嵌合抗原受體及制備方法與流程

本申請(qǐng)要求2014年2月14日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)No.61/940,339的權(quán)益，所述申請(qǐng)通過(guò)引用方式將其全文并入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，它涉及產(chǎn)生嵌合抗原受體(CAR)的方法。

相關(guān)領(lǐng)域的描述

過(guò)繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移是一種可以用于治療癌癥的有希望的治療方法。過(guò)繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移牽涉分離并擴(kuò)增能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的抗原特異性T細(xì)胞。一般地，從受試者取出T細(xì)胞，并且在體外培養(yǎng)?？梢詫⑶逗峡乖荏w(CAR)在體外引入T細(xì)胞中以指導(dǎo)T細(xì)胞在再引入受試者中后基于抗原的表達(dá)而選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞(例如Wieczorek等2013；Berry等,2013)。

一個(gè)與過(guò)繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)的問(wèn)題是哪種CAR可以在某些患者群體中更有效起作用(例如用于治療特定癌癥)之間存在顯著的可變性。由于可以潛在產(chǎn)生的可以展現(xiàn)出針對(duì)癌癥的治療活性的潛在不同CAR的數(shù)目非常大，目前臨床醫(yī)生非常難以預(yù)期哪種CAR可以展示針對(duì)給定癌癥或癌癥亞型的治療活性。由于過(guò)繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重大的治療潛力，明顯需要用于鑒定和產(chǎn)生新CAR的改善的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一些方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生CAR的方法，并且提供了特定的CAR。在一些方面，提供了用于產(chǎn)生大量CAR的方法，所述CAR可以針對(duì)特定癌癥或癌癥亞型的活性被篩選；這樣，可以產(chǎn)生并鑒定可以展現(xiàn)出改善的針對(duì)特定癌癥或癌癥亞型的治療潛力的CAR?？梢韵蚴茉囌呋蛉嘶颊咧委熜允┯帽疚闹刑峁┑腃AR，例如以治療癌癥。

臨床數(shù)據(jù)證明了使T細(xì)胞靶向給定的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的特定的嵌合抗原受體(CAR)設(shè)計(jì)在不同患者中可以具有不同的治療潛力。例如，當(dāng)向具有急性的而不是慢性的B譜系白血病的患者施用自體遺傳修飾的T細(xì)胞時(shí)，經(jīng)由嵌合CD28/CD3ζ或CD137/CD3-ζ活化的第二代CD19特異性CAR可以展現(xiàn)出優(yōu)越的臨床響應(yīng)。為了解決此問(wèn)題，本文中提供了用于產(chǎn)生可以展現(xiàn)出改善的針對(duì)給定腫瘤的抗腫瘤效果的CAR種類(lèi)的方法。

例如，本文中提供了可以用于產(chǎn)生大量CAR并且篩選它們治療來(lái)自給定患者的癌癥的能力的方法；這樣，可以使用所述方法使用于患者的療法個(gè)體化，并且選擇展示針對(duì)具有特定癌癥的特定患者或患者亞組的改善的治療潛力的特定CAR。用于基因療法的臨床方法可以利用來(lái)自睡美人(Sleeping Beauty)(SB)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的DNA質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)移，例如以降低制造用于小患者亞組的單獨(dú)CAR設(shè)計(jì)的成本和復(fù)雜性。用于使CAR+T細(xì)胞個(gè)體化的這些方法可以利用大量CAR分子的產(chǎn)生，可以篩選所述CAR分子和評(píng)估其有益于給定患者的能力。

在一些方面，提供了使用三重位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)(又稱(chēng)為“EZ-CAR”平臺(tái))高通量裝配CAR分子的方法。在一些實(shí)施方案中，這些方法可以允許從(i)限定特異性的單鏈可變片段(scFv)，(ii)從細(xì)胞表面附加scFv的支架/鉸鏈，和(iii)一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域快速組合原型CAR的3種組分。例如，如下文實(shí)施例中顯示，使用EZ CAR平臺(tái)連同臨床級(jí)CD19RCD28mζCAR+T細(xì)胞(CG CAR)，產(chǎn)生經(jīng)由嵌合CD28/CD3-ζ活化的CD19特異性CAR。

在一些實(shí)施方案中，本文中提供或通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的CAR可以在T細(xì)胞中與膜結(jié)合IL-15共表達(dá)。這樣，T細(xì)胞可以在體外或體內(nèi)在不顯著增殖的情況下以靜止?fàn)顟B(tài)存活或存在。比較而言，如先前描述，表達(dá)CAR的T細(xì)胞當(dāng)在體外去除細(xì)胞因子時(shí)通常會(huì)死亡，并且此細(xì)胞死亡可以在某些情況中臨床施用T細(xì)胞時(shí)充當(dāng)安全性特征。通常使用自發(fā)細(xì)胞測(cè)定來(lái)測(cè)量T細(xì)胞增殖。因此，與某些先前鑒定的CAR(其中T細(xì)胞在沒(méi)有抗原性刺激的情況下在體外不能存活)形成對(duì)比，本文中提供了可以在體外在沒(méi)有自發(fā)生長(zhǎng)的情況下誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的CAR。根據(jù)期望的具體的實(shí)施方案，通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生或本文中提供的CAR可以在T細(xì)胞中在具有或沒(méi)有膜結(jié)合IL-15在T細(xì)胞中共表達(dá)的情況下表達(dá)。

本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種組合物，所述組合物包含(a)編碼一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多個(gè)第一載體；(b)編碼一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的鉸鏈結(jié)構(gòu)域的多個(gè)第二載體；和(c)編碼一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域的多個(gè)第三載體；其中所述第一、第二和第三載體中的至少兩種包括多個(gè)分別編碼獨(dú)特的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域和/或膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域的兩種或更多種載體，并且進(jìn)一步其中所述載體包含用于同源重組的位點(diǎn)以允許編碼嵌合抗原受體(CAR)的第四載體的產(chǎn)生。

在本發(fā)明中，如提到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和多肽，如抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域(endodomain)使用，術(shù)語(yǔ)“獨(dú)特的”意味著具有不同的多肽(氨基酸)序列、包含不同的多肽(氨基酸)序列或由不同的多肽(氨基酸)序列組成的結(jié)構(gòu)域。例如，兩個(gè)“獨(dú)特的”抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合相同抗原(實(shí)際上，甚至所述抗原上的相同表位)；然而，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域在它們的連續(xù)氨基酸組成彼此不同的情況下是“獨(dú)特的”。同樣地，在連續(xù)的氨基酸組成方面不同的兩種“獨(dú)特的”抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域也可以特異性結(jié)合不同抗原和表位。相反，如本文中使用，相同氨基酸序列的兩個(gè)分子(多肽)不是“獨(dú)特的”多肽。

在一些實(shí)施方案中，多個(gè)第一載體編碼多個(gè)獨(dú)特的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，多個(gè)第二載體編碼一個(gè)鉸鏈結(jié)構(gòu)域，并且多個(gè)第三載體編碼多個(gè)獨(dú)特的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)第一載體編碼多個(gè)獨(dú)特的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，多個(gè)第二載體編碼多個(gè)獨(dú)特的鉸鏈結(jié)構(gòu)域，并且多個(gè)第三載體編碼多個(gè)獨(dú)特的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)第一載體編碼多個(gè)獨(dú)特的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，多個(gè)第二載體編碼多個(gè)獨(dú)特的鉸鏈結(jié)構(gòu)域，并且多個(gè)第三載體編碼一個(gè)膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)第一載體編碼一個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，多個(gè)第二載體編碼多個(gè)獨(dú)特的鉸鏈結(jié)構(gòu)域，并且多個(gè)第三載體編碼多個(gè)獨(dú)特的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含scFv或由scFv組成。第三載體可以編碼跨膜結(jié)構(gòu)域。第二載體可以編碼跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包含編碼一個(gè)或多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的多個(gè)第五載體；其中第一載體、第二載體、第三載體和第五載體包含用于同源重組的位點(diǎn)以產(chǎn)生編碼嵌合抗原受體(CAR)的第四載體。第一載體可以包含同源重組的第一序列和第二位點(diǎn)。第二載體可以包含同源重組的第二序列和同源重組的第三序列。第三載體可以包含同源重組的第三序列和同源重組的第四序列。第三載體可以包含同源重組的所述第三序列和同源重組的第四序列。第四載體包含同源重組的第一序列和同源重組的第四序列。第一載體、第二載體、和/或第三載體可以編碼轉(zhuǎn)座酶。轉(zhuǎn)座酶可以是鮭魚(yú)型Tc1樣轉(zhuǎn)座酶(SB)。在一些實(shí)施方案中，第一載體、第二載體、第三載體、第四載體和/或第五載體中的1種、2種、3種、4種或全部是睡美人(SB)或piggyBac轉(zhuǎn)座子載體?；蛘?，在一些實(shí)施方案中，第一載體、第二載體、第三載體、第四載體、和/或第五載體不是睡美人(SB)或piggyBac轉(zhuǎn)座子載體；例如，在一些實(shí)施方案中，可以在不使用睡美人(SB)或piggyBac載體的情況下產(chǎn)生CAR，然后可以隨后將CAR插入在適合于轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的載體中(例如，插入睡美人(SB)載體，如例如Singh等,2015中所述)。不過(guò)，在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生已經(jīng)存在于適合于轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的載體中的CAR可以簡(jiǎn)化過(guò)程或者減少產(chǎn)生CAR和轉(zhuǎn)染T細(xì)胞兩者所需的步驟的數(shù)目。獨(dú)特的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以選擇性結(jié)合不同的抗原。在一些實(shí)施方案中，獨(dú)特的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域選擇性結(jié)合相同的抗原?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域可以選擇性結(jié)合CD19、通用抗原(小鼠)、HER-3、GD2、Gp75、CS1蛋白、間皮素、磷脂酰絲氨酸、cMyc、CD22、CD4、CD44v6、CD45、CD28、CD3、CD3e、CD123、CD138、CD52、CD56、CD74、CD30、Gp75、CD38、CD33、CD20、Her1/HER3融合物、GD2、碳水化合物、曲霉、ROR1、c-MET、EGFR、Dectin、埃博拉、真菌、GP、HERV-K(HERVK)、NY-ESO-1、VEGF-R2、TGF-b2R、IgG4、生物素或O-AcGD2。獨(dú)特的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由scFv組成或者包含scFv。鉸鏈區(qū)可以由下列各項(xiàng)組成或包含下列各項(xiàng)：12AA肽(GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCT，SEQ ID NO:1)、t-20AA肽、IgG4FcΔ EQ、IgG4FcΔQ、(t-12AA+t-20AA)、mKate、phiLov、dsRed、Venus、eGFP、CH3HA,(CD8α+t-20AA)、雙重t-20AA、(t-20AA+CD8α)、(CD8α+亮氨酸拉鏈Basep1)、(CD8α+亮氨酸拉鏈Acid1)、2D3、CD8α或IgG4Fc。膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)可以包含CD3ζ。膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)可以包含一個(gè)或多個(gè)ITAM結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)包含(CD28+CD3ζ)、(CD28+CD27+CD3ζ)、(CD28+OX40+CD3ζ)、(CD28+4-1BB+CD3ζ)、(CD28+CD27+OX40+CD3ζ)、(CD28+4-1BB+CD27+CD3ζ)、(CD28+4-1BB+OX40+CD3ζ)、(4-1BB+CD3ζ)、(4-1BB+OX40+CD3ζ)、(4-1BB+CD27+CD3ζ)、(CD27+CD3ζ)、(CD27+OX 40+CD3ζ)、(CD28Δ+CD3ζ)、(CD28Δ+CD27+CD3ζ)、(CD28Δ+OX40+CD3ζ)、(CD28Δ+4-1BB+CD3ζ)、(CD28Δ+4-1BB+OX40+CD3ζ)、(CD28Δ+CD27+OX40+CD3ζ)、(CD28Δ+4-1BB+CD27+CD3ζ)、(4-1BB+ICOS+CD3ζ)、(CD28+ICOS+CD3ζ)、(ICOS+CD3ζ)、CD3ζ、或僅CD28。在一些實(shí)施方案中，可以測(cè)試CAR的活性，例如，使用iQue^TM篩選器(iQue^TM Screener)(IntelliCyt,Albuquerque,NM)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)在細(xì)胞如T細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，使用諸如例如流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)，可以評(píng)估CAR的一種或多種特征(例如，活力、活化信號(hào)的上調(diào)、CD25的上調(diào)、細(xì)胞因子釋放、和/或細(xì)胞殺傷)。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種組合物，所述組合物包含編碼嵌合抗原受體的載體集合，所述載體集合編碼多個(gè)獨(dú)特的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域，所述集合的所述載體就所述結(jié)構(gòu)域而言是隨機(jī)化的。

本發(fā)明的又一個(gè)方面涉及產(chǎn)生多個(gè)各自編碼嵌合抗原受體(CAR)的載體的方法，所述方法包括：(i)獲得包含本發(fā)明的多個(gè)載體(例如，如上文描述)的組合物；并且(ii)使所述組合物經(jīng)受足以允許在所述載體中包含或由所述載體編碼的所述獨(dú)特的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域和/或膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域經(jīng)由同源重組而重組的條件以產(chǎn)生多個(gè)第四載體，其中所述第四載體中的每個(gè)編碼CAR。所述方法可以進(jìn)一步包括在細(xì)胞中表達(dá)CAR。所述方法可以進(jìn)一步包括測(cè)試CAR的活性。在一些實(shí)施方案中，第一載體中的一個(gè)或多個(gè)編碼scFv區(qū)。在一些實(shí)施方案中，第三載體中的一個(gè)或多個(gè)編碼跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，第二載體中的一個(gè)或多個(gè)編碼跨膜結(jié)構(gòu)域。所述方法可以進(jìn)一步包括通過(guò)重組隨機(jī)合并編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的第五載體與所述第一載體、第二載體、和第三載體以形成所述第四載體。在一些實(shí)施方案中，從編碼多個(gè)獨(dú)特的scFv區(qū)和多個(gè)獨(dú)特的鉸鏈區(qū)的多個(gè)載體隨機(jī)連接所述第一載體和所述第二載體。在一些實(shí)施方案中，從編碼多個(gè)獨(dú)特的scFv區(qū)和多個(gè)獨(dú)特的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域的多個(gè)載體隨機(jī)連接所述第一載體和所述第三載體。在一些實(shí)施方案中，從編碼多個(gè)獨(dú)特的鉸鏈區(qū)和多個(gè)獨(dú)特的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域的多個(gè)載體隨機(jī)連接所述第二載體和所述第三載體。在一些實(shí)施方案中，從編碼多個(gè)獨(dú)特的scFv區(qū)、多個(gè)獨(dú)特的鉸鏈區(qū)和多個(gè)獨(dú)特的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域的多個(gè)載體隨機(jī)連接所述第一載體、所述第二載體和所述第三載體。所述方法可以進(jìn)一步包括通過(guò)隨機(jī)連接來(lái)自編碼多個(gè)scFv區(qū)的載體的第一文庫(kù)的所述第一載體，隨機(jī)連接來(lái)自編碼多個(gè)scFv區(qū)的載體的第二文庫(kù)的所述第二載體，并且隨機(jī)連接來(lái)自編碼多個(gè)膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域的載體的第三文庫(kù)的所述第三載體產(chǎn)生所述第四載體，以形成編碼所述CAR的所述第四載體。第一載體可以包含同源重組的第一序列和第二位點(diǎn)。第二載體可以包含同源重組的第二序列和同源重組的第三序列。第三載體可以包含同源重組的所述第三序列和同源重組的第四序列。第三載體可以包含同源重組的所述第三序列和同源重組的第四序列。第四載體可以包含同源重組的所述第一序列和同源重組的所述第四序列。第一載體、第二載體、和/或第三載體可以編碼轉(zhuǎn)座酶。在一些實(shí)施方案中，第六載體編碼轉(zhuǎn)座酶，并且其中所述方法包括將所述第四載體和所述第六載體中的一種或多種引入、電穿孔、或轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)座酶可以是鮭魚(yú)型Tc1樣轉(zhuǎn)座酶(SB)。所述方法可以進(jìn)一步包括在存在人工抗原呈遞細(xì)胞(aAPC)的情況下培養(yǎng)或提供用所述CAR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，所述人工抗原呈遞細(xì)胞(aAPC)能刺激表達(dá)CAR的T細(xì)胞的擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，所述scFv區(qū)、所述鉸鏈區(qū)和所述膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域中的每種各自在睡美人(SB)或piggyBac轉(zhuǎn)座子載體中編碼。在一些實(shí)施方案中，從編碼多個(gè)獨(dú)特的scFv區(qū)、鉸鏈區(qū)和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域的多個(gè)載體通過(guò)所述重組隨機(jī)連接所述第一載體、所述第二載體和/或所述第三載體中的每種。在一些實(shí)施方案中，所述第一載體、所述第二載體、和所述第三載體各自含有轉(zhuǎn)座子；并且其中經(jīng)由同源重組的所述連接包括位點(diǎn)特異性重組。在一些實(shí)施方案中，所述第一載體和所述第二載體各自具有第一同源重組位點(diǎn)；并且其中所述第二載體和所述第三載體各自具有第二同源重組位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，所述第一載體具有第三重組位點(diǎn)，并且其中所述第四載體具有第四重組位點(diǎn)，其中所述第三重組位點(diǎn)和第四重組位點(diǎn)可以允許對(duì)細(xì)胞的同源重組。細(xì)胞可以是T細(xì)胞，如例如αβT細(xì)胞、γδT細(xì)胞、或NK細(xì)胞、或NKT細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是多能細(xì)胞，如例如干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞從干細(xì)胞、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞或干細(xì)胞衍生。細(xì)胞可以是從誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞衍生的T細(xì)胞或NK細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述獨(dú)特的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或更多個(gè)選擇性識(shí)別不同抗原的scFv。在一些實(shí)施方案中，所述獨(dú)特的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或更多個(gè)選擇性識(shí)別(即特異性結(jié)合)相同抗原的scFv。在一些實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域選擇性(特異性)結(jié)合CD19、通用抗原(小鼠)、HER-3、GD2、Gp75、CS1蛋白、間皮素、磷脂酰絲氨酸、cMyc、CD22、CD4、CD44v6、CD45、CD28、CD3、CD3e、CD123、CD138、CD52、CD56、CD74、CD30、Gp75、CD38、CD33、CD20、Her1/HER3融合物、GD2、碳水化合物、曲霉、ROR1、c-MET、EGFR、Dectin、埃博拉、真菌、GP、HERV-K、NY-ESO-1、VEGF-R2、TGF-b2R、IgG4、生物素或O-AcGD2。在一些實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含scFv或由scFv組成。所述鉸鏈區(qū)可以編碼12AA肽(GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCT,SEQ ID NO:1)、t-20AA肽、IgG4FcΔ EQ、IgG4FcΔQ、(t-12AA+t-20AA)、mKate、phiLov、dsRed、Venus、eGFP、CH3HA,(CD8α+t-20AA)、雙重t-20AA、(t-20AA+CD8α)、(CD8α+亮氨酸拉鏈Basep1)、(CD8α+亮氨酸拉鏈Acid1)、2D3、CD8α或IgG4Fc。膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域可以編碼CD3ζ。膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域可以編碼一個(gè)或多個(gè)ITAM結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，所述膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域編碼(CD28+CD3ζ)、(CD28+CD27+CD3ζ)、(CD28+OX40+CD3ζ)、(CD28+4-1BB+CD3ζ)、(CD28+CD27+OX40+CD3ζ)、(CD28+4-1BB+CD27+CD3ζ)、(CD28+4-1BB+OX40+CD3ζ)、(4-1BB+CD3ζ)、(4-1BB+OX40+CD3ζ)、(4-1BB+CD27+CD3ζ)、(CD27+CD3ζ)、(CD27+OX 40+CD3ζ)、(CD28Δ+CD3ζ)、(CD28Δ+CD27+CD3ζ)、(CD28Δ+OX40+CD3ζ)、(CD28Δ+4-1BB+CD3ζ)、(CD28Δ+4-1BB+OX40+CD3ζ)、(CD28Δ+CD27+OX40+CD3ζ)、(CD28Δ+4-1BB+CD27+CD3ζ))、(4-1BB+ICOS+CD3ζ)、(CD28+ICOS+CD3ζ)、(ICOS+CD3ζ)、CD3ζ、或僅CD28。在一些實(shí)施方案中，可以測(cè)試CAR的活性，例如，使用iQue^TM篩選器(IntelliCyt,Albuquerque,NM)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)在細(xì)胞如T細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，使用諸如例如流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)，可以評(píng)估CAR的一種或多種特征(例如，活力、活化信號(hào)的上調(diào)、CD25的上調(diào)、細(xì)胞因子釋放、和/或細(xì)胞殺傷)。在一些實(shí)施方案中，所述活性包括所述CAR選擇性結(jié)合癌細(xì)胞，選擇性結(jié)合病原體，選擇性結(jié)合涉及自身免疫性疾病的細(xì)胞或者促進(jìn)T細(xì)胞的活化、T細(xì)胞的破壞、T細(xì)胞的分化、T細(xì)胞的增殖、T細(xì)胞的去分化、T細(xì)胞的移動(dòng)、T細(xì)胞的細(xì)胞因子生成、或T細(xì)胞的殺傷的能力。

在一些實(shí)施方案中，所述癌細(xì)胞是卵巢癌、淋巴瘤、腎細(xì)胞癌、B細(xì)胞惡性腫瘤、CLL、B-ALL、ALL、白血病、B細(xì)胞惡性腫瘤或淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、無(wú)痛性B細(xì)胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、AML，宮頸癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、皮膚癌、黑素瘤、肺癌、骨肉瘤、膠質(zhì)瘤、上皮衍生的腫瘤、前列腺癌或兒科癌癥。所述病原體可以是病毒、真菌或細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，所述測(cè)試包括單細(xì)胞成像、單細(xì)胞遺傳學(xué)、單個(gè)T細(xì)胞或T細(xì)胞群體的評(píng)估；測(cè)量特異性殺傷或連續(xù)殺傷、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)表達(dá)、朝向或遠(yuǎn)離靶標(biāo)的移動(dòng)、增殖、活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡、細(xì)胞因子的分泌或趨化因子的分泌。所述方法可以進(jìn)一步包括基于單個(gè)CAR的特性，從所述多個(gè)載體選擇所述單個(gè)CAR。所述方法可以進(jìn)一步包括向受試者治療性施用所述單個(gè)CAR。所述受試者可以是哺乳動(dòng)物，如例如人。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及多肽，其包含下列各項(xiàng)或者由下列各項(xiàng)組成：CAR 217(SEQ ID NO:2)、CAR 194(SEQ ID NO:3)、CAR 212(SEQ ID NO:4)、CAR 213(SEQ ID NO:5)、CAR 265(SEQ ID NO:6)、CAR 214(SEQ ID NO:56)、CAR 215(SEQ ID NO:57)、CAR 216(SEQ ID NO:58)、CAR 218(SEQ ID NO:59)、CAR 193(SEQ ID NO:55)或CAR 268(SEQ ID NO:7)。

本發(fā)明的又一個(gè)方面涉及表達(dá)多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞，所述多肽包含下列各項(xiàng)或者由下列各項(xiàng)組成：CAR 217(SEQ ID NO:2)、CAR 194(SEQ ID NO:3)、CAR 212(SEQ ID NO:4)、CAR 213(SEQ ID NO:5)、CAR 265(SEQ ID NO:6)、CAR 214(SEQ ID NO:56)、CAR 215(SEQ ID NO:57)、CAR 216(SEQ ID NO:58)、CAR 218(SEQ ID NO:59)、CAR 193(SEQ ID NO:55)或CAR 268(SEQ ID NO:7)。細(xì)胞可以是永生化細(xì)胞。T細(xì)胞可以是αβT細(xì)胞、γδT細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、干細(xì)胞、或從干細(xì)胞衍生的細(xì)胞，包括免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及藥物制劑，所述藥物制劑包含本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞。

本發(fā)明的又一個(gè)方面涉及核酸，所述核酸編碼包含下列各項(xiàng)或由下列各項(xiàng)組成的嵌合抗原受體：CAR 217(SEQ ID NO:2)、CAR 194(SEQ ID NO:3)、CAR 212(SEQ ID NO:4)、CAR 213(SEQ ID NO:5)、CAR 265(SEQ ID NO:6)、CAR 214(SEQ ID NO:56)、CAR 215(SEQ ID NO:57)、CAR 216(SEQ ID NO:58)、CAR 218(SEQ ID NO:59)、CAR 193(SEQ ID NO:55)或CAR 268(SEQ ID NO:7)。所述核酸可以被包含在T細(xì)胞中，如例如αβT細(xì)胞、γδT細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、干細(xì)胞、或從多能細(xì)胞衍生的T細(xì)胞。T細(xì)胞可以被包含在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑中。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及組合物，所述組合物包含不同CAR編碼載體的文庫(kù)，所述文庫(kù)的載體就獨(dú)特的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域和/或膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域而言是隨機(jī)化的。在一些實(shí)施方案中，所述文庫(kù)就獨(dú)特的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域而言隨機(jī)化。在一些實(shí)施方案中，所述文庫(kù)就獨(dú)特的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域而言隨機(jī)化。在一些實(shí)施方案中，所述文庫(kù)就獨(dú)特的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和鉸鏈結(jié)構(gòu)域而言隨機(jī)化。在一些實(shí)施方案中，所述文庫(kù)就獨(dú)特的抗原鉸鏈結(jié)構(gòu)域和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域而言隨機(jī)化。

下文在表1中顯示了在本發(fā)明的方法中用于產(chǎn)生CAR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域的實(shí)例。抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域、和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域在表1中僅作為非限制性實(shí)例提供，并且預(yù)期如對(duì)于具體臨床應(yīng)用所期望的，可以選擇實(shí)際上任何抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，靶向癌性細(xì)胞、細(xì)菌、真菌、病毒或病毒感染的細(xì)胞)。在表1中，提供了抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶標(biāo)(例如，“CD19”可以指選擇性結(jié)合CD19的scFv區(qū))。在一些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含選擇性結(jié)合抗原的scFv或由選擇性結(jié)合抗原的scFv組成。若期望的話(huà)，可以在期望時(shí)使scFv的部分隨機(jī)化(例如，scFv的可變區(qū)的部分)。在一些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域選擇性結(jié)合蛋白質(zhì)。或者，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以選擇性結(jié)合在靶標(biāo)，如例如真菌、病毒、細(xì)菌或癌性細(xì)胞上表達(dá)的碳水化合物。例如，在一些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含Dectin-1或由Dectin-1組成，所述Dectin-1可以選擇性結(jié)合存在于真菌細(xì)胞壁中的β-葡聚糖和碳水化合物。在一些實(shí)施方案中，CAR可以選擇性結(jié)合病毒，例如，CAR可以結(jié)合病毒蛋白，如肝炎包膜蛋白(例如，Krebs等,2013)。在一些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞因子?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域可以選擇性結(jié)合蛋白質(zhì)、碳水化合物、或糖。在一些實(shí)施方案中，從選擇性結(jié)合單一靶標(biāo)，抗原的多個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生CAR，或者抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以具有重疊的抗原。在一些實(shí)施方案中，從選擇性結(jié)合不同靶標(biāo)或抗原的多個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生CAR。CAR中的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域可以在表達(dá)CAR的細(xì)胞，如例如T細(xì)胞或自然殺傷(NK)細(xì)胞中產(chǎn)生抑制信號(hào)(例如，PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、BTLA、ITIM、SHP-1、LAIR-1、TIGIT、Siglecs)或刺激信號(hào)(例如，CD27、CD28、ICOS、CD134、CD137、LCK、DAP10、ITAM、ZAP-70、LAT、SLP-76、細(xì)胞因子以及細(xì)胞因子受體；以及組合和突變)。當(dāng)抗原結(jié)合區(qū)選擇性識(shí)別抗原時(shí)，膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域可以引起或促進(jìn)包含CAR的細(xì)胞(例如T細(xì)胞或NK細(xì)胞)活化細(xì)胞殺傷、遷移、分化、去分化、或者導(dǎo)致誘導(dǎo)細(xì)胞中的凋亡信號(hào)。凋亡信號(hào)可以包含CTLA4凋亡信號(hào)和/或PD1(蛋白質(zhì)死亡1)凋亡信號(hào)或由CTLA4凋亡信號(hào)和/或PD1(蛋白質(zhì)死亡1)凋亡信號(hào)組成。在一些實(shí)施方案中，可以在細(xì)胞，如例如T細(xì)胞或NK細(xì)胞中表達(dá)超過(guò)一種獨(dú)特的CAR。例如，可以在細(xì)胞中表達(dá)第一CAR和第二CAR，其中第一CAR選擇性結(jié)合健康細(xì)胞上的抗原，并且經(jīng)由第一膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)抑制信號(hào)(例如，降低T細(xì)胞或NK細(xì)胞將損傷健康細(xì)胞的概率)，并且第二CAR選擇性結(jié)合靶細(xì)胞(例如，癌性細(xì)胞、真菌、病毒感染的細(xì)胞、細(xì)菌)上的抗原，并且經(jīng)由第二膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)刺激信號(hào)(例如，促進(jìn)或引起T細(xì)胞或NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷)。經(jīng)由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的CAR可以插入靶細(xì)胞，如例如T細(xì)胞或NK細(xì)胞，作為整合的DNA(例如，使用電穿孔和經(jīng)由轉(zhuǎn)座酶/轉(zhuǎn)座子載體或系統(tǒng)的同源重組)或作為非整合的DNA或RNA(例如，使用病毒載體，如例如慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒的mRNA的病毒遞送)。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的編碼CAR的T細(xì)胞是永生化細(xì)胞；此類(lèi)永生化細(xì)胞可以發(fā)揮功能，可以用于評(píng)估或測(cè)量CAR的治療潛力或毒性。這樣，可以篩選許多CAR的期望的藥理學(xué)譜、針對(duì)患病細(xì)胞或病原體的毒性、在健康細(xì)胞中的毒性缺乏、和/或治療效力。

表1：可以組合為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域-鉸鏈-信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生CAR的DNA分子。

ζ–zeta；△-突變體；注意＝4-1BB又稱(chēng)為CD137；“+”指不同區(qū)域的融合。

例如，在一些實(shí)施方案中，可以使用以下抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈/支架、跨膜結(jié)構(gòu)域、和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域，如表2中顯示。信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域中，例如表1或表2中包含的序列的實(shí)例包括CD27(SEQ ID NO:41)、CD28(SEQ ID NO:42)、CD28Δ(SEQ ID NO:43)、CD134(OX40)(SEQ ID NO:44)、CD137(41BB)(SEQ ID NO:45)、ICOS(SEQ ID NO:46)和CD3ζ(SEQ ID NO:47)。如表2中列出的scFv抗EGFR結(jié)構(gòu)域的實(shí)例包括Nimotuximab(SEQ ID NO:48)和西妥昔單抗(Cetuximab)(SEQ ID NO:49)。如表2中列出的scFv抗磷脂酰絲氨酸的實(shí)例是巴維昔單抗(Bavituximab)(SEQ ID NO:50)。

表2：用于產(chǎn)生CAR的文庫(kù)的實(shí)例

如本文中使用，術(shù)語(yǔ)“嵌合抗原受體(CAR)”或“CAR”包括人工T細(xì)胞受體、嵌合T細(xì)胞受體、或嵌合免疫受體。CAR一般是工程化受體，其可以將人工特異性植入到特定的免疫效應(yīng)細(xì)胞上?？梢圆捎肅AR來(lái)將單克隆抗體的特異性賦予給T細(xì)胞，從而允許產(chǎn)生大量特異性T細(xì)胞，例如用于過(guò)繼性細(xì)胞療法。在一些實(shí)施方案中，CAR將細(xì)胞的特異性針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，CAR包含膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域(包含胞內(nèi)活化結(jié)構(gòu)域)、跨膜結(jié)構(gòu)域、鉸鏈或支架區(qū)、和包含靶向結(jié)構(gòu)域的胞外結(jié)構(gòu)域(例如，從單克隆抗體衍生的scFv)。在一些實(shí)施方案中，胞外靶向結(jié)構(gòu)域可以是受體的配體(例如，選擇性結(jié)合蛋白質(zhì)受體的肽)。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)使用對(duì)惡性細(xì)胞特異的CAR重定向T細(xì)胞的特異性(例如，通過(guò)使用抗CD19scFv靶向癌性B譜系細(xì)胞)來(lái)靶向惡性細(xì)胞。

表1中顯示了scFv區(qū)、鉸鏈/支架區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域、和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域的實(shí)例，并且本文中還提供了相關(guān)序列的實(shí)例。在表1中注意到scFv區(qū)可以指用于特定靶標(biāo)的多個(gè)scFv區(qū)(例如，表1中的“CD19”可以指單一單克隆抗體序列，或者在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，它可以指從選擇性靶向CD19的單克隆抗體衍生的多個(gè)scFv區(qū))。預(yù)期可以使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生CAR，所述CAR包含例如表1的scFv區(qū)、鉸鏈/支架、跨膜結(jié)構(gòu)域、和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域的任何組合的融合物。例如，在一些實(shí)施方案中，CAR可以包含與IgG4Fc鉸鏈/支架區(qū)、CD28跨膜結(jié)構(gòu)域、和包含CD28和CD3ζ的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合的選擇性靶向CD19的scFv區(qū)(例如，從小鼠、人或人源化單克隆抗體衍生)。在一些實(shí)施方案中，CAR可以包含與IgG4Fc鉸鏈/支架區(qū)、CD28跨膜結(jié)構(gòu)域、和包含CD28和CD3ζ的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合的選擇性靶向ROR1的scFv區(qū)。在一些實(shí)施方案中，CAR可以包含與IgG4Fc鉸鏈/支架區(qū)、CD28跨膜結(jié)構(gòu)域、和包含4-1BB和CD3ζ的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合的選擇性靶向ROR1的scFv區(qū)。在一些實(shí)施方案中，CAR可以包含與IgG4Fc鉸鏈/支架區(qū)、CD28跨膜結(jié)構(gòu)域、和包含CD28和CD3ζ的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合的選擇性靶向CD19的scFv區(qū)(例如，從小鼠、人或人源化單克隆抗體衍生)。

如本文中使用，術(shù)語(yǔ)“抗原”是能夠由抗體或T細(xì)胞受體結(jié)合的分子?？乖话憧梢杂糜谡T導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致B和/或T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生。

如本文中說(shuō)明書(shū)使用，“一個(gè)”或“一種”可以意指一個(gè)/種或多個(gè)/種。如本文中在權(quán)利要求中使用，當(dāng)結(jié)合詞語(yǔ)“包含”使用時(shí)，詞語(yǔ)“一個(gè)”或“一種”可以意指一個(gè)/種或超過(guò)一個(gè)/種。

在權(quán)利要求書(shū)中使用術(shù)語(yǔ)“或”用于指“和/或”，除非明確指明僅指?jìng)溥x或者備選是互相排斥的，盡管公開(kāi)內(nèi)容支持僅指?jìng)溥x和“和/或”的定義。如本文中使用，“另一”可以意指至少第二或更多。

貫穿本申請(qǐng)，術(shù)語(yǔ)“約”用于指數(shù)值包括裝置、用于測(cè)定數(shù)值的方法的固有誤差變化，或者研究受試者間存在的變化。

通過(guò)以下詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得明顯。然而，應(yīng)當(dāng)理解，雖然詳細(xì)描述和具體的實(shí)例指示本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，但是它們僅作為例示給出，因?yàn)橥ㄟ^(guò)此詳細(xì)描述，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得明顯。

附圖簡(jiǎn)述

以下附圖形成本說(shuō)明書(shū)的一部分，并且為了進(jìn)一步證明本發(fā)明的某些方面而包括在內(nèi)?？梢酝ㄟ^(guò)與本文中呈現(xiàn)的具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述組合參考這些中的一張或多張圖更好理解本發(fā)明。

圖1:用于使用表達(dá)(i)特異性scFv，(ii)胞外鉸鏈和(iii)膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域的三種供體質(zhì)粒再裝配CAR的克隆載體。此方法將適合于產(chǎn)生各組在鉸鏈、跨膜和胞內(nèi)區(qū)上不同的CAR。使用三重重組位點(diǎn)系統(tǒng)從組分scFv，IgG4 Fc(長(zhǎng)鉸鏈)；或CD8a(中等鉸鏈)或僅肽(小鉸鏈)和CD3ζιν與不同信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的組合工程化改造CAR分子。將三種供體質(zhì)粒(進(jìn)入克隆)中編碼的scFv的文庫(kù)和獨(dú)特的支架和信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域重組入表達(dá)DNA載體中。此方法產(chǎn)生形式scFv-B-支架-C-信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的多個(gè)CAR種類(lèi)。

圖2A-B:(圖2A)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)得到的電穿孔后66天T細(xì)胞中的CAR(Fc)和CD8⁺表達(dá)。在加載有CD19抗原的aAPC(克隆4)中擴(kuò)增細(xì)胞。(圖2B)使用4-h鉻釋放測(cè)定法通過(guò)CD19CAR+T細(xì)胞臨床級(jí)(CG)，通過(guò)三重重組位點(diǎn)得到的CD19CAR+T細(xì)胞(EZ CAR)和CAR^-T細(xì)胞將CD19+EL-4的裂解與CD19^-EL-4的背景裂解比較。與經(jīng)照射的且加載有抗CD3(OKT3)的K562衍生的aAPC克隆#4一起擴(kuò)增CAR^-T。

圖3:CAR設(shè)計(jì)。CAR 212＝SEQ ID NO:4；CAR 213＝SEQ ID NO:5；CAR 214＝SEQ ID NO:56；CAR 215＝SEQ ID NO:57；CAR 216＝SEQ ID NO:58；CAR 217＝SEQ ID NO:2；CAR 218＝SEQ ID NO:59；CAR 193＝SEQ ID NO:55。

圖4:睡美人追蹤質(zhì)粒。

圖5:CAR表達(dá)。

圖6:CAR表達(dá)動(dòng)力學(xué)。

圖7:表型。

圖8A-B:圖8A和圖8B中顯示了延長(zhǎng)的表型。

圖9:蛋白質(zhì)印跡分析。

圖10:擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)。

圖11:倍數(shù)擴(kuò)增：總細(xì)胞。

圖12:倍數(shù)擴(kuò)增：CAR+T細(xì)胞。

圖13:細(xì)胞毒性。

圖14:4-1BB CAR：細(xì)胞毒性。

圖15:TM結(jié)構(gòu)域：細(xì)胞毒性。

圖16:間隔區(qū)(IgG4對(duì)CD8)：細(xì)胞毒性。

圖17:IFN-γ產(chǎn)生。

圖18:4-1BB CAR：IFN-γ產(chǎn)生。

圖19:TM結(jié)構(gòu)域：IFN-γ產(chǎn)生。

圖20:間隔區(qū)(IgG4對(duì)CD8)：IFN-γ產(chǎn)生。

圖21:安全性：針對(duì)SB11轉(zhuǎn)座酶的PCR。

圖22:安全性：CAR拷貝數(shù)(qPCR)。

圖23:安全性：自主生長(zhǎng)。如圖中顯示，觀(guān)察到自主生長(zhǎng)的缺乏。

圖24:CAR設(shè)計(jì)。在圖的右手邊提供了CAR的實(shí)例。

圖25:CD3-ζ。詢(xún)問(wèn)＝SEQ ID NO:51；對(duì)象–頂部＝SEQ ID NO:52；對(duì)象–中間＝SEQ ID NO:53；對(duì)象–底部＝SEQ ID NO:54。

圖26:CAR設(shè)計(jì)。

圖27:CAR。

圖28:CAR表達(dá)。

圖29:擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)。

圖30:擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)。

圖31:細(xì)胞毒性。

圖32:細(xì)胞毒性。

圖33:記憶標(biāo)志物。顯示了CAR⁺T細(xì)胞上的CD27、CD62L、CD28和CCR7的百分比表達(dá)(圖26中顯示了表達(dá)構(gòu)建體)。

圖34:IFN-γ產(chǎn)生。

圖35:IFN-γ產(chǎn)生(PMA-Ion)

圖36:自主生長(zhǎng)。

圖37:CAR拷貝數(shù)。

圖38:CAR拷貝數(shù)。

圖39:CAR拷貝數(shù)。

圖40A-E:實(shí)施通過(guò)Lipofectamine用攜帶CAR DNA的質(zhì)粒(pSBSO EZ CAR)轉(zhuǎn)染293-HEK細(xì)胞。在用抗Fc或抗獨(dú)特型(抗CD19svFv)抗體染色后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

圖41A-B:圖41A，Nalm-6；EL-4CD19+細(xì)胞；具有MCL和CLL的患者腫瘤細(xì)胞(靶標(biāo))，先前修飾為表達(dá)GFP。將5x10³個(gè)靶細(xì)胞與增加濃度的CD19RIgG4CD28CAR T細(xì)胞、CD19RCD8αCD28CAR T細(xì)胞和CAR^-T細(xì)胞(用作對(duì)照)一起溫育4小時(shí)。在4小時(shí)后，通過(guò)IntelliCyt’s iQue獲得細(xì)胞，并且數(shù)據(jù)分析在其專(zhuān)有的軟件中進(jìn)行。圖42B，圖代表針對(duì)腫瘤細(xì)胞的CAR T細(xì)胞的殺傷百分比。效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞之前的比率范圍為0至40個(gè)細(xì)胞。

圖42:將5x10³個(gè)靶細(xì)胞(EL-4CD19+粒酶B細(xì)胞報(bào)告物)與增加濃度的臨床級(jí)CD19RIgG4CD28CAR T細(xì)胞、EZ CD19RCD8α CD28 CAR T細(xì)胞和CAR^-T細(xì)胞(用作對(duì)照)一起溫育4小時(shí)和10小時(shí)。在溫育時(shí)間后，通過(guò)IntelliCyt’s iQue獲得細(xì)胞，并且數(shù)據(jù)分析在其專(zhuān)有的軟件中進(jìn)行。圖代表針對(duì)腫瘤細(xì)胞的CAR T細(xì)胞的殺傷百分比。效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞之前的比率范圍為0至20個(gè)細(xì)胞。

具體實(shí)施方式

本文中提供了用于產(chǎn)生嵌合抗原受體(CAR)的方法。所述方法利用多個(gè)載體，每個(gè)編碼抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，scFv區(qū))、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、和/或膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域。例如，在一些實(shí)施方案中，第一載體編碼抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，第二載體編碼鉸鏈區(qū)，并且第三區(qū)編碼膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，跨膜區(qū)在第二載體中，在第三載體中，或在第四載體中編碼。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體可以同源重組以形成編碼CAR的核酸，所述CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域。這樣，可以產(chǎn)生許多CAR，并且篩選期望的活性，如例如，選擇性識(shí)別和殺傷表達(dá)由CAR選擇性結(jié)合的抗原的癌性細(xì)胞。然后，CAR可以在細(xì)胞，如T細(xì)胞或自然殺傷(NK)細(xì)胞中以整合核酸(例如，使用轉(zhuǎn)座酶/轉(zhuǎn)座子整合到宿主基因組中的DNA)或以非整合核酸(例如，經(jīng)由病毒載體，如慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒遞送的mRNA)表達(dá)。然后，表達(dá)CAR的T細(xì)胞或NK細(xì)胞可以在藥物制劑或賦形劑中向受試者，如人患者施用以治療或預(yù)防疾病(例如，癌癥、真菌感染、細(xì)菌感染、或病毒感染)。

I.文庫(kù)產(chǎn)生

可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生編碼多個(gè)scFv區(qū)、鉸鏈/支架區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域、和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域(信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)的文庫(kù)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)于scFv區(qū)、鉸鏈/支架區(qū)、和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域(信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)中的兩個(gè)或三個(gè)，可得到多種可能性。在一些實(shí)施方案中，對(duì)于scFv區(qū)、鉸鏈/支架區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域、和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域(信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)中的兩個(gè)、三個(gè)或全部，可得到多種可能性。例如，在表1中提供了scFv區(qū)、鉸鏈/支架區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域、和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域(信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)的實(shí)例。在一些實(shí)施方案中，文庫(kù)可以編碼多個(gè)靶向不同抗原，如多個(gè)抗癌抗原或腫瘤靶向抗原的scFv；在其它實(shí)施方案中，文庫(kù)可以編碼選擇性結(jié)合單一靶標(biāo)(例如，單一抗癌抗原，如CD19等)的多個(gè)不同scFv。這樣，可以使用所述方法鑒定哪個(gè)腫瘤靶向構(gòu)建體可以對(duì)給定細(xì)胞樣品更有效起(例如以在個(gè)體化藥物中使用)或可以使用所述方法鑒定在靶向給定抗原中更有效發(fā)揮功能的新CAR。scFv區(qū)一般包含從抗體衍生的可變輕(VL)和可變重(VH)鏈。在一些實(shí)施方案中，若想要的話(huà)，可以隨機(jī)化VL和VH區(qū)的部分。用于產(chǎn)生文庫(kù)的通用方法包括例如產(chǎn)生酵母文庫(kù)、細(xì)菌、噬菌體文庫(kù)、浸潤(rùn)性B細(xì)胞、雜交瘤(包括來(lái)自人和嚙齒類(lèi))，或來(lái)自羊駝(llamas)的文庫(kù)、駱駝、馬文庫(kù)、和計(jì)算機(jī)方法(參見(jiàn)例如Lennard,2002)。

在一些實(shí)施方案中，融合編碼scFv、鉸鏈/支架區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域、和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域的不同載體以形成編碼CAR的單一載體?？梢越?jīng)由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的同源重組發(fā)生融合。

例如，在一些實(shí)施方案中，編碼scFv、鉸鏈/支架區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域、和/或膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域的載體可以是睡美人(SB)或piggyBac DNA質(zhì)粒。睡美人(SB)和piggyBac DNA質(zhì)粒描述于例如Maiti等(2013)，Singh等(2008)，和Huls等(2013)。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)座子由鮭魚(yú)型Tc1樣轉(zhuǎn)座酶(SB)介導(dǎo)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)由如Singh等,2014或Huls等中描述的方法，將編碼CAR的載體轉(zhuǎn)染或摻入來(lái)自受試者，如患有癌癥的人患者的T細(xì)胞中。例如，可以使用從睡美人(SB)系統(tǒng)衍生的DNA載體避免與用重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞有關(guān)的費(fèi)用和制造困難。在電穿孔后，轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶可以改善用于在T細(xì)胞中表達(dá)CAR和其它轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒的整合效率。與人工抗原呈遞細(xì)胞(aAPC)組合的SB系統(tǒng)可以選擇性增殖，并且產(chǎn)生適合于人應(yīng)用的CAR(+)T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，兩種DNA質(zhì)粒、SB轉(zhuǎn)座子(編碼感興趣的CAR)和SB轉(zhuǎn)座酶(例如，SB11)的同步電轉(zhuǎn)移可以繼之以通過(guò)在存在可溶性重組人IL-2和IL-21的情況下每7天添加(刺激循環(huán))經(jīng)γ-照射的aAPC回收穩(wěn)定整合體。例如，可以進(jìn)行4個(gè)循環(huán)(28天的連續(xù)培養(yǎng))以產(chǎn)生臨床上有吸引力的數(shù)目的穩(wěn)定表達(dá)感興趣CAR的T細(xì)胞?？梢岳棉D(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)的使用遞送表達(dá)CAR的T細(xì)胞，如例如Hackett等中描述。

II.嵌合抗原受體

本發(fā)明的實(shí)施方案牽涉產(chǎn)生并鑒定編碼抗原特異性嵌合抗原受體(CAR)多肽的核酸。在一些實(shí)施方案中，將CAR進(jìn)行人源化以降低免疫原性(hCAR)。

在一些實(shí)施方案中，CAR可以識(shí)別由一種或多種抗原之間共享的空間構(gòu)成的表位。模式識(shí)別受體，如Dectin-1可以用于驅(qū)動(dòng)針對(duì)碳水化合物抗原的特異性。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合區(qū)可以包含單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)、單克隆抗體的可變區(qū)、和/或其抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合區(qū)是scFv。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合受體或細(xì)胞靶標(biāo)的肽(例如，細(xì)胞因子)可以作為可能性包括在內(nèi)或者替換CAR的結(jié)合區(qū)中的scFv區(qū)。因此，在一些實(shí)施方案中，可以從編碼多個(gè)scFv區(qū)和/或其它靶向蛋白的多個(gè)載體產(chǎn)生CAR。互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)是在抗原受體(例如，免疫球蛋白和T細(xì)胞受體)蛋白的可變域中找到的互補(bǔ)抗原并且因此向受體提供其針對(duì)所述特定抗原的特異性的短氨基酸序列。抗原受體的每條多肽鏈含有三個(gè)CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。由于抗原受體通常由兩條多肽鏈構(gòu)成，每個(gè)抗原受體有可以與抗原接觸的6個(gè)CDR：每條重鏈和輕鏈含有3個(gè)CDR。由于通常在CDR中找到與免疫球蛋白和T細(xì)胞受體選擇性有關(guān)的大多數(shù)序列變異，這些區(qū)域有時(shí)稱(chēng)為超變結(jié)構(gòu)域。在這些之中，CDR3顯示最大的變異性，因?yàn)樗蒝J(在重鏈和TCR αβ鏈的情況下為VDJ)區(qū)的重組編碼。

經(jīng)由本發(fā)明產(chǎn)生的CAR編碼核酸可以包含一個(gè)或多個(gè)人基因或基因片段以增強(qiáng)用于人患者的細(xì)胞免疫療法。在一些實(shí)施方案中，可以經(jīng)由本文中描述的方法產(chǎn)生全長(zhǎng)CAR cDNA或編碼區(qū)?？乖Y(jié)合區(qū)或結(jié)構(gòu)域可以包含從特定的人單克隆抗體衍生的單鏈可變片段(scFv)的V_H和V_L鏈的片段，如那些描述于美國(guó)專(zhuān)利7,109,304(通過(guò)引用方式并入本文)的片段。在一些實(shí)施方案中，scFv包含人抗原特異性抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，scFv區(qū)是由針對(duì)人密碼子使用優(yōu)化以在人細(xì)胞中表達(dá)的序列編碼的抗原特異性scFv。

CAR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的排列可以是多聚體的，如雙抗體(diabody)或多聚體。多聚體可以通過(guò)將輕鏈和重鏈的可變部分交叉配對(duì)成可以稱(chēng)為雙抗體的事物而形成。在一些實(shí)施方案中，可以縮短或排除CAR的鉸鏈部分(即，產(chǎn)生僅包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的CAR)。大量鉸鏈可以在本發(fā)明的情況下使用，例如如表1中顯示。在一些實(shí)施方案中，可以使鉸鏈區(qū)的第一個(gè)半胱氨酸得到維持，或者通過(guò)脯氨酸或絲氨酸取代突變，或者截短直至第一個(gè)半胱氨酸。從用作抗原結(jié)合區(qū)的scFv缺失Fc部分以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的CAR。在一些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合區(qū)可以編碼僅Fc結(jié)構(gòu)域之一，例如來(lái)自人免疫球蛋白的CH2或CH3結(jié)構(gòu)域。還可以包括已經(jīng)被修飾以改善二聚化和寡聚化的人免疫球蛋白的鉸鏈、CH2、和CH3區(qū)。在一些實(shí)施方案中，鉸鏈部分可以包含8-14個(gè)氨基酸的肽(例如12AA肽)、CD8α的部分、或IgG4Fc或者由其組成。在一些實(shí)施方案中，可以使用促進(jìn)寡聚化的結(jié)構(gòu)域，如CD8α，從細(xì)胞表面附加抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，可以使用被單克隆抗體(mAb)克隆2D3(描述于例如Singh等,2008中的mAb克隆2D3)識(shí)別的結(jié)構(gòu)域從細(xì)胞表面附加抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

CAR的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域或胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域一般可以引起或促進(jìn)包含CAR的免疫細(xì)胞的至少一種正常效應(yīng)子功能的活化。例如，膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域可以促進(jìn)T細(xì)胞的效應(yīng)子功能，如例如細(xì)胞裂解活性或輔助活性，包括細(xì)胞因子的分泌。初始、記憶的或記憶類(lèi)型的T細(xì)胞中的效應(yīng)子功能可以包括抗原依賴(lài)性增殖。術(shù)語(yǔ)“胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”或“膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域”指可以轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號(hào)和/或指導(dǎo)細(xì)胞實(shí)施特化功能的CAR部分。雖然通常整個(gè)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以被包含在CAR中，但是在一些情況中可以包含膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域的截短部分。一般地，膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括截短的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其中截短的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域保留在細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號(hào)的能力。

在一些實(shí)施方案中，膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域包含T細(xì)胞受體的ζ鏈或任何其同源物(例如，η、δ、γ、或ε)、MB1鏈、B29、Fc RIII、Fc RI和信號(hào)傳導(dǎo)分子的組合，如CD3ζ和CD28，CD27、4-1BB、DAP-10、OX40及其組合，以及其它類(lèi)似的分子和片段。可以使用活化蛋白家族的其它成員的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)部分，如FcγRIII和FcεRI。這些備選的跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的實(shí)例可以參見(jiàn)例如Gross等(1992)，Stancovski等(1993)，Moritz等(1994)，Hwu等(1995)，Weijtens等(1996)，和Hekele等(1996)，通過(guò)引用方式以其整體并入本文。在一些實(shí)施方案中，膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域可以包括人CD3ζ胞內(nèi)域。

優(yōu)選地，通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)域連接抗原特異性胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域?？梢栽贑AR中包含的跨膜結(jié)構(gòu)域包括例如人IgG4Fc鉸鏈和Fc區(qū)、人CD4跨膜結(jié)構(gòu)域、人CD28跨膜結(jié)構(gòu)域、跨膜人CD3ζ結(jié)構(gòu)域、或半胱氨酸突變?nèi)薈D3ζ結(jié)構(gòu)域、或來(lái)自人跨膜信號(hào)傳導(dǎo)蛋白如例如CD16和CD8和紅細(xì)胞生成素受體的跨膜結(jié)構(gòu)域。例如，在表1中提供了跨膜結(jié)構(gòu)域的實(shí)例。

在一些實(shí)施方案中，膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域包含編碼共刺激受體，如例如經(jīng)修飾的CD28胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、或CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10、或4-1BB(CD137)共刺激受體的序列。在一些實(shí)施方案中，由CD3ζ啟動(dòng)的初始信號(hào)，由人共刺激受體提供的別的信號(hào)兩者可以被包含在CAR中以更有效活化經(jīng)轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞，這可以有助于改善過(guò)繼性免疫療法的體內(nèi)持久性和治療成功。如表1中記錄，膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域或胞內(nèi)受體信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以包含單獨(dú)或與FcγRIII共刺激信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，如例如CD28、CD27、DAP10、CD137、OX40、CD2、4-1BB組合的CD3的ζ鏈。在一些實(shí)施方案中，膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域包含TCRζ鏈、CD28、CD27、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、IL-2Rbeta/CD122、IL-2Ralpha/CD132、DAP10、DAP12、和CD40中的一種或多種的部分或全部。在一些實(shí)施方案中，膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域中可以包含1、2、3、4或更多個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。例如，在一些CAR中，已經(jīng)觀(guān)察到融合在一起的至少兩個(gè)或三個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以導(dǎo)致疊加或協(xié)同效應(yīng)。

在一些方面，可以產(chǎn)生包含編碼CAR的DNA序列的分離的核酸區(qū)段和表達(dá)盒。可以使用多種載體。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體可以允許將編碼CAR的DNA遞送到免疫，如T細(xì)胞。CAR表達(dá)可以在調(diào)控的真核啟動(dòng)子，如例如MNDU3啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、EF1α啟動(dòng)子、或泛素啟動(dòng)子的控制下。此外，載體可以含有選擇標(biāo)記，若不是出于其它原因，以促進(jìn)其體外操作。在一些實(shí)施方案中，可以從自DNA模板體外轉(zhuǎn)錄的mRNA表達(dá)CAR。

嵌合抗原受體分子是重組的，并且以其既結(jié)合抗原又經(jīng)由存在于其胞質(zhì)尾部中的免疫受體活化基序(ITAM)而轉(zhuǎn)導(dǎo)活化信號(hào)的能力區(qū)分。利用抗原結(jié)合部分(例如，從單鏈抗體(scFv)產(chǎn)生)的受體構(gòu)建體提供“通用”的額外優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兛梢砸圆灰蕾?lài)于HLA的方式結(jié)合靶細(xì)胞上的天然抗原。例如，可以將scFv構(gòu)建體與編碼CD3復(fù)合物的ζ鏈(ζ)的胞內(nèi)部分、Fc受體γ鏈、和sky酪氨酸激酶的序列融合(Eshhar等,1993；Fitzer-Attas等,1998)。已經(jīng)在幾種鼠和人抗原-scFv:ζ系統(tǒng)中證明重定向的T細(xì)胞效應(yīng)子機(jī)制，包括CTL的腫瘤識(shí)別和裂解(Eshhar等,1997；Altenschmidt等,1997；Brocker等,1998)。

例如，抗原結(jié)合區(qū)可以來(lái)自人或非人scFv。使用非人抗原結(jié)合區(qū)，如鼠單克隆抗體的一個(gè)可能的問(wèn)題是降低的人效應(yīng)子功能性和降低的穿透腫瘤塊的能力。此外，非人單克隆抗體可以被人宿主識(shí)別為外來(lái)蛋白質(zhì)，并且因此重復(fù)注射此類(lèi)外來(lái)抗體可以導(dǎo)致免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，從而導(dǎo)致有害的超敏感性反應(yīng)。對(duì)于基于鼠的單克隆抗體，此效應(yīng)已經(jīng)稱(chēng)為人抗小鼠抗體(HAMA)應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，與一些鼠抗體相比，在CAR中包含人抗體或scFv序列可以導(dǎo)致很少或無(wú)HAMA應(yīng)答。類(lèi)似地，在CAR中包含人序列可以用于降低或避免免疫介導(dǎo)的內(nèi)源T細(xì)胞的識(shí)別或消除的風(fēng)險(xiǎn)，所述內(nèi)源T細(xì)胞存在于接受者中，并且可以基于HLA識(shí)別加工過(guò)的抗原。

在一些實(shí)施方案中，CAR包含：a)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，b)跨膜結(jié)構(gòu)域，c)鉸鏈區(qū)，和d)包含抗原結(jié)合區(qū)的胞外結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域與膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域一起由單一載體編碼，所述單一載體可以與編碼鉸鏈區(qū)的載體和編碼抗原結(jié)合區(qū)的載體融合(例如，經(jīng)由轉(zhuǎn)座子指導(dǎo)的同源重組)。在其它實(shí)施方案中，胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)和跨膜區(qū)可以由融合(例如，經(jīng)由轉(zhuǎn)座子指導(dǎo)的同源重組)的兩個(gè)不同載體編碼。

在一些實(shí)施方案中，CAR的抗原特異性部分，又稱(chēng)為包含抗原結(jié)合區(qū)的胞外結(jié)構(gòu)域，選擇性靶向腫瘤相關(guān)抗原。腫瘤相關(guān)抗原可以是任何種類(lèi)的，只要它在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)?？梢杂媒?jīng)由本發(fā)明產(chǎn)生的CAR靶向的腫瘤相關(guān)抗原的實(shí)例包括例如CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、CD56、EGFR、c-Met、AKT、Her2、Her3、上皮腫瘤抗原、黑素瘤相關(guān)抗原、突變p53、突變r(jià)as、Dectin-1等。在一些實(shí)施方案中，CAR的抗原特異性部分是scFv。表1中提供了腫瘤靶向性scFv的實(shí)例。在一些實(shí)施方案中，CAR可以與膜結(jié)合細(xì)胞因子共表達(dá)，例如以改善在存在有少量腫瘤相關(guān)抗原時(shí)的持久性。例如，CAR可以與膜結(jié)合IL-15共表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，可以用CAR靶向胞內(nèi)腫瘤相關(guān)抗原，如例如HA-1、存活蛋白、WT1和p53。這可以通過(guò)通用T細(xì)胞上表達(dá)的CAR實(shí)現(xiàn)，所述通用T細(xì)胞在HLA的背景中識(shí)別從胞內(nèi)腫瘤相關(guān)抗原描述的加工過(guò)的肽。另外，通用T細(xì)胞可以遺傳修飾為表達(dá)T細(xì)胞受體配對(duì)，其在HLA的情形中識(shí)別胞內(nèi)加工過(guò)的腫瘤相關(guān)抗原。

由CAR識(shí)別的病原體可以基本上是任何種類(lèi)的病原體，但是在一些實(shí)施方案中，病原體是真菌、細(xì)菌或病毒。示例性的病毒病原體包括腺病毒科(Adenoviridae)、埃巴病毒(EBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、JC病毒、BK病毒、HSV、HHV病毒科、細(xì)小RNA病毒科(Picornaviridae)、皰疹病毒科(Herpesviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、黃病毒科(Flaviviridae)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、副粘液病毒科(Paramyxoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、多瘤病毒(Polyomavirus)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、和披膜病毒科(Togaviridae)的病毒。示例性的病原性病毒引起天花、流感、流行性腮腺炎、麻疹、水痘、埃博拉和風(fēng)疹。示例性的病原性真菌包括念珠菌屬(Candida)、曲霉屬(Aspergillus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、組織胞漿菌屬(Histoplasma)、肺囊蟲(chóng)屬(Pneumocystis)和葡萄狀穗霉屬(Stachybotrys)。示例性的病原性細(xì)菌包括鏈球菌屬(Streptococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、志賀菌屬(Shigella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、螺桿菌屬(Helicobacter)、大腸桿菌(E.coli)、立克次體屬(Rickettsia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、博德特菌屬(Bordetella)、衣原體屬(Chlamydia)、螺旋體屬(Spirochetes)、和沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)。在一些實(shí)施方案中，病原體受體Dectin-1可以用于產(chǎn)生CAR，所述CAR識(shí)別真菌，如曲霉屬的細(xì)胞壁上的碳水化合物結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以基于識(shí)別病毒決定簇(例如，來(lái)自CMV和埃博拉的糖蛋白)的抗體制備CAR以中斷病毒感染和病理學(xué)。

在一些實(shí)施方案中，可以將編碼CAR的裸DNA或合適的載體引入受試者的T細(xì)胞(例如，從患有癌癥或其它疾病的人患者獲得的T細(xì)胞)中。通過(guò)使用裸DNA的電穿孔穩(wěn)定轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域中已知的。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.6,410,319。裸DNA一般指以對(duì)于表達(dá)正確的方向在質(zhì)粒表達(dá)載體中含有的編碼本發(fā)明的嵌合受體的DNA。在一些實(shí)施方案中，裸DNA的使用可以減少產(chǎn)生表達(dá)經(jīng)由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的CAR的T細(xì)胞需要的時(shí)間。

或者，病毒載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、或慢病毒載體)可以用于將嵌合構(gòu)建體引入T細(xì)胞中。一般地，用于轉(zhuǎn)染來(lái)自受試者的T細(xì)胞的編碼CAR的載體在受試者的T細(xì)胞中一般應(yīng)當(dāng)是非復(fù)制的?；诓《镜拇罅枯d體是已知的，其中在細(xì)胞中維持的病毒的拷貝數(shù)足夠低以維持細(xì)胞的活力。說(shuō)明性的載體包括pFB-neo載體以及基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的載體。

一旦確定經(jīng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞能夠以期望的調(diào)節(jié)和在期望水平以表面膜蛋白表達(dá)CAR，可以確定嵌合受體在宿主細(xì)胞中是否有功能以提供期望的信號(hào)誘導(dǎo)。隨后，可以向受試者再引入或施用經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞以活化受試者中的抗腫瘤應(yīng)答。為了促進(jìn)施用，可以用合適的載體或稀釋劑(其優(yōu)選是藥學(xué)上可接受的)將經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞制備成藥物組合物或者制備成適合于體內(nèi)施用的植入物。本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了制備此類(lèi)組合物或植入物的手段(參見(jiàn)例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Mack編(1980))。在適當(dāng)時(shí)，可以將表達(dá)CAR的經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞配制成半固體或液體形式的制劑，如膠囊、溶液、注射液、吸入劑、或氣霧劑，以用于其各自的施用途徑的常見(jiàn)方式進(jìn)行。可以利用本領(lǐng)域中已知的手段防止或最小化組合物的釋放和吸收，直至它達(dá)到靶組織或器官，或者確保組合物的定時(shí)釋放。一般地，優(yōu)選地，采用不使表達(dá)嵌合受體的細(xì)胞失效(ineffectuate)的藥學(xué)可接受形式。因此，期望地，可以將經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞制備成含有平衡鹽溶液，如漢克(Hanks)氏平衡鹽溶液、或生理鹽水的藥物組合物。

IV.人工抗原呈遞細(xì)胞

在一些情況中，aAPC可用于制備基于CAR的治療組合物和細(xì)胞療法產(chǎn)品。對(duì)于關(guān)于抗原呈遞系統(tǒng)的制備和用途的一般指導(dǎo)，參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.6,225,042、6,355,479、6,362,001和6,790,662；美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No.2009/0017000和2009/0004142；和國(guó)際公開(kāi)No.WO2007/103009)。

可以使用aAPC擴(kuò)增表達(dá)CAR的T細(xì)胞。在遇到腫瘤抗原期間，通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞遞送的信號(hào)可以影響T細(xì)胞編程及其隨后的治療效力。這已經(jīng)刺激開(kāi)發(fā)人工抗原呈遞細(xì)胞的努力，所述人工抗原呈遞細(xì)胞允許最佳控制對(duì)T細(xì)胞提供的信號(hào)(Turtle等,2010)。除了感興趣的抗體或抗原外，aAPC系統(tǒng)還可以包含至少一種外源輔助分子?？梢圆捎幂o助分子的任何合適的數(shù)目和組合。輔助分子可以選自諸如共刺激分子和粘附分子等輔助分子。示例性的共刺激分子包括CD70和B7.1(又稱(chēng)作B7或CD80)，其可以結(jié)合T細(xì)胞表面上的CD28和/或CTLA-4分子，從而影響例如T細(xì)胞擴(kuò)增、Th1分化、短期T細(xì)胞存活、和細(xì)胞因子分泌，如白介素(IL)-2(參見(jiàn)Kim等,2004)。粘附分子可以包括碳水化合物結(jié)合糖蛋白，如選擇蛋白、跨膜結(jié)合糖蛋白，如整聯(lián)蛋白、鈣依賴(lài)性蛋白，如鈣粘蛋白和單次跨膜免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白質(zhì)，如胞間粘附分子(ICAM)，其促進(jìn)例如細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與基質(zhì)接觸。示例性的粘附分子包括LFA-3和ICAM，如ICAM-1。例如，在美國(guó)專(zhuān)利No.6,225,042、6,355,479和6,362,001中例示了可用于選擇、克隆、制備和表達(dá)示例性的輔助分子，包括共刺激分子和粘附分子的技術(shù)、方法和試劑。

優(yōu)選地，為了變?yōu)閍APC而選擇的細(xì)胞具有胞內(nèi)抗原呈遞、胞內(nèi)肽運(yùn)輸、和/或胞內(nèi)MHC I類(lèi)或II類(lèi)分子-肽加載的缺陷，或者是變溫的(即，比哺乳動(dòng)物細(xì)胞系對(duì)溫度攻擊的敏感性更小)，或者擁有缺陷和變溫特性?xún)烧?。?yōu)選地，為了變?yōu)閍APC而選擇的細(xì)胞還缺乏表達(dá)引入細(xì)胞中的外源MHC I類(lèi)或II類(lèi)分子和輔助分子組分的至少一種內(nèi)源對(duì)應(yīng)物(例如，如上文描述的內(nèi)源MHC I類(lèi)或II類(lèi)分子和/或內(nèi)源輔助分子)的能力。此外，aAPC優(yōu)選地保留細(xì)胞在其修飾為產(chǎn)生aAPC前擁有的缺陷和變溫特性。示例性的aAPC構(gòu)成或衍生自與抗原加工(TAP)缺陷細(xì)胞系，如昆蟲(chóng)細(xì)胞系有關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。示例性的變溫昆蟲(chóng)細(xì)胞系是果蠅細(xì)胞系，如Schneider 2細(xì)胞系(例如Schneider,J.m 1972)。美國(guó)專(zhuān)利No.6,225,042、6,355,479和6,362,001中提供了用于Schneider 2細(xì)胞的制備、生長(zhǎng)和培養(yǎng)的說(shuō)明性方法。

aAPC可以進(jìn)行冷凍-融化循環(huán)。例如，可以通過(guò)將含有aAPC的合適容器與合適量的液氮、固體二氧化碳(干冰)、或類(lèi)似的低溫材料接觸，從而快速發(fā)生冷凍來(lái)冷凍aAPC。然后，通過(guò)從低溫材料取出aAPC并且暴露于周?chē)覝貤l件，或者通過(guò)其中采用微溫水浴或溫手促進(jìn)較短的融化時(shí)間的促進(jìn)融化過(guò)程融化冷凍的aAPC。另外，可以冷凍aAPC，并且在融化前貯存延長(zhǎng)的時(shí)間段。也可以融化冷凍的aAPC，然后在進(jìn)一步使用前凍干。有利地，可以不利影響冷凍-融化程序的防腐劑，如二甲亞砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)和其它防腐劑可以從進(jìn)行冷凍-融化循環(huán)的含有aAPC的培養(yǎng)基中缺乏，或者基本上被除去，如通過(guò)將aAPC轉(zhuǎn)移到基本上缺乏此類(lèi)防腐劑的培養(yǎng)基。

在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以通過(guò)交聯(lián)使異體核酸和aAPC的內(nèi)源核酸失活，從而在失活后基本上不發(fā)生細(xì)胞生長(zhǎng)、核酸的復(fù)制或表達(dá)。例如，可以在表達(dá)外源MHC和輔助分子，在aAPC表面上呈遞此類(lèi)分子，并且給呈遞的MHC分子加載一種或多種選擇的肽后的點(diǎn)時(shí)使aAPC失活。因而，雖然此類(lèi)加載有失活的且選擇的肽的aAPC使得基本上不能增殖或復(fù)制，但是它們可以保留選擇的肽呈遞功能。交聯(lián)也可以導(dǎo)致基本上沒(méi)有污染性微生物，如細(xì)菌和病毒的aAPC，而基本上不降低aAPC的抗原呈遞細(xì)胞功能。因此，交聯(lián)可以用于維持aAPC的重要APC功能，同時(shí)幫助減輕關(guān)于使用aAPC開(kāi)發(fā)的細(xì)胞療法產(chǎn)品的安全性的憂(yōu)慮。關(guān)于與交聯(lián)和aAPC相關(guān)的方法，參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No.20090017000，其通過(guò)引用方式并入本文。

IV.實(shí)施例

包括以下實(shí)施例以證明本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，以下實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)代表由發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明的實(shí)施中良好發(fā)揮功能的技術(shù)，并且因此可以認(rèn)為構(gòu)成其優(yōu)選的實(shí)施模式。然而，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可以在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下對(duì)公開(kāi)的具體的實(shí)施方案進(jìn)行許多改變，而仍然獲得相同或相似的結(jié)果。

實(shí)施例1

材料和方法

臨床級(jí)DNA質(zhì)粒的產(chǎn)生

SB轉(zhuǎn)座子CoOpCD19RCD28ζ/pSBSO在EF-1/HTLV雜合復(fù)合啟動(dòng)子(InvivoGen)下表達(dá)人密碼子優(yōu)化的(CoOp)第二代CoOpCD19RCD28ζCAR，所述EF-1/HTLV雜合復(fù)合啟動(dòng)子(InvivoGen)由延長(zhǎng)因子-1a(EF-1a[Kim等,1990]和人T細(xì)胞白血病病毒(HTLV)的59非翻譯區(qū)[Singh等,2011；Davies等,2010]構(gòu)成。此DNA質(zhì)粒的衍生描述于圖S1中。從DNA質(zhì)粒pCMV-SB11以順式表達(dá)在巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子下的SB轉(zhuǎn)座酶SB11(Singh等,2011；Singh等,2008)。對(duì)這兩種質(zhì)粒完整測(cè)序，并且由Waisman Clinical Biomanufacturing Facility(Madison,WI)使用用于選擇細(xì)菌菌株大腸桿菌DH5a的卡那霉素制備。

產(chǎn)生三重位點(diǎn)特異性重組DNA質(zhì)粒：EZ-Build-CAR

使用來(lái)自上文描述的CAR(CoOpCD19RCD28z/pSBSO)的DNA序列，各部分CD19ScFv、鉸鏈IgG4Fc和與CD3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)的域結(jié)構(gòu)域CD28跨膜和胞質(zhì)溶膠部分側(cè)翼有λ重組位點(diǎn)，由Geneart(Life Technologies)以PCR產(chǎn)物合成。將這三個(gè)部分單獨(dú)插入pDonors221質(zhì)粒中(通過(guò)酶BP clonase(兩者都來(lái)自Invitrogen)。將三個(gè)質(zhì)粒與三重位點(diǎn)特異性重組睡美人質(zhì)粒通過(guò)酶LR PLUS clonase(Invitrogen)重組，以scFv-B-支架-C-信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域形式產(chǎn)生EZ-Build CD19CD28ζCAR(圖1)。

細(xì)胞計(jì)數(shù)

使用臺(tái)盼藍(lán)排除法(Trypan-blue exclusion)區(qū)分活細(xì)胞與死亡細(xì)胞，并且使用Cellometer(Nexecelom Bioscience)計(jì)數(shù)(Singh等,2011)。

PBMC的分離

來(lái)自?xún)擅行灾驹刚呓】倒w的白細(xì)胞去除術(shù)(Leukapheresis)產(chǎn)品購(gòu)自Key Biologics LLC(Memphis,TN)。通過(guò)我們修改Biosafe Sepax系統(tǒng)(Eysins,Switzerland)根據(jù)cGMP工作分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。簡(jiǎn)言之，在閉合CS-900試劑盒上的所有夾子后，經(jīng)由60mL注射器通過(guò)魯爾鎖緊連接器(Luer-lock connector)將100mL Ficoll(GE Healthcare)無(wú)菌轉(zhuǎn)移到密度梯度介質(zhì)袋(“ficoll袋”)，并且加熱使用手持式密封器(Sebra,型號(hào)#2380)密封的管道。將試劑盒用釘連接到1,000mL含有具有20mL 25％人血清清蛋白(HSA)(Baxter)的CliniMACS緩沖液(PBS/EDTA,Miltenyi,Cat#70026)(2％v/v，清洗緩沖液)以用于清洗的袋、最終產(chǎn)品袋[300mL具有偶聯(lián)器的轉(zhuǎn)移包(Baxter/Fenwal 4R2014)]和試劑/血液袋。使用基于密度梯度的分離方案(v126)，將注射器活塞加載到離心機(jī)室中，并且將Sepax蓋加載到aAPC(克隆#4)中以選擇性增殖CAR+T細(xì)胞。使用經(jīng)c-照射的aAPC在數(shù)字上擴(kuò)增經(jīng)遺傳修飾的T細(xì)胞。在VueLife細(xì)胞培養(yǎng)袋中在CM中使來(lái)自WCB的融化的aAPC增殖長(zhǎng)達(dá)60天，并且使用Biosafe Sepax II收獲程序收獲。簡(jiǎn)言之，經(jīng)由魯爾鎖定連接將CS-490.1試劑盒連接到300mL輸出袋(轉(zhuǎn)移包)。在坑中安裝分離室，并且將管道插入光學(xué)傳感器中，并且旋塞閥對(duì)準(zhǔn)成T位置。在連接壓力傳感器線(xiàn)后，在支持架上吊起產(chǎn)品袋和上清液/血漿袋。修改的方案PBSCv302選自Sepax手冊(cè)，并且有待處理的輸入產(chǎn)品的體積(初始體積)設(shè)置為#840mL。在確認(rèn)和試劑盒測(cè)試后，開(kāi)始程序。在完成后，除去袋，閉合夾子，并且除去試劑盒。無(wú)菌取出來(lái)自最終產(chǎn)品袋的細(xì)胞，用清洗介質(zhì)(Plasmalyte中的10％HSA)清洗兩次，并且計(jì)數(shù)。使用CIS BIO國(guó)際放射器(IBL-437C#09433)照射(100Gy)aAPC，并且使用控制速率冷凍器(Planer Kryo 750)在冷凍保存介質(zhì)中冷凍保存?zhèn)溆?。使用加載有抗CD3(OKT3)的K562衍生的aAPC克隆#4來(lái)增殖尚未進(jìn)行遺傳修飾的對(duì)照(CAR-)自體對(duì)照T細(xì)胞。在稱(chēng)作加載培養(yǎng)基(LM)的含有0.2％乙酰半胱氨酸(Acetadote,Cumberland Pharmaceuticals)的無(wú)血清X(qián)-Vivo 15(目錄號(hào)04-744Q,Lonza)中將獲自培養(yǎng)物的aAPC溫育過(guò)夜。次日，洗滌細(xì)胞，使用γCell 1000 Elite Cs-137放射器(MDS Nordion)照射(100Gy)，與1mg/10⁶細(xì)胞功能級(jí)純化的抗人CD3(克隆-OKT3,16-0037-85,eBioscience)一起以106個(gè)細(xì)胞/mL的濃度重懸于LM中，并且在3-D旋轉(zhuǎn)器(Lab-Line)上在溫和攪拌的情況下于4℃溫育30分鐘。在用LM洗滌三次后，細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)或者在氣體層中在液氮中以等分試樣冷凍以備用。

CAR+T細(xì)胞的制備

將融化的PBMC重懸于(i)人T細(xì)胞試劑盒(目錄號(hào)VPA-1002,Lonza；對(duì)于2x10⁷個(gè)細(xì)胞，一個(gè)小杯中100μL)中，與(ii)編碼CD19RCD28CAR轉(zhuǎn)座子的DNA質(zhì)粒(CoOpCD19RCD28/pSBSO)(每個(gè)小杯每2x10⁷個(gè)PBMC的15μg超螺旋DNA)，和(iii)編碼SB11轉(zhuǎn)座酶的DNA質(zhì)粒(pCMVSB11)(每個(gè)小杯每2x10⁷個(gè)PBMC的5μg超螺旋DNA)。將此混合物立即轉(zhuǎn)移到小杯(Lonza)，使用Nucleofector II(程序U-14,Amaxa/Lonza)電穿孔(限定培養(yǎng)第0天)，在10％RPMI完全培養(yǎng)基中靜止2至3小時(shí)，并且在半培養(yǎng)基更換后，在37℃，5％CO₂溫育過(guò)夜。次日，收獲細(xì)胞，計(jì)數(shù)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定表型，并且以比率1:2(CAR+T細(xì)胞:aAPC)與經(jīng)c-照射的aAPC共培養(yǎng)，其標(biāo)記為培養(yǎng)第1天和7天刺激周期的開(kāi)始。分別從第1天和第7天起按星期一-星期三-星期五日程表添加IL-21(目錄號(hào)AF-200-21,PeproTech)和IL-2(目錄號(hào)NDC 65483-116-07,Novartis)。NK細(xì)胞可以防止CAR+T細(xì)胞的數(shù)字?jǐn)U增，尤其在它們的過(guò)度生長(zhǎng)在組織培養(yǎng)過(guò)程中早期出現(xiàn)的情況下。因此，若CD3-CD56+細(xì)胞$10％，則在含有25％HAS的CliniMACS緩沖液(80mL/107個(gè)細(xì)胞)中在LS柱(目錄號(hào)130-042-401,Miltenyi Biotech)上使用CD56珠粒(目錄號(hào)70206,Miltenyi Biotech,20mL珠/107個(gè)細(xì)胞)實(shí)施CD56消減。

CAR^-對(duì)照T細(xì)胞的產(chǎn)生

作為對(duì)照，在7天刺激循環(huán)中以1:1的比率將5x10⁶個(gè)mock轉(zhuǎn)染的PBMC與經(jīng)照射的并且加載有抗CD3(OKT3)的K562衍生的aAPC克隆#4共培養(yǎng)。從培養(yǎng)第1天起給所有培養(yǎng)物補(bǔ)充IL-21(30ng/mL)，并且在開(kāi)始培養(yǎng)后7天開(kāi)始補(bǔ)充IL-2(50U/mL)。隨后，每隔一天添加所有細(xì)胞因子。

細(xì)胞的免疫表型

在4℃使用100mL FACS緩沖液(2％FBS，0.1％疊氮化鈉)中的抗體使染色細(xì)胞30分鐘。使用FACSCalibur(BD Bioscience)進(jìn)行采集，并且使用FCS Express 3.00.0612分析。

鉻釋放測(cè)定

使用經(jīng)⁵¹Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞，在標(biāo)準(zhǔn)的4小時(shí)鉻釋放測(cè)定中對(duì)T細(xì)胞評(píng)估其細(xì)胞毒性。一式三份在1x10⁵、0.5x10⁵、0.25x10⁵、0.125x10⁵底部板(Costar)上鋪板T細(xì)胞。在溫育后，將50μL上清液收獲到LumaPlate(Perkin Elmer)上，在TopCount NXT(Perkin Elmer)上讀數(shù)，并且如下計(jì)算特異性裂解百分比：

實(shí)驗(yàn)⁵¹Cr釋放-自發(fā)⁵¹Cr釋放 x 100

最大⁵¹Cr釋放-自發(fā)⁵¹Cr釋放

通過(guò)在96孔V(Manufacturee Novo Software,Thornhill,Ontario,Canada)中在來(lái)自分別與CM或0.1％Triton X-100(Sigma)溫育的靶細(xì)胞和0.0625x10⁵個(gè)細(xì)胞/孔與5x10³個(gè)靶細(xì)胞的條件化上清液中測(cè)量鉻來(lái)測(cè)定自發(fā)和最大釋放。

實(shí)施例2

CD19⁺CAR的產(chǎn)生

使用上文在實(shí)施例1中描述的方法(稱(chēng)為“EZ”法)產(chǎn)生CD19+CAR。比較這些CD19⁺CAR(CD19CAR)與經(jīng)由先前的方法產(chǎn)生的臨床級(jí)(“CG”)CD19CAR。

數(shù)據(jù)顯示了三重位點(diǎn)重組系統(tǒng)產(chǎn)生與臨床級(jí)CD19CAR(CG)相似的CD19CAR(EZ)。質(zhì)粒中由重組位點(diǎn)留下的足跡不干擾CAR的表達(dá)和功能(圖2A-B)。

實(shí)施例3

含有(CD8,CD28)跨膜結(jié)構(gòu)域和(CD28,4-1BB)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的CAR的產(chǎn)生

測(cè)試的各個(gè)CAR已經(jīng)顯示相似的擴(kuò)增、細(xì)胞毒性和Th1細(xì)胞毒性。CD19-BB-z已經(jīng)顯示了較低的Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生；在體內(nèi)，它在控制小鼠中的疾病方面是有效的(Molecular Therapy 17(8):1453–1464,2009)。不過(guò)，由于細(xì)胞在沒(méi)有抗原性刺激的情況下在體外存活的事實(shí)而存在憂(yōu)慮。

下文在表2中顯示了臨床中的CAR。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的CAR沒(méi)有如下文表2中顯示的特定構(gòu)建體?；蛘?，在一些實(shí)施方案中，可以使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生具有下文表2中提到的CAR特征，不過(guò)與目前在臨床中使用的CAR截然不同的CAR的另一種變化。

表2：臨床中的CAR

圖3中說(shuō)明了具體的CAR構(gòu)建體設(shè)計(jì)。如圖3中顯示，產(chǎn)生使用CD19scfv、CD8a鉸鏈或IgG4Fc莖部、CD8跨膜(TM)或CD28TM或CD137TM和經(jīng)CD28或CD137膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域連同CD3ζ膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域信號(hào)傳導(dǎo)的組合的各個(gè)CAR的示意圖。

然后，將圖3中顯示的CAR構(gòu)建體克隆到含有SIM和FRA標(biāo)簽的睡美人質(zhì)粒中以允許在使用常見(jiàn)的CVseq7引物擴(kuò)增時(shí)在競(jìng)爭(zhēng)再增殖研究中追蹤。圖4中顯示了睡美人追蹤質(zhì)粒。

使用Amaxa Nucleofector II將圖3中顯示的CAR構(gòu)建體電穿孔到T細(xì)胞中，并且在存在細(xì)胞因子(IL2，IL-21)的情況下與aAPC共培養(yǎng)28天。顯示了電穿孔后1天(第1天)和與aAPC共培養(yǎng)28天(第28天)后的CAR表達(dá)。顯示了CD3和CAR的點(diǎn)圖，其中使用CD3和抗CD19scfv特異性Ab區(qū)分T細(xì)胞和CAR。圖5中顯示了CAR表達(dá)結(jié)果。

隨時(shí)間對(duì)圖3中顯示的CAR構(gòu)建體評(píng)估CAR表達(dá)持續(xù)28天，并且顯示。在21天后，大多數(shù)培養(yǎng)物具有>80％CAR表達(dá)。圖6中顯示了CAR表達(dá)動(dòng)力學(xué)。

在與aAPC共培養(yǎng)28天后顯示了用來(lái)自圖3的CAR核轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物中的CD4和CD8T細(xì)胞的表達(dá)百分比。圖7中顯示了這些表型結(jié)果。

在共培養(yǎng)28天后，對(duì)CAR⁺T細(xì)胞(表達(dá)圖3中描述的CAR)評(píng)估屬于記憶(CD45RA、CCR7、CD27)、活化(CD69、HLA-DR)、細(xì)胞毒性(穿孔蛋白、粒酶B)、耗竭/衰老(CD57、KLRG1、PD1)、和粘附(CD39、CD150)的標(biāo)志物表達(dá)。圖8A-B中顯示了此延伸表型的結(jié)果。

使用蛋白質(zhì)印跡對(duì)CAR⁺T細(xì)胞(表達(dá)圖3中描述的CAR)評(píng)估CD3ζ的表達(dá)。在變性條件下運(yùn)行細(xì)胞裂解物，轉(zhuǎn)移，并且使用一級(jí)小鼠抗人CD3ζmAb和偶聯(lián)有HRP的山羊抗小鼠IgG使用SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity底物測(cè)量嵌合CD3ζ的表達(dá)。相對(duì)于CAR構(gòu)建體的大小，觀(guān)察到52、71和78kD的嵌合CD3ζ條帶。圖9中顯示了這些蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。

在第1天和此后每7天持續(xù)28天，用K562aAPC刺激用CAR構(gòu)建體(圖3中描述)電穿孔的T細(xì)胞。在每個(gè)刺激循環(huán)結(jié)束時(shí)，使用臺(tái)盼藍(lán)排除方法計(jì)數(shù)細(xì)胞，并且在CD3和CAR表達(dá)方面進(jìn)行表型分析。圖10中顯示的圖描繪了隨時(shí)間總共、CD3、和CAR⁺T細(xì)胞的推斷的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

測(cè)量細(xì)胞的擴(kuò)增。通過(guò)與(電穿孔后)第1天比較計(jì)數(shù)在共培養(yǎng)的第14天、第21天和第28天計(jì)算總細(xì)胞(圖11)和CAR⁺(圖12)T細(xì)胞的倍數(shù)擴(kuò)增。圖11和圖12中顯示了結(jié)果。

對(duì)CAR表達(dá)T細(xì)胞(CAR⁺T細(xì)胞)測(cè)量細(xì)胞毒性。在標(biāo)準(zhǔn)的4小時(shí)鉻釋放測(cè)定法中，與CD19^-EL-4相比，對(duì)CAR⁺T細(xì)胞(表達(dá)圖3中描述的CAR)評(píng)估其針對(duì)CD19⁺腫瘤靶標(biāo)(Daudiβ₂m、NALM-6和CD19⁺EL-4)的細(xì)胞毒性。在圖13、圖14、圖15和圖16中顯示了結(jié)果。

胞內(nèi)IFN-γ產(chǎn)生。在存在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的情況下將CAR⁺T細(xì)胞(表達(dá)圖3中描述的構(gòu)建體)與(CD19⁺和CD19^-)刺激細(xì)胞一起溫育4-6小時(shí)，固定，透化，并且用IFN-γ特異性mAb染色。PMA-離子霉素用作陽(yáng)性對(duì)照。圖17、圖18、圖19和圖20中顯示了胞內(nèi)IFN-γ產(chǎn)生的結(jié)果。

針對(duì)SB11轉(zhuǎn)座酶的PCR。在熱循環(huán)儀中使用SB11特異性引物擴(kuò)增從CAR+T細(xì)胞分離的DNA(圖3)。GAPDH用作持家基因，并且線(xiàn)性化pCMV-SB11質(zhì)粒，來(lái)自表達(dá)SB11的Jurkat細(xì)胞的基因組DNA用作陽(yáng)性對(duì)照。CAR^-細(xì)胞(無(wú)DNA)用作陰性對(duì)照。圖21中顯示了這些PCR結(jié)果。

使用定量PCR(qPCR)測(cè)量CAR拷貝數(shù)。通過(guò)使用對(duì)IgG4Fc莖部和反向/同向重復(fù)序列(IR/DR)特異性的引物和探針擴(kuò)增基因組DNA來(lái)評(píng)估細(xì)胞中的CAR轉(zhuǎn)基因(圖3中顯示的CAR構(gòu)建體)的整合數(shù)目。RNA酶P基因用作內(nèi)部對(duì)照，并且表達(dá)單拷貝CAR的Jurkat細(xì)胞系用于產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。圖22中顯示了結(jié)果。

接著，測(cè)量CAR+T細(xì)胞的自主生長(zhǎng)的存在或缺乏。通過(guò)在缺乏細(xì)胞因子和aAPC的情況下培養(yǎng)T細(xì)胞來(lái)監(jiān)測(cè)并測(cè)量CAR+T細(xì)胞(表達(dá)圖3中顯示的CAR構(gòu)建體)的異常生長(zhǎng)。每7天計(jì)數(shù)細(xì)胞，并且計(jì)算并繪圖活細(xì)胞/死亡細(xì)胞百分比(從第1天起)。如圖23中顯示，觀(guān)察到超過(guò)80％的T細(xì)胞到第14天是死亡的，顯示缺乏自主生長(zhǎng)。

各個(gè)CAR可以進(jìn)行表達(dá)(>80％)，擴(kuò)增(約1010)，并且在相似程度上有細(xì)胞毒性(約60％，Daudi)。支架結(jié)構(gòu)域(IgG4或CD8α)用于建立CAR，并且不影響表達(dá)或效力?？缒そY(jié)構(gòu)域(CD8，CD28)不影響效力。4-1BB跨膜結(jié)構(gòu)域(216)影響表達(dá)(抗scFv Ab)，但是不影響細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子產(chǎn)生。信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、CD28和4-1BB的組合沒(méi)有疊加效應(yīng)。CAR+T細(xì)胞展現(xiàn)出記憶/效應(yīng)子表型。與其它CAR相比，僅含有4-1BB結(jié)構(gòu)域(212、214、217)的CAR具有更高的CCR7表達(dá)。細(xì)胞表達(dá)記憶(CD27hi、CD45RAhi、CCR7lo)、活化(CD69med、HLA-DRhi)、細(xì)胞溶解(粒酶hi，穿孔蛋白lo)，和粘附(CD39hi,CD150lo)的標(biāo)志物，但是觀(guān)察到可忽略不計(jì)量的抑制性標(biāo)志物(CD57、PD1、KLRG1)。所有CAR，包括含有4-1BB結(jié)構(gòu)域域的CAR，缺乏SB11轉(zhuǎn)座酶，并且不自身增殖。

實(shí)施例4

含有CD3-ζ的CAR的產(chǎn)生

在本實(shí)施例中提供了含有CD3ζ的CAR。圖24中顯示了CAR設(shè)計(jì)的總圖。如圖24中顯示，顯示了CAR設(shè)計(jì)(圖24，右)與抗體分子(圖24，左)的比較。

圖25中顯示了CD3ζ序列。圖25中顯示了CD3ζ及其同等型的序列。CAR設(shè)計(jì)包括CD3ζ(同等型1)，其形成膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域信號(hào)傳導(dǎo)部分之一并且具有三個(gè)ITAM。

圖26和圖27中顯示了具體的CAR構(gòu)建體。圖26顯示了具有長(zhǎng)(IgG4)、中等(CD8a鉸鏈)和小(IgG 12aa)莖部，經(jīng)由CD28或CD137膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)的CD19特異性CAR的示意圖。圖27中顯示了具有不同莖部和信號(hào)傳導(dǎo)的CAR分子的命名。

測(cè)量CAR表達(dá)。在電穿孔后1天(第1天)和在aAPC上共培養(yǎng)28天(第28天)后測(cè)量CAR(如圖26中描述)的表達(dá)。圖28中顯示了CD3和CAR(如通過(guò)CD19scfv特異性mAb測(cè)量)的點(diǎn)圖。

對(duì)CAR測(cè)量擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)。在7天刺激循環(huán)中在aAPC上共培養(yǎng)用CAR構(gòu)建體(圖26中顯示)電穿孔的T細(xì)胞。對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且評(píng)估CD3和CAR的表達(dá)。圖29和圖30中顯示了結(jié)果。

測(cè)量CAR⁺T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在28天共培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，在鉻釋放測(cè)定法中評(píng)估CAR⁺T細(xì)胞(表達(dá)圖26中顯示的構(gòu)建體)的針對(duì)腫瘤靶標(biāo)的細(xì)胞毒性。如圖31中顯示，對(duì)針對(duì)CD19⁺和CD19^-腫瘤靶標(biāo)的CD19RCD28(CAR 194)和CD19RCD137(CAR 217)CAR以各個(gè)效應(yīng)物與靶標(biāo)比率測(cè)量細(xì)胞毒性百分比。如圖32中顯示，獲得在20:1的E:T比率時(shí)CAR⁺T細(xì)胞(表達(dá)圖26中顯示的CAR構(gòu)建體)對(duì)CD19⁺EL-4的裂解百分比的數(shù)據(jù)。測(cè)量CAR⁺T細(xì)胞(表達(dá)圖26中顯示的構(gòu)建體)上的CD27、CD62L、CD28和CCR7的表達(dá)百分比，并且在圖33中顯示了結(jié)果。

對(duì)CAR⁺T細(xì)胞測(cè)量胞內(nèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生。在存在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的情況下將刺激細(xì)胞(CD19⁺和CD19^-)與CAR⁺T細(xì)胞(表達(dá)圖26中顯示的CAR)一起溫育4小時(shí)，并且用IFN-γ和IL-2mAb染色。PMA-離子霉素充當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照，并且單獨(dú)的T細(xì)胞充當(dāng)陰性對(duì)照。圖34顯示了刺激后的IFN-γ生成細(xì)胞的百分比。圖35顯示了與細(xì)胞刺激混合物(PMA-離子霉素)一起溫育后IFN-γ和或IL-2生成細(xì)胞的分解。

對(duì)CAR⁺T細(xì)胞測(cè)量自主生長(zhǎng)的存在或缺乏。對(duì)CAR⁺T細(xì)胞(表達(dá)圖26中描述的CAR)評(píng)估其在缺乏外部刺激(細(xì)胞因子和aAPC)的情況下缺乏異常生長(zhǎng)持續(xù)18天。在18天結(jié)束時(shí)，超過(guò)80％的細(xì)胞是死亡的，顯示了缺乏不想要的生長(zhǎng)。如圖36中顯示，觀(guān)察到自主生長(zhǎng)的缺乏。

在CAR⁺T細(xì)胞中測(cè)量CAR拷貝數(shù)。通過(guò)qPCR使用對(duì)IgG4-Fc和IR/DR區(qū)特異性的引物/探針評(píng)估整合的CAR分子的拷貝數(shù)。如圖37中顯示，使用IR/DR探針觀(guān)察到整合的CAR拷貝數(shù)(圖26中顯示的CAR)。如圖38和圖39中顯示，在CAR構(gòu)建體(圖3中顯示的兩種CAR構(gòu)建體和圖26中顯示的CAR構(gòu)建體)的表和圖形形式中提供了CAR拷貝數(shù)數(shù)據(jù)的匯編，如在兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)中測(cè)試(P491；C714和GCR357861)。

這些數(shù)據(jù)顯示了可以在如本文中描述的培養(yǎng)系統(tǒng)中體外表達(dá)并培養(yǎng)具有各種間隔區(qū)的CAR。觀(guān)察到所有CAR具有相似的CAR表達(dá)。在具有CD8鉸鏈區(qū)的CAR中觀(guān)察到CD19+EL-4s的最大細(xì)胞毒性。對(duì)測(cè)試的所有CAR觀(guān)察到相似的CD62L和CD28表達(dá)。除了含有IgG4-Fc莖部的CAR外，在所有CAR中觀(guān)察到如通過(guò)CAR拷貝數(shù)測(cè)量的高整合頻率。通過(guò)PCR觀(guān)察到自主生長(zhǎng)和SB11的缺乏。與先前的報(bào)告形成對(duì)比，在CAR中包含12aa間隔區(qū)在這些研究中沒(méi)有賦予改善的功能性。

實(shí)施例5

從主要組分快速裝配CAR

與臨床級(jí)CD19RCD28mζCAR+T細(xì)胞(CG CAR)平行，發(fā)明人使用EZ CAR平臺(tái)產(chǎn)生經(jīng)由嵌合CD28/CD3-ζ活化的CD19特異性CAR。將臨床級(jí)CD28/CD3-ζ和EZ CAR CD19RCD28mζCAR序列兩者插入睡美人轉(zhuǎn)座子載體中，并且電穿孔到T細(xì)胞中。在電穿孔后，在存在CD19+人工抗原呈遞細(xì)胞(又稱(chēng)作活化和增殖細(xì)胞，或AaPC)的情況下培養(yǎng)T細(xì)胞，用于T細(xì)胞的抗原特異性擴(kuò)增。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(Fc+表達(dá))每周測(cè)量T細(xì)胞表面中的CAR表達(dá)，顯示了臨床級(jí)CD19CAR T細(xì)胞和EZ CD19CAR T細(xì)胞中的相似CAR表達(dá)。還實(shí)施鉻釋放測(cè)定(CRA)以評(píng)估通過(guò)EZ CAR平臺(tái)產(chǎn)生的T細(xì)胞CD19CAR+針對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷功能。在溫育4小時(shí)后，通過(guò)EZ CAR T細(xì)胞觀(guān)察到特異性細(xì)胞裂解的百分比為52％，并且通過(guò)CG CAR T細(xì)胞為49％。

這些結(jié)果證明了使用這些方法產(chǎn)生功能性CAR⁺T細(xì)胞。然后，發(fā)明人使用與含有CAR分子的以下三種組分的質(zhì)粒文庫(kù)組合的如上文描述的方法進(jìn)行CAR的快速產(chǎn)生：(i)抗CD19scFv，(ii)具有不同尺寸的5種鉸鏈(長(zhǎng)-IgG4a和IgG4ΔEQ，中等-CD8α，短-t-20AA和t-12AA)和(iii)具有CD3ζ結(jié)構(gòu)域的7種信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(CD27、CD28、CD28ΔY¹⁷³→F¹⁷³、CD134、CD137、CD278)的不同組合。用含有CAR轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞用于篩選27種不同CAR構(gòu)建體以確保細(xì)胞表面中的CAR蛋白的表達(dá)。使用iQue^TM篩選器(Intellicyt,Albuquerque,NM)(一種高通量流式細(xì)胞儀)進(jìn)行個(gè)別CAR分子的高通量測(cè)試，其中使用表達(dá)熒光粒酶B報(bào)告物或GFP的工程化靶細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定。圖40A-E中顯示了結(jié)果。

使用IntelliCyt’s iQue^TM，進(jìn)行額外的實(shí)驗(yàn)以篩選CAR分子。iQue^TM使用高通量流式細(xì)胞術(shù)，一種通過(guò)使用復(fù)用(multiplexing)性能和逐個(gè)細(xì)胞分析(cell-by-cell analysis)研究大群體產(chǎn)生信息的補(bǔ)充技術(shù)。發(fā)明人采用此技術(shù)來(lái)告知用CAR組修飾的T細(xì)胞的治療潛力?？梢葬槍?duì)活力，及活化信號(hào)(例如，CD25的上調(diào))、細(xì)胞因子釋放、和殺傷方面對(duì)來(lái)自孔的T細(xì)胞染色。因此，發(fā)明人調(diào)適iQue篩選器，并且利用其進(jìn)行復(fù)用的基于珠粒的細(xì)胞因子檢測(cè)和基于細(xì)胞的測(cè)定的能力。獲得的結(jié)果指示此技術(shù)可以用于測(cè)試通過(guò)EZ CAR平臺(tái)產(chǎn)生的大量不同CAR T細(xì)胞。使用IntelliCyt’s iQue^TM產(chǎn)生數(shù)據(jù)，其中對(duì)CAR T細(xì)胞的2個(gè)群體評(píng)估其殺傷靶細(xì)胞的能力。圖41A-B和圖42中顯示了結(jié)果。這些結(jié)果證明了CAR分子有活性，并且iQue^TM方法可以有效用于評(píng)估CAR活性。

***

本文中公開(kāi)和要求保護(hù)的所有方法可以根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容進(jìn)行和執(zhí)行而無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)。雖然本發(fā)明的組合物和方法已經(jīng)按照優(yōu)選的實(shí)施方案描述，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將明顯的是，可以在不偏離本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍的前提下對(duì)方法和在本文中描述的方法的步驟中或步驟的順序中應(yīng)用變化。更具體地，將明顯的是，可以用化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的某些藥劑替代本文中的描述的藥劑，同時(shí)將實(shí)現(xiàn)相同或相似的結(jié)果。認(rèn)為對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的所有此類(lèi)類(lèi)似的替代和修飾在本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思內(nèi)，如所附權(quán)利要求書(shū)限定。

參考文獻(xiàn)

通過(guò)引用方式將以下參考文獻(xiàn)明確并入本文，其程度為它們提供對(duì)本文中列出的那些補(bǔ)充性的示例性程序或其它詳情。

美國(guó)公開(kāi)No.2009/0017000

美國(guó)公開(kāi)No.2009/0004142

美國(guó)專(zhuān)利No.6,225,042

美國(guó)專(zhuān)利No.6,355,479

美國(guó)專(zhuān)利No.6,362,001

美國(guó)專(zhuān)利No.6,410,319

美國(guó)專(zhuān)利No.6,790,662

美國(guó)專(zhuān)利No.7,109,304

WO2007/103009

Ahmed and Cheung，F(xiàn)EBS Lett.2014 Jan 21；588(2)：288-97.

Altenschmidt et al.，Adoptive transfer of in vitro-targeted，activated T lymphocytes res ults in total tumor regression，J Immunol.1997 Dec 1；159(11)：5509-15.

Audet et al.，Sci Rep.2014 Nov 6；4：6881.

Berry et al.Adoptive immunotherapy for cancer：the next generation of gene-engineered immune cells.Tissue Antigens.2009 Oct；74(4)：277-89.

Brocker et al.，Adv.Immunol.，68：257，1998.

Curtin et al.，MAbs.2015 Jan 2；7(1)：265-75.

et al.，Drug Metab Dispos.2015 Jan；43(1)：42-52.

Davies JK，Singh H，Huls H，Yuk D.Lee DA，et al.(2010)Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.Cancer Res 70：3915-3924.

de Weers et al.，J Immunol.2011 Feb 1；186(3)：1840-8.

Duong et al.，(2013)Engineering T Cell Function Using Chimeric Antigen Receptors Identified Using a DNA Library Approach.PLOS ONE 8(5)：e63037.

Eshhar et al.，Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T-cell receptors.Proc Natl Acad Sci U S A.；90(2)：720-4，1993.

Eshhar，Tumor-specific T-bodies：towards clinical application.Cancer Immunol Immunother.1997 Nov-Dec；45(3-4)：131-6.1997

Fitzer-Attas et al.，Harnessing Syk family tyrosine kinases as signaling domains for chimeric single chain of the variable domain receptors：optimal design for T cell activation.J Immunol.1998 Jan1；160(1)：145-54.1998

Funakoshi et al.，Cancer Treat Rev.2014 Dec；40(10)：1221-9.

Gerber et al.，Clin Cancer Res.2011 Nov 1；17(21)：6888-96.

Goldberg et al.，J Clin Oncol.2014 May 10；32(14)：1445-52.

Gross et al.，Expression of immunoglobulin-T-cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibody-type specificity.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：10024-10028，1989.

Gross et al.(1992)Endowing T cells with antibody specificity using chimeric T cell receptors.FASEB J.1992 Dec；6(15)：3370-8.

Hackett et al.，A transposon and transposase system for human application，Mol Ther.2010 Apr；18(4)：674-83).

Hekele et al.Growth retardation of tumors by adoptive transfer of cytotoxic T lymphocytes reprogrammed by CD44v6-specific scFv：zeta-chimera.Int J Cancer.1996 Oct 9；68(2)：232-8，1996.

Huls et al.，Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood.J.Vis.Exp.，doi：10.3791/50070，2013.

Huls et al.“Clinical application of Sleeping Beauty and artificial antigen presenting cells to genetically modify T cells from peripheral and umbilical cord blood”J Vis Exp.2013 Feb 1；(72)：e50070.

Humbler-Baron and Baron，Immunol Cell Biol.2015 Feb 10.doi：10.1038/icb.2014.120.

Hwu et al.(1995)In vivo antitumor activity of T cells redirected with chimeric antibody/T-cell rcccptor gcnes.Cancer Res.1995 Aug 1；55(15)：3369-73.

Ikeda et al.，Clin Cancer Res.2009 Jun 15；15(12)：4028-37.

Jabbour et al.，Am J Hematol.2014 Nov 18.

Kaufmann et al.，Hum Pathol.1997 Dec；28(12)：1373-8.

Kaufman et al.，Br J Haematol.2013 Nov；163(4)：478-86.

Kim DW，Uetsuki T，Kaziro Y，Yamaguchi N，Sugano S(1990)Use of the human elongation factor l alpha promoter as a versatile and efficient expression system.Gene 91：217-223.

Kim et al.，2004，Nature，Vol.22(4)，pp.403-410.

Kim et al.，Immunology.2010 Aug；130(4)：545-55.

Kong et al.，Leuk Res.2014 Nov；38(11)：1320-6.

Krebs et al.，T cells expressing a chimeric antigen receptor that binds hepatitis B virus envelope proteins control virus replication in mice.Gastroenterology.2013 Aug；145(2)：456-65.

Le Garff-Tavernier et al.，Haematologica.2014 Dec 31.

Lennard S.，Standard protocols for the construction of scFv libraries.Methods Mol Biol.2002；178：59-71.

Leung，Molecular Imaging and Contrast Agent Database(MICAD)，Bethesda(MD)：National Center for Biotechnology Information(US)：2004-2013.2010 Mar 25

Leung 2011，IRDye800CW-anti-CD105 TRC105 chimeric monoclonal antibody.Molecular Imaging and Contrast Agent Database(MICAD).Bcthesda(MD)：National Center for Biotechnology Information(US)；2004-2013.2011 Dec 01

Maiti et al.，Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications.J Immunother.36(2)：112-23，2013.

Manero et al.，Haematologica.2013 Feb；98(2)：217-21.

Molecular Therapy 17(8)：1453-1464，2009.

Moritz et al.(1994)Cytotoxic T lymphocytes with a grafted recognition specificity for ERBB2-expressing tumor cells.Proc Natl Acad Sci U S A.1994 May 10；91(10)：4318-22.

Patel et al.，Anticancer Res.2008 Sep-Oct；28(5A)：2679-86.

Qiu et al.，PLoS Negl Trop Dis.2012；6(3)：e1575.

Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th Ed.，Mack，ed.(1980)

Rushworth et al.，(2014)“Universal Artificial Antigen Presenting Cells to Selectively Propagate T Cells Expressing Chimeric Antigen Receptor Independent of Specificity”J Immunother.May；37(4)：204-13.

Sarup et al.，Mol Cancer Ther.2008 Oct；7(10)：3223-36.

Schneider，J.Embryol.Exp.Morph.1972 Vol 27，pp.353-365

Schultz-Thater et al.，Br J Cancer.2000 Jul；83(2)：204-8.

Shin et al，Immune Netw.2011 Apr；11(2)：114-22.

Singh et al.，Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system.Cancer Res.，68：2961-2971，2008.

Singh H，F(xiàn)igliola MJ，Dawson MJ，Huls H，Olivares S，et al.(2011)Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies.Cancer Res 71：3516-3527.

Singh et al.“A new approach to gene therapy using Sleeping Beauty to genetically modify clinical-grade T cells to target CD19.”Immunol Rev.2014 Jan；257(1)：181-90.

Singh et al.，“Manufacture of T cells using the Sleeping Beauty system to enforce expression of a CD 19-specific chimeric antigen receptor.”Cancer Gene Ther.2015 Jan 16.

Stancovski et al.(1993)

Stynen et al.，F(xiàn)ungal Cell Wall and Immune Response，NATO ASI Series Volume 53，1991，pp 181-193.

Sun et al.，Cell Mol Immunol.2007 Jun；4(3)：209-14.

Turtle et al.，“Artificial antigen-presenting cells for use in adoptive immunotherapy”Cancer J.2010 Jul-Aug；16(4)：374-81.

Vcrcl，Iht J Cancer.2002 May 20；99(3)：396-402.

Vincent and Samuel，Journal of Immunological Methods，Volume 165，Issue 2，15 October 1993，Pages 177-182.

Wang et al.，Immunology.2015 Feb；144(2)：254-62.

Weijtens et al.(1996)Single chain Ig/gamma gene-redirected human T lymphocytes produce cytokines，specifically lyse tumor cells，and recycle lyric capacity.J Immunol.1996 Jul 15；157(2)：836-43.

Wieczorek et al.，Genetically Modified T Cells for the Treatment of Malignant Disease.Transfus Med Hemother.2013 Dec；40(6)：388-402.

Winiarska et al.，MAbs.2014；6(5)：1300-13.

Zhuang et al.，Cancer Cell Int.2014 Nov 30；14(1)：109.

Zhang et al.，Angiogenesis.2002；5(1-2)：35-44.