯：己烷(1:1)純化，得到白色固體，2g，64％。

方案2.中間體12的合成

(S)-2-(5-(4-溴苯基)-1H-咪唑-2-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯10：在5℃下，將DIPEA(9.7mL，55.6mmol)滴加到2-溴-1-(4-溴苯基)乙酮5(15g，53.9mmol)和1-(叔丁氧羰基)-L-脯氨酸(12g，55.7mol)的乙腈(100mL)溶液中。將所得黃色溶液溫?zé)嶂潦覝夭嚢柽^夜。將混合物用水(20mL)，飽和碳酸氫鈉溶液(20mL×2)，鹽水(20mL)洗滌，用Na₂SO₄干燥并真空蒸發(fā)，得到黃色固體9；該殘余物不經(jīng)任何純化用于下一步反應(yīng)。

將殘余物9用甲苯(200mL)稀釋，并加入乙酸銨(20g)。將所得混合物在130℃下加熱24小時(shí)。冷卻后，將混合物倒入水中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。將合并的有機(jī)物用水，飽和碳酸氫鈉，水洗滌，經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并濃縮。殘余物通過硅膠色譜法用乙酸乙酯：己烷＝20:100至50:50純化，得到白色固體14.8g，70％。此外，化合物可以通過在己烷：乙酸甲酯(50:20)的溶劑中的懸浮來純化，然后過濾并用相同的溶劑洗滌，得到黃色固體。純度對于下一反應(yīng)是足夠好的。

(S)-2-(5-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼雜環(huán)戊烷-2-基)苯基)-1H-咪唑-2-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯11：將化合物10(4g，10.2mmol)，雙(頻哪醇)二硼(5.44，21.4mmol)，乙酸鉀(2.56g，26.08mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(480mg，0.41mmol)在1,4-二惡烷(60mL)中的混合物在80℃下在氮?dú)庀聰嚢?0小時(shí)。原料消耗后，過濾混合物；在真空下濃縮濾液。將殘余物用二氯甲烷和水分配，用二氯甲烷(20mL×2)萃取水。合并有機(jī)層，用硫酸鈉干燥，過濾，濃縮并通過硅膠色譜法用乙酸乙酯：己烷(10:100至50:50)純化，得到3.6g，80％。

(S)-2-(4-氯-5-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼雜環(huán)戊烷-2-基)苯基)-1H-咪唑-2-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯12：向化合物11(0.61g，1.38mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液中加入NCS(0.31g，2.32mmol)并將所得反應(yīng)混合物攪拌過夜。在16和24小時(shí)之間加入三至四份NCS(0.1g)以推動(dòng)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物倒入水中，用二氯甲烷(10mL×3)萃取。合并的有機(jī)層用飽和碳酸氫鈉、連二亞硫酸鈉、水洗滌，用硫酸鈉干燥，過濾，濃縮并通過硅膠色譜法用乙酸乙酯：己烷(1:5至1:1)純化，得到500mg，77％。

方案3. 30的合成

(2S，4S)-2-(5-(4'-(2-((S)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-4-氯-1H-咪唑-5-基)-[1'-聯(lián)苯]-4-基)-1H-咪唑-2-基)-4-(甲硫基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯13：將化合物7(0.47g，1.07mmol)和化合物12(0.5g，1.05mmol)，碳酸氫鈉(0.383g，4.55mmol)，二乙氧基甲烷(30mL)，水(9mL)，[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)(139.09mg，0.19mmol)的混合物在氮?dú)庀略?0℃下加熱并攪拌過夜。在18小時(shí)時(shí)，將反應(yīng)物冷卻，倒入水中，用乙酸乙酯萃取，用硫酸鈉干燥，過濾，濃縮并通過硅膠色譜法用乙酸乙酯：己烷(1:1)純化，得到0.5g，67％。

4-氯-5-(4'-(2-((2S，4S)-4-(甲硫基)吡咯烷-2-基)-1H-咪唑-5-基)-[1,1'-聯(lián)苯]-4-基)-2-((S)-吡咯烷-2-基)-1H-咪唑-4HCl 14：在室溫下，向化合物13(500mg，0.708mmol)的甲醇(5mL)溶液中加入6N HCl(3mL)。將反應(yīng)溫?zé)嶂?0℃，保持5h。將所得漿液蒸發(fā)并與乙醇共蒸發(fā)3次，過濾，用少量的乙腈洗滌，得到黃色固體(足夠干燥以用于下一反應(yīng))350mg，76％。

(S)-2-((甲氧基羰基)氨基)-2-苯基乙酸15：將Na₂CO₃(1.83g，17.2mmol)加入到溶液NaOH(33mL 1M/H₂O，33mmol)和L-苯基甘氨酸(5.0g，33.29mmol)中，然后將所得溶液用冰浴冷卻。將氯甲酸甲酯(2.8mL，36.1mmol)滴加到冷卻的溶劑中。加完后，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3.25小時(shí)。反應(yīng)混合物用乙醚(30mL×3)洗滌，水相用冰浴冷卻并用濃HCl酸化至pH區(qū)間為1-2，用CH₂Cl₂(30mL×3)萃取，用硫酸鈉并真空濃縮，得到白色固體，6.2g，90％。

((S)-2-((2S,4S)-2-(5-(4'-(4-氯-2-((S)-1-((S)-2-((甲氧基羰基氨基)-2-苯基乙?；?吡咯烷-2-基)-1H-咪唑-5-基)-[1,1'-聯(lián)苯]-4-基)-1H-咪唑-2-基)-4-(甲硫基)吡咯烷-1-基)-2-氧代-1-苯基乙基)氨基甲酸甲酯30：

在-30℃下向14(50mg，0.076mmol)和(S)-2-((甲氧基羰基)氨基)-2-苯基乙酸(48mg，0.23mmol)的DMF(2mL)攪拌溶液中加入DIPEA(81.5μL，0.46mmol)，然后加入COMU*(98.25mg，0.23mmol)。將反應(yīng)混合物在-20℃至-10℃下攪拌2-2.5小時(shí)(通過TLC，反應(yīng)應(yīng)該是一個(gè)主要的點(diǎn)，然后淬滅反應(yīng))。向冷反應(yīng)物中加入水(1mL)，所得溶液用乙酸乙酯(10mL×2)萃取。將合并的有機(jī)物用水、飽和碳酸氫鈉、飽和氯化鈉洗滌，用硫酸鈉干燥，并用二氯甲烷：甲醇＝100:1至100:5的硅膠色譜法純化，得到淺黃色固體53mg，78％>。

化合物30的¹³C和¹H NMR譜分別示于圖1和2中。

*1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亞乙基氨基氧基)二甲基氨基嗎啉代碳鎓六氟磷酸鹽(1075198-30-9)

(6-2-(((甲基過氧基)甲基)氨基)-2-苯基乙酸¹的合成

將L-α-苯基甘氨酸(4g，26.46mmol)溶于THF(80mL)中，隨后加入在水(80mL)中的碳酸氫鈉(6.68g，79.54mmol)，然后在冰浴冷卻下加入氯甲酸甲酯(2.25mL，29.18mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。將混合物用6N HCl酸化至pH 2-3，然后真空濃縮除去THF。水層用乙酸乙酯(20mL×2)萃取，有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，得到淺黃色固體，用乙酸乙酯和己烷的混合溶劑(V/V 20/60)研磨數(shù)次，得到白色固體，4.73g，84％。

(1)(5)-2-(((甲基過氧基)甲基)氨基)-2-苯基乙酸使用氫氧化鈉方法在合成最終化合物時(shí)產(chǎn)生痕量的外消旋化。碳酸氫鈉法可以得到完全單一的異構(gòu)體。

實(shí)施例2

細(xì)胞毒性測定

如先前所述，在Vera，人PBM，CEM(人類淋巴母細(xì)胞)，MT-2和HepG2細(xì)胞中評估化合物的毒性(參見Schinazi R.F.,Sommadossi J.-P.,Saalmann V.,Cannon D.L.,Xie M.-Y.,Hart G.C.,Smith G.A.&Hahn E.F.Antimicrob.Agents Chemother.1990,34,1061-67)。包括環(huán)己酰亞胺作為陽性細(xì)胞毒性對照，并包括暴露于溶劑的未處理細(xì)胞作為陰性對照。使用前述中值有效方法從濃度-反應(yīng)曲線獲得細(xì)胞毒性IC50(參見Chou T.-C.&Talalay P.Adv.Enzyme Regul.1984,22,27-55；Belen'kii M.S.&Schinazi R.F.Antiviral Res.1994,25,1-11)。

實(shí)施例3

在HepG2細(xì)胞中的線粒體毒性測定：

i)化合物對細(xì)胞生長和乳酸產(chǎn)生的影響：對HepG2細(xì)胞生長的影響可通過在0μΜ、0.1μΜ、1μΜ、10μΜ及100μΜ藥物存在下孵育細(xì)胞來確定?？蓪⒓?xì)胞(5×10⁴個(gè)/孔)接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的具有補(bǔ)充有10％胎牛血清、1％丙酮酸鈉及1％青霉素/鏈霉素的非必需氨基酸的最小必需培養(yǎng)基中并且在37℃下孵育4天。孵育期結(jié)束時(shí)，細(xì)胞數(shù)量可使用血球計(jì)來測定。還由Pan-Zhou X-R,Cui L,Zhou X-J,Sommadossi J-P,Darley-Usmer VM."Differential effects of antiretroviral nucleoside analogs on mitochondrial function in HepG2 cells"Antimicrob.Agents Chemother.2000；44:496-503所教導(dǎo)。為了測量化合物對乳酸產(chǎn)生的影響，來自儲(chǔ)備培養(yǎng)物的HepG2細(xì)胞可被稀釋并以2.5×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔接種于12孔培養(yǎng)板中?？商砑痈鞣N濃度(0μΜ、0.1μΜ、1μΜ、10μΜ及100μΜ)的化合物，并且可將培養(yǎng)物在37℃下在濕潤的5％CO₂氣氛中孵育4天。在第4天，可測定每個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)量并收集培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)基過濾，并且使用比色乳酸測定(Sigma-Aldrich)來測定培養(yǎng)基中的乳酸含量。因?yàn)槿樗岙a(chǎn)物可被視為受損的線粒體功能的標(biāo)記物，所以在測試化合物存在下生長的細(xì)胞中檢測到的升高水平的乳酸產(chǎn)生可用于指示藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)。

ii)化合物對線粒體DNA合成的影響：已開發(fā)了精確地定量線粒體DNA含量的實(shí)時(shí)PCR測定(參見Stuyver LJ,Lostia S,Adams M,Mathew JS,Pai BS,Grier J,Tharnish PM,Choi Y,Chong Y,Choo H,Chu C K,Otto MJ,Schinazi RF.Antiviral activities and cellular toxicities of modified 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrocytidine analogs.Antimicrob.Agents Chemother.2002；46:3854-60)。此測定可用于本申請中所述的所有研究，所述研究確定化合物對線粒體DNA含量的影響。在此測定中，低傳代數(shù)的HepG2細(xì)胞可以5,000個(gè)細(xì)胞/孔接種于膠原涂覆的96孔板中。將測試化合物添加至培養(yǎng)基中以獲得0μΜ、0.1μΜ、10μΜ及100μΜ的最終濃度。在培養(yǎng)第7天，細(xì)胞核酸可通過使用可商購獲得的柱(RNeasy 96試劑盒；Qiagen)來制備。這些試劑盒共同純化RNA和DNA，且因此將總核酸從柱上洗脫。線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基II(COXII)基因及β-肌動(dòng)蛋白或rRNA基因可使用多重Q-PCR方案從5μl洗脫的核酸來擴(kuò)增，其中適合的引物和探針用于靶標(biāo)和參照擴(kuò)增兩者。對于COXII，可分別使用以下有義、探針及反義引物：5'-TGCCCGCCATCATCCTA-3'*、5'-四氯-6-羧基熒光素-TCCTCATCGCCCTCCCATCCC-TAMRA-3'及5'-CGTCTGTTATGTAAAGGATGCGT-3'*。對于β-肌動(dòng)蛋白基因(GenBank登錄號E01094)的外顯子3，有義、探針及反義引物分別是5'-GCGCGGCTACAGCTTCA-3'*、5'*-6-FAMCACCACGGCCGAGCGGGATAMRA-3'*及5'-TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'*。rRNA基因的引物和探針可從Applied Biosystems商購獲得。因?yàn)橄嗟鹊臄U(kuò)增效率可對于所有基因獲得，所以比較CT方法可用于研究線粒體DNA合成的可能抑制。比較CT方法使用以下算術(shù)公式，其中靶標(biāo)(COXII基因)的量相對于內(nèi)源參照物(β-肌動(dòng)蛋白或rRNA基因)的量進(jìn)行歸一化并且與校準(zhǔn)器有關(guān)(在第7天時(shí)沒有藥物的對照)。用于此方法的算術(shù)公式是由2-ΔΔCT給出，其中ΔΔCT是(平均靶標(biāo)測試樣品的CT-靶標(biāo)對照的CT)-(平均參照測試的CT-參照對照的CT)(參見Johnson MR,K Wang,J B Smith,MJ Heslin,RB Diasio.Quantitation of dihydropyrimidine dehydrogenase expression by real-time reverse transcription polymera se chain reaction.Anal.Biochem.2000；278:175-184)。在藥物存在下生長的細(xì)胞中的線粒體DNA含量的下降指示線粒體毒性。

實(shí)施例4

在Neuro2A細(xì)胞中的線粒體毒性測定

為了估計(jì)本發(fā)明的化合物產(chǎn)生神經(jīng)元毒性的可能性，小鼠Neuro2A細(xì)胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心131)可用作模型系統(tǒng)(參見Ray AS,H ernandez-Santiago BI,Mathew JS,Murakami E,Bozeman C,Xie MY,Dutschman GE,Gullen E,Yang Z,Hurwitz S,Cheng YC,Chu CK,McClure H,Schinazi RF,Anderson KS.Mechanism of anti-human immunodeficiency virus activity of beta-D-6-cyclopropylamino-2',3'-didehydro-2',3'-dideoxyguanosine.Antimicwb.Agen ts Chemother.2005,49,1994-2001)。抑制50％細(xì)胞生長所必需的濃度(CC50)可使用基于3-(4,5-二甲基-噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物染料的測定如所述來測量。細(xì)胞乳酸和線粒體DNA水平在限定的藥物濃度下的擾動(dòng)可如上所述進(jìn)行。在所有實(shí)驗(yàn)中，ddC和AZT可用作對照核苷類似物。

實(shí)施例5

骨髓細(xì)胞毒性的測定

原代人骨髓單核細(xì)胞可從Cambrex Bioscience(Walkersville，MD)商購獲得。CFU-GM測定可在50單位/mL人重組粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子存在下使用雙層軟瓊脂進(jìn)行，而BFU-E測定使用含有1單位/mL促紅細(xì)胞生成素的甲基纖維素基質(zhì)(參見Sommadossi JP,Carlisle R.Toxicity of 3'-azido-3'-deoxythymidine and 9-(1,3-dihydrosy-2-propoxymethyl)guanine for normal human hepatopoietic progenitor cells in vitro.Antimicrob.Agents Chemother.1987；31:452-454；Sommadossi,JP,Schinazi,RF,Chu,CK,and Xie,MY.Comparison of Cytotoxicity of the(-)and(+)enantiomer of 2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine in normal human bone marrow progenitor cells.Biochem.Pharmacol.1992；44:1921-1925)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)都在來自三個(gè)不同供體的細(xì)胞中一式兩份進(jìn)行。AZT可用作陽性對照。細(xì)胞可在化合物存在下在37℃和5％CO₂下孵育14-18天，并且大于50個(gè)細(xì)胞的集落可使用倒置顯微鏡計(jì)數(shù)以測定IC₅₀。50％抑制濃度(IC50)可通過藥物濃度對BFU-E存活分?jǐn)?shù)的對數(shù)的最小二乘法線性回歸分析來獲得。統(tǒng)計(jì)分析可用針對獨(dú)立的非成對樣品的Student's t檢驗(yàn)進(jìn)行。

實(shí)施例6

HCV復(fù)制子測定¹

將含有HCV復(fù)制子RNA的Huh 7 Clone B細(xì)胞以5000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，并且在接種之后立即一式三份在10μΜ下測試化合物。五天孵育(37℃，5％CO₂)之后，通過使用來自Gentra的versaGene RNA純化試劑盒分離總細(xì)胞RNA。在單步多重實(shí)時(shí)RT-PCR測定中擴(kuò)增復(fù)制子RNA和內(nèi)部對照(TaqMan rRNA對照試劑，Applied Biosystems)?；衔锏目共《拘Яνㄟ^從無藥物的對照(ΔCt HCV)的閾值RT-PCR循環(huán)減去測試化合物的閾值RT-PCR循環(huán)來計(jì)算。3.3的ΔCt等于復(fù)制子RNA水平的1-log減少(等于90％較少的起始材料)?；衔锏募?xì)胞毒性還通過使用ΔCt rRNA值來計(jì)算。2'-C-Me-C被用作陽性對照。為了測定EC₉₀和IC₅₀值²，ΔCt：值首先被轉(zhuǎn)換為起始材料³的分?jǐn)?shù)，然后用于計(jì)算抑制％。

參考文獻(xiàn)：

1.Stuyver L et al.，Ribonucleoside analogue that blocks replication or bovine viral diarrhea and hepatitis C viruses in culture.Antimicrob.Agents Chemother.2003，47，244-254.

2.Reed IJ&Muench H，A simple method or estimating fifty percent endpoints.Am.J.Hyg.27：497，1938.

3.Applied Biosystems公司手冊

針對HCV lb的半數(shù)有效濃度(EC₅₀)范圍如下：

A＝1-10μΜ

B＝100-999nM

C＝1-99nM

D＝<1nM

實(shí)施例7：人肝微粒體中NS5A抑制劑化合物A和化合物B的代謝研究

目的

為了鑒定化合物30在人肝微粒體中的代謝物。

化學(xué)品

甲醇和乙腈購自(飛世爾科技)

甲酸購自ACROS Organics。

水經(jīng)純化和去離子。

儀器儀表

HPLC系統(tǒng)是由兩個(gè)三元泵，真空脫氣機(jī)，恒溫自動(dòng)進(jìn)樣器，和恒溫柱室(Dionex Corporation，Sunnyvale，CA)組成的Ultimate 3000模塊化LC系統(tǒng)。TSQ Quantum Ultra三重四極桿質(zhì)譜儀(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA。)用于檢測。Thermo Xcalibur軟件版本2.0用于操作HPLC，質(zhì)譜儀用于執(zhí)行數(shù)據(jù)分析。

方法概述&結(jié)果

在磷酸鉀緩沖液中用人肝微粒體孵育化合物(1μΜ最終濃度)。在測定中微粒體蛋白濃度為1mg/mL，并且DMSO最終百分比為小于0.2％。反應(yīng)通過加入NADPH開始，并在60分鐘時(shí)由200μl，80％的冰冷的MeOH(含有100nM的內(nèi)標(biāo)RS-1174)結(jié)束。樣本通過LC-MS/MS進(jìn)行定性和定量分析。

在具有3μm粒徑的Hypersil GOLD柱(100×1.0mm)(Thermo Electron，Waltham，MA)上進(jìn)行梯度分離。流動(dòng)相A由含0.1％甲酸的水組成且B由乙腈組成。在8分鐘內(nèi)流動(dòng)相B由15％上升到100％，并保持在100％2分鐘。流速保持在50μl/min并使用了25μl進(jìn)樣量。自動(dòng)進(jìn)樣器保持在4℃，并且將柱保持在30℃。

將前3.0分鐘分析轉(zhuǎn)移到廢液。在噴射電壓為3.0kV，鞘氣為50(任意單位)，離子吹掃氣為0.2(任意單位)，輔助氣體為5(任意單位)，并且毛細(xì)管溫度為300℃的負(fù)電離模式中操作質(zhì)譜儀。碰撞室壓力維持在1.5mTorr。前體和產(chǎn)物離子躍遷分別在下面的表中列出。

實(shí)施例8：先導(dǎo)化合物的HCV活性和細(xì)胞毒性的評價(jià)

雖然不希望束縛于特定的理論，然而在可能在體內(nèi)提供多種生物活性實(shí)體的含硫代甲基的化合物中，抗HCV活性和缺乏細(xì)胞毒性的最佳組合似乎在含有至少一個(gè)硫代甲基和0-2個(gè)氯原子的化合物中發(fā)現(xiàn)。

總體而言，含有至少一個(gè)硫代甲基和至少一個(gè)氯原子，最好具有連接到吡咯烷環(huán)的苯丙氨酸的那些化合物具有最佳的毒性和抗HCV活性譜。

使用上面的實(shí)施例中的方案評價(jià)式(I)的范圍內(nèi)的一系列化合物的活性和細(xì)胞毒性，并且將數(shù)據(jù)概括于下表中。

本發(fā)明的范圍不限于本文所述的具體實(shí)施方案。實(shí)際上，除了所描述的那些之外，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說根據(jù)前面的描述和附圖本發(fā)明的各種修改將變得顯而易見。這樣的修改旨在落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

本文引用了各種出版物，其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。