人KRAS中單核苷酸多態(tài)性的檢測的制作方法

本發(fā)明涉及人KRAS中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，涉及鑒別一種或多種SNP在人KRAS中的存在與否的方法，涉及選擇癌癥療法的方法，和涉及預(yù)測對癌癥療法的應(yīng)答的方法。
背景技術(shù)：
：基因v-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS)與多種癌癥（例如，結(jié)直腸癌和非小細胞肺癌）有關(guān)。具體地，癌癥可能與KRAS基因的密碼子12、13和61中的突變（即單核苷酸多態(tài)性(SNP)）有關(guān)。這些SNP可以指示遭受癌癥的受試者對一種或多種癌癥療法的應(yīng)答性。該預(yù)測又輔助癌癥療法的選擇以施用給受試者。本發(fā)明的用于檢測這些SNP的測定包括基于擴增的測定，其能夠檢測兩個反應(yīng)混合物中的多種SNP。但是，這樣的測定不會鑒別存在的具體突變，而是僅僅檢測任何突變是否存在。如果鑒別SNP的同一性存在與否失敗，那么這些測定不允許使用者預(yù)測遭受癌癥的受試者對一種或多種癌癥療法的應(yīng)答，由此阻礙用于所述受試者的癌癥療法的選擇。其它基于擴增的測定鑒別具體的SNP，但是為此目的，每個SNP需要一個反應(yīng)混合物，且因而，需要較大樣品輸入。用于診斷測試的樣品通常具有小尺寸，且因此，較大量樣品在一個測定中的應(yīng)用會限制在另一個測定中測試另外標志物的能力。因此，需要開發(fā)這樣的方法：其用小量樣品輸入來檢測和鑒別KRAS基因中的多種SNP以促進受試者對一種或多種癌癥療法的應(yīng)答的預(yù)測。KRAS基因的特定SNP的鑒別將進一步允許從業(yè)人員為受試者選擇適當?shù)陌┌Y療法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種引物，其包含選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47和SEQIDNO:48的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及一種引物集合，其包含(a)選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:7和SEQIDNO:43的正向引物；(b)選自SEQIDNO:6、SEQIDNO:11和SEQIDNO:48的反向引物；和(c)選自SEQIDNO:52和SEQIDNO:56的肽核酸寡聚體。所述引物集合可以選自：(a)SEQIDNO:2、SEQIDNO:6和SEQIDNO:52；(b)SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:43、SEQIDNO:48和SEQIDNO:52；(c)SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:11、SEQIDNO:52和SEQIDNO:56；(d)SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:11、SEQIDNO:43、SEQIDNO:48、SEQIDNO:52和SEQIDNO:56；(e)SEQIDNO:7、SEQIDNO:11和SEQIDNO:56；和(f)SEQIDNO:7、SEQIDNO:11、SEQIDNO:43、SEQIDNO:48和SEQIDNO:56。本發(fā)明還涉及一種探針，其包含選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50和SEQIDNO:51的核苷酸序列。所述探針可以包含與可檢測標記組合的選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50和SEQIDNO:51的核苷酸序列。所述可檢測標記可以是熒光標記。所述熒光標記可以選自FAM、NED、Cy5和VIC。所述探針還可以包含猝滅劑部分。本發(fā)明還涉及一種探針，其還可以包含與可檢測標記組合的選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50和SEQIDNO:51的核苷酸序列，其中所述可檢測標記可以是熒光標記。所述熒光標記可以選自FAM、NED、Cy5和VIC。本發(fā)明還涉及一種探針，其包含選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50和SEQIDNO:51的核苷酸序列。所述探針還可以包含與可檢測標記和猝滅劑部分組合的選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50和SEQIDNO:51的核苷酸序列。所述可檢測標記可以是熒光標記。所述熒光標記可以選自FAM、NED、Cy5和VIC。本發(fā)明還涉及一種引物和探針集合，其包含：(a)一種或多種選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的正向引物；(b)一種或多種選自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的反向引物；(c)一種或多種選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的探針；和(d)一種或多種選自SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56和SEQIDNO:57的肽核酸寡聚體。所述一種或多種探針可以選自：SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41和SEQIDNO:42，且還包含可檢測標記。所述可檢測標記可以是熒光標記。所述熒光標記可以選自FAM、NED、Cy5和VIC。所述一種或多種探針可以選自：SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41和SEQIDNO:42，且還包含可檢測標記，且還可以包含猝滅劑部分。所述引物和探針集合還可以包含內(nèi)部對照集合，其包含：(a)正向引物，其包含SEQIDNO:43、SEQIDNO:44或SEQIDNO:45所示的核苷酸序列；(b)反向引物，其包含SEQIDNO:46、SEQIDNO:47或SEQIDNO:48所示的核苷酸序列；和(c)探針，其包含SEQIDNO:49、SEQIDNO:50或SEQIDNO:51所示的核苷酸序列。包含SEQIDNO:49、SEQIDNO:50或SEQIDNO:51所示的核苷酸序列的探針還可以包含可檢測標記。所述可檢測標記可以是熒光標記。包含SEQIDNO:49、SEQIDNO:50或SEQIDNO:51所示的核苷酸序列的探針還可以包含猝滅劑部分。所述引物和探針集合可以選自：(a)SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:43、SEQIDNO:48、SEQIDNO:52、SEQIDNO:22、SEQIDNO:27、SEQIDNO:30和SEQIDNO:51；(b)SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:43、SEQIDNO:48、SEQIDNO:52、SEQIDNO:13、SEQIDNO:16、SEQIDNO:20和SEQIDNO:51；和(c)SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:11、SEQIDNO:43、SEQIDNO:48、SEQIDNO:52、SEQIDNO:56、SEQIDNO:31、SEQIDNO:34、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40和SEQIDNO:51。本發(fā)明還涉及一種引物和探針集合，其包含：(a)一種或多種選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的正向引物；(b)一種或多種選自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的反向引物；(c)一種或多種選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的探針；和(d)一種或多種選自SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56和SEQIDNO:57的肽核酸寡聚體。在所述引物和探針集合中，所述一種或多種探針可以包含可檢測標記。該可檢測標記可以是熒光標記，其中所述熒光標記選自FAM、NED、Cy5和VIC。在所述引物和探針集合中，所述一種或多種探針還可以包含猝滅劑部分。本發(fā)明還涉及一種引物和探針集合，其包含：(a)一種或多種選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的正向引物；(b)一種或多種選自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的反向引物；(c)一種或多種選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的探針；和(d)一種或多種選自SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56和SEQIDNO:57的肽核酸寡聚體。該引物和探針集合還可以包含內(nèi)部對照集合，其包含：(a)正向引物，其含有SEQIDNO:43、SEQIDNO:44或SEQIDNO:45所示的核苷酸序列；(b)反向引物，其含有SEQIDNO:46、SEQIDNO:47或SEQIDNO:48所示的核苷酸序列；和(c)探針，其含有SEQIDNO:49、SEQIDNO:50或SEQIDNO:51所示的核苷酸序列。該引物和探針集合可以選自：(a)SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:43、SEQIDNO:48、SEQIDNO:52、SEQIDNO:22、SEQIDNO:27、SEQIDNO:30和SEQIDNO:51；(b)SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:43、SEQIDNO:48、SEQIDNO:52、SEQIDNO:13、SEQIDNO:16、SEQIDNO:20和SEQIDNO:51；和(c)SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:11、SEQIDNO:43、SEQIDNO:48、SEQIDNO:52、SEQIDNO:56、SEQIDNO:31、SEQIDNO:34、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40和SEQIDNO:51。本發(fā)明還涉及一種引物和探針集合，其包含：(a)一種或多種選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的正向引物；(b)一種或多種選自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的反向引物；(c)一種或多種選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的探針；和(d)一種或多種選自SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56和SEQIDNO:57的肽核酸寡聚體。該引物和探針集合還可以包含內(nèi)部對照集合，其包含：(a)正向引物，其含有SEQIDNO:43、SEQIDNO:44或SEQIDNO:45所示的核苷酸序列；(b)反向引物，其含有SEQIDNO:46、SEQIDNO:47或SEQIDNO:48所示的核苷酸序列；和(c)探針，其含有SEQIDNO:49、SEQIDNO:50或SEQIDNO:51所示的核苷酸序列。在該引物和探針集合中，含有SEQIDNO:49、SEQIDNO:50或SEQIDNO:51所示的核苷酸序列的探針還可以包含可檢測標記。在該引物和探針集合中，含有SEQIDNO:49、SEQIDNO:50或SEQIDNO:51所示的核苷酸序列的探針還可以包含猝滅劑部分。在該引物和探針集合中，所述一種或多種探針還可以包含可檢測標記。本發(fā)明還涉及鑒別一種或多種單核苷酸多態(tài)性(SNP)在v-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS)中的存在與否的方法，所述方法包括：(a)形成反應(yīng)混合物，其包含(i)得自受試者的樣品，其中所述樣品疑似含有KRAS靶序列，和(ii)一種引物和探針集合，其包含：a.一種或多種選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的正向引物；b.一種或多種選自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的反向引物；c.一種或多種選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的探針；和d.一種或多種選自SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56和SEQIDNO:57的肽核酸寡聚體；(b)使所述反應(yīng)混合物處于足以形成一種或多種擴增子的條件；和(c)檢測所述一種或多種擴增子。所述反應(yīng)混合物還可以包含內(nèi)部對照，所述內(nèi)部對照包含：(a)正向引物，其含有SEQIDNO:43、SEQIDNO:44或SEQIDNO:45所示的核苷酸序列；(b)反向引物，其含有SEQIDNO:46、SEQIDNO:47或SEQIDNO:48所示的核苷酸序列；和(c)探針，其含有SEQIDNO:49、SEQIDNO:50或SEQIDNO:51所示的核苷酸序列。所述鑒別方法還可以包括確定循環(huán)數(shù)目的差異(ΔCN)。所述ΔCN可以是與含有SNP的擴增子有關(guān)的循環(huán)數(shù)目和與從內(nèi)部對照產(chǎn)生的擴增子有關(guān)的循環(huán)數(shù)目之間的差異。如果ΔCN小于截止值，那么SNP可以存在于KRAS中。所述鑒別方法還可以包括基于在上面步驟(c)中描述的檢測鑒別一種或多種SNP在KRAS中的存在。在該方法中，所述一種或多種SNP可以選自G12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13D、G13C和Q61H。在該方法中，所述引物和探針集合的一種或多種探針可以包含可檢測標記。所述可檢測標記可以是熒光標記。所述可檢測標記可以選自FAM、Cy5、NED和VIC。權(quán)利要求的引物和探針集合的一種或多種探針還可以包含猝滅劑部分。在該方法中，檢測可以包括測量由所述可檢測標記產(chǎn)生的熒光信號。在該方法中，權(quán)利要求的引物和探針集合可以是選自以下的引物和探針集合：(a)SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:52、SEQIDNO:22、SEQIDNO:27和SEQIDNO:30；(b)SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:52、SEQIDNO:13、SEQIDNO:16和SEQIDNO:20；和(c)SEQIDNO:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:11、SEQIDNO:52、SEQIDNO:56、SEQIDNO:31、SEQIDNO:34、SEQIDNO:38和SEQIDNO:40。在該方法中，所述樣品可以得自受試者的癌性組織。所述癌性組織可以是來自結(jié)直腸癌或非小細胞肺癌的組織。所述樣品可以是從固定的福爾馬林石蠟包埋的樣品提取的核酸。所述核酸可以是基因組DNA。在該方法中，所述樣品可以是血液樣品、血清樣品或血漿樣品。所述樣品可以是循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)。在該方法中，形成反應(yīng)混合物可以包括形成三種反應(yīng)混合物，每種反應(yīng)混合物包含所述得自受試者的樣品以及所述引物和探針集合。第一反應(yīng)混合物可以包含所述得自受試者的樣品、正向引物SEQIDNO:2、反向引物SEQIDNO:6、肽核酸寡聚體SEQIDNO:52；和探針SEQIDNO:22、SEQIDNO:27和SEQIDNO:30。第二反應(yīng)混合物可以包含所述得自受試者的樣品、正向引物SEQIDNO:2、反向引物SEQIDNO:6、肽核酸寡聚體SEQIDNO:52；和探針SEQIDNO:13、SEQIDNO:16和SEQIDNO:20。第三反應(yīng)混合物可以包含所述得自受試者的樣品、正向引物SEQIDNO:2、反向引物SEQIDNO:6、正向引物SEQIDNO:7、反向引物SEQIDNO:11、肽核酸寡聚體SEQIDNO:52、肽核酸寡聚體SEQIDNO:56和探針SEQIDNO:31、SEQIDNO:34、SEQIDNO:38和SEQIDNO:40。第一、第二和第三反應(yīng)混合物中的每一種還可以包含內(nèi)部對照，所述內(nèi)部對照包含(a)正向引物，其含有SEQIDNO:43所示的核苷酸序列；(b)反向引物，其含有SEQIDNO:48所示的核苷酸序列；和(c)探針，其含有SEQIDNO:51所示的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及鑒別一種或多種單核苷酸多態(tài)性(SNP)在v-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS)中的存在與否的方法，所述方法包括：(a)形成反應(yīng)混合物，其包含(i)得自受試者的樣品，其中所述樣品疑似含有KRAS靶序列，和(ii)一種引物和探針集合，其包含：a.一種或多種選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的正向引物；b.一種或多種選自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的反向引物；c.一種或多種選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的探針；和d.一種或多種選自SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56和SEQIDNO:57的肽核酸寡聚體；(b)使所述反應(yīng)混合物處于足以形成一種或多種擴增子的條件；和(c)檢測所述一種或多種擴增子。在該鑒別方法中，所述反應(yīng)混合物還可以包含內(nèi)部對照，所述內(nèi)部對照包含(a)正向引物，其含有SEQIDNO:43、SEQIDNO:44或SEQIDNO:45所示的核苷酸序列；(b)反向引物，其含有SEQIDNO:46、SEQIDNO:47或SEQIDNO:48所示的核苷酸序列；和(c)探針，其含有SEQIDNO:49、SEQIDNO:50或SEQIDNO:51所示的核苷酸序列。該鑒別方法還可以包括確定循環(huán)數(shù)目的差異(ΔCN)。所述ΔCN可以是與含有SNP的擴增子有關(guān)的循環(huán)數(shù)目和與從內(nèi)部對照產(chǎn)生的擴增子有關(guān)的循環(huán)數(shù)目之間的差異。如果ΔCN小于截止值，那么SNP可以存在于KRAS中。本發(fā)明還涉及鑒別一種或多種單核苷酸多態(tài)性(SNP)在v-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS)中的存在與否的方法，所述方法包括：(a)形成反應(yīng)混合物，其包含(i)得自受試者的樣品，其中所述樣品疑似含有KRAS靶序列，和(ii)一種引物和探針集合，其包含：a.一種或多種選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的正向引物；b.一種或多種選自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的反向引物；c.一種或多種選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的探針；和d.一種或多種選自SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56和SEQIDNO:57的肽核酸寡聚體；(b)使所述反應(yīng)混合物處于足以形成一種或多種擴增子的條件；和(c)檢測所述一種或多種擴增子。該鑒別方法還可以包括基于步驟(c)中的檢測來鑒別一種或多種SNP在KRAS中的存在。所述一種或多種SNP可以選自G12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13D、G13C和Q61H。本發(fā)明還涉及鑒別一種或多種單核苷酸多態(tài)性(SNP)在v-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS)中的存在與否的方法，所述方法包括：(a)形成反應(yīng)混合物，其包含(i)得自受試者的樣品，其中所述樣品疑似含有KRAS靶序列，和(ii)一種引物和探針集合，其包含：a.一種或多種選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的正向引物；b.一種或多種選自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的反向引物；c.一種或多種選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的探針；和d.一種或多種選自SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56和SEQIDNO:57的肽核酸寡聚體；(b)使所述反應(yīng)混合物處于足以形成一種或多種擴增子的條件；和(c)檢測所述一種或多種擴增子。在該鑒別方法中，所述引物和探針集合的一種或多種探針可以包含可檢測標記。所述可檢測標記是熒光標記。在該鑒別方法中，所述引物和探針集合的一種或多種探針還可以包含猝滅劑部分。在該鑒別方法中，檢測可以包括測量由所述可檢測標記產(chǎn)生的熒光信號。本發(fā)明還涉及鑒別一種或多種單核苷酸多態(tài)性(SNP)在v-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS)中的存在與否的方法，所述方法包括：(a)形成反應(yīng)混合物，其包含(i)得自受試者的樣品，其中所述樣品疑似含有KRAS靶序列，和(ii)一種引物和探針集合，其包含：a.一種或多種選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的正向引物；b.一種或多種選自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的反向引物；c.一種或多種選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的探針；和d.一種或多種選自SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56和SEQIDNO:57的肽核酸寡聚體；(b)使所述反應(yīng)混合物處于足以形成一種或多種擴增子的條件；和(c)檢測所述一種或多種擴增子。在該鑒別方法中，形成反應(yīng)混合物可以包括形成三種反應(yīng)混合物，每種反應(yīng)混合物包含所述得自受試者的樣品以及所述引物和探針集合。在該鑒別方法中，第一反應(yīng)混合物可以包含所述得自受試者的樣品、正向引物SEQIDNO:2、反向引物SEQIDNO:6、肽核酸寡聚體SEQIDNO:52；和探針SEQIDNO:22、SEQIDNO:27和SEQIDNO:30。在該鑒別方法中，第二反應(yīng)混合物可以包含所述得自受試者的樣品、正向引物SEQIDNO:2、反向引物SEQIDNO:6、肽核酸寡聚體SEQIDNO:52；和探針SEQIDNO:13、SEQIDNO:16和SEQIDNO:20。在該鑒別方法中，第三反應(yīng)混合物可以包含所述得自受試者的樣品、正向引物SEQIDNO:2、反向引物SEQIDNO:6、正向引物SEQIDNO:7、反向引物SEQIDNO:11、肽核酸寡聚體SEQIDNO:52、肽核酸寡聚體SEQIDNO:56和探針SEQIDNO:31、SEQIDNO:34、SEQIDNO:38和SEQIDNO:40。第一、第二和第三反應(yīng)混合物中的每一種還可以包含內(nèi)部對照，所述內(nèi)部對照包含(a)正向引物，其含有SEQIDNO:43所示的核苷酸序列；(b)反向引物，其含有SEQIDNO:48所示的核苷酸序列；和(c)探針，其含有SEQIDNO:51所示的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及用于為有此需要的受試者選擇癌癥療法的方法，所述方法包括：(a)形成反應(yīng)混合物，其包含(i)得自受試者的樣品，其中所述樣品疑似含有KRAS靶序列，和(ii)一種引物和探針集合，其包含：a.一種或多種選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的正向引物；b.一種或多種選自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的反向引物；c.一種或多種選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的探針；和d.一種或多種選自SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56和SEQIDNO:57的肽核酸寡聚體；(b)使所述反應(yīng)混合物處于足以形成一種或多種擴增子的條件；(c)檢測所述一種或多種擴增子；(d)鑒別v-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS)中的一種或多種單核苷酸多態(tài)性(SNP)；和(e)基于在步驟(d)中鑒別的一種或多種SNP，為所述受試者選擇癌癥療法。在該選擇癌癥療法的方法中，所述樣品可以得自受試者的癌性組織。所述癌性組織可以是來自結(jié)直腸癌或非小細胞肺癌的組織。所述樣品可以是從固定的福爾馬林石蠟包埋的樣品提取的核酸。所述核酸可以是基因組DNA。在該選擇癌癥療法的方法中，所述樣品可以是血液樣品、血清樣品或血漿樣品。所述樣品可以是循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)。在該選擇癌癥療法的方法中，所述反應(yīng)混合物還可以包含內(nèi)部對照，所述內(nèi)部對照包含(a)正向引物，其含有SEQIDNO:43、SEQIDNO:44或SEQIDNO:45所示的核苷酸序列；(b)反向引物，其含有SEQIDNO:46、SEQIDNO:47或SEQIDNO:48所示的核苷酸序列；和(c)探針，其含有SEQIDNO:49、SEQIDNO:50或SEQIDNO:51所示的核苷酸序列。在該選擇癌癥療法的方法中，鑒別可以包括確定循環(huán)數(shù)目的差異(ΔCN)。所述ΔCN可以是與含有SNP的擴增子有關(guān)的循環(huán)數(shù)目和與從內(nèi)部對照產(chǎn)生的擴增子有關(guān)的循環(huán)數(shù)目之間的差異。如果ΔCN小于截止值，那么SNP可以存在于KRAS中。所述一種或多種SNP可以選自G12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13D、G13C、Q61H和它們的任意組合。在該選擇癌癥療法的方法中，所述引物和探針集合的一種或多種探針可以包含可檢測標記。所述可檢測標記可以是熒光標記。所述熒光標記可以選自FAM、Cy5、NED和VIC。所述引物和探針集合中的一種或多種探針還可以包含猝滅劑部分。在該選擇癌癥療法的方法中，檢測可以包括測量由所述可檢測標記產(chǎn)生的熒光信號。在該選擇癌癥療法的方法中，選擇可以包括，當一種或多種SNP被鑒別為從KRAS缺失時，給所述受試者施用靶向表皮生長因子受體(EGFR)的治療。選擇可以包括，當一種或多種SNP被鑒別為存在于KRAS中時，不給所述受試者施用靶向表皮生長因子受體(EGFR)的治療。選擇可以包括，當一種或多種SNP被鑒別為存在于KRAS中時，給所述受試者施用除了靶向表皮生長因子受體(EGFR)的治療以外的療法。本發(fā)明還涉及用于為有此需要的受試者選擇癌癥療法的方法，所述方法包括：(a)形成反應(yīng)混合物，其包含(i)得自受試者的樣品，其中所述樣品疑似含有KRAS靶序列，和(ii)一種引物和探針集合，其包含：a.一種或多種選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的正向引物；b.一種或多種選自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的反向引物；c.一種或多種選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的探針；和d.一種或多種選自SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56和SEQIDNO:57的肽核酸寡聚體；(b)使所述反應(yīng)混合物處于足以形成一種或多種擴增子的條件；(c)檢測所述一種或多種擴增子；(d)鑒別v-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS)中的一種或多種單核苷酸多態(tài)性(SNP)；和(e)基于在步驟(d)中鑒別的一種或多種SNP，為所述受試者選擇癌癥療法。在該選擇癌癥療法的方法中，所述反應(yīng)混合物還可以包含內(nèi)部對照，所述內(nèi)部對照包含(a)正向引物，其含有SEQIDNO:43、SEQIDNO:44或SEQIDNO:45所示的核苷酸序列；(b)反向引物，其含有SEQIDNO:46、SEQIDNO:47或SEQIDNO:48所示的核苷酸序列；和(c)探針，其含有SEQIDNO:49、SEQIDNO:50或SEQIDNO:51所示的核苷酸序列。在該選擇癌癥療法的方法中，鑒別可以包括確定循環(huán)數(shù)目的差異(ΔCN)。所述ΔCN可以是與含有SNP的擴增子有關(guān)的循環(huán)數(shù)目和與從內(nèi)部對照產(chǎn)生的擴增子有關(guān)的循環(huán)數(shù)目之間的差異。如果ΔCN小于截止值，那么SNP可以存在于KRAS中。所述一種或多種SNP可以選自G12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13D、G13C、Q61H和它們的任意組合。在該選擇癌癥療法的方法中，所述樣品可以得自受試者的癌性組織。所述癌性組織可以是來自結(jié)直腸癌或非小細胞肺癌的組織。所述樣品可以是從固定的福爾馬林石蠟包埋的樣品提取的核酸。所述核酸可以是基因組DNA。在該選擇癌癥療法的方法中，所述樣品可以是血液樣品、血清樣品或血漿樣品。所述樣品可以是循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)。本發(fā)明還涉及用于為有此需要的受試者選擇癌癥療法的方法，所述方法包括：(a)形成反應(yīng)混合物，其包含(i)得自受試者的樣品，其中所述樣品疑似含有KRAS靶序列，和(ii)一種引物和探針集合，其包含：a.一種或多種選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的正向引物；b.一種或多種選自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的反向引物；c.一種或多種選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41和SEQIDNO:42的探針；和d.一種或多種選自SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56和SEQIDNO:57的肽核酸寡聚體；(b)使所述反應(yīng)混合物處于足以形成一種或多種擴增子的條件；(c)檢測所述一種或多種擴增子；(d)鑒別v-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS)中的一種或多種單核苷酸多態(tài)性(SNP)；和(e)基于在步驟(d)中鑒別的一種或多種SNP，為所述受試者選擇癌癥療法。在該選擇癌癥療法的方法中，所述引物和探針集合的一種或多種探針可以包含可檢測標記。所述可檢測標記可以是熒光標記。所述引物和探針集合中的一種或多種探針還可以包含猝滅劑部分。在該選擇癌癥療法的方法中，檢測可以包括測量由所述可檢測標記產(chǎn)生的熒光信號。選擇可以包括，當一種或多種SNP被鑒別為從KRAS缺失時，給所述受試者施用靶向表皮生長因子受體(EGFR)的治療；當一種或多種SNP被鑒別為存在于KRAS中時，不給所述受試者施用靶向表皮生長因子受體(EGFR)的治療；或，當一種或多種SNP被鑒別為存在于KRAS中時，給所述受試者施用除了靶向表皮生長因子受體(EGFR)的治療以外的療法。所述一種或多種SNP可以選自G12C、G12R、G12S、G12D、G12A、G12V、G13D、G13C、Q61H和它們的任意組合。附圖說明圖1顯示了闡明突變體KRAS序列的選擇性擴增和檢測的示意圖。圖2顯示了闡明三種反應(yīng)混合物的示意圖，所述三種反應(yīng)混合物通過本文描述的方法形成，并用于檢測KRAS基因中的九種不同SNP，即G12S、G12C、G12R、G12V、G12D、G12A、G13D、G13C和Q61H(即，Q61Ha和Q61Hb)。圖3顯示的表列出了用于標記的探針的檢測的熒光通道，其中的每一種檢測圖2的SNP中的一種。內(nèi)部對照探針也被標記，且因而是可檢測的。因此，將四個熒光通道用于每種反應(yīng)混合物，因為在每種反應(yīng)混合物中，每個探針含有一個不同標記，例外是，用于檢測Q61Ha和Q61Hb的探針含有與這些產(chǎn)生相同氨基酸置換（即Q61H）的突變相同的標記。具體地，四個通道檢測來自標記NED、FAM、VIC和Cy5的熒光。詳細描述本發(fā)明涉及用于在有此需要的受試者中鑒別一種或多種SNP在KRAS中的存在與否的引物和探針。所述一種或多種SNP可以存在于KRAS基因的密碼子12、13和/或61中。KRAS中的一種或多種SNP可以與癌癥（例如，但不限于，結(jié)直腸癌(CRC)和非小細胞肺癌(NSCLC)）有關(guān)。KRAS中的一種或多種SNP的存在與否可以指示遭受癌癥(例如，CRC或NSCLC)的受試者對特定癌癥療法或治療的應(yīng)答，且因而輔助用于所述受試者的癌癥療法的選擇。本發(fā)明還涉及鑒別KRAS中的一種或多種SNP的存在與否的方法。該方法包括從受試者得到樣品，其中所述樣品疑似含有KRAS靶序列。所述KRAS靶序列可以是野生型KRAS序列、突變體KRAS序列或它們的組合。所述鑒別方法提供選擇性擴增，并從而提供了突變體KRAS序列的富集。該選擇性擴增提供了以下有利性能：需要更少樣品用于檢測KRAS中的一種或多種SNP，且具有更少由野生型KRAS序列的擴增引起的干擾或噪音。所述鑒別方法還提供了多種SNP(諸如至多10種、9種、8種、7種、6種、5種、4種、3種、2種或1種SNP)的同時擴增、檢測和鑒別。這又提供了在突變體KRAS序列的選擇性擴增提供的富集下用少量樣品輸入確定約98%、約97%、約96%、約95%、約94%、約93%、約92%、約91%或約90%的KRAS中的與CRC和NSCLC有關(guān)的突變的存在與否的有利能力。在某些實施方案中，所述方法提供100ng或10ng或1ng或1μg或10μg或100μgKRAS靶序列中至少約2%KRAS突變的靈敏度。所述方法還在一種或多種SNP的存在與否的檢測中提供了100%再現(xiàn)性。所述方法還不會與污染和/或干擾物質(zhì)（諸如微生物、血紅蛋白、甘油三酯、壞死組織、同源序列、諸如此類，它們可能存在于得自受試者的樣品中）交叉反應(yīng)，也不會受其干擾。因此，所述鑒別方法實現(xiàn)了在單個測定中檢測KRAS中與CRC和NSCLC有關(guān)的幾乎所有突變的顯著技術(shù)效果。所述鑒別方法還實現(xiàn)了鑒別哪些突變不存在和哪些突變存在于給定受試者的KRAS基因中的顯著技術(shù)效果。知道哪些突變存在于或不存在于KRAS基因中允許所述方法的使用者預(yù)測遭受CRC或NSCLC的受試者對給定治療的應(yīng)答。該預(yù)測又允許使用者選擇和施用如下面更詳細地描述的適當治療。1.定義除非另有定義，在本文中使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。在沖突的情況下，以本文件（包括定義）為準。下面描述了優(yōu)選的方法和材料，盡管與本文描述的那些類似或等同的方法和材料可以用于實踐或測試本發(fā)明。本文中提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻通過引用整體并入。本文中公開的材料、方法和實施例僅僅是示例性的，且無意成為限制性的。本文中使用的術(shù)語“包含”、“包括”、“具有”、“有”、“可以”、“含有”、及其變體意圖是末端開放的過渡短語、術(shù)語或詞語，其不排除另外動作或結(jié)構(gòu)的可能性。單數(shù)形式“一個/種”、“且”和“所述”包括復數(shù)所指，除非上下文另外清楚地指明。本公開內(nèi)容也預(yù)見到“包含”本文呈現(xiàn)的實施方案或元件、“由其組成”和”基本上由其組成”的其它實施方案，不論是否明確地闡述。本文中使用的術(shù)語“約”表示從所述值大約±10%變化。應(yīng)當理解，這樣的變化總是被包括在本文中提供的任意給定值中，無論是否具體提及它。本文中使用的術(shù)語“熒光團”或“熒光標記”是指能夠發(fā)光的任意合適的部分。所述光可以化學地、生物地、響應(yīng)于激發(fā)光子或從任意其它合適的原因產(chǎn)生。優(yōu)選地，熒光團是為了經(jīng)由連接部分連接至本文描述的探針的核酸而衍生化的熒光有機染料。當使用核糖基或脫氧核糖基聚合物將核苷堿基連接在一起時，所述染料可以有利地衍生化以連接至所述聚合物的末端3′碳或末端5′碳。本文中使用的術(shù)語“高親和力核酸類似物”是指與具有相同堿基序列的未修飾的核酸相比以更高親和力與互補核酸（諸如脫氧核糖核酸（DNA））雜交的經(jīng)修飾的核酸。高親和力核酸包括、但不限于鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、己糖醇核酸(HNA)、氨基磷酸酯等。本文中使用的術(shù)語“雜交”是指通過兩個單鏈核酸之間的互補堿基配對形成雙鏈體結(jié)構(gòu)。雜交可以發(fā)生在準確互補的核酸鏈之間或含有低數(shù)目錯配的互補核酸鏈之間。本文中使用的術(shù)語“KRAS靶序列”或“KRAS靶核酸序列”是指包括KRAS基因的密碼子12、密碼子13、密碼子61、密碼子117或密碼子146或它們的任意組合的核酸或其補體，其使用本文描述的引物和/或探針中的一種或多種進行擴增、檢測或二者。另外，盡管術(shù)語靶序列有時表示雙鏈核酸序列，但是靶序列也可以是單鏈的。在其中靶序列是雙鏈的情況下，本發(fā)明的引物可以擴增靶序列的兩條鏈。可以選擇對特定生物體或多或少具有特異性的靶序列。例如，所述靶序列可以對整個屬、對超過一個屬、對一個種或亞種、血清群、auxotrope、血清型、菌株、分離物或其它生物體子集具有特異性。本文中使用的術(shù)語“標記”是指這樣的任何部分：其可以基于所述部分的固有化學性質(zhì)或它與另一個分子反應(yīng)的能力而產(chǎn)生可檢測信號。標記的例子包括、但不限于放射性的、熒光的或化學發(fā)光的分子或酶。標記也包括對容易檢測的其它分子（諸如生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng)和抗原-抗體系統(tǒng)）具有親和力的分子。本文中使用的術(shù)語“鎖核酸(LNA)”是指其特征在于存在一個或多個單體的核酸類似物(嘌呤和/或嘧啶堿基的聚合物)，所述單體是具有添加至核糖環(huán)的額外2H—O、4H—C-亞甲基橋的構(gòu)象上受限制的核苷酸類似物。LNA已經(jīng)被定義為具有一個或多個2H—O、4H—C-亞甲基-(D-呋喃核糖基)核苷酸單體的寡核苷酸。LNA對外切核酸酶和熱具有抗性。術(shù)語“核酸”、“核酸序列”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、修飾的RNA或DNA、或RNA或DNA模擬物(例如，蛋白核酸(PNA))的核酸聚合物，及其衍生物，及其變體。因而，多核苷酸包括由天然存在的核苷堿基、糖和共價核苷間(主鏈)鍵組成的聚合物以及具有類似地起作用的非天然存在的部分的聚合物。寡核苷酸通常是約10個至約160或200個核苷酸的短多核苷酸。這些術(shù)語“核酸”、“核酸序列”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”也表示引物、可檢測的寡核苷酸或探針、和寡聚體，不論長度，且包括多脫氧核糖核苷酸、多核糖核苷酸和修飾的/未修飾的嘌呤/嘧啶堿基的任意其它N-糖苷。例子包括單鏈DNA(ssDNA)、雙鏈DNA(dsDNA)、單鏈RNA(ssRNA)和雙鏈RNA(dsRNA)。這樣的分子可以包含磷酸二酯鍵或經(jīng)修飾的鍵，包括、但不限于，磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、乙酰亞胺酸酯(acetamidate)、氨基甲酸酯、硫醚、橋連的氨基磷酸酯、橋連的亞甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、橋連的硫代磷酸酯或砜鍵和它們的組合。這樣的分子可以包含腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和/或尿嘧啶、以及其它經(jīng)修飾的、非標準的或衍生化的堿基?？蛇x地或額外地，這樣的分子可以包含一個或多個經(jīng)修飾的糖部分。本文中使用的術(shù)語“肽核酸(PNA)”是指這樣的合成DNA類似物：其中正常的磷酸二酯主鏈被N-(2-氨基乙基)甘氨酸鏈或其它可選的氨基酸鏈替換。它的核苷堿基以相同的A-T(U)和G-C方式補充DNA或RNA(Nielsen,等人,Science254:1497-1500(1991)；Hanvey,等人,Science258:1481-1485(1992)；和Egholm,等人,Nature365:566-568(1993))。所述人工主鏈使PNA對核酸酶具有抗性。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法可以合成PNA(參見，例如，Hyrup,等人,Bioorg.Med.Chem.4:5-23(1996)；國際專利申請公開號WO92/20702和92/20703；和美國專利號5,539,082，為了它們關(guān)于這方面的教導，它們的內(nèi)容都通過引用并入本文)。兩個重要特征使PNA成為特定等位基因的優(yōu)良PCR夾。它不可充當聚合的引物。它不可充當Taq聚合酶的外切核酸酶活性的底物。另外，完美匹配的PNA-DNA雙鏈體的解鏈溫度高于相同長度的DNA-DNA雙鏈體的解鏈溫度；因而，所述PNA-DNA雙鏈體是更穩(wěn)定的。PNA-DNA雜合物中的單個錯配會造成約10-18℃的解鏈溫度的下降(Kyger,等人,Anal.Biochem.260:142-148(1998))。因此，在適當?shù)臏囟确秶鷥?nèi)，PNA可以特異性地阻斷引物/可檢測的寡核苷酸退火或完美匹配的模板上的鏈延長，而不會干擾具有錯配堿基的模板上的反應(yīng)(Sun,等人,Nat.Biotechnol.20:186-189(2002)；Thiede,等人,NucleicAcidsRes.24:983-984(1996)；和Taback,等人,Int.J.Cancer111:409-414(2004))，其被稱作PNA介導的PCR夾(Orum,等人,NucleicAcidsRes.21:5332-5336(1993))。完美匹配的和錯配的雜合物之間的解鏈溫度的大差異使得PNA成為點突變的良好傳感器(參見，例如，Karadag,等人,NucleicAcidsRes.32:e63(2004)；Taback,等人(2004),出處同上;Hancock,等人,Clin.Chem.48:2155-2163(2002)；Takiya,等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.68:360-368(2004)；Kirishima,等人,J.Hepatol.37:259-265(2002)；和Ohishi,等人,J.Med.Virol.72:558-565(2004))。美國專利申請公開號2004/0014105公開了以低豐度存在于樣品中的多核苷酸的選擇性富集的方法。所述方法使用酶不可延長的核堿基寡聚體(例如，PNA)作為PCR夾以選擇性地阻斷以高豐度存在于樣品中的多核苷酸的聚合酶活性，由此導致在樣品中不太豐富的物質(zhì)的富集?！癙NA”可以包括PNA夾。夾通過PNA和DNA引物或探針之間對共同靶位的物理競爭而工作，由此干擾引物延伸。本文中關(guān)于核酸序列使用的術(shù)語“核酸序列同一性百分比(%)”是指，在比對序列且如果必要的話引入缺口以達到最大序列同一性百分比以后，候選序列中與目標序列中的核苷酸等同的核苷酸的百分比。用于確定核酸序列同一性百分比的目的的比對可以以在本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的不同方式實現(xiàn)，例如，使用公眾可得到的計算機軟件諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megaalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于測量比對的適當參數(shù)，包括達到在被對比的序列的全長上的最大比對所需的任何算法。當比對核苷酸序列時，相對于、關(guān)于或針對給定核酸序列D的給定核酸序列C的核酸序列同一性百分比（其可以可選地用短語表示為具有或包括相對于、關(guān)于或針對給定核酸序列D的特定核酸序列同一性百分比的給定核酸序列C）可以如下計算：核酸序列同一性百分比=W/Z*100其中W是通過序列比對程序或算法的C和D比對評分為等同匹配的核苷酸的數(shù)目且Z是D中的核苷酸的總數(shù)。當核酸序列C的長度不等于核酸序列D的長度時，C與D的核酸序列同一性百分比將不等于D與C的核酸序列同一性百分比。與第二多核苷酸具有序列同一性的第一多核苷酸是指，與第二多核苷酸具有至少約60%核酸序列同一性或至少約61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列同一性的第一多核苷酸。本文中使用的術(shù)語“聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)”是指制備DNA序列的拷貝的方法。該方法采用熱循環(huán)(即，分別對DNA加熱和冷卻進行變性(或解鏈)和復制的循環(huán))。使用引物（其為含有與要復制的DNA序列互補的序列的短DNA片段）和熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（諸如得自水生棲熱菌（Thermusaquaticus）的DNA聚合酶，其被稱作Taq聚合酶）來選擇DNA序列并拷貝它(參見，例如，美國專利號4,683,195、4,800,195和4,965,188，為了它們關(guān)于這方面的教導，它們都通過引用并入本文)。利用重復循環(huán)，制備的拷貝用作產(chǎn)生其它拷貝的模板(即，鏈式反應(yīng))。PCR技術(shù)包括、但不限于：標準PCR等位基因-特異性的PCR、裝配PCR、不對稱的PCR、數(shù)字PCR、熱啟動PCR、序列間-特異性的PCR、反向PCR、連接介導的PCR、甲基化-特異性的PCR、微小引物PCR、嵌套PCR、重疊延伸PCR、實時PCR、反轉(zhuǎn)錄-PCR、固相PCR、熱不對稱的交錯PCR和降落PCR。本文中使用的術(shù)語“引物”是指開始模板依賴性的核酸合成的寡核苷酸。在有核酸模板、核苷三磷酸前體、聚合酶和輔因子存在下，在合適的溫度和pH條件下，所述引物可以通過聚合酶對核苷酸的添加而在它的3′端處延伸以產(chǎn)生引物延伸產(chǎn)物。所述引物的長度可以隨采用的特定條件和擴增的目的而變化。例如，為診斷目的用于擴增的引物通常具有約15至約35個核苷酸的長度。所述引物必須與期望的模板具有足夠的互補性以提供期望的延伸產(chǎn)物的合成。換而言之，所述引物必須能夠以足以在適當?shù)牟⒘羞B接中提供引物的3′羥基部分的方式與期望的模板鏈退火用于開始聚合酶的合成。所述引物不一定是期望的模板的精確補體。例如，非互補的核苷酸序列可以存在于在其它方面互補的引物的5′末端處?？蛇x地，非互補的堿基可以散布在寡核苷酸引物內(nèi)，前提條件是，所述引物序列與期望的模板鏈的序列具有足夠的互補性，以提供模板-引物復合物用于延伸產(chǎn)物的合成。本文中使用的術(shù)語“探針”或“引物”是指這樣的多核苷酸：其具有至少8個核苷酸、至少10個核苷酸、至少15個核苷酸、至少20個核苷酸或至少25個核苷酸的長度，并由于探針或引物中的至少一個序列與靶區(qū)域中的序列的互補性而與靶序列形成雜合結(jié)構(gòu)。探針的多核苷酸區(qū)域可以由DNA和/或RNA和/或合成的核苷酸類似物組成。優(yōu)選地，所述探針不含有與在聚合酶鏈式反應(yīng)中用于激發(fā)靶序列的一個或多個序列互補的序列。引物和探針在合適的條件下選擇性地與靶序列雜交?？梢詸z測所述探針。在某些實施方案中，所述引物和/或探針可以含有一種或多種高親和力核酸類似物。本文中使用的術(shù)語“特異性地雜交”是指核酸(或其類似物)諸如引物或探針與另一個核酸特異性地結(jié)合的能力。本文中使用的術(shù)語“受試者”是指哺乳動物、鳥或爬行動物。所述受試者可以是牛、馬、狗、貓或靈長類動物。所述受試者可以是人。所述受試者可以是活的或死的。本文中使用的術(shù)語“嚴謹?shù)摹被颉靶蛄?特異性的”雜交條件是指其中完全互補的核酸鏈將優(yōu)先雜交的條件。嚴謹雜交條件是本領(lǐng)域眾所周知的。嚴謹條件是序列依賴性的，且在不同的情況下將是不同的。通常，將嚴謹條件選擇為比在確定的pH和離子強度條件下特定序列的熱熔點(Tm)低約5℃，在此時50%的堿基對發(fā)生解離。本文中使用的術(shù)語“基本上互補的”是指除了微小的錯配區(qū)域以外互補的序列。通常，長度為約15個核苷酸的核酸中錯配的總數(shù)是約3個核苷酸或更少。本文中使用的術(shù)語“靶序列”和“靶區(qū)域”是指要檢測、或者檢測并分析的核酸區(qū)域，且其包含目標多態(tài)位點。本文中使用的術(shù)語“測試樣品”、“生物樣品”、“患者樣品”或“樣品”是指取自受試者的樣品或生物流體，其中所述樣品可以含有KRAS靶序列。測試樣品可以取自任何來源，例如，組織、血液、血漿、唾液、痰、粘液、汗液、尿、尿道拭子、宮頸拭子、泌尿生殖器或肛門拭子、結(jié)膜拭子、眼透鏡流體、腦脊液等。測試樣品可以(i)以從來源得到的狀態(tài)直接使用，或(ii)在預(yù)處理以改變樣品的特性以后使用。因而，可以如下預(yù)處理測試樣品：例如，從血液制備血漿或血清，破碎細胞或病毒顆粒，從固體材料制備液體，稀釋粘稠的流體，過濾液體，添加試劑，純化核酸等。在某些實施方案中，所述樣品可以是福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)的組織。在其它實施方案中，所述樣品可以是從FFPE組織提取或得到的核酸(例如，DNA和/或RNA)。在其它實施方案中，所述樣品可以是從血液、血漿或另一種體液提取或得到的核酸(例如，DNA和/或RNA)。本文中使用的術(shù)語“治療”可互換地是指逆轉(zhuǎn)、減輕或抑制這樣的術(shù)語適用的疾病的進展、或這樣的疾病的一種或多種征狀。取決于受試者的狀況，該術(shù)語也表示預(yù)防疾病，且包括預(yù)防疾病的發(fā)作，或預(yù)防與疾病有關(guān)的征狀。治療可以以急性或慢性方式執(zhí)行。該術(shù)語也表示，在罹患疾病之前，減輕疾病的嚴重程度或與這樣的疾病有關(guān)的征狀。“預(yù)防”也表示阻止具有與這樣的疾病有關(guān)的一種或多種征狀的疾病的復發(fā)?！爸委煛焙汀爸委熒稀北硎救缟厦嫠x的“治療”的治療動作。在本文中使用的術(shù)語僅用于描述特定實施方案的目的，且不會在其它方面意圖是限制性的。就本文中列舉的數(shù)字范圍而言，明確地預(yù)見到具有相同精確度的在二者之間的每個插入數(shù)字。例如，就6-9的范圍而言，除了6和9以外還預(yù)見到數(shù)字7和8，且就范圍6.0-7.0而言，明確地預(yù)見到數(shù)字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。2.鑒別KRAS中的單核苷酸多態(tài)性的方法本文提供了在有此需要的受試者中鑒別在v-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS)中的一種或多種單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法。所述鑒別方法確定KRAS中的一種或多種SNP的存在與否。如下面更詳細地描述的，KRAS中的一種或多種SNP可以與癌癥（例如，但不限于，結(jié)直腸癌(CRC)和非小細胞肺癌(NSCLC)）有關(guān)。KRAS中的一種或多種SNP的存在與否可以指示遭受癌癥(例如，CRC或NSCLC)的受試者對特定癌癥療法或治療的應(yīng)答，且因而輔助用于所述受試者的癌癥療法的選擇。所述鑒別方法將KRAS中的一種SNP與KRAS中的另一種SNP區(qū)分開。所述鑒別方法將KRAS中的SNP與KRAS中的野生型序列區(qū)分開。所述鑒別方法提供在100ng、10ng、1ng、1μg、10μg或100μgKRAS靶序列中的至少約0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%KRAS突變的靈敏度。所述鑒別方法提供在10ngKRAS靶序列中的至少約0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%KRAS突變的靈敏度。在某些實施方案中，所述方法提供在10ngKRAS靶序列中的至少約2%KRAS突變的靈敏度。所述鑒別方法是可再現(xiàn)的。所述鑒別方法在一種或多種SNP的存在與否的檢測中提供至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%再現(xiàn)性。在某些實施方案中，所述鑒別方法在一種或多種SNP的存在與否的檢測中提供100%再現(xiàn)性。所述鑒別方法對檢測靶向的一種或多種SNP是特異性的，由此避免與污染和/或干擾物質(zhì)（諸如諸如微生物、血紅蛋白、甘油三酯、壞死組織、諸如此類，它們可能存在于得自受試者的樣品中）的交叉反應(yīng)性或其干擾。所述鑒別方法對檢測靶向的KRAS中的一種或多種SNP是特異性的，且因而，不會與KRAS的同系物（例如，hRAS和nRAS）和KRAS假基因KRAS1P交叉反應(yīng)。所述方法包括從受試者得到樣品，其中所述樣品可以包括或不包括KRAS靶序列。如下面更詳細地描述的，所述KRAS靶序列可以是野生型KRAS序列、突變體KRAS序列或它們的組合。所述方法還包括測量或檢測KRAS中的一種或多種SNP。測量或檢測可以包括形成如下面更詳細地描述的反應(yīng)混合物。所述反應(yīng)混合物可以包括用于擴增KRAS靶序列(或其部分)的引物和肽核酸(PNA)寡聚體。所述PNA寡聚體阻止野生型KRAS序列的擴增，由此允許突變體KRAS序列的選擇性擴增。該選擇性擴增會富集擴增的突變體KRAS序列。因此，突變體KRAS序列（如果存在于樣品中的話）被選擇性地擴增(且從而富集)，無論從其得到所述樣品的受試者對于KRAS中的一種或多種SNP而言是雜合的還是純合的。該選擇性擴增也會提供以下有利性能：需要更少樣品用于檢測KRAS中的一種或多種SNP，且具有更少由野生型KRAS序列的擴增引起的干擾或噪音。所述反應(yīng)混合物還可以包括內(nèi)部對照。所述反應(yīng)混合物還可以包括一種或多種探針，每種探針允許KRAS中的不同SNP的獨立檢測，且從而允許所述SNP的鑒別。所述一種或多種探針可以如下面更詳細地描述地可檢測地標記。所述方法還包括：使所述反應(yīng)混合物處于足以形成一種或多種擴增子的條件，所述擴增子含有KRAS中的一種或多種SNP。所述方法還包括用一種或多種探針檢測所述一種或多種擴增子，其中檢測給出KRAS中的一種或多種SNP的存在的信號。沒有檢測給出KRAS中的一種或多種SNP的不存在的信號。檢測可以與KRAS中的特定SNP比對。有利地，所述一種或多種探針可以各自獨立地用不同標記進行標記，由此允許KRAS中的超過一種SNP的檢測，并從而允許其鑒別。在某些實施方案中，檢測各個密碼子內(nèi)的不同突變（其中所述不同突變產(chǎn)生相同氨基酸置換）的探針可以含有相同標記。具體地，多種SNP(例如，1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種或更多種SNP)可以以與本文描述的鑒別方法同時的方式檢測和鑒別。這會提供在突變體KRAS序列的選擇性擴增提供的富集下用少量樣品輸入(諸如1ng、10ng、100ng或1μg)確定約98%、約97%、約96%、約95%、約94%、約93%、約92%、約91%、約90%的KRAS中分別與CRC和NSCLC有關(guān)的突變的存在與否的有利能力。因此，所述鑒別KRAS中的一種或多種SNP的方法會實現(xiàn)檢測KRAS中與CRC和NSCLC有關(guān)的幾乎所有突變的顯著技術(shù)效果。所述鑒別方法還會實現(xiàn)鑒別哪些突變不存在和哪些突變存在于給定受試者的KRAS基因中的顯著技術(shù)效果。知道哪些突變存在于或不存在于KRAS基因中允許所述方法的使用者預(yù)測遭受CRC或NSCLC的受試者對給定治療的應(yīng)答。該預(yù)測又允許使用者選擇和施用如下面更詳細地描述的適當治療。a.KRAS基因中的SNP所述方法鑒別一種或多種SNP在基因v-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS)中的存在與否。KRAS編碼在GTP-結(jié)合的活性構(gòu)象和GDP-結(jié)合的無活性構(gòu)象之間循環(huán)的小GTP酶。由KRAS編碼的GTP酶也是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號傳遞途徑的一個成員，其調(diào)節(jié)細胞增殖和分化。具體地，KRAS被源自細胞表面受體酪氨酸激酶(RTK)的上游信號（例如，表皮生長因子受體(EGFR)）活化。KRAS的活性構(gòu)象通過活化下游迅速地加速的纖維肉瘤(RAF)激酶（例如，B-RAF）而傳送所述信號。抑制GTP水解的KRAS中的突變是致癌的，因為這些突變誘導組成活性的KRAS構(gòu)象。這些活化突變主要位于KRAS基因的密碼子12、13和61內(nèi)，且可以是SNP。在KRAS基因的外顯子2的密碼子12和13以及外顯子3的61中可能存在多達18個氨基酸變化。密碼子12和13位于KRAS基因的外顯子2中，而密碼子61位于KRAS基因的外顯子3中。如下面更詳細地描述的，在幾種癌癥中發(fā)現(xiàn)了KRAS中的活化突變，所述癌癥包括、例如結(jié)直腸癌(CRC)和非小細胞肺癌(NSCLC)。具體地，在密碼子12、13和61中可能的18種氨基酸變化中，這些癌癥中大于98%的鑒別的KRAS突變是G12D、G12A、G12V、G12S、G12C、G12R、G13D、G13C或Q61H。另外，位于KRAS基因的密碼子117和146中的突變是致癌的。在KRAS基因的密碼子117和146中可能存在多達四種致癌的氨基酸變化(參見下面表1)，且可以與上面討論的和下面在表1中顯示的KRAS基因的密碼子12、13和/或61中的突變變化相組合)。因此，KRAS中的一種或多種SNP可以與癌癥（例如，但不限于，結(jié)直腸癌(CRC)和非小細胞肺癌(NSCLC)）有關(guān)。如在下面更詳細地描述的，KRAS中的一種或多種SNP的存在與否可以指示遭受癌癥(例如，CRC或NSCLC)的受試者對特定癌癥療法或治療的應(yīng)答?？梢栽谕怙@子2、外顯子3、外顯子2和外顯子3、或KRAS基因的另一個部分中發(fā)現(xiàn)一種或多種SNP?？梢栽贙RAS基因的密碼子12、13、61、117和/或146中發(fā)現(xiàn)一種或多種SNP。所述一種或多種SNP可以是下面表1中列出的SNP中的一種或多種。在某些實施方案中，所述一種或多種SNP可以是G12S、G12C、G12R、G12V、G12D、G12A、G13D、G13C、Q61H(即，Q61Ha或Q61Hb)中的一種或多種。所述一種或多種SNP可以是下面表1中列出的SNP的任意組合。在某些實施方案中，所述一種或多種SNP可以是G12S、G12C、G12R、G12V、G12D、G12A、G13D、G13C、Q61H(即，Q61Ha或Q61Hb)的任意組合。表1突變序列*野生型-密碼子12和13GGTGGCG12DGATGGCG12VGTTGGCG13DGGTGACG12CTGTGGCG12SAGTGGCG12AGCTGGCG12RCGTGGCG13CGGTTGCG13RGGTCGCG13SGGTAGCG13AGGTGCCG13VGGTGTC野生型-密碼子61CAA或CAGQ61HCAC或CAT(在本文中分別也被稱作“Q61Ha”或“Q61Hb”)**Q61LCTAQ61RCGAQ61KAAAQ61PCCAQ61EGAA野生型-密碼子117AAAK117NAAC或AAT野生型-密碼子146GCAA146PCCAA146TACAA146VGTA*下劃線標記了導致氨基酸序列中的對應(yīng)突變(即，置換)的單核苷酸多態(tài)性。**Q61Ha或Q61Hb可以導致Q61H突變。(1)與癌癥有關(guān)的SNPKRAS基因中的一種或多種SNP可以與癌細胞、癌性組織、癌癥、贅生物、腫瘤和/或轉(zhuǎn)移性癌癥有關(guān)。具體地，上述KRAS基因中的一種或多種SNP可以與一種或多種癌癥有關(guān)。所述一種或多種癌癥可以是，但不限于結(jié)直腸癌(CRC)和非小細胞肺癌(NSCLC)。35%的結(jié)直腸癌或腫瘤包括KRAS基因中的突變。16%的非小細胞肺癌或腫瘤包括KRAS基因中的突變。下面的表2顯示了每種SNP在鑒別的癌癥中的發(fā)生。具體地，在上面表1中列出的SNP中的一種或多種的存在與否允許本文描述的鑒別方法的使用者預(yù)測遭受CRC或NSCLC的受試者對給定治療的應(yīng)答。該預(yù)測又允許使用者選擇和施用如下面更詳細地描述的適當治療。在某些實施方案中，SNPG12S、G12C、G12R、G12V、G12D、G12A、G13D、G13C和Q61H中的一種或多種的存在與否允許本文描述的鑒別方法的使用者預(yù)測遭受CRC或NSCLC的受試者對給定治療的應(yīng)答。該預(yù)測又允許使用者選擇和施用如下面更詳細地描述的適當治療。表2突變在CRC中的發(fā)生百分比在NSCLC中的發(fā)生百分比G12D33.9917.47G12V22.0320.05G13D19.212.55G12C8.2241.29G12S5.974.10G12A6.126.68G12R1.232.07G13C0.512.70G13R0.250.11G13S0.060.22G13A0.090.07G13V0.120.07Q61H0.520.48Q61L0.180.30Q61R0.140.33Q61K0.070.18Q61P0.000.07Q61E0.010.15(2)KRAS靶序列所述方法可以包括KRAS靶序列的擴增。所述KRAS靶序列可以存在于DNA、RNA或cDNA內(nèi)。所述DNA可以是基因組DNA或循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)。在某些實施方案中，所述DNA、RNA或cDNA可以在血液、血漿或其它體液內(nèi)循環(huán)或在血液、血漿或其它體液中發(fā)現(xiàn)。所述KRAS靶序列可以存在于得自上述樣品的DNA、RNA或cDNA內(nèi)。所述KRAS靶序列可以存在于DNA內(nèi)，所述DNA得自來自癌癥或腫瘤的組織或細胞。所述KRAS靶序列可以存在于基因組DNA內(nèi)，所述基因組DNA得自來自癌癥或腫瘤的組織或細胞。所述KRAS靶序列可以存在于基因組DNA內(nèi)，所述基因組DNA得自或提取自固定的福爾馬林石蠟包埋的(FFPE)癌癥或腫瘤組織。所述KRAS靶序列可以存在于基因組DNA內(nèi)，所述基因組DNA得自來自結(jié)直腸癌或腫瘤的組織或細胞。所述KRAS靶序列可以存在于基因組DNA內(nèi)，所述基因組DNA得自來自非小細胞肺癌或腫瘤的組織或細胞。所述KRAS靶序列可以存在于KRAS序列的外顯子2(下面討論的第一擴增子)和/或外顯子3(下面討論的第二擴增子)內(nèi)。所述KRAS靶序列可以是野生型KRAS序列、突變體KRAS序列或它們的組合。所述野生型KRAS序列不含有上述SNP中的一種或多種。所述突變體KRAS序列可以含有上述SNP中的一種或多種。(a)用于擴增KRAS基因的外顯子2的引物所述KRAS靶序列可以是KRAS基因的外顯子2(或其部分)。因此，所述方法可以包括一對用于擴增KRAS基因的外顯子2(或其部分)的引物。該引物對與KRAS基因的外顯子2內(nèi)所含的核酸序列特異性地雜交。所述引物對包括用于產(chǎn)生第一擴增子的第一正向引物和第一反向引物(即，在本文中分別也被稱作“外顯子2正向引物”和“外顯子2反向引物”)。所述第一擴增子可以包括SNPG12S、G12C、G12R、G12V、G12D、G12A、G13C、G13D中的一種或多種或它們的任意組合。所述第一擴增子可以與在下面更詳細地描述的第二擴增子和/或第三擴增子同時產(chǎn)生。所述第一正向引物可以包括或具有如在SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3中所示的核酸序列(參見下面表3)。所述第一反向引物可以包括或具有如在SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6中所示的核酸序列(參見下面表3)。(b)用于擴增KRAS基因的外顯子3的引物所述KRAS靶序列可以是KRAS基因的外顯子3(或其部分)。因此，所述方法可以包括一對用于擴增KRAS基因的外顯子3(或其部分)的引物。該引物對與KRAS基因的外顯子3內(nèi)所含的核酸序列特異性地雜交。所述引物對包括用于產(chǎn)生第二擴增子的第二正向引物和第二反向引物(即，在本文中分別也被稱作“外顯子3正向引物”和“外顯子3反向引物”)。所述第二擴增子可以包括SNPQ61H。所述第二擴增子可以與第一擴增子和/或第三擴增子同時產(chǎn)生。所述第二正向引物可以包括或具有如在SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:9中所示的核酸序列(參見下面表4)。所述第二反向引物可以包括或具有如在SEQIDNO:10、SEQIDNO:11或SEQIDNO:12中所示的核酸序列(參見下面表4)。(3)用于檢測SNP的探針所述方法包括用于檢測如上所述的KRAS基因中的一種或多種SNP的一種或多種探針。所述一種或多種探針可以與第一擴增子或第二擴增子特異性地雜交。所述一種或多種探針可以含有標記，其中每種探針含有不同標記，由此允許每種探針的獨立檢測。在下面更詳細地描述了所述標記。在某些實施方案中，檢測各個密碼子內(nèi)的不同突變（其中所述不同突變導致相同氨基酸置換）的探針可以含有相同標記，由此允許與特定氨基酸置換有關(guān)的每種探針的獨立檢測。如上所述，所述第一擴增子可以包括SNPG12S、G12C、G12R、G12V、G12D、G12A、G13C、G13D中的一種或多種或它們的任意組合。因此，與第一擴增子特異性地雜交的一種或多種探針可以包括當SNPG12S存在于第一擴增子中時與第一擴增子特異性地雜交的探針(即，在本文中也被稱作“G12S探針”)，當SNPG12C存在于第一擴增子中時與第一擴增子特異性地雜交的探針(在本文中也被稱作“G12C探針”)，當SNPG12R存在于第一擴增子中時與第一擴增子特異性地雜交的探針(即，在本文中也被稱作“G12R探針”)，當SNPG12V存在于第一擴增子中時與第一擴增子特異性地雜交的探針(即，在本文中也被稱作“G12V探針”)，當SNPG12D存在于第一擴增子中時與第一擴增子特異性地雜交的探針(即，在本文中也被稱作“G12D探針”)，當SNPG12A存在于第一擴增子中時與第一擴增子特異性地雜交的探針(即，在本文中也被稱作“G12A探針”)，當SNPG13C存在于第一擴增子中時與第一擴增子特異性地雜交的探針(即，在本文中也被稱作“G13C探針”)，當SNPG13D存在于第一擴增子中時與第一擴增子特異性地雜交的探針(在本文中也被稱作“G13D探針”)，或它們的任意組合。所述G12S探針可以包括或具有如在SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:24中所示的核酸序列(參見下面表5)。所述G12C探針可以包括或具有如在SEQIDNO:25、SEQIDNO:26或SEQIDNO:27中所示的核酸序列(參見下面表5)。所述G12R探針可以包括或具有如在SEQIDNO:28、SEQIDNO:29或SEQIDNO:30中所示的核酸序列(參見下面表5)。所述G12V探針可以包括或具有如在SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21中所示的核酸序列(參見下面表5)。所述G12D探針可以包括或具有如在SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:15中所示的核酸序列(參見下面表5)。所述G12A探針可以包括或具有如在SEQIDNO:16、SEQIDNO:17或SEQIDNO:18中所示的核酸序列(參見下面表5)。所述G13C探針可以包括或具有如在SEQIDNO:34、SEQIDNO:35或SEQIDNO:36中所示的核酸序列(參見下面表5)。所述G13D探針可以包括或具有如在SEQIDNO:31、SEQIDNO:32或SEQIDNO:33中所示的核酸序列(參見下面表5)。如上所述，所述第二擴增子可以包括SNPQ61H。因此，與第二擴增子特異性地雜交的一種或多種探針可以包括當SNPQ61Ha存在于第二擴增子中時與第二擴增子特異性地雜交的探針(即，在本文中也被稱作“Q61Ha探針”)，當SNPQ61Hb存在于第二擴增子中時與第二擴增子特異性地雜交的探針(即，在本文中也被稱作“Q61Hb探針”)，或它們的組合。所述Q61Ha探針可以包括或具有如在SEQIDNO:37、SEQIDNO:38或SEQIDNO:39中所示的核酸序列(參見下面表5)。所述Q61Hb探針可以包括或具有如在SEQIDNO:40、SEQIDNO:41或SEQIDNO:42中所示的核酸序列(參見下面表5)。b.內(nèi)部對照(IC)所述方法還包括反應(yīng)混合物中的內(nèi)部對照，其形成在下面更詳細地描述。所述內(nèi)部對照是不具有已知的突變發(fā)生的KRAS基因的一部分。所述內(nèi)部對照指示條件是否足以在反應(yīng)混合物中發(fā)生擴增，且因而指示擴增的效率。所述內(nèi)部對照還指示KRAS靶序列是否存在于得自受試者的樣品中。所述內(nèi)部對照還指示如下面更詳細地描述的可擴增的KRAS靶序列的總量，且因而指示反應(yīng)混合物中的KRAS靶序列的輸入量。另外，如果在擴增之前從樣品提取KRAS靶序列，所述內(nèi)部對照可以指示提取的效率。所述內(nèi)部對照包括一對用于產(chǎn)生第三擴增子的引物和用于檢測第三擴增子的探針(在本文中也被稱作“內(nèi)部對照探針”或“IC探針”)。第三擴增子的形成不會干擾上述第一擴增子和/或第二擴增子的形成。另外，所述第三擴增子可以與第一和/或第二擴增子的檢測同時檢測。(1)用于內(nèi)部對照(IC)的引物所述內(nèi)部對照包括用于產(chǎn)生第三擴增子的引物對。該引物對與不具有已知的突變發(fā)生的KRAS基因的一部分內(nèi)所含的核酸序列特異性地雜交。因此，第三擴增子的形成獨立于上述第一和第二擴增子的形成，且因而不會干擾第一和第二擴增子的形成。該引物對包括用于產(chǎn)生第三擴增子的第三正向引物和第三反向引物(即，在本文中分別也被稱作“IC正向引物”和“IC反向引物”)。該第三擴增子可以與第二擴增子和/或第一擴增子同時產(chǎn)生。所述第三正向引物可以包括或具有如在SEQIDNO:43、SEQIDNO:44或SEQIDNO:45中所示的核酸序列(參見下面表6)。所述第三反向引物可以包括或具有如在SEQIDNO:46、SEQIDNO:47或SEQIDNO:48中所示的核酸序列(參見下面表6)。(2)內(nèi)部對照探針所述內(nèi)部對照還包括IC探針，其與第三擴增子特異性地雜交。所述IC探針可以含有標記，所述標記不同于用于上述一種或多種探針(即，G12S探針、G12C探針、G12R探針、G12V探針、G12D探針、G12A探針、G13C探針、G13D探針、Q61Ha探針和/或Q61Hb探針)的標記，由此允許IC探針以及與第一或第二擴增子特異性地雜交的一種或多種探針的獨立和同時檢測。所述IC探針可以包括或具有如在SEQIDNO:49、SEQIDNO:50或SEQIDNO:51中所示的核酸序列(參見下面表7)。c.PNA寡聚體所述方法包括PNA寡聚體用于阻斷野生型KRAS序列的擴增，由此允許突變體KRAS序列的選擇性擴增和富集的用途。所述PNA寡聚體與野生型KRAS序列互補且因而與其選擇性地雜交。具體地，所述PNA寡聚體與野生型KRAS序列中的核酸序列選擇性地雜交，所述核酸序列位于第一或第二正向引物或者第一或第二反向引物與KRAS靶序列選擇性地雜交的地方的下游(圖1)。這樣，PNA寡聚體阻斷第一或第二正向引物或者第一或第二反向引物的延伸。例如，如在圖1中所示，PNA寡聚體阻斷反向引物的延伸，但是，應(yīng)當理解，PNA寡聚體可以設(shè)計成與KRAS靶序列的任一個鏈雜交，且因而阻斷從正向引物或反向引物的延伸。PNA寡聚體阻斷引物延伸，因為從PNA和靶序列(例如，DNA)的互補鏈形成的雙鏈體具有比對應(yīng)的DNA:DNA雙鏈體更大的熱穩(wěn)定性，且因而不會被延伸聚合酶容易地移動。但是，PNA:DNA雙鏈體可以通過單個錯配而失穩(wěn)且被延伸聚合酶移動。因此，當KRAS靶序列是野生型KRAS序列時，PNA寡聚體與野生型KRAS序列選擇性地雜交，形成PNA:DNA雙鏈體，且延伸被阻止，由此阻斷或阻止從野生型KRAS序列形成擴增子。當KRAS靶序列是突變體KRAS序列時，在PNA:DNA雙鏈體中發(fā)生一個或多個錯配，由此使PNA:DNA雙鏈體失穩(wěn)。延伸可以通過失穩(wěn)的雙鏈體進行，從而導致從突變體KRAS序列產(chǎn)生擴增子。因此，PNA寡聚體會提供突變體KRAS序列的選擇性擴增，并從而提供突變體KRAS序列的富集。因此，突變體KRAS序列（如果存在于樣品中的話）被選擇性地擴增(且因而富集)，無論從其得到樣品的受試者就KRAS中的一種或多種SNP而言是雜合的還是純合的。該選擇性擴增還會提供以下有利性能：需要更少樣品用于檢測KRAS中的一種或多種SNP，且具有更少由野生型KRAS序列的擴增引起的干擾或噪音。該減少的干擾又會促進KRAS基因中的多種SNP(例如，1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種或更多種SNP)的同時檢測和鑒別。該同時檢測和鑒別會實現(xiàn)以下顯著技術(shù)效果：檢測KRAS中與CRC和NSCLC有關(guān)的幾乎所有突變，并鑒別這些突變中的哪些不存在和/或存在于給定受試者的KRAS基因中。PNA寡聚體可以與上述第一擴增子選擇性地雜交。PNA寡聚體可以與上述第二擴增子選擇性地雜交。PNA寡聚體可以是兩種PNA寡聚體，其中的一種與第一擴增子選擇性地雜交，且其中的另一種與第二擴增子選擇性地雜交。PNA寡聚體可以包括或具有如SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56或SEQIDNO:57所示的序列(參見下面表8)。具有SEQIDNO:52、SEQIDNO:53或SEQIDNO:54所示的序列的PNA寡聚體可以與第一擴增子(即，KRAS基因的外顯子2的擴增區(qū)域)選擇性地雜交，且因而，在本文中也可以被稱作“外顯子2PNA寡聚體”。具有SEQIDNO:55、SEQIDNO:56或SEQIDNO:57所示的序列的PNA寡聚體可以與第二擴增子(即，KRAS基因的外顯子3的擴增區(qū)域)選擇性地雜交，且因而，在本文中也可以被稱作“外顯子3PNA寡聚體”。d.引物和探針集合所述鑒別方法可以利用引物和/或探針集合中的上述引物、探針和PNA寡聚體的任意組合。所述引物集合可以包括、但不限于，(1)SEQIDNO:2和6；(2)SEQIDNO:7和11；(3)SEQIDNO:43和48；(4)SEQIDNO:2、6、7和11；(5)SEQIDNO:2、6、7、11、43和48；(6)SEQIDNO:7、11、43和48；和(7)SEQIDNO:2、6、43和48。在某些實施方案中，所述引物集合還可以包括SEQIDNO:52、SEQIDNO:56或SEQIDNO:52和56。所述引物和探針集合可以包括、但不限于，(1)SEQIDNO:2、6、43、48、22、27、30和51；(2)SEQIDNO:2、6、43、48、13、16、20和51；和(3)SEQIDNO:2、6、7、11、43、48、31、34、38、40和51。所述引物和探針集合還可以包括SEQIDNO:52、SEQIDNO:56或SEQIDNO:52和56。在其它實施方案中，所述引物和探針集合可以包括，但是仍然不限于，(1)SEQIDNO:2、6、43、48、13、16、20、22、27、30和51；(2)SEQIDNO:2、6、43、48、13、16、20、22、27、30、31、34和51(3)SEQIDNO:2、6、7、11、43、48、13、16、20、22、27、30、31、34、38、40和51。所述引物和探針集合還可以包括SEQIDNO:52、SEQIDNO:56或SEQIDNO:52和56。在某些實施方案中，所述引物和探針集合可以包括在表3、4、5、6、7和8中的上述引物、探針和PNA寡聚體的任意組合。e.引物的化學修飾所述鑒別KRAS中的一種或多種SNP的方法可以使用上述引物的化學修飾形式，例如，以改善與KRAS靶序列雜交的效率。例如，因為在物種之間在保守區(qū)中的變異(由于在第三個位置中的密碼子擺動)經(jīng)常發(fā)生在DNA三聯(lián)體的第三個位置，所以可以修飾上述引物，使得與該位置對應(yīng)的核苷酸是可以結(jié)合超過一種核苷酸的“通用堿基”。例如，肌苷(I)結(jié)合尿苷(U)、胞嘧啶(C)或腺嘌呤(A)，鳥嘌呤(G)結(jié)合U或C，且U結(jié)合A或G。通用堿基的其它例子包括硝基吲哚諸如5-硝基吲哚或3-硝基吡咯，退化核苷酸dP或dK，含有5-硝基吲唑的無環(huán)核苷類似物，或嘌呤類似物1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-咪唑-4-甲酰胺。在另一個實施方案中，為了補償“擺動”堿基的稍微更弱的結(jié)合，可以設(shè)計引物，使得每個三聯(lián)體的第一個和第二個位置被以比未修飾的核苷酸更大的親和力結(jié)合的核苷酸類似物占據(jù)。這些類似物的例子包括結(jié)合胸腺嘧啶的2,6-二氨基嘌呤，結(jié)合腺嘌呤的丙炔T，和結(jié)合鳥嘌呤的丙炔C和吩噁嗪（包括G-夾）。丙炔基化的嘧啶描述在美國專利號5,645,985、5,830,653和5,484,908中，每篇專利的整個內(nèi)容通過引用并入本文。吩噁嗪描述在美國專利號5,502,177、5,763,588和6,005,096中，每篇專利的整個內(nèi)容通過引用并入本文。G-夾描述在美國專利號6,007,992和6,028,183中，每篇專利的整個內(nèi)容通過引用并入本文。f.標記所述鑒別KRAS中的一種或多種SNP的方法可以使用上述探針的標記來促進它們的檢測(即，所述探針被可檢測地標記)。所述鑒別方法還可以使用與該標記（當它是熒光標記時）組合的猝滅劑，如下面關(guān)于上述探針更詳細地描述的。通過標記檢測領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的光譜、光化學、生化、免疫化學或化學方式，可以檢測所述標記。所述標記可以是熒光團或熒光標記、化學發(fā)光標記、或?qū)α硪粋€分子具有親和力的另一個部分。其它有用的標記包括染料，諸如熒光染料，放射性標記，諸如32P，電子致密試劑，酶，諸如過氧化物酶或堿性磷酸酶，生物素，或可得到其抗血清或單克隆抗體的半抗原和蛋白。可以選擇不同顏色的熒光團，使得反應(yīng)混合物中的每種探針可以被清楚地檢測。例如，可以使用下述熒光團的組合(但不限于)：FAMTM(LifeTechnologies,Carlsbad,California),VIC?(LifeTechnologies,Carlsbad,California),Cy?5(MolecularProbes,Inc.,Eugene,Oregon),NEDTM(LifeTechnologies,Carlsbad,California),7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA),TexasRedTM(MolecularProbes,Inc.,Eugene,Oregon),5-(和-6)-羧基-X-羅丹明,麗絲胺羅丹明B,5-(和-6)-羧基熒光素,熒光素-5-異硫氰酸酯(FITC),7-二乙基氨基香豆素-3-甲酸,四甲基羅丹明-5-(和-6)-異硫氰酸酯,5-(和-6)-羧基四甲基羅丹明,7-羥基香豆素-3-甲酸,6-[熒光素5-(和-6)-羧基酰氨基]己酸,N-(4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼雜-3a,4a-二氮雜-3-引達省丙酸,曙紅-5-異硫氰酸酯,藻紅-5-異硫氰酸酯,CascadeTMblueacetylazide(MolecularProbes,Inc.,Eugene,Oregon),紫色/藍色染料(Emmax375-491nm)7-甲氧基香豆素-3-羧基,AMCA-X(7-氨基香豆素-X),6-MI或6-MAP(6-甲基-8-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)異黃喋啶)；綠色/黃色染料(Emmax492-585nm)DTAF(4,6-二氯三嗪基)氨基熒光素,6-FAM(熒光素,6-羧基熒光素),丹磺?；?X(6-((5-二甲基氨基萘-1-磺酰基)氨基)己酸酯,6-JOE(6-羧基-4′,5′-二氯-2′,7′-二甲氧基熒光素),HEX(六氯熒光素),BODIPY-TMR-X(四甲基羅丹明替代物),PyMPO(1-(3-羧基芐基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓溴化物),TAMRA-X(6-(四甲基羅丹明-5(6)-甲酰氨基)己酸酯)；橙色染料(Emmax586-647nm)羅丹明衍生物BODIPY576/589,BODIPY581/591,ROX(羧基羅丹明),VIC(AppliedBiosystemsInc.,FosterCity,Calif.),NED(AppliedBiosystemsInc.,FosterCity,Calif.)和紅色染料(Emmax647-700nm)如羧基萘并熒光素。在某些實施方案中，用于標記反應(yīng)混合物中的探針的熒光團的組合可以是FAMTM(LifeTechnologies,Carlsbad,California),VIC?(LifeTechnologies,Carlsbad,California),Cy?5(MolecularProbes,Inc.,Eugene,Oregon),和NEDTM(LifeTechnologies,Carlsbad,California)，使得反應(yīng)混合物中的每種探針提供在KRAS基因中的它的對應(yīng)SNP的獨特檢測和鑒別。具有熒光性能的其它分子也是合適的標記。例如，蛋白如藻紅蛋白（一種240千道爾頓(kDa)蛋白）表現(xiàn)出穩(wěn)健的熒光性能。具有熒光性能的其它標記可以包括量子點、納米晶體和有關(guān)的半導體熒光團。通過任意合適的檢測熒光的方式檢測熒光標記。這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。熒光團或熒光標記可以與猝滅劑(在本文中也被稱作“猝滅劑部分”)組合使用。本文中使用的猝滅劑是在測量信號的波長減少由熒光團發(fā)出的光的部分，或者是用于轉(zhuǎn)換由核酸探針的熒光團發(fā)出的光的波長的熒光部分。在本發(fā)明的上下文中合適的猝滅劑包括(但不限于)DABCYL(4-(4′-二甲基氨基苯基偶氮基)苯甲酸),QSY-7(9-[2-[[4-[[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]羰基]-1-哌啶基]磺?；鵠苯基]-3,6-雙(甲基苯基氨基)),BHQ-1,BHQ-2,BHQ-3(BiosearchTechnologiesInc.,2003,目錄號BG5-5041T,BG5-5042T,和BG5-5043T)和TAMRA((6-四甲基羅丹明-5(6)-甲酰氨基)己酸酯)。另外，猝滅劑可以是有機染料，其可以是或不是熒光的，取決于本發(fā)明的實施方案。在某些實施方案中，所述標記可以是化學發(fā)光的標記。例如，化學發(fā)光的標記可以是，但不限于，吖啶鎓化合物。吖啶鎓化合物可以包括吖啶鎓-9-甲酰胺和吖啶鎓-9-甲酸芳基酯。這樣的化合物描述在，例如，美國專利號5,783,699中，其整個內(nèi)容特此通過引用并入。探針還可以間接地用生物素（biotein）或地高辛（digoxygenin）標記，或用放射性同位素諸如32P和3H標記，盡管然后需要第二種檢測分子或進一步加工來檢測探針。例如，用生物素間接地標記的探針可以通過綴合至可檢測的標志物的抗生物素蛋白來檢測。例如，抗生物素蛋白可以綴合至酶標志物諸如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。使用酶的底物和/或催化劑，可以在標準比色測量反應(yīng)中檢測酶標志物。堿性磷酸酶的催化劑包括5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和硝基藍四氮唑。二氨基苯甲酸酯可以用作辣根過氧化物酶的催化劑。g.陽性和陰性對照所述鑒別方法可以采用陽性和陰性對照來促進樣品制備、擴增和檢測的監(jiān)測，它們都在下面更詳細地描述。監(jiān)測還可以包括監(jiān)測污染。在某些實施方案中，可以設(shè)計陽性對照以產(chǎn)生和檢測反應(yīng)混合物中的每個引物對的擴增子。例如，陽性對照可以包括編碼內(nèi)部對照的質(zhì)粒以及編碼一種或多種SNP的一個或多個質(zhì)粒。另外，如果在一種或多種探針內(nèi)含有熒光標記，那么陽性對照還可以包括至少一個陽性信號在用于監(jiān)測擴增的每個熒光通道中的產(chǎn)生。可以設(shè)計陰性對照以產(chǎn)生和檢測第三擴增子(即，內(nèi)部對照的擴增)，但是不會產(chǎn)生和檢測與一種或多種SNP對應(yīng)的擴增子。例如，陰性對照可以包括編碼內(nèi)部對照的質(zhì)粒。h.樣品制備所述鑒別KRAS中的一種或多種SNP的方法可以包括從受試者得到樣品。在所述鑒別方法中，在形成下述反應(yīng)混合物之前，可以任選地處理、加工或制備所述得自受試者的樣品。這樣的處理可以包括、但不限于，稀釋、超濾、提取、沉淀、透析、酶消化和勻漿化。此外，如果這樣的處理方法與樣品一起采用，這樣的處理方法具有以與在未處理的樣品(例如，即，沒有進行任何這樣的處理方法的樣品)中成比例的濃度保留在樣品中的KRAS靶序列。例如，使用本領(lǐng)域已知的任意合適的方法，可以制備用于擴增測定的樣品。理想地，所述方法提取和濃縮核酸。所述方法還理想地使KRAS靶序列可用于擴增，并從提取物除去擴增的潛在抑制劑。在某些實施方案中，所述KRAS靶序列可以是DNA。使用例如得自QiagenInc.(Valencia、Calif.)的DNeasyDNA分離試劑盒、QIAampDNA血液試劑盒或PAXgene血液DNA試劑盒，或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它方法，可以從外周血分離DNA。使用DNeasyDNA分離試劑盒，也可以得到來自其它組織樣品的DNA。還可以使用任意其它DNA提取和純化技術(shù)，包括從苯酚-氯仿提取至自動化磁珠核酸捕獲系統(tǒng)的液體-液體和固相技術(shù)。可以將RNA分離和反轉(zhuǎn)錄，并可以將得到的cDNA擴增(例如，如在例如美國專利號5,310,652、5,322,770、5,561,058、5,641,864和5,693,517中描述的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR))。在其它實施方案中，可以從固定的福爾馬林石蠟包埋的(FFPE)組織提取DNA。因此，樣品制備試劑盒的另一個例子是可得自Qiagen的QIAampDNAFFPE組織試劑盒。在其它實施方案中，AbbottmSamplePreparationSystemDNA(4×24preps;Abbott)試劑捕獲核酸并除去未結(jié)合的樣品組分。在裂解步驟中包括蛋白水解酶K以消化與樣品結(jié)合的蛋白。將結(jié)合的核酸洗脫并轉(zhuǎn)移至96-孔深板。然后使核酸準備好擴增。在某些實施方案中，將無關(guān)的DNA序列（其充當內(nèi)部對照(IC)以證實所述過程已經(jīng)針對每個樣品正確地進行）引入樣品制備操作中并與校準物、對照和樣本一起加工。在某些實施方案中，如果KRAS靶序列是RNA，那么可以使用反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA。然后可以在如下所述的反應(yīng)混合物中擴增該cDNA。在某些實施方案中，自動化樣品制備系統(tǒng)（諸如設(shè)計成使用磁性微粒方法進行核酸純化的自動化樣品制備系統(tǒng)）的應(yīng)用可以是優(yōu)選的。自動化樣品制備系統(tǒng)的一個例子是m2000sp，其可得自AbbottLaboratories,AbbottPark,Ill?？蛇x地，樣品可以使用m24sp自動化樣品制備系統(tǒng)(Abbott)來制備或手工地制備。自動化樣品制備比手工制備優(yōu)選，因為它是更一致的。i.形成反應(yīng)混合物所述鑒別KRAS中的一種或多種SNP的方法包括形成反應(yīng)混合物。所述反應(yīng)混合物包含疑似含有KRAS靶序列的樣品、用于產(chǎn)生第一和/或第二擴增子的引物、用于檢測KRAS基因中的一種或多種SNP的一種或多種探針、PNA寡聚體和內(nèi)部對照。所述反應(yīng)混合物在形成后放在如在下面更詳細地描述的足以擴增核酸序列的條件下。形成反應(yīng)混合物可以包括形成一種或多種反應(yīng)混合物。形成反應(yīng)混合物可以包括形成1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、或更多種反應(yīng)混合物。每種反應(yīng)混合物可以含有用于產(chǎn)生第一和/或第二擴增子的引物和用于檢測KRAS基因中的一種或多種SNP的一種或多種探針的不同組合。這些不同組合導致各種反應(yīng)混合物中的獨特SNP集合的檢測。每個獨特SNP集合可以包括重疊SNP，使得單個擴增子的產(chǎn)生允許檢測多種SNP的存在與否。例如，第一擴增子的產(chǎn)生允許檢測重疊SNPG12C、G12R、G12S、G12D、G12A和G12V的存在與否。在另一個實施例中，第一擴增子的產(chǎn)生允許檢測重疊SNPG13D和D13C的存在與否。所述反應(yīng)混合物還可以包括核酸擴增試劑。所述核酸擴增試劑可以包括具有聚合酶活性的酶(例如，DNA聚合酶)、酶輔因子諸如鎂或錳、鹽和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，即dATP、dGTP、dCTP和dTTP。在某些情況下，所述核酸擴增試劑可以包括核糖核苷三磷酸。(1)用于檢測和鑒別KRAS基因中的九種SNP的三種反應(yīng)混合物作為形成一種或多種反應(yīng)混合物的一個非限制性實施例，形成反應(yīng)混合物可以包括形成三種反應(yīng)混合物，即第一反應(yīng)混合物、第二反應(yīng)混合物和第三反應(yīng)混合物。這三種反應(yīng)混合物會促進來自所述得自受試者的樣品的KRAS基因中的九種不同SNP的同時擴增、檢測和鑒別。該同時擴增、檢測和鑒別會實現(xiàn)以下顯著技術(shù)效果：檢測KRAS中與CRC和NSCLC有關(guān)的幾乎所有突變，和鑒別這些突變中的哪些不存在和/或存在于給定受試者的KRAS基因中。所述第一反應(yīng)混合物可以包括疑似含有KRAS靶序列的樣品、用于產(chǎn)生第一擴增子的引物、用于檢測KRAS基因中的三種SNP的三種探針、外顯子2PNA寡聚體和內(nèi)部對照。所述第一反應(yīng)混合物還可以包括上述的核酸擴增試劑。在某些實施方案中，所述第一反應(yīng)混合物可以包括G12C探針、G12R探針和G12S探針。每種探針以及IC探針可以具有不同標記，由此允許每種探針的獨立和同時檢測，且因而允許SNPG12C、G12R和G12S中的每一種的獨立和同時檢測(圖2和3)。在某些實施方案中(如在圖2和3中所示)，所述IC探針可以含有標記NEDTM(LifeTechnologies,Carlsbad,California)，所述G12S探針可以含有標記Cy?5(MolecularProbes,Inc.,Eugene,Oregon)，所述G12C探針可以含有標記FAMTM(LifeTechnologies,Carlsbad,California)，且所述G12R探針可以含有標記VIC?(LifeTechnologies,Carlsbad,California)。在其它實施方案中，當每種探針含有熒光標記時，每種探針還可以含有猝滅劑，其可以是，例如，但不限于，用于與FAM和VIC熒光標記一起使用的BHQ1，和用于與Quasara、Q670和NED熒光標記一起使用的BHQ2。所述第二反應(yīng)混合物可以包括疑似含有KRAS靶序列的樣品、用于產(chǎn)生第一擴增子的引物、用于檢測KRAS基因中的三種SNP的三種探針（其中所述三種探針不同于所述第一反應(yīng)混合物中的三種探針）、外顯子2PNA寡聚體和內(nèi)部對照。所述第二反應(yīng)混合物還可以包括上述的核酸擴增試劑。在某些實施方案中，所述第二反應(yīng)混合物可以包括G12D探針、G12A探針和G12V探針。每種探針以及IC探針可以具有不同標記，由此允許每種探針的獨立和同時檢測，且因而允許SNPG12D、G12A和G12V中的每一種的獨立和同時檢測(圖2和3)。在某些實施方案中(如在圖2和3中所示)，所述IC探針可以含有標記NEDTM(LifeTechnologies,Carlsbad,California)，所述G12D探針可以含有標記FAMTM(LifeTechnologies,Carlsbad,California)，所述G12A探針可以含有標記VIC?(LifeTechnologies,Carlsbad,California)，且所述G12V探針可以含有標記Cy?5(MolecularProbes,Inc.,Eugene,Oregon)。在其它實施方案中，當每種探針含有熒光標記時，每種探針還可以含有猝滅劑，其可以是，例如，但不限于，用于與FAM和VIC熒光標記一起使用的BHQ1，和用于與Quasara、Q670和NED熒光標記一起使用的BHQ2。所述第三反應(yīng)混合物可以包括疑似含有KRAS靶序列的樣品、用于產(chǎn)生第一擴增子的引物、用于產(chǎn)生第二擴增子的引物、用于檢測KRAS基因中的四種SNP的四種探針（其中所述四種探針不同于第一和第二反應(yīng)混合物中的探針）、外顯子2PNA寡聚體、外顯子3PNA寡聚體和內(nèi)部對照。所述第三反應(yīng)混合物還可以包括上述的核酸擴增試劑。在某些實施方案中，所述第三反應(yīng)混合物可以包括G13D探針、G13C探針、Q61Ha探針和Q61Hb探針。每種探針以及IC探針可以具有不同標記，由此允許每種探針的獨立和同時檢測，且因而允許SNPG13D、G13C和Q61H中的每一種的獨立和同時檢測。在某些實施方案中，所述Q61Ha探針和Q61Hb探針可以含有相同標記，因而兩種探針提供相同SNP（即Q61H）的檢測。在某些實施方案中(如在圖2和3中所示)，所述IC探針可以含有標記NEDTM(LifeTechnologies,Carlsbad,California)，所述G13D探針可以含有標記FAMTM(LifeTechnologies,Carlsbad,California)，所述G13C探針可以含有標記VIC?(LifeTechnologies,Carlsbad,California)，所述Q61Ha探針可以含有標記Cy?5(MolecularProbes,Inc.,Eugene,Oregon)，且所述Q61Hb探針可以含有標記Cy?5(MolecularProbes,Inc.,Eugene,Oregon)。在其它實施方案中，當每種探針含有熒光標記時，每種探針還可以含有猝滅劑，其可以是，例如，但不限于，用于與FAM和VIC熒光標記一起使用的BHQ1，和用于與Quasar、Q670和NED熒光標記一起使用的BHQ2。j.擴增在形成上述反應(yīng)混合物以后，使所述反應(yīng)混合物處于足以擴增核酸序列的條件(即，擴增條件)。這些擴增條件使得產(chǎn)生與靶序列互補的核酸序列的至少一個拷貝（如果所述靶序列存在于樣品中）。因此，使所述反應(yīng)混合物處于擴增條件可以在檢測步驟之前或同時重復任意合適的次數(shù)。例如，通過使所述反應(yīng)混合物熱循環(huán)10-100次(或更多)，通常約20至約60次，且更通常約25至約45次。所述擴增條件可以包括促進一個或多個核酸序列的退火和延伸的那些條件。這樣的退火以相當可預(yù)測的方式依賴于幾個參數(shù)，包括溫度、離子強度、序列長度、互補性和核酸序列的G:C含量。例如，降低互補核酸序列的環(huán)境的溫度會促進退火。通常，診斷應(yīng)用使用比解鏈溫度Tm低約2℃至約18℃(例如，約10℃)的雜交(即，退火)溫度。離子強度也影響Tm。典型的鹽濃度依賴于陽離子的性質(zhì)和化合價，但是容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解。類似地，高G:C含量和增加的序列長度會穩(wěn)定雙鏈體形成和增加Tm。最后，可以選擇接近或在引物的Tm的雜交溫度。因而，得到特定引物對或引物集合的合適雜交條件是在PCR領(lǐng)域的普通技術(shù)內(nèi)?？梢匀绫绢I(lǐng)域已知地進行擴增，諸如通過使用m2000rt儀器(AbbottMolecularInc.,DesPlaines,Ill.)。在有脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)和活化劑（例如，鎂或錳）存在下由DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶擴增靶核酸(例如，DNA、RNA或二者)。在PCR擴增過程中，使用高溫來分離雙鏈DNA的鏈。當將反應(yīng)混合物冷卻至可以發(fā)生DNA退火的溫度時，分析物-特異性的、單鏈的DNA寡核苷酸引物會結(jié)合分析物DNA。所述引物被DNA聚合酶延伸，由此產(chǎn)生分析物DNA的短靶段的精確拷貝。DNA聚合酶可以是，但不需要是，已經(jīng)在它的活性部位被使它無活性的分子修飾的嗜熱酶。當在PCR開始之前加熱酶時，抑制性分子從酶切掉，由此使它重新獲得它的活性。以此方式，酶僅僅在發(fā)生特異性DNA-DNA相互作用的溫度具有活性。這會極大地減少非特異性的PCR人造品，諸如引物二聚體。在每輪熱循環(huán)過程中，擴增產(chǎn)物(即，擴增子)在高溫解離成單鏈，從而允許隨著溫度降低發(fā)生引物退火和延伸。通過高溫和低溫之間的重復循環(huán)，實現(xiàn)靶標的指數(shù)擴增。KRAS靶序列的擴增以產(chǎn)生第一、第二和/或第三擴增子同時發(fā)生。擴增操作是本領(lǐng)域眾所周知的，且包括聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、實時PCR、定量PCR、PNA夾介導的PCR、轉(zhuǎn)錄介導的擴增(TMA)、滾環(huán)擴增、基于核酸序列的擴增(NASBA)、連接酶鏈式反應(yīng)和鏈置換擴增(SDA)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，對于在某些擴增技術(shù)中的應(yīng)用，所述引物可能需要被修飾。例如，SDA引物通常包含在5’末端附近的另外核苷酸，其構(gòu)成限制性內(nèi)切核酸酶的識別位點。對于NASBA，所述引物可以包括在5’末端附近的另外核苷酸，其構(gòu)成RNA聚合酶啟動子。如此修飾的多核苷酸被認為是在本發(fā)明范圍內(nèi)。擴增以后，可能合乎需要的是，將擴增產(chǎn)物與靶序列和多余的引物分離以確定是否發(fā)生特異性擴增?？梢允褂脴藴史椒ㄍㄟ^瓊脂糖、瓊脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝膠電泳實現(xiàn)分離(參見，例如，Sambrook,等人,MolecularCloning,Fritsch和Maniatis,編,ColdSpringHarborLab.Press,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989))?？蛇x地，可以使用色譜法實現(xiàn)分離。色譜法的例子包括吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法和分子篩色譜法，且色譜技術(shù)的類型的例子包括柱、紙、薄層和氣相色譜法(參見，例如，F(xiàn)reifelder,PhysicalBiochemistryApplicationstoBiochemistryandMolecularBiology,第2版,Wm.Freeman&Co.,NewYork,N.Y.(1982))。k.檢測所述鑒別方法還包括檢測KRAS中的一種或多種SNP。該檢測步驟包括檢測或測量第一擴增子和/或第二擴增子和第三擴增子。如上所述，反應(yīng)混合物中的每種探針可以含有不同標記，且因而可以明顯地檢測。在某些實施方案中，檢測該相同氨基酸置換（除了各個密碼子中的不同的核苷酸變化）的探針可以含有相同標記。該獨特檢測又會提供一種或多種SNP在KRAS基因中的缺失或存在的鑒別。檢測可以與擴增同時。因此，在單一反應(yīng)混合物中，可以使用1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、或更多種不同的探針，每種探針含有不同標記，由此允許每種探針的獨特檢測。該獨特檢測又會提供在單一反應(yīng)混合物中鑒別1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、或更多種SNP在KRAS基因中的缺失或存在。在某些實施方案中，可以在實時PCR測定中組合擴增和檢測。當使用實時PCR時，可檢測地標記的探針允許僅在探針與它的互補核酸序列選擇性地雜交以后的檢測，由此實現(xiàn)同時擴增和檢測。當可檢測地標記的探針在擴增過程中存在于反應(yīng)混合物中時，所述可檢測地標記的探針應(yīng)當在促進擴增的條件下是穩(wěn)定的，應(yīng)當不會干擾擴增，應(yīng)當在擴增條件下結(jié)合它的靶序列，且僅在結(jié)合它的靶序列以后發(fā)射信號。在這點上特別適合的可檢測地標記的探針的例子包括分子信標可檢測的寡核苷酸、TAQMAN?可檢測的寡核苷酸、和直鏈可檢測的寡核苷酸，諸如Abravaya,等人(美國專利申請公開號2005/0227257)描述的那些?？蓹z測地標記的探針可以形成分子信標的環(huán)區(qū)域，所述環(huán)區(qū)域是單獨的或與莖區(qū)域的組成部分進一步組合。所述可檢測地標記的探針也可以用作直鏈可檢測的寡核苷酸，其具有在一個末端的熒光團(例如，F(xiàn)AM)和在另一個末端的高效猝滅劑，諸如BlackHoleQuencher(BHQ?;BioSearchTechnologies,Inc.,Novato,Calif.)。如果需要的話，可以將疑似含有KRAS靶序列或可檢測地標記的探針的樣品固定化在固體支持物上以促進檢測。利用固體支持物的測定形式的例子包括斑點印跡形式和逆向斑點印跡形式(參見，例如，美國專利號5,310,893、5,451,512、5,468,613和5,604,099，它們都為了它們關(guān)于這方面的教導特別地通過引用并入本文)。在其它實施方案中，可以通過顯影來檢測擴增。例如，用溴化乙錠染色的凝膠可以用紫外線顯影。用放射性同位素標記的擴增產(chǎn)物可以通過暴露x-射線膠片并顯影而顯影，而用熒光測量標記來標記的擴增產(chǎn)物可以通過使擴增產(chǎn)物遇到刺激波譜而顯影。一種優(yōu)選的擴增顯影方法是與擴增產(chǎn)物雜交的、標記的可檢測的寡核苷酸的應(yīng)用。還可以使用手工柱，諸如可得自Qiagen的手工柱。在其它實施方案中，基于二脫氧測序的方法和寡核苷酸-長度產(chǎn)物的Pyrosequencing?也可以用于檢測擴增的核酸。Kobayashi,等人,Mol.Cell.Detectableoligonucleotides9:175-182(1995))描述了另一種測序方法。l.ΔCN的確定所述鑒別方法還包括確定每種反應(yīng)混合物的循環(huán)數(shù)目的差異(ΔCN)。ΔCN是KRAS突變體序列的擴增的循環(huán)數(shù)目(CN)和內(nèi)部對照的擴增的CN之間的差異。針對固定截止值評價每種SNP的ΔCN值，其中如果ΔCN小于固定截止值，那么檢測到各個SNP。每個固定截止值是正在檢測的SNP和在各個探針上所含的標記的組合所獨有的。因此，給定的SNP的ΔCN越小，SNP存在于KRAS靶序列中的可能性越大(即，更高的百分比)。在某些實施方案中，如果檢測到超過一種SNP，將具有最小相對ΔCN的SNP報告為檢測到，因為KRAS基因中的突變是“驅(qū)動器（driver）”突變。這樣的驅(qū)動器突變會驅(qū)動癌發(fā)生，且因而，在超過一個突變的原發(fā)腫瘤內(nèi)不存在選擇性優(yōu)點。因此，如果原發(fā)腫瘤含有在KRAS基因中的突變，經(jīng)常預(yù)見到一種突變或SNP。但是，不應(yīng)當認為所述鑒別方法限于檢測KRAS基因中的僅一種SNP。在某些實施方案中，可能合乎需要的是，將所有具有小于對應(yīng)固定截止值的各個ΔCN的SNP報告為檢測到。報告可以包括檢測到的SNP的排序順序，其中具有最小相對ΔCN的SNP排在第一，且具有最大相對ΔCN的SNP排在最后，由此給所述鑒別方法的使用者提供KRAS基因中的檢測到的SNP的排序列表。在某些實施方案中，在反應(yīng)混合物中不可檢測到SNP，即，任何給定SNP的ΔCN不小于各個固定截止值。當內(nèi)部對照的擴增(即，第三擴增子的檢測)指示足夠的KRAS靶序列存在于反應(yīng)混合物中以檢測低百分比SNP時，確定這是真實的或準確的陰性結(jié)果。另一方面，如果內(nèi)部對照的擴增(即，第三擴增子的檢測)指示存在于反應(yīng)混合物中的KRAS靶序列不足以檢測低百分比SNP，那么陰性結(jié)果可以是假陰性結(jié)果，由此指示所述鑒別方法的使用者應(yīng)當用預(yù)期會提供更大可擴增的量的KRAS靶序列的樣品重復所述方法。因此，內(nèi)部對照的擴增(即，第三擴增子的產(chǎn)生和檢測)會確定存在于反應(yīng)混合物中的可擴增的KRAS靶序列的量，且因而指示反應(yīng)混合物和擴增條件是否足夠敏感以允許準確報告在KRAS基因中沒有檢測到SNP。3.選擇癌癥療法的方法本文提供了為有此需要的受試者選擇癌癥療法或治療的方法。所述方法可以應(yīng)用上述鑒別KRAS中的一種或多種SNP的存在與否的方法來為受試者選擇治療。在選擇后，所述方法還可以包括給所述受試者施用所述治療。如果檢測到KRAS中的一種或多種SNP，那么在某些實施方案中，所述選擇方法的使用者可以選擇不靶向表皮生長因子受體(EGFR)的療法。選擇可以包括，當一種或多種SNP被鑒別為存在于KRAS中時，給所述受試者施用除了靶向表皮生長因子受體(EGFR)的治療以外的療法。如上所述，EGFR在MAPK信號傳遞途徑中在KRAS的上游起作用，并且KRAS基因中的一種或多種SNP使得KRAS具有組成活性。因此，在CRC和NSCLC中，如果一種或多種SNP存在于KRAS基因中，靶向EGFR的療法具有更低的有效性，因為鑒于突變體KRAS的組成活性，MAPK途徑的下游部分不被EGFR療法抑制。在某些實施方案中，所述選擇方法可以包括，當本文描述的方法檢測到KRAS中的一種或多種SNP時，不給所述受試者施用靶向EGFR的療法。如果沒有檢測到KRAS中的一種或多種SNP，那么在某些實施方案中，選擇方法的使用者可以選擇靶向EGFR的療法作為所述受試者的癌癥療法。因此，在某些實施方案中，選擇方法可以包括，當本文描述的方法沒有檢測到KRAS中的一種或多種SNP時，給所述受試者施用靶向EGFR的療法。4.預(yù)測對癌癥療法的應(yīng)答的方法本文還提供了在有此需要的受試者中預(yù)測對癌癥療法或治療的應(yīng)答的方法。所述方法可以應(yīng)用上述鑒別一種或多種SNP在KRAS中的存在與否的方法以預(yù)測所述受試者對給定的癌癥療法的應(yīng)答。在某些實施方案中，如果將一種或多種SNP鑒別為存在于所述受試者的KRAS基因中，這會允許所述方法的使用者預(yù)測所述受試者可能具有降低的對靶向EGFR的療法做出應(yīng)答的可能性。因此，可以給含有一種或多種SNP的受試者施用不會靶向EGFR的療法。在其它實施方案中，如果沒有將一種或多種SNP鑒別為存在于所述受試者的KRAS基因中，這會允許所述方法的使用者預(yù)測所述受試者可能具有增加的對靶向EGFR的療法做出應(yīng)答的可能性。因此，可以給不含有一種或多種SNP的受試者施用靶向EGFR的療法。5.試劑盒本文還提供了用于與本文中公開的方法一起使用的試劑盒。所述試劑盒可以包括本文描述的引物、探針、PNA寡聚體和內(nèi)部對照，其中的每一種可以被包含在單個容器內(nèi)或以任意組合組合在一個或多個容器中。所述試劑盒還可以包括上述的陽性和陰性對照。所述試劑盒還可以包括上述的核酸擴增試劑。所述試劑盒還可以包括從使用者觀點看可能合乎需要的其它物質(zhì)，諸如緩沖劑、稀釋劑、標準品和/或在樣品處理、洗滌或進行本文描述的方法的任意其它步驟中有用的其它物質(zhì)。根據(jù)本公開內(nèi)容的試劑盒優(yōu)選地包括關(guān)于執(zhí)行本發(fā)明的方法的使用說明。在本公開內(nèi)容的試劑盒中包括的使用說明可以附著于包裝材料，或可以作為包裝說明書來包括。盡管使用說明通常是書寫或打印的材料，它們不限于此。本公開內(nèi)容預(yù)見到能夠存儲這樣的使用說明并將它們傳遞給最終使用者的任何介質(zhì)。這樣的介質(zhì)包括、但不限于電子存儲介質(zhì)(例如，磁盤、磁帶、筒、芯片)、光學介質(zhì)(例如，CDROM)等。本文中使用的術(shù)語“使用說明”可以包括提供使用說明的因特網(wǎng)站點的地址。本發(fā)明具有由下述非限制性實施例例證的多個方面。6.實施例實施例1用于實施例2-8的材料和方法樣本收集.從人NSCLC組織、CRC組織或下面詳細說明的細胞系制備固定的福爾馬林石蠟包埋的(FFPE)切片(5-10微米)。對于安放在載玻片上的FFPE切片，將切片刮離載玻片(例如，使用解剖刀或單刃剃刀片)并轉(zhuǎn)移至帶標記的試管用于如下所述的DNA提取。對于沒有安放在載玻片上的FFPE切片，將切片轉(zhuǎn)移至帶標記的試管用于如下所述的DNA提取。在每個試管中的總組織面積是至少4mm2。儀器.使用得自AbbottLaboratories的m2000rt儀器進行實時PCR。來自FFPE樣品的基因組DNA提取.按照生產(chǎn)商的使用說明，使用TargetPrepDNAFFPE樣品制備試劑盒I和II(AbbottLaboratories)，從FFPE樣品提前基因組DNA。簡而言之，將FFPE樣品使用二甲苯或Hemo-De脫石蠟，并然后在含有蛋白水解酶K的裂解溶液1中溫育以釋放DNA。在升高的溫度的溫育步驟會部分地逆轉(zhuǎn)釋放的核酸的福爾馬林交聯(lián)，從而改善DNA收率和質(zhì)量。然后將裂解物與裂解緩沖液2和乙醇混合以提供DNA的適當結(jié)合條件，隨后將樣品應(yīng)用于DNAElutionSpinColumn，在此處DNA結(jié)合至硅膠膜。將結(jié)合的DNA用洗滌緩沖液1洗滌，并然后用洗滌緩沖液2洗滌以除去雜質(zhì)。將結(jié)合的DNA用洗脫緩沖液洗脫，并然后用于PCR擴增。擴增和檢測.將擴增試劑組合成3個獨特的主混合物。在96-孔光學反應(yīng)板中將純化的DNA樣品與每個主混合物組合(即，每個樣品3個PCR孔)。用光學膜密封板以后，然后將板轉(zhuǎn)移至m2000rt儀器進行KRAS突變的擴增和檢測。下面提供了關(guān)于擴增和檢測的其它細節(jié)。第一主混合物含有在下面表9中顯示的試劑。表9也顯示了每種試劑的最終反應(yīng)濃度。表9試劑最終反應(yīng)濃度G12S探針(SEQIDNO:22)0.20μMG12C探針(SEQIDNO:27)0.20μMG12R探針(SEQIDNO:30)0.20μM外顯子2正向引物(SEQIDNO:2)0.50μM外顯子2反向引物(SEQIDNO:6)0.50μM外顯子2PNA寡聚體(SEQIDNO:52)0.80μMIC正向引物(SEQIDNO:43)0.25μMIC反向引物(SEQIDNO:48)0.25μMIC探針(SEQIDNO:51)0.10μM緩沖液*1XROX參照0.06μMdNTP0.80mM活化試劑(MgCl2)**7mM熱穩(wěn)定的耐熱性DNA聚合酶11單位/反應(yīng)*所述緩沖液適合用于利用引物、探針和內(nèi)部對照的PCR測定。**所述活化試劑是在含有MgCl2和Tris的緩沖液中。MgCl2是DNA聚合酶的輔因子。第二主混合物含有在下面表10中顯示的試劑。表10也顯示了每種試劑的最終反應(yīng)濃度。表10試劑最終反應(yīng)濃度G12D探針(SEQIDNO:13)0.20μMG12A探針(SEQIDNO:16)0.20μMG12V探針(SEQIDNO:20)0.20μM外顯子2正向引物(SEQIDNO:2)0.50μM外顯子2反向引物(SEQIDNO:6)0.50μM外顯子2PNA寡聚體(SEQIDNO:52)0.80μMIC正向引物(SEQIDNO:43)0.25μMIC反向引物(SEQIDNO:48)0.25μMIC探針(SEQIDNO:51)0.10μM緩沖液*1XROX參照0.06μMdNTP0.80mM活化試劑(MgCl2)**7mM熱穩(wěn)定的耐熱性DNA聚合酶11單位/反應(yīng)*所述緩沖液適合用于利用引物、探針和內(nèi)部對照的PCR測定。**所述活化試劑是在含有MgCl2和Tris的緩沖液中。MgCl2是DNA聚合酶的輔因子。第三主混合物含有在下面表11中顯示的試劑。表11也顯示了每種試劑的最終反應(yīng)濃度。表11試劑最終反應(yīng)濃度G13D探針(SEQIDNO:31)0.20μMQ61Ha探針(SEQIDNO:38)0.20μMQ61Hb探針(SEQIDNO:40)0.20μMG13C探針(SEQIDNO:34)0.20μM外顯子3正向引物(SEQIDNO:7)0.50μM外顯子3反向引物(SEQIDNO:11)0.50μM外顯子3PNA寡聚體(SEQIDNO:56)1.20μM外顯子2正向引物(SEQIDNO:2)0.50μM外顯子2反向引物(SEQIDNO:6)0.50μM外顯子2PNA寡聚體(SEQIDNO:52)0.80μMIC正向引物(SEQIDNO:43)0.25μMIC反向引物(SEQIDNO:48)0.25μMIC探針(SEQIDNO:51)0.10μM緩沖液*1XROX參照0.06μMdNTP0.80mM活化試劑(MgCl2)**7mM熱穩(wěn)定的耐熱性DNA聚合酶11單位/反應(yīng)*所述緩沖液適合用于利用引物、探針和內(nèi)部對照的PCR測定。**所述活化試劑是在含有MgCl2和Tris的緩沖液中。MgCl2是DNA聚合酶的輔因子。另外，在每個運行中包括陽性和陰性對照試劑，并在所述方法的DNA提取、擴增和檢測步驟中處理以評估運行有效性。具體地，陰性對照試劑包括在6.67x105拷貝/mL的水平編碼內(nèi)部對照的質(zhì)粒和含有載體DNA的TE緩沖液。內(nèi)部對照是不具有已知的突變發(fā)生的KRAS基因區(qū)域。陽性對照試劑包括編碼內(nèi)部對照的質(zhì)粒(以6.67x105拷貝/mL的水平存在)、兩個編碼靶向的SNP的質(zhì)粒(每個在1.00x105拷貝/mL，其中一個質(zhì)粒編碼G12R和G12D，且另一個質(zhì)粒編碼G13D和Q61Ha)和含有載體DNA的TE緩沖液。因此，陽性對照試劑在每個反應(yīng)產(chǎn)生每個引物對的擴增子，且在每個熒光通道中的至少一個陽性信號用于監(jiān)測所述方法中的擴增。陽性和陰性對照試劑用于監(jiān)測樣品制備、擴增和檢測以及污染。在m2000rt儀器上的循環(huán)條件如在下面表12中所示。取樣是快速的，體積設(shè)定為50μl，且反應(yīng)體積為80μl。表12*在該步驟中在每個循環(huán)處進行實時熒光測量。每種探針含有下面表13所示的5’熒光標記和3’猝滅劑部分，由此允許在光學反應(yīng)板的各個孔中每種探針的獨立檢測。該獨立檢測又會提供檢測和鑒別每種SNP（當存在于KRAS基因中時）的能力。具體地，在光學反應(yīng)板的任何給定孔內(nèi)，每種探針含有不同的熒光團，且通過m2000rt儀器上的獨特熒光通道來檢測。該設(shè)置允許在光學讀數(shù)板的單個孔中同時擴增和檢測內(nèi)部對照和三種突變（如果存在的話）中的任一個(即，SNP)。因此，每個患者3個反應(yīng)的設(shè)置允許檢測KRAS基因中的九種獨立SNP。表13探針5'熒光標記3'猝滅劑部分G12D探針(SEQIDNO:13)FAMBHQ1G12A探針(SEQIDNO:16)VICBHQ1G12V探針(SEQIDNO:20)QuasarBHQ2G12S探針(SEQIDNO:22)QuasarBHQ2G12C探針(SEQIDNO:27)FAMBHQ1G12R探針(SEQIDNO:30)VICBHQ1G13D探針(SEQIDNO:31)FAMBHQ1G13C探針(SEQIDNO:34)VICBHQ1Q61Ha探針(SEQIDNO:38)QuasarBHQ2Q61Hb探針(SEQIDNO:40)Q670BHQ2IC探針(SEQIDNO:51)NEDBHQ2實施例2突變包含性評價了上述方法將G12D、G12A、G12V、G12S、G12C、G12R、G13D和G13C彼此區(qū)分開和與G12、G13、G13A、G13V、G13S和G13R區(qū)分開、以及將Q61H與Q61、Q61P、Q61E、Q61K、Q61L和Q61R區(qū)分開的能力。一式三份測試了KRAS野生型人細胞系DNA或以每個單倍體基因組一個拷貝的頻率用含有列出的突變的質(zhì)粒摻合（spike）的KRAS野生型人細胞系DNA。如在下面表14中所示，在每種情況下準確地確定每種突變的存在與否。因此，上述方法準確地鑒別出每種靶向的SNP，且沒有檢測出檢測未靶向的SNP或野生型序列。表14aKRAS突變(具有突變體核苷酸的密碼子標有下劃線).bG12、G13和Q61代表野生型。實施例3FFPE(固定的-福爾馬林石蠟包埋的)切片類型關(guān)于與安裝和未安裝在載玻片上的FFPE切片一起使用，進一步評價了上述方法。具體地，用共計50個FFPE樣品(即，22個CRC樣本、24個NSCLC樣本和4個細胞系樣品)評價了以下切片類型之間的一致：(1)安裝在載玻片上的FFPE切片，和(2)未安裝在載玻片上的FFPE切片。每個FFPE細胞系樣品由含有特定KRAS突變(G12R、G12D、G13C或Q61H)的細胞系和KRAS野生型細胞系的混合物組成。將細胞系樣品混合以產(chǎn)生5%突變細胞系頻率，并隨后在福爾馬林中固定并包埋在石蠟中。如在表15中所示，50個樣品中的30個具有對于兩種切片類型而言“檢測到的突變”的解釋。50個樣品中的20個具有對于兩種切片類型而言“未檢測到”的解釋。這些結(jié)果證實了切片類型(即，安裝在載玻片上的FFPE切片和未安裝在載玻片上的FFPE切片)之間的100%(50/50)總一致。因此，這些數(shù)據(jù)也證實，上述方法沒有區(qū)分安裝在載玻片上的FFPE切片和未安裝在載玻片上的FFPE切片。實施例4分析靈敏度上述方法還關(guān)于分析靈敏度進行了評價。具體地，從KRAS突變體和野生型FFPE細胞系提取DNA并純化。給每個KRAS突變體DNA純化物摻合KRAS野生型DNA純化物以實現(xiàn)在10ng可擴增的基因組DNA中4.0%或在2ng可擴增的基因組DNA中8.0%的突變頻率。隨后將每個10ng摻合物稀釋以產(chǎn)生具有4.0%、2.0%、1.0%、0.5%和0.25%的突變頻率的集合。隨后將每個2ng摻合物稀釋以產(chǎn)生具有8.0%、4.0%、2.0%、1.0%和0.5%的突變頻率的集合。對于每個集合，使用兩批擴增試劑和3m2000rt儀器執(zhí)行共6個運行。在每個運行中包括每個集合的8個重復，從而產(chǎn)生每個集合的共48個測試。每個10ng集合和每個2ng集合的檢測百分比分別顯示在下面表16和17中。使用概率單位數(shù)據(jù)分析來確定在10ng或2ng可擴增的基因組DNA中具有95%概率的突變百分比檢測，并顯示在下面表18中。這些數(shù)據(jù)證實，所述方法的分析靈敏度在10ng可擴增的基因組DNA中為2%KRAS突變。表16aQ61H密碼子CACbQ61H密碼子CATc從分析排除了一個具有無效結(jié)果的副本。表17aQ61H密碼子CACbQ61H密碼子CAT。表18aQ61H密碼子CACbQ61H密碼子CAT。實施例5再現(xiàn)性還評價了上述方法的再現(xiàn)性。使用CRC和NSCLC樣本的FFPE勻漿物的11-成員集合證實了再現(xiàn)性。該研究的結(jié)果顯示在下面表19中。集合成員01-09代表靶向的KRAS突變。集合成員10和11代表KRAS野生型。該研究也包括4個低陽性的樣品(即，集合成員01、05、08和09)，它們靶向小于或等于10ng的基因組DNA輸入和小于或等于5%的突變百分比。使用三個擴增試劑批次/儀器/操作人員完成了研究，每個集合成員2個樣品制備，且每天2次m2000rt儀器運行持續(xù)6天。所述方法具有對于組合的所有集合成員、重復、操作人員、試劑批次、儀器和天數(shù)而言100%(791/791)的總一致，對于“未檢測到”集合成員而言100%(144/144)的一致，和對于“檢測到的突變”集合成員而言100%(647/647)的一致。因此，這些數(shù)據(jù)證實，上述方法產(chǎn)生了可再現(xiàn)的結(jié)果，即在100%再現(xiàn)性比率。表19a來自具有列出預(yù)期的KRAS突變的有效結(jié)果的集合成員01-09的重復，并且認為“檢測到的突變”的解釋是一致的。來自具有有效結(jié)果的集合成員10和11的重復，并且認為“未檢測到”的解釋是一致的。b從分析排除了一個具有無效結(jié)果的重復。實施例6與參考方法的關(guān)聯(lián)將上述方法與另一種檢測SNP的方法（即2X雙向Sanger測序）進行了對比。使用TargetPrepDNAFFPE樣品制備試劑盒I和II處理了81個NSCLC和97個CRCFFPE樣本。通過上述方法和2X雙向Sanger測序測試了相同的含有DNA的洗脫液。如果通過兩種方法檢測到相同突變，認為突變檢測是正一致。對于NSCLC、CRC和組合的NSCLC和CRC，所述一致分別顯示在下面表20、21和22中。對于NSCLC樣本，上述方法和2X雙向Sanger測序之間的總一致是95.1%(77/81)，具有92.9%(13/14)的正一致。在被發(fā)現(xiàn)為正一致的13個突變中，觀察到下述突變(實例)：G12C(6)、G12D(1)、G12V(2)、G13D(1)、G13C(1)和Q61H(2)。對于CRC樣本，上述方法和2X雙向Sanger測序之間的總一致是86.6%(84/97)，具有97.6%(41/42)的正一致。在被發(fā)現(xiàn)為正一致的41個突變中，觀察到下述突變(實例)：G12S(1)、G12C(1)、G12D(12)、G12V(9)、G13D(15)和Q61H(3)。對于組合的NSCLC和CRC樣本，上述方法和2X雙向Sanger測序之間的總一致是90.4%(161/178)，具有96.4%(54/56)的正一致。在被發(fā)現(xiàn)為正一致的54個突變中，觀察到下述突變(實例)：G12S(1)、G12C(7)、G12D(13)、G12V(11)、G13D(16)、G13C(1)和Q61H(5)?？傊?，這些數(shù)據(jù)證實了上述方法和2X雙向Sanger測序之間86%或更高的總一致和92%或更高的正一致。表20a雙向Sanger測序具有在FFPE樣本中大約20%突變含量的檢測限度。通過QiagentherascreenRGQPCR證實了每個突變的存在和身份。b通過2X雙向Sanger測序鑒別出的突變是G13D。使用IonAmpliSeqCancerHotspotPanelv2的樣本下一代測序指示在密碼子12、13和61處的野生型序列。還通過QiagentherascreenRGQPCR證實了突變的缺失。表21a雙向Sanger測序具有在FFPE樣本中大約20%突變含量的檢測限度。通過使用IonAmpliSeqCancerHotspotPanelv2的下一代測序證實了2個具有Q61H突變的樣本。10個樣本具有密碼子12或13突變。通過QiagentherascreenRGQPCR證實了9個突變的存在和身份。通過QiagentherascreenRGQPCR證實了剩余突變的存在；但是，突變身份不同(通過本文描述的方法鑒別的G12A突變和通過QiagentherascreenRGQPCR鑒別的G12S突變)。b通過2X雙向Sanger測序鑒別的突變是G13D。使用IonAmpliSeqCancerHotspotPanelv2的樣本下一代測序指示在密碼子12、13和61處的野生型序列。還通過QiagentherascreenRGQPCR證實了突變的缺失。表22a雙向Sanger測序具有在FFPE樣本中大約20%突變含量的檢測限度。通過使用IonAmpliSeqCancerHotspotPanelv2的下一代測序證實了2個具有Q61H突變的樣本。13個樣本具有密碼子12或13突變。通過QiagentherascreenRGQPCR證實了12個突變的存在和身份。通過QiagentherascreenRGQPCR證實了剩余突變的存在；但是，突變身份不同(通過本文描述的方法鑒別的G12A突變和通過QiagentherascreenRGQPCR鑒別的G12S突變)。b對于每個樣本，通過2X雙向Sanger測序鑒別的突變是G13D。使用IonAmpliSeqCancerHotspotPanelv2的每個樣本的下一代測序指示在每個樣本中在密碼子12、13和61處的野生型序列。還通過QiagentherascreenRGQPCR證實了每個樣本中突變的缺失。實施例7分析特異性還針對它的分析特異性評價了上述方法。使用人胎盤衍生出的DNA（其含有KRAS同系物hRAS和nRAS以及KRAS假基因KRAS1P）評價了分析特異性。在25ng的基因組DNA輸入一式三份地測試了人胎盤衍生出的DNA，且沒有觀察到交叉反應(yīng)性。另外，在上述方法中針對潛在交叉反應(yīng)性評價了四種肺相關(guān)的微生物和三種結(jié)腸相關(guān)的微生物(參見下表23)。在樣品處理的裂解步驟中以106個集落形成單位(CFU)或106個基因組拷貝將每種微生物加入KRAS突變陰性的樣品中，并一式三份地測試。用測試過的任何微生物沒有觀察到交叉反應(yīng)性。另外，針對微生物的干擾評價了KRAS突變-陽性的樣品。以2%拷貝頻率將KRAS突變體質(zhì)粒加入10ngKRAS野生型人細胞系DNA中，并在有每個樣品輸入106個CFU或106個基因組拷貝的每種微生物存在下通過所述方法一式三份地測試。沒有微生物干擾KRAS突變檢測?？傊?，這些數(shù)據(jù)證實，上述方法沒有與KRAS同系物或假基因交叉反應(yīng)，且因而，所述方法對KRAS是特異性的。通過與可能污染得自受試者的樣品的微生物的交叉反應(yīng)性的缺乏和所述微生物的干擾的缺乏，進一步證實了該方法的特異性。表23微生物有關(guān)的器官樣品類型每個樣品輸出的靶濃度糞擬桿菌（Bacteroidescaccae）結(jié)腸培養(yǎng)的微生物106CFU中間普雷沃氏菌（Prevotellaintermedia）結(jié)腸純化的核酸106基因組拷貝大腸桿菌（Escherichiacoli）結(jié)腸純化的核酸106基因組拷貝金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）肺純化的核酸106基因組拷貝銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）肺純化的核酸106基因組拷貝肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumonia）肺純化的核酸106基因組拷貝煙曲霉（Aspergillusfumigatus）肺純化的核酸106基因組拷貝實施例8潛在干擾物質(zhì)還評價了上述方法對可能存在于臨床樣本中的高水平的物質(zhì)的干擾的敏感性。用在樣品處理的裂解步驟處添加的血紅蛋白、甘油三酯和壞死組織測試了KRAS突變陰性的樣品(即，KRAS野生型FFPE人細胞系)和KRAS突變陽性的樣品(即，與產(chǎn)生2%突變含量的KRAS突變體FFPE人細胞系混合的KRAS野生型FFPE人細胞系)。對于突變陰性的樣品和突變陽性的樣品，在至多4g/L血紅蛋白(2XClinicalandLaboratoryStandardsInstitute(CLSI)推薦的濃度)、至多74mM甘油三酯(2XCLSI推薦的高濃度)存在下和在具有70%壞死區(qū)域的人CRCFFPE組織的另外10微米切片存在下，沒有觀察到報告的解釋和突變檢測結(jié)果中的干擾。因此，這些結(jié)果證實，血紅蛋白、甘油三酯和壞死組織的存在(和高水平)不會干擾上述方法。應(yīng)當理解，前述詳細描述和附隨實施例僅僅是示例性的，且不應(yīng)用作對本發(fā)明的范圍的限制，所述范圍僅由所附權(quán)利要求和它們的等同方案限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白對公開的實施方案的不同變化和修改?？梢宰龀鲞@樣的變化和修改而不脫離其精神和范圍，所述變化和修改包括、但不限于與化學結(jié)構(gòu)、取代基、衍生物、中間體、合成、組合物、制劑或本發(fā)明的使用方法有關(guān)的那些。當前第1頁1 2 3