1.一種用于純化如下過程中蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，其中該蛋白質(zhì)的至少一部分具有位于該蛋白質(zhì)表面上的2-6個(gè)組氨酸殘基；該過程包括以下步驟：
a.提供發(fā)酵液，
b.任選的調(diào)節(jié)pH至低于6.0的值；
c.任選地保持該混合物一段時(shí)間；并且
d.從來自該發(fā)酵液的至少一部分固體物質(zhì)中分離溶解的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中位于該蛋白質(zhì)的表面上的2-6個(gè)組氨酸位于一級序列的內(nèi)部，或其中位于該蛋白質(zhì)的表面上的2-6個(gè)組氨酸處于該蛋白質(zhì)的C-末端和/或N-末端延伸的形式。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中在感興趣的蛋白質(zhì)的表面上的2-6個(gè)組氨酸殘基中的至少一個(gè)通過取代或插入被提供。
4.如權(quán)利要求1-3所述的方法，其中該蛋白質(zhì)產(chǎn)物是選自水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶、或轉(zhuǎn)移酶中的一種酶；如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、綠色熒光蛋白、葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中該酶是與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25具有至少80％序列一致性，優(yōu)選地至少90％序列一致性，優(yōu)選地至少95％序列一致性，優(yōu)選地至少96％序列一致性，優(yōu)選地至少97％序列一致性，優(yōu)選地至少98％序列一致性，優(yōu)選地至少99％序列一致性的蛋白酶。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中該酶是與SEQ ID NO:18具有至少80％序列一致性，優(yōu)選地至少90％序列一致性，優(yōu)選地至少95％序列一致性，優(yōu)選地至少96％序列一致性，優(yōu)選地至少97％序列一致性，優(yōu)選地至少98％序列一致性，優(yōu)選地至少99％序列一致性的溶菌酶。
7.如前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其中感興趣的蛋白質(zhì)在pH 4.5下的溶解度高于pH 7.0下的溶解度至少10％，優(yōu)選地高于至少20％，優(yōu)選地高于至少30％，優(yōu)選地高于至少40％，優(yōu)選地高于至少50％，優(yōu)選地高于至少60％，優(yōu)選地高于至少70％，優(yōu)選地高于至少80％，優(yōu)選地高于至少90％，優(yōu)選地高于至少100％。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其中發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的濃度是至少3g/l，如至少4g/l，如至少5g/l，如至少6g/l；如至少7g/l，如至少8g/l，如至少9g/l；如至少10g/l，如至少11g/l，如至少12g/l；如至少13g/l，如至少14g/l，如至少15g/l；如至少16g/l，如至少17g/l，如至少18g/l；如至少19g/l，如至少20g/l。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟b)中的pH被調(diào)節(jié)至低于6.0，優(yōu)選地低于5.5，優(yōu)選地低于5.0，優(yōu)選地低于4.5的pH值。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，該方法包括步驟c中的保持時(shí)間段，并且其中該保持時(shí)間段在10秒至90分鐘的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在1分鐘至90分鐘的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在1分鐘至60分鐘的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在1分鐘至30分鐘的范圍內(nèi)，如在5分鐘至30分鐘的范圍內(nèi)，并且最優(yōu)選地在10分鐘至20分鐘的范圍內(nèi)。
11.如前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其中通過在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物來提供該發(fā)酵液。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中該微生物選自屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，或選自屬于曲霉屬、木霉屬、青霉屬、鐮孢屬的真菌，如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、醬油曲霉、里氏木霉、長枝木霉或綠色木霉；或優(yōu)選地選自屬于酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬、漢森酵母屬(Hanensula)、克魯維酵母(Klyveromyces)屬的酵母；如釀酒酵母、葡萄汁酵母、畢赤酵母、乳酸克魯維酵母。
13.如前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其中使用過濾、離心或傾析進(jìn)行步驟d中的分離。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括在步驟d中的分離之前的預(yù)處理步驟，如稀釋、添加鹽以及添加聚合物。
15.如前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其中該蛋白產(chǎn)物包含具有給出的氨基酸序列的感興趣的蛋白質(zhì)和除了2-6個(gè)組氨酸殘基的C-末端和/或N-末端延伸外具有相同氨基酸序列的修飾的蛋白質(zhì)。
16.如前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，該方法包括步驟c中的保持時(shí)間段，并且其中該保持時(shí)間段在10秒至90分鐘的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在1分鐘至90分鐘的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在1分鐘至60分鐘的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在1分鐘至30分鐘的范圍內(nèi)，如在5分鐘至30分鐘的范圍內(nèi)，并且最優(yōu)選地在10分鐘至20分鐘的范圍內(nèi)。
17.一種重組微生物，其包含編碼感興趣的蛋白的至少一種多核苷酸，該至少一種多核苷酸可操作地連接至指導(dǎo)該感興趣的蛋白的生產(chǎn)的一個(gè)或多個(gè)控制序列上；和編碼修飾蛋白的至少一種多核苷酸，與該感興趣的蛋白相比該修飾蛋白被修飾為包含位于蛋白質(zhì)的表面上的2-6個(gè)組氨酸殘基，經(jīng)修飾的基因可操作地連接至指導(dǎo)該修飾蛋白的生產(chǎn)的一個(gè)或多個(gè)控制序列上。
18.如權(quán)利要求17所述的重組微生物，該重組微生物是原核細(xì)胞，優(yōu)選地是革蘭氏陽性細(xì)胞，更優(yōu)選地是芽胞桿菌屬細(xì)胞；最優(yōu)選地是嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、或蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求17所述的重組微生物，該重組微生物是真核細(xì)胞，優(yōu)選地是真菌細(xì)胞，更優(yōu)選地是曲霉屬、木霉屬或酵母屬或畢赤酵母屬細(xì)胞；最優(yōu)選地是黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、棘孢曲霉、里氏木霉、哈茨木霉、綠色木霉、釀酒酵母、葡萄汁酵母、或巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。
20.如權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)所述的重組微生物，該重組微生物包含編碼感興趣的蛋白質(zhì)的多核苷酸的至少兩個(gè)拷貝，優(yōu)選是至少三個(gè)拷貝，更優(yōu)選是至少四個(gè)拷貝并且最優(yōu)選是編碼感興趣的蛋白質(zhì)的多核苷酸的至少五個(gè)拷貝。
21.如權(quán)利要求17-20中的任一項(xiàng)所述的重組微生物，該重組微生物包含編碼同一個(gè)感興趣的蛋白質(zhì)的至少兩個(gè)不同的多核苷酸，優(yōu)選地至少三個(gè)，更優(yōu)選地至少四個(gè)并且最優(yōu)選地至少五個(gè)編碼同一個(gè)感興趣的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求17至21中的任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中感興趣的蛋白質(zhì)是一種酶，優(yōu)選地是水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶、或轉(zhuǎn)移酶，如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、綠色熒光蛋白、葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
23.如權(quán)利要求22中的任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中該酶是蛋白酶；優(yōu)選地該蛋白酶具有如下氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25中的一個(gè)具有至少80％序列一致性，優(yōu)選地至少90％序列一致性，優(yōu)選地至少95％序列一致性，優(yōu)選地至少96％序列一致性，優(yōu)選地至少97％序列一致性，優(yōu)選地至少98％序列一致性，優(yōu)選地至少99％序列一致性。
24.如權(quán)利要求22中的任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中該酶是溶菌酶；優(yōu)選地具有如下氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQ ID NO:18具有至少80％序列一致性，優(yōu)選地至少90％序列一致性，優(yōu)選地至少95％序列一致性，優(yōu)選地至少96％序列一致性，優(yōu)選地至少97％序列一致性，優(yōu)選地至少98％序列一致性，優(yōu)選地至少99％序列一致性。
25.如權(quán)利要求17-24中的任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸被整合到宿主細(xì)胞染色體的不同基因座中。
26.一種生產(chǎn)酶的方法，所述方法包括在有益于產(chǎn)生該酶的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求17-25中的任一項(xiàng)所定義的細(xì)胞的步驟。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，該方法進(jìn)一步包括回收該酶的步驟。
28.一種蛋白質(zhì)產(chǎn)物，包含感興趣的蛋白質(zhì)和修飾的蛋白質(zhì)，與該感興趣的蛋白質(zhì)相比該修飾的蛋白質(zhì)被修飾為在蛋白質(zhì)的表面上具有2-6個(gè)組氨酸殘基。
29.如權(quán)利要求28所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中該修飾的蛋白質(zhì)包含附接至蛋白質(zhì)的C-末端和/或N-末端上的2-6個(gè)組氨酸殘基。
30.如權(quán)利要求28或29所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中感興趣的蛋白質(zhì)是一種酶，優(yōu)選地是水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶、或轉(zhuǎn)移酶，如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、綠色熒光蛋白、葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
31.如權(quán)利要求30所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中該酶是蛋白酶；優(yōu)選地該蛋白酶具有如下氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25中的一個(gè)具有至少80％序列一致性，優(yōu)選地至少90％序列一致性，優(yōu)選地至少95％序列一致性，優(yōu)選地至少96％序列一致性，優(yōu)選地至少97％序列一致性，優(yōu)選地至少98％序列一致性，優(yōu)選地至少99％序列一致性。
32.如權(quán)利要求30所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中該感興趣的酶是溶菌酶；優(yōu)選地該溶菌酶具有如下氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQ ID NO:18具有至少80％序列一致性，優(yōu)選地至少90％序列一致性，優(yōu)選地至少95％序列一致性，優(yōu)選地至少96％序列一致性，優(yōu)選地至少97％序列一致性，優(yōu)選地至少98％序列一致性，優(yōu)選地至少99％序列一致性。