本申請(qǐng)包括計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，將其通過(guò)引用結(jié)合在此。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域，具體涉及通過(guò)發(fā)酵過(guò)程制備的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域。發(fā)明背景工業(yè)蛋白生產(chǎn)的一個(gè)重要部分是將所希望的蛋白質(zhì)從其中已經(jīng)生成了蛋白質(zhì)的產(chǎn)物混合物的其余部分中進(jìn)行純化。在發(fā)酵工業(yè)中，蛋白質(zhì)一般通過(guò)經(jīng)設(shè)計(jì)或選擇以產(chǎn)生大量所希望的蛋白質(zhì)的特殊細(xì)胞產(chǎn)生。所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)可以被這些細(xì)胞分泌到細(xì)胞周圍的體液中。已經(jīng)在發(fā)酵期間產(chǎn)生蛋白質(zhì)之后，一般在蛋白質(zhì)處于預(yù)期形式和純度之前在后續(xù)步驟中對(duì)其進(jìn)行純化。在純化過(guò)程期間，通常將所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)從生產(chǎn)培養(yǎng)基的一種或多種組分中分離，并且通常涉及可溶性蛋白質(zhì)從固體細(xì)胞物質(zhì)中的分離。如果蛋白質(zhì)以足夠高的量生產(chǎn)，那么其可以以結(jié)晶形式沉淀，這為通常發(fā)酵之后的純化過(guò)程中造成了額外的挑戰(zhàn)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)需要是可溶的以便從產(chǎn)物混合物的固體細(xì)胞物質(zhì)和/或其他固體組分中分離。在這種情況下，可以用另外的水或能溶解已沉淀的蛋白質(zhì)的其它流體稀釋產(chǎn)物混合物。然而，即使稀釋該產(chǎn)物混合物可以解決在產(chǎn)物混合物中沉淀的蛋白質(zhì)的問(wèn)題，但這是一個(gè)不太希望的解決方案，因?yàn)檫@也意味著體積增大，并且因此隨后的純化設(shè)備必須能夠處理由于稀釋產(chǎn)生的更大的體積，這通常意味著更多的投資和更高的操作花費(fèi)是必需的，以應(yīng)對(duì)增加的體積。因此，需要一種使用于分離過(guò)程的蛋白質(zhì)產(chǎn)物再增溶的方法，其中再增溶發(fā)生而不引發(fā)體積的高度增加。發(fā)明既述在第一方面，本發(fā)明涉及用于純化如下過(guò)程中蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，其中該蛋白質(zhì)的至少一部分具有位于該蛋白質(zhì)表面上的2-6個(gè)組氨酸殘基；該過(guò)程包括以下步驟：a.提供發(fā)酵液，b.任選地將pH調(diào)節(jié)至低于組氨酸側(cè)鏈的pKa的值；c.任選地保持該混合物一段時(shí)間；并且d.從來(lái)自發(fā)酵液的至少一部分固體物質(zhì)中分離溶解的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。在第二方面，本發(fā)明涉及一種重組微生物，其包含編碼感興趣的蛋白的至少一種多核苷酸，該至少一種多核苷酸可操作地連接至一種或多種指導(dǎo)該感興趣的蛋白的生產(chǎn)的控制序列上，和至少一種編碼修飾蛋白的多核苷酸，與該感興趣的蛋白相比該修飾蛋白被修飾為包含位于蛋白質(zhì)的表面上的2-6個(gè)組氨酸殘基，經(jīng)修飾的基因可操作地連接至一種或多種指導(dǎo)該修飾蛋白的生產(chǎn)的控制序列上。在第三方面，本發(fā)明涉及一種重組微生物，其包含編碼感興趣的蛋白的至少一種多核苷酸，該至少一種多核苷酸可操作地連接至一種或多種指導(dǎo)該感興趣的蛋白的生產(chǎn)的控制序列上，和至少一種編碼修飾蛋白的多核苷酸，與該感興趣的蛋白相比該修飾蛋白被修飾為包含位于蛋白質(zhì)的表面上的2-6個(gè)組氨酸殘基，經(jīng)修飾的基因可操作地連接至一種或多種指導(dǎo)該修飾蛋白的生產(chǎn)的控制序列上。在另一方面，本發(fā)明涉及使用第二方面的重組微生物以產(chǎn)生蛋白產(chǎn)品，該蛋白產(chǎn)品包含感興趣的蛋白和修飾蛋白，與該感興趣的蛋白相比該修飾蛋白具有攜帶沿C-末端和/或N-末端延伸的2-6個(gè)組氨酸殘基的相同氨基酸序列。優(yōu)選地，該感興趣的蛋白是一種酶。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1A示出了SDS-page凝膠，該SDS-page凝膠顯示來(lái)自溶菌酶發(fā)酵與發(fā)酵期間所取樣本的上清液。圖中的泳道1是標(biāo)記物，泳道2-6分別為97小時(shí)后、120小時(shí)后、144小時(shí)后、169小時(shí)后以及192小時(shí)后來(lái)自溶菌酶發(fā)酵的發(fā)酵液的上清液樣品；并且泳道7是純化的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)?？梢钥闯觯捎诔恋?，與144小時(shí)后相比在169小時(shí)后和192小時(shí)后溶菌酶的量降低。圖1B示出了SDS-page凝膠，該SDS-page凝膠顯示來(lái)自溶菌酶發(fā)酵與發(fā)酵期間所取樣本的上清液。圖中的泳道1是標(biāo)記物，泳道2-6分別為97小時(shí)后、120小時(shí)后、144小時(shí)后、169小時(shí)后以及192小時(shí)后來(lái)自溶菌酶發(fā)酵的發(fā)酵液的上清液樣品；并且泳道7是純化的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)?？梢钥闯?，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程期間溶菌酶的量增加。發(fā)明詳述定義編碼序列：術(shù)語(yǔ)“編碼序列”是指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界一般由開(kāi)放閱讀框架決定，該開(kāi)放閱讀框架從起始密碼子(如ATG、GTG或TTG)開(kāi)始并且以終止密碼子(如TAA、TAG或TGA)結(jié)束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。控制序列：術(shù)語(yǔ)“控制序列”意指對(duì)于表達(dá)編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每個(gè)控制序列對(duì)于編碼該多肽的多核苷酸來(lái)說(shuō)可以是原生的(即，來(lái)自相同基因)或外源的(即，來(lái)自不同基因)，或相對(duì)于彼此是原生的或外源的。此類控制序列包括但不限于前導(dǎo)子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列、以及轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動(dòng)子，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。出于引入有利于將這些控制序列與編碼一種多肽的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點(diǎn)的目的，這些控制序列可以提供有多個(gè)接頭。表達(dá)：術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。表達(dá)載體：術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”意指線性或環(huán)狀DNA分子，該分子包含編碼多肽的多核苷酸并且該多核苷酸可操作地與提供用于其表達(dá)的控制序列相連接。宿主細(xì)胞：術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”意指易于用包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類型。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。分離的：術(shù)語(yǔ)“分離的”意指處于自然界中不存在的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括(1)任何非天然存在的物質(zhì)，(2)下述任何物質(zhì)，包括但不限于任何酶、變異核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子，其中所述物質(zhì)至少部分地從在自然界中與該物質(zhì)結(jié)合的一種或多種或所有天然存在的組分移除；(3)相對(duì)于天然發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)通過(guò)人工修飾的任何物質(zhì)；或(4)通過(guò)增加該物質(zhì)相對(duì)于與其天然相關(guān)的其他組分的量而修飾的任何物質(zhì)(例如，宿主細(xì)胞中的重組體產(chǎn)生；編碼該物質(zhì)的基因的多個(gè)拷貝；以及使用比編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)的啟動(dòng)子強(qiáng)的啟動(dòng)子)。成熟多肽：術(shù)語(yǔ)“成熟多肽”意指呈其在翻譯以及任何翻譯后修飾之后的最終形式的多肽，所述修飾如N末端加工、C末端截?cái)唷⑻腔?、磷酸化等。在本領(lǐng)域中已知的是，宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生由相同多核苷酸表達(dá)的兩種或更多種不同成熟多肽(即，具有一個(gè)不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本領(lǐng)域還已知，不同的宿主細(xì)胞不同地加工多肽，并且因此一個(gè)表達(dá)一種多核苷酸的宿主細(xì)胞當(dāng)與另一個(gè)表達(dá)相同多核苷酸的宿主細(xì)胞相比時(shí)可以產(chǎn)生一種不同的成熟多肽(例如，具有一個(gè)不同的C末端和/或N末端氨基酸)。成熟多肽編碼序列：術(shù)語(yǔ)“成熟多肽編碼序列”意指編碼成熟多肽的多核苷酸。核酸構(gòu)建體：術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”意指單鏈或雙鏈的核酸分子，該核酸分子是從天然存在的基因中分離的，或以本來(lái)不存在于自然界中的方式被修飾成含有核酸的區(qū)段，或是合成的，該核酸分子包括一個(gè)或多個(gè)控制序列?？刹僮鞯剡B接：術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”意指如下的構(gòu)造，其中，控制序列相對(duì)于多核苷酸的編碼序列安置在適當(dāng)位置，從而使得該控制序列指導(dǎo)該編碼序列的表達(dá)。序列一致性：用參數(shù)“序列一致性”來(lái)描述兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性。出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件套件，賴斯(Rice)等人，2000，遺傳學(xué)趨勢(shì)(TrendsGenet.)16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的尼德?tīng)柍绦蛑兴鶎?shí)施的尼德?tīng)柭?翁施算法(尼德?tīng)柭?Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48:443-453)來(lái)確定兩個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性。所使用的參數(shù)是空位開(kāi)放罰分10，空位延伸罰分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。尼德?tīng)枠?biāo)注的“最長(zhǎng)的一致性”的輸出(使用-非簡(jiǎn)化選項(xiàng)獲得)被用作百分比一致性，并且計(jì)算如下：(一致的殘基x100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù))出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件套件，賴斯等人，2000，同上)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的尼德?tīng)柍绦蛑兴鶎?shí)施的尼德?tīng)柭?翁施算法(尼德?tīng)柭臀淌?970，同上)來(lái)確定兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的序列一致性。所使用的參數(shù)是空位開(kāi)放罰分10，空位延伸罰分0.5，以及EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。尼德?tīng)枠?biāo)注的“最長(zhǎng)的一致性”的輸出(使用-非簡(jiǎn)化選項(xiàng)獲得)被用作百分比一致性，并且計(jì)算如下：(一致的脫氧核糖核苷酸x100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù))當(dāng)今許多蛋白質(zhì)產(chǎn)品在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行制備，其中微生物在發(fā)酵罐中使用特定底物和發(fā)酵方案進(jìn)行發(fā)酵。這是眾所周知的并且在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了許多發(fā)酵方案。在發(fā)酵期間，微生物產(chǎn)生預(yù)期的蛋白質(zhì)并分泌該蛋白質(zhì)進(jìn)入發(fā)酵液中。在發(fā)酵過(guò)程后，將包括已溶解的預(yù)期的蛋白質(zhì)的液體部分從固體(如細(xì)胞、細(xì)胞碎片以及來(lái)自底物的固體殘余)中分離，并且蛋白質(zhì)產(chǎn)物可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)從該液體部分中進(jìn)一步純化。在許多工業(yè)發(fā)酵中，然而卻經(jīng)歷了所生產(chǎn)的預(yù)期的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的量過(guò)高，使得蛋白質(zhì)沉淀從而形成結(jié)晶或非晶形固體，因?yàn)椴灰讖墓腆w部分中分離而造成了純化中的問(wèn)題?？梢杂糜谠诒景l(fā)明的方法中的蛋白質(zhì)在原則上是與在組氨酸側(cè)鏈的pKa以上的pH值下的溶解度相比，在低于組氨酸側(cè)鏈的pKa的pH值下具有較高溶解度的任何蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，低于組氨酸側(cè)鏈的pKa的pH值是低于組氨酸側(cè)鏈的pKa至少0.1個(gè)pH單位，優(yōu)選地低于至少0.2個(gè)pH單位、優(yōu)選地低于至少0.3個(gè)pH單位、優(yōu)選地低于至少0.4個(gè)pH單位、優(yōu)選地低于至少0.5個(gè)pH單位、優(yōu)選地低于至少0.6個(gè)pH單位、優(yōu)選地低于至少0.7個(gè)pH單位、優(yōu)選地低于至少0.8個(gè)pH單位、優(yōu)選地低于至少0.9個(gè)pH單位、優(yōu)選地低于至少1.0個(gè)pH單位、優(yōu)選地低于至少1.5個(gè)pH單位、優(yōu)選地低于組氨酸側(cè)鏈的pKa值至少2.0個(gè)pH單位。高于組氨酸側(cè)鏈的pKa的pH值是高于組氨酸側(cè)鏈的pKa至少0.1個(gè)pH單位，優(yōu)選地高于至少0.2個(gè)pH單位、優(yōu)選地高于至少0.3個(gè)pH單位、優(yōu)選地高于至少0.4個(gè)pH單位、優(yōu)選地高于至少0.5個(gè)pH單位、優(yōu)選地高于至少0.6個(gè)pH單位、優(yōu)選地高于至少0.7個(gè)pH單位、優(yōu)選地高于至少0.8個(gè)pH單位、優(yōu)選地高于至少0.9個(gè)pH單位、優(yōu)選地高于至少1.0個(gè)pH單位、優(yōu)選地高于至少1.5個(gè)pH單位、優(yōu)選地高于組氨酸側(cè)鏈的pKa值至少2.0個(gè)pH單位。將被理解的是，組氨酸具有三個(gè)pKa值，一個(gè)值針對(duì)羧基基團(tuán)，一個(gè)值針對(duì)吡咯基團(tuán)并且一個(gè)值針對(duì)NH2基團(tuán)。在一種肽(如多肽或蛋白質(zhì))中，羧基基團(tuán)和NH2基團(tuán)中的至少一個(gè)以肽鍵結(jié)合至相鄰的氨基酸上。本說(shuō)明書和權(quán)利要求中的組氨酸側(cè)鏈的pKa旨在表示組氨酸分子的咪唑環(huán)的pKa。在25℃下該咪唑基團(tuán)的pKa大約是6.0。技術(shù)人員將理解的是，該pKa將會(huì)隨條件，如溫度、濃度和溶劑的離子強(qiáng)度而輕微改變。對(duì)于涉及蛋白質(zhì)的純化的本說(shuō)明來(lái)說(shuō)，相關(guān)的條件是引起蛋白質(zhì)的相對(duì)較小的變性的條件，即相對(duì)溫和的條件。在這樣的條件下，出于本發(fā)明的目的可以假定組氨酸側(cè)鏈的pKa為6.0，并且除非另有具體說(shuō)明在本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中進(jìn)行假定。這意味著，在pH低于6.0下的組氨酸(具體是暴露于蛋白質(zhì)的表面上的組氨酸)上的咪唑基團(tuán)，將主要被質(zhì)子化并因此帶正電荷，而在pH高于6.0下的組氨酸(具體是暴露于蛋白質(zhì)的表面上的組氨酸)上的咪唑基，將主要被非質(zhì)子化并因此不帶電荷。針對(duì)游離的組氨酸，組氨酸側(cè)鏈的pKa大約是6.0。針對(duì)組氨酸側(cè)鏈的pKa可受周圍的氨基酸影響，具體針對(duì)位于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的組氨酸。有關(guān)本發(fā)明的組氨酸是位于感興趣的蛋白的表面上的組氨酸，并且因此高度暴露于環(huán)境中，并且因此對(duì)于這些組氨酸的pKa中的變化會(huì)僅僅很小。因此，出于本發(fā)明的目的，針對(duì)組氨酸側(cè)鏈的pKa可被認(rèn)為是6.0獨(dú)立于周圍氨基酸。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，用于在本發(fā)明的方法中使用的這些蛋白質(zhì)是與在pH6.5下的溶解度相比，在pH5.5下具有較高溶解度的蛋白質(zhì)；或是與在pH7.0下的溶解度相比，在pH5.0下具有較高溶解度的蛋白質(zhì)；或是與在pH8.0下的溶解度相比，在pH4.5下具有較高溶解度的蛋白質(zhì)。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)：在其表面處具有2-6個(gè)組氨酸的蛋白質(zhì)在低于組氨酸側(cè)鏈的pKa的pH下典型地具有高溶解度，其中該組氨酸側(cè)鏈或其重要部分是帶正電的，與具有相同序列(除了2-6個(gè)組氨酸之外)的對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)相比。在高于組氨酸側(cè)鏈的pKa的pH值下，該組氨酸側(cè)鏈通常是不帶電的，并且典型地這導(dǎo)致在此pH下的較低的溶解度。具體而言，本發(fā)明涉及在蛋白質(zhì)的表面區(qū)域通過(guò)插入或取代組氨酸殘基而修飾的蛋白質(zhì)，因此經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)在表面上含有2-6個(gè)組氨酸。所述2-6個(gè)組氨酸可內(nèi)在地位于一級(jí)序列，或者它們可以被附接至成熟蛋白質(zhì)的C-末端或N-末端、或它們的任意組合。此類修飾的蛋白質(zhì)在低于組氨酸側(cè)鏈的pKa的pH下具有高溶解度的益處，大概由于在該pH下的組氨酸殘基的正電荷；但在高于組氨酸側(cè)鏈的pKa的pH下經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)將與未經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)具有相同的電荷，并且因此可以準(zhǔn)確地作為未修飾的蛋白質(zhì)使用。蛋白質(zhì)產(chǎn)物在原則上可以是在發(fā)酵過(guò)程中制備的任何蛋白質(zhì)，并且本發(fā)明涉及分離過(guò)程，其中在給定條件下蛋白質(zhì)以高于其溶解度的濃度存在，因此這導(dǎo)致處于結(jié)晶或無(wú)晶型形式的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的沉淀。所述蛋白質(zhì)可以是治療性蛋白質(zhì)或酶。該酶可以是水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶、或轉(zhuǎn)移酶；優(yōu)選地，該感興趣的酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、綠色熒光蛋白、葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。蛋白酶在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶或金屬蛋白酶?？莶輻U菌蛋白酶是一種使用了由Asp32、His64以及Ser221(枯草桿菌蛋白酶BPN'編號(hào))組成的催化三聯(lián)體的絲氨酸蛋白酶?？莶輻U菌蛋白酶可根據(jù)肽酶分類描述為：宗族SB，家族S8，MEROPSID：S08.001?？莶輻U菌蛋白酶描述于例如，Barrett等人，1998，蛋白水解酶手冊(cè)(Handbookofproteolyticenzymes)，學(xué)術(shù)出版社(Academicpress)，289-294頁(yè)中。西埃澤恩(Siezen)和洛因伊森(Leunissen)，蛋白質(zhì)科學(xué)(ProteinScience)，1997，6&501-523提供了枯草桿菌蛋白酶的描述。對(duì)本發(fā)明的和/或用于本發(fā)明用途的蛋白酶的來(lái)源沒(méi)有限制。因此，術(shù)語(yǔ)蛋白酶不僅包括自然或野生型的蛋白酶，還包括展示其蛋白酶活性的任何突變體、變體、片段等等，以及合成的蛋白酶，例如改組的蛋白酶以及共有蛋白酶。這種基因工程蛋白酶可以按照本領(lǐng)域通常已知的制備，例如通過(guò)定點(diǎn)誘變，通過(guò)PCR(在PCR反應(yīng)中，使用含有所希望的突變的PCR片段作為引物之一)，或者通過(guò)隨機(jī)誘變。共有蛋白的制備在例如EP897985中描述。用于在本發(fā)明中使用的蛋白酶的實(shí)例包括野生型蛋白酶(如具有SEQIDNO:2(Savinase)或SEQIDNO:25(BPN’)的氨基酸序列的蛋白酶)或蛋白酶變體(如具有SEQIDFNO:1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的Savinase變體)。用于在本發(fā)明中使用的優(yōu)選的蛋白酶是與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:25中的一個(gè)具有至少80％序列一致性，例如至少90％序列一致性、例如至少95％序列一致性、例如至少96％序列一致性、例如至少97％序列一致性、例如至少98％序列一致性、例如至少99％序列一致性的蛋白酶。淀粉酶適合的淀粉酶(a和/或β)包括細(xì)菌來(lái)源的那些。包括化學(xué)修飾的變體或蛋白質(zhì)工程變體。淀粉酶包括例如從芽孢桿菌屬(Bacillus)，例如GB1,296,839中更詳細(xì)描述的地衣芽孢桿菌(B.Licheniformis)的α菌株獲得的α-淀粉酶。纖維素酶適合的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌來(lái)源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程的突變體(包括取代、插入和/或缺失)。適合的纖維素酶包括來(lái)自芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、鐮孢屬(Fusarium)、梭孢殼屬(Thielavia)、枝頂孢霉屬(Acremonium)的纖維素酶，例如由在US4,435,307、US5,648,263、US5,691,178、US5,776,757以及WO89/09259中公開(kāi)的特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、嗜熱毀絲霉(myceliophthorathermophila)和尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)產(chǎn)生的真菌纖維素酶。脂肪酶適合的脂酶包括含有蛋白質(zhì)工程化的突變體(包括取代、插入和/或缺失)的細(xì)菌或真菌來(lái)源的那些。適合的脂肪酶包括來(lái)自腐質(zhì)霉屬和根毛霉屬的脂肪酶，例如產(chǎn)自柔毛腐質(zhì)霉(Humocolalanuginose)和米黑根毛霉(Rhizomucormihei)的真菌脂肪酶。氧化還原酶根據(jù)本發(fā)明處理的氧化還原酶包括過(guò)氧化物酶(EC1.11.1.7)和氧化酶，如漆酶和過(guò)氧化氫酶(EC1.11.1.6)。溶菌酶在此將術(shù)語(yǔ)“溶菌酶”活性定義為一種催化兩個(gè)或更多個(gè)碳水化合物之間、或碳水化合物與非碳水化合物部分之間的糖苷鍵的水解的O-糖基水解酶。溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的黏多糖和黏肽中的某些殘基之間的糖苷鍵，例如在肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸與N-乙?；?D-葡糖胺殘基之間以及在殼糊精中的N-乙?；?D-葡糖胺殘基之間的1,4-β-鍵，這導(dǎo)致溶菌作用。溶菌酶屬于EC3.2.1.17酶類。用于在本發(fā)明中使用的溶菌酶的實(shí)例包括披露于WO2003/076253中的溶菌酶。用于在本發(fā)明中使用的優(yōu)選的溶菌酶是與SEQIDNO:18具有至少80％序列一致性，例如至少90％序列一致性、例如至少95％序列一致性、例如至少96％序列一致性、例如至少97％序列一致性、例如至少98％序列一致性、例如至少99％序列一致性的溶菌酶。發(fā)酵液中的在發(fā)酵過(guò)程結(jié)束時(shí)的pH和低pH被選擇，使得感興趣的蛋白質(zhì)的凈電荷在發(fā)酵結(jié)束時(shí)的pH和低pH值之間變化。確保這一點(diǎn)的一種優(yōu)選的方法是選擇具有2-6個(gè)氨基酸(具有位于感興趣的蛋白質(zhì)的表面上的在發(fā)酵結(jié)束時(shí)的pH值和低pH值之間的pKa值)的感興趣的蛋白質(zhì)。氨基酸殘基(在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)具有采用常用的宿主細(xì)胞的pH耐受性和感興趣的蛋白質(zhì)的pH穩(wěn)定性的pKa值)的優(yōu)選實(shí)例可以舉出具有約6.0的側(cè)鏈的pKa的組氨酸。在發(fā)酵液中的發(fā)酵結(jié)束時(shí)的pH可取決于幾個(gè)參數(shù)，如宿主生物、發(fā)酵培養(yǎng)基的成分、供氧、過(guò)程期間pH調(diào)節(jié)的延伸以及一般來(lái)說(shuō)發(fā)酵過(guò)程下的條件。然而，典型的工業(yè)發(fā)酵過(guò)程是pH調(diào)節(jié)的，并且在發(fā)酵結(jié)束時(shí)的pH由施加到具體過(guò)程的pH調(diào)節(jié)來(lái)確定。用于根據(jù)本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)可以是天然的蛋白，理解為與在自然界中天然發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)具有相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或者它可以是工程化的蛋白質(zhì)，其中氨基酸序列已經(jīng)被人類改變，其結(jié)果是具有這樣的氨基酸序列的蛋白質(zhì)沒(méi)有在自然界天然發(fā)現(xiàn)。用于本發(fā)明的方法中使用的一類優(yōu)選的這樣的蛋白質(zhì)是具有位于蛋白質(zhì)的表面上的2-6個(gè)組氨酸殘基的蛋白質(zhì)。此類蛋白質(zhì)可以是天然蛋白或者可以被工程化，例如工程化以在其表面上包含2-6個(gè)組氨酸。位于表面上的2-6個(gè)組氨酸殘基可以內(nèi)部位于蛋白質(zhì)的一級(jí)氨基酸序列中或者它們可以位于蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一端或另一端，或者它甚至可以是其組合。用于本發(fā)明的方法中使用的一類優(yōu)選的工程化的蛋白質(zhì)是具有附接至N-末端或C-末端或蛋白質(zhì)的His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。在本申請(qǐng)中，His-標(biāo)簽意在是指包含2-6個(gè)相鄰的組氨酸殘基的氨基酸的一小段。該His標(biāo)簽可包含蛋白酶切割位點(diǎn)，該位點(diǎn)允許在純化包括his-標(biāo)簽的蛋白之后移除his-標(biāo)簽，并由此獲得沒(méi)有任何his標(biāo)簽殘基的蛋白質(zhì)。用于在本發(fā)明的方法中使用的其他工程化蛋白質(zhì)和酶被工程化以在一級(jí)氨基酸序列內(nèi)部和位于該蛋白質(zhì)的表面上包含2-6個(gè)組氨酸。此類蛋白質(zhì)可按在歐洲專利局提交并命名為“酶變體及其多核苷酸編碼”(通過(guò)引用包括在本文中)的共同待審的申請(qǐng)?zhí)?4162434.6中所描述的被設(shè)計(jì)，并且其傳授內(nèi)容也應(yīng)用于本說(shuō)明書和權(quán)利要求中。一般在發(fā)酵過(guò)程中的pH在過(guò)程期間被控制以獲得最佳產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量。這在本領(lǐng)域中是熟知的。使用具有位于表面上的2-6個(gè)組氨酸的蛋白質(zhì)可提供具體的益處使得通過(guò)控制pH影響感興趣的蛋白的溶解度是可能的。因此可以通過(guò)降低pH至低于組氨酸側(cè)鏈的pKa的pH值來(lái)增加溶解度，并可以通過(guò)升高pH至高于組氨酸側(cè)鏈的pKa的pH值來(lái)降低溶解度。這對(duì)于提供易感于蛋白酶降解的意向產(chǎn)物和此外提供結(jié)束發(fā)酵液的蛋白酶的發(fā)酵具有特別的益處。這種情況可以有益于在感興趣的蛋白質(zhì)在發(fā)酵期間沉淀于其中的條件下進(jìn)行該過(guò)程，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)一般在固體狀態(tài)較少易感于蛋白酶降解，并且為了從固體部分分離意向蛋白質(zhì)，在純化期間溶解蛋白質(zhì)。已知的是，許多微生物在發(fā)酵期間生產(chǎn)蛋白酶，無(wú)論是作為意向產(chǎn)物、作為副活性或作為一些細(xì)胞的裂解的結(jié)果，這些全部可以導(dǎo)致感興趣的意向蛋白質(zhì)的某些降解，并從而導(dǎo)致產(chǎn)品的損失或產(chǎn)品質(zhì)量的降低。具體而言，在蛋白酶生產(chǎn)的發(fā)酵中所產(chǎn)生的蛋白酶會(huì)降解存在的蛋白質(zhì)，被稱為蛋白質(zhì)自水解，并且因此其可以有利于發(fā)酵期間蛋白酶沉淀于其中的條件下的蛋白酶發(fā)酵過(guò)程，并由此保護(hù)對(duì)抗蛋白質(zhì)自水解，并且隨后的蛋白質(zhì)在純化期間再增溶，在純化中使用適合的分離技術(shù)從固體分離該產(chǎn)物。這可根據(jù)本發(fā)明在至少一部分純化期間通過(guò)在pH6.0以上和低于pH6.0的pH的發(fā)酵來(lái)完成。發(fā)酵可以例如在pH6.0以上、例如6.2以上、例如6.5以上、例如7.0以上來(lái)進(jìn)行并且至少一部分純化可以在pH低于5.8、例如低于5.5、例如低于5.0下來(lái)進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，蛋白質(zhì)產(chǎn)物通過(guò)工程化微生物來(lái)生產(chǎn)，該微生物被工程化以包含編碼感興趣的基因的一個(gè)或多個(gè)基因和編碼感興趣的基因的修飾變體的一個(gè)或多個(gè)基因，被修飾以使所編碼的蛋白質(zhì)在一級(jí)氨基酸序列的內(nèi)部和位于該蛋白質(zhì)的表面上包含2-6個(gè)組氨酸，或附接至蛋白質(zhì)的N-末端和/或C-末端的2-6個(gè)組氨酸的His-標(biāo)簽；并且其中感興趣的一個(gè)或多個(gè)基因和感興趣的一個(gè)或多個(gè)修飾的基因在微生物的發(fā)酵期間被全部表達(dá)。已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，由這種工程化的微生物生產(chǎn)的感興趣的蛋白質(zhì)與對(duì)應(yīng)的不具有感興趣的修飾的基因的微生物相比具有更高的溶解度，并且還有通過(guò)改變pH低于6.0，感興趣的沉淀的蛋白質(zhì)是容易溶解的。在工程化的微生物中的感興趣的基因和感興趣的修飾的基因的拷貝數(shù)可在1-20的范圍內(nèi)，如1-10，如1-5。感興趣的基因的拷貝數(shù)可以與或可以不與感興趣的修飾的基因的拷貝數(shù)相同。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，感興趣的修飾的基因的拷貝數(shù)是1并且感興趣的基因的拷貝數(shù)是1、2、3、4、5、6、7或8，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中感興趣的修飾的基因的拷貝數(shù)是2并且感興趣的基因的拷貝數(shù)是1、2、3、4、5、6、7或8。多核苷酸本發(fā)明還涉及如在此描述的編碼多肽的分離的多核苷酸。用于分離或克隆多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的并且包括從基因組DNA或cDNA、或其組合進(jìn)行分離。可以例如通過(guò)使用熟知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選來(lái)檢測(cè)具有共有結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段，實(shí)現(xiàn)從基因組DNA克隆多核苷酸。參見(jiàn)例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和應(yīng)用指南(PCR:AGuidetoMethodsandApplication)，學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress)，紐約?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增程序例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接激活轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于多核苷酸的擴(kuò)增(NASBA)。編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸的修飾對(duì)于合成實(shí)質(zhì)上類似于該多肽的多肽可能是必需的。術(shù)語(yǔ)“基本上類似”于該多肽是指該多肽的非天然發(fā)生的形式。這些多肽可能以某種工程化方式而不同于從其天然來(lái)源分離的多肽，例如在比活性、熱穩(wěn)定性、最適pH等方面不同的變體。這些變體可以基于以成熟多肽編碼序列呈現(xiàn)的多核苷酸(該成熟多肽編碼序列不會(huì)導(dǎo)致該多肽的氨基酸序列中的改變，但對(duì)應(yīng)于預(yù)定用于產(chǎn)生該酶的宿主有機(jī)體的密碼子用法)，或通過(guò)引入可以產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代來(lái)構(gòu)建。對(duì)于核苷酸取代的一般描述，參見(jiàn)例如福德(Ford)等人，1991，蛋白質(zhì)表達(dá)與純化(ProteinExpressionandPurification)2:95-107。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，這些核酸構(gòu)建體包括可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)控制序列的本發(fā)明的多核苷酸，在與控制序列相容的條件下，這些控制序列指導(dǎo)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。該多核苷酸可以按多種方式操縱，以提供該多肽的表達(dá)。取決于表達(dá)載體，在多核苷酸插入載體之前對(duì)其進(jìn)行操縱可以是令人希望的或必需的。用于利用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。該控制序列可以是啟動(dòng)子，即，被宿主細(xì)胞識(shí)別以對(duì)編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸進(jìn)行表達(dá)的多核苷酸。該啟動(dòng)子包含轉(zhuǎn)錄控制序列，這些序列介導(dǎo)了該多肽的表達(dá)。該啟動(dòng)子可以是在宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變型、截短型及雜合型啟動(dòng)子，并且可以是由編碼與該宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從以下基因中獲得的啟動(dòng)子：解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、蘇云金芽孢桿菌cryIIIA基因(阿蓋塞(Agaisse)和勒爾克呂(Lereclus)，1994，分子微生物學(xué)(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大腸桿菌lac操縱子、大腸桿菌trc啟動(dòng)子(埃貢(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天藍(lán)鏈霉菌瓊脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-內(nèi)酰胺酶基因(維拉-卡馬洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac啟動(dòng)子(德波爾(DeBoer)等人，1983，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊80:21-25)。其他啟動(dòng)子描述在吉爾伯特(Gilbert)等人，1980，科學(xué)美國(guó)人(ScientificAmerican)242:74-94的“來(lái)自重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)(Usefulproteinsfromrecombinantbacteria)”；以及在薩姆布魯克(Sambrook)等人，1989，同上。串聯(lián)啟動(dòng)子的實(shí)例披露在WO99/43835中。在絲狀真菌宿主細(xì)胞中，用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是獲得自以下各項(xiàng)的基因的啟動(dòng)子：構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢胰蛋白酶–樣蛋白酶(WO96/00787)、鑲片鐮孢菌淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、鑲片鐮孢菌Daria(達(dá)莉亞)(WO00/56900)、鑲片鐮孢菌Quinn(奎恩)(WO00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻譯延伸因子，連同NA2tpi啟動(dòng)子(來(lái)自編碼中性α-淀粉酶的曲霉屬基因的修飾的啟動(dòng)子，其中已經(jīng)用來(lái)自編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的曲霉屬基因的未翻譯的前導(dǎo)子替換未翻譯的前導(dǎo)子；非限制性實(shí)例包括來(lái)自編碼中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修飾的啟動(dòng)子，其中已經(jīng)用來(lái)自編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的構(gòu)巢曲霉或米曲霉基因的未翻譯的前導(dǎo)子替換未翻譯的前導(dǎo)子)；及其變異體、截短型及雜合型啟動(dòng)子。其他啟動(dòng)子在美國(guó)專利號(hào)6,011,147中描述。在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子獲得自以下各項(xiàng)的基因：釀酒酵母烯醇酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇去氫酶/甘油醛-3-磷酸去氫酶(ADH1、ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)、以及釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。羅馬諾斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主細(xì)胞的其他有用的啟動(dòng)子?？刂菩蛄羞€可以是由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止子。該終止子可操作地連接到編碼該多肽的多核苷酸的3'末端。在該宿主細(xì)胞中起作用的任何終止子都可以用于本發(fā)明中。用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(amyL)以及大腸桿菌核糖體RNA(rrnB)的基因獲得。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從以下各項(xiàng)的基因獲得：構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻譯延長(zhǎng)因子。用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYC1)、以及釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因獲得。用于酵母宿主細(xì)胞的其他有用的終止子由羅馬諾斯(Romanos)等人，1992，見(jiàn)上文描述。該控制序列還可以是在啟動(dòng)子下游并且在基因編碼序列上游的mRNA穩(wěn)定子區(qū)域，它增加該基因的表達(dá)。適合的mRNA穩(wěn)定子區(qū)的實(shí)例是從以下獲得的：蘇云金芽孢桿菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢桿菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，細(xì)菌學(xué)雜志(JournalofBacteriology)177:3465-3471)。該控制序列還可以是前導(dǎo)子，一種對(duì)宿主細(xì)胞翻譯很重要的非翻譯mRNA區(qū)域。該前導(dǎo)子可操作地連接到編碼該多肽的多核苷酸的5'末端。在宿主細(xì)胞中起作用的任何前導(dǎo)子都可以使用。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)子是從米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因獲得。酵母宿主細(xì)胞的適合的前導(dǎo)子是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的：釀酒酵母烯醇酶(ENO-1)、釀酒酵母3磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子、和釀酒酵母醇去氫酶/甘油醛-3磷酸去氫酶(ADH2/GAP)。控制序列還可以是一種多腺苷酸化序列，可操作地連接至該多核苷酸的3’-末端并且當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)由宿主細(xì)胞識(shí)別為將聚腺苷酸殘基添加至所轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號(hào)的序列。可以使用在宿主細(xì)胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選多腺苷酸化序列是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的：構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的多腺苷酸化序列在郭(Guo)和謝爾曼(Sherman)，1995，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.CellularBiol.)15:5983-5990中得以描述?？刂菩蛄羞€可以是編碼連接至多肽的N-末端的信號(hào)肽并指導(dǎo)該多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑的信號(hào)肽編碼區(qū)域。多核苷酸的編碼序列的5’端本身可包含在翻譯閱讀框中天然與編碼多肽的編碼序列區(qū)段相連接的信號(hào)肽編碼序列。可替代地，該編碼序列的5’末端可以包含對(duì)于該編碼序列來(lái)說(shuō)是外來(lái)的信號(hào)肽編碼序列。在編碼序列不天然地包含信號(hào)肽編碼序列的情況下，可能需要外源信號(hào)肽編碼序列。可替代地，外源信號(hào)肽編碼序列可簡(jiǎn)單地替換天然的信號(hào)肽編碼序列以便增強(qiáng)該多肽的分泌。然而，可以使用指導(dǎo)所表達(dá)多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌通路的任何信號(hào)肽編碼序列。用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼序列是從以下各項(xiàng)的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列：芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢桿菌prsA。西蒙納(Simonen)和帕爾瓦(Palva)，1993，微生物學(xué)評(píng)論(MicrobiologicalReviews)57:109-137描述了另外的信號(hào)肽。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼序列是獲得自以下各項(xiàng)的基因的信號(hào)肽編碼序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、柔毛腐質(zhì)霉脂肪酶以及米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的信號(hào)肽獲得自以下項(xiàng)的基因：釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶。羅馬諾斯(Romanos)等人，1992，見(jiàn)上文，描述了其他有用的信號(hào)肽編碼序列?？刂菩蛄羞€可以是編碼位于多肽的N-末端的前肽的前肽編碼序列。生成的多肽被稱為前體酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情況下被稱為酶原(zymogen))。多肽原通常是無(wú)活性的并且可以通過(guò)從該多肽原上催化切割或自動(dòng)催化切割前肽而被轉(zhuǎn)化成一種活性多肽。前肽編碼序列可以從以下各項(xiàng)的基因獲得：枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及釀酒酵母α-因子。在信號(hào)肽序列和前肽序列二者都存在的情況下，該前肽序列定位成緊鄰多肽的N末端并且該信號(hào)肽序列定位成緊鄰該前肽序列的N末端。還可以希望添加調(diào)節(jié)序列，這些調(diào)節(jié)序列相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)控序列的實(shí)例是使得基因的表達(dá)響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)控化合物的存在)而開(kāi)啟或關(guān)閉的那些序列。原核系統(tǒng)中的調(diào)控序列包括lac、tac以及trp操縱子系統(tǒng)。調(diào)節(jié)序列的其他實(shí)例是允許基因擴(kuò)增的那些。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、米曲霉TAKAα-淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、里氏木霉纖維二糖水解酶I啟動(dòng)子以及里氏木霉纖維二糖水解酶II啟動(dòng)子。調(diào)控序列的其他實(shí)例是允許基因擴(kuò)增的那些。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)控序列包括在甲氨蝶呤存在下被擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因以及用重金屬擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況中，編碼多肽的多核苷酸將與調(diào)控序列可操作地連接。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動(dòng)子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)的重組表達(dá)載體。不同的核苷酸和控制序列可以連接在一起以產(chǎn)生一個(gè)重組表達(dá)載體，這一重組表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)便利的限制酶切位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)處插入或取代編碼該變體的多核苷酸?？商娲?，該多核苷酸可以通過(guò)將該多核苷酸或包括該多核苷酸的核酸構(gòu)建體插入用于表達(dá)的適當(dāng)載體中來(lái)表達(dá)。在產(chǎn)生該表達(dá)載體時(shí)，該編碼序列是位于該載體中，這樣使得該編碼序列與該供表達(dá)的適當(dāng)控制序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA程序，并且能夠引起多核苷酸的表達(dá)。載體的選擇將典型地取決于該載體與有待引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。該載體可以是一種線性的或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。該載體可以是一種自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體存在的載體，該載體的復(fù)制與染色體復(fù)制無(wú)關(guān)，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。該載體可以包含用于確保自我復(fù)制任何裝置?？商娲兀撦d體可以是這樣一種載體，當(dāng)它被引入該宿主細(xì)胞中時(shí)，被整合到基因組中并且與其中已整合了它的一個(gè)或多個(gè)染色體一起復(fù)制。此外，可以使用單一載體或質(zhì)粒或兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒(這些載體或質(zhì)粒共同含有待引入宿主細(xì)胞的基因組中的總DNA)或轉(zhuǎn)座子。該載體優(yōu)選包含允許方便地選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞等細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是這樣一種基因，該基因的產(chǎn)物提供了殺生物劑抗性或病毒抗性、重金屬抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等。細(xì)菌性選擇性標(biāo)記的實(shí)例是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌dal基因，或賦予抗生素抗性(如氨比西林、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素或四環(huán)素抗性)的標(biāo)記。用于酵母宿主細(xì)胞的適合的標(biāo)記包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用的選擇性標(biāo)記包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶)、以及trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)、連同其等效物。優(yōu)選在曲霉屬細(xì)胞中使用的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因。優(yōu)選在木霉屬細(xì)胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。載體優(yōu)選地包含允許該載體整合到宿主細(xì)胞的基因組或允許該載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組而自主復(fù)制的一個(gè)或多個(gè)元件。對(duì)于整合到該宿主細(xì)胞基因組中，該載體可以依靠編碼該多肽的多核苷酸序列或者用于通過(guò)同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他元件。可替代地，該載體可以包含用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組而整合到宿主細(xì)胞基因組中的一個(gè)或多個(gè)染色體中的一個(gè)或多個(gè)精確位置處的另外的多核苷酸。為了增加在精確位置處整合的可能性，這些整合的元件應(yīng)包含足夠數(shù)量的核酸，例如100至10,000個(gè)堿基對(duì)、400至10,000個(gè)堿基對(duì)、以及800至10,000個(gè)堿基對(duì)，這些堿基對(duì)與對(duì)應(yīng)的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重組的可能性。這些整合元件可以是與宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)的靶序列同源的任何序列。此外，這些整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。另一方面，該載體可以通過(guò)非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。對(duì)于自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含使該載體能夠在所討論的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可以是在細(xì)胞中起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語(yǔ)“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”意指使得質(zhì)?；蜉d體可在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，以及允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的復(fù)制起點(diǎn)。用于在酵母宿主細(xì)胞中使用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)ARS1、ARS4、ARS1與CEN3的組合以及ARS4與CEN6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡倫(Cullen)等人，1987，核酸研究(NucleicAcidsRes.)15:9163-9175；WO00/24883)。AMA1基因的分離和包含該基因的質(zhì)?；蜉d體的構(gòu)建可以根據(jù)披露于WO00/24883中的方法來(lái)完成。可以將本發(fā)明的多核苷酸的多于一個(gè)拷貝插入宿主細(xì)胞中以增加多肽的產(chǎn)生。通過(guò)將序列的至少一個(gè)另外的拷貝整合到宿主細(xì)胞基因組中或者通過(guò)包含與該多核苷酸一起的可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因可以獲得多核苷酸的增加的拷貝數(shù)目，其中通過(guò)在適當(dāng)?shù)倪x擇性試劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞可以選擇包含選擇性標(biāo)記基因的經(jīng)擴(kuò)增的拷貝的細(xì)胞、以及由此該多核苷酸的另外的拷貝。用于連接以上所描述的元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的程序是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的(參見(jiàn)，例如，薩姆布魯克(Sambrook)等人，1989，同上)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，這些重組宿主細(xì)胞包括本發(fā)明的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)控制序列，該一個(gè)或多個(gè)控制序列指導(dǎo)本發(fā)明的多肽的產(chǎn)生。將包括多核苷酸的構(gòu)建體或載體引入宿主細(xì)胞中，這樣使得該構(gòu)建體或載體被維持作為染色體整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體，如早前所述。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上取決于編碼該多肽的基因及其來(lái)源。宿主細(xì)胞可以是有用于重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的任何細(xì)胞，例如原核細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括但不限于芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、土芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、以及鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于：彎曲桿菌屬、大腸桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、以及脲原體屬。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞，包括但不局限于嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)硬芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、以及蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞，包括但不限于似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌以及馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞，包括但不局限于不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌、以及淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。將DNA引入芽孢桿菌屬細(xì)胞中可通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)例如，張(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遺傳學(xué)與基因組學(xué)(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)例如，楊格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大衛(wèi)杜夫-阿貝爾森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、電穿孔(參見(jiàn)例如，茂川(Shigekawa)和道爾(Dower)，1988，生物技術(shù)(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(參見(jiàn)例如，克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，細(xì)菌學(xué)雜志169:5271-5278)。將DNA引入大腸桿菌細(xì)胞中可通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)例如，哈納汗(Hanahan)，1983，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或電穿孔(參見(jiàn)例如，道爾(Dower)等人，1988，核酸研究(NucleicAcidsRes.)16:6127-6145)。將DNA引入鏈霉菌屬細(xì)胞中可通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔(參見(jiàn)例如，貢(Gong)等人，2004，葉線形微生物學(xué)(FoliaMicrobiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(參見(jiàn)例如，馬佐迪耶(Mazodier)等人，1989，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見(jiàn)例如，伯克(Burke)等人，2001，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。將DNA引入假單孢菌屬細(xì)胞中可通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)：電穿孔(參見(jiàn)例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物學(xué)方法雜志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(參見(jiàn)例如，皮內(nèi)多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。將DNA引入鏈球菌屬細(xì)胞中可通過(guò)以下來(lái)實(shí)現(xiàn)：天然感受態(tài)(參見(jiàn)，例如，佩里(Perry)和藏滿(Kuramitsu)，1981，感染與免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如，凱特(Catt)和喬力克(Jollick)，1991，微生物學(xué)(Microbios)68:189-207)、電穿孔(參見(jiàn)，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(參見(jiàn)，例如，克萊威爾(Clewell)，1981，微生物學(xué)評(píng)論(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本領(lǐng)域已知的用于將DNA引入宿主細(xì)胞中的任何方法。宿主細(xì)胞還可以是真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物、或真菌細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是真菌細(xì)胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、以及接合菌門(Zygomycota)、連同卵菌門(Oomycota)和全部有絲分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌詞典(AinsworthandBisby’sDictionaryofTheFungi)，第8版，1995，國(guó)際應(yīng)用生物科學(xué)中心(CABInternational)，大學(xué)出版社(UniversityPress)，英國(guó)劍橋(Cambridge，UK)中進(jìn)行定義的)。該真菌宿主細(xì)胞可以是酵母細(xì)胞。如在此使用的“酵母”包括產(chǎn)子嚢酵母(內(nèi)孢霉目)、產(chǎn)擔(dān)子酵母和屬于半知菌類(芽孢綱)的酵母。由于酵母的分類在將來(lái)可能有變化，出于本發(fā)明的目的，酵母應(yīng)如酵母生物學(xué)和活動(dòng)性(BiologyandActivitiesofYeast)(斯金納(Skinner)、帕斯莫爾(Passmore)、以及達(dá)文波特(Davenport)編輯，應(yīng)用細(xì)菌學(xué)學(xué)會(huì)討論會(huì)(Soc.App.Bacteriol.Symposium)系列第9期，1980)所述地進(jìn)行定義。酵母宿主細(xì)胞可以是假絲酵母屬、漢遜酵母屬、克魯弗酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、或耶氏酵母屬細(xì)胞，如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)細(xì)胞。真菌宿主細(xì)胞可以是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，見(jiàn)上文所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、以及其他復(fù)雜多糖構(gòu)成的菌絲體壁。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)菌絲延長(zhǎng)，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母(如釀酒酵母)的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)單細(xì)胞菌體的出芽(budding)，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬臘菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、線黑粉菌科(Filibasidium)、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新美鞭菌屬、鏈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細(xì)胞。例如，絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)、干擬蠟菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡內(nèi)基擬蠟菌(Ceriporiopsiscaregiea)、淺黃擬蠟孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘諾希塔擬蠟菌(Ceriporiopsispannocinta)、環(huán)帶擬蠟菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微紅擬蠟菌(Ceriporiopsissubrufa)、蟲擬蠟菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狹邊金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角質(zhì)金孢子菌、盧克諾文思金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、糞狀金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、熱帶金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、桿孢狀鐮孢、谷類鐮孢、庫(kù)威鐮孢、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙鏈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脈菌(Phlebiaradiata)、刺芹側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢殼霉、長(zhǎng)域毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉、或綠色木霉細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、以及以本身已知的方式進(jìn)行細(xì)胞壁再生的一個(gè)過(guò)程來(lái)轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的適合程序在EP238023和約爾頓(Yelton)等人，1984，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474以及科里蒂森(Christensen)等人，1988，生物/技術(shù)(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬物種的適合方法由馬拉迪爾(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO96/00787描述。酵母可以使用以下各文獻(xiàn)中所描述的程序轉(zhuǎn)化：貝克爾(Becker)和古倫特(Guarente)，在艾本爾森，J.N.(Abelson,J.N.)和塞蒙，M.I.(Simon,M.I.)編輯，酵母遺傳學(xué)與分子生物學(xué)指南(GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology)，酶學(xué)方法(MethodsinEnzymology)，第194卷，第182-187頁(yè)，學(xué)術(shù)出版社有限公司(AcademicPress,Inc.)，紐約；埃托(Ito)等人，1983，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)153:163；及辛倫(Hinnen)等人，1978，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。生產(chǎn)方法本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，這些方法包括(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞；并且可任選地，(b)回收該多肽。這些宿主細(xì)胞是在適合于使用本領(lǐng)域中已知的方法產(chǎn)生該多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。例如，可以通過(guò)在適合的培養(yǎng)基中和在允許表達(dá)和/或分離該多肽的條件下，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，或者在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)，分批，分批補(bǔ)料，或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。該培養(yǎng)是使用本領(lǐng)域中已知的程序，在適合的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)生，該培養(yǎng)基包含碳源和氮源及無(wú)機(jī)鹽。適合的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開(kāi)的組成(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。如果多肽分泌到該營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，那么可直接從培養(yǎng)基中回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可從細(xì)胞裂解液中進(jìn)行回收?？梢允褂锰禺愋葬槍?duì)該多肽的本領(lǐng)域已知的方法來(lái)檢測(cè)該多肽。這些檢測(cè)方法包括但不限于，特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶測(cè)定來(lái)確定該多肽的活性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法來(lái)回收多肽。例如，該多肽可以通過(guò)常規(guī)程序，包括但不限于，收集、離心、過(guò)濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀，從該營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基回收。在一方面，回收包含該多肽的發(fā)酵液?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域中已知的多種程序來(lái)純化該多肽以獲得基本上純的多肽，這些程序包括但不限于：色譜法(例如，離子交換色譜、親和色譜、疏水作用色譜、色譜聚焦、以及尺寸排阻色譜)、電泳程序(例如，制備型等電點(diǎn)聚焦)、差別溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或提取(參見(jiàn)例如，蛋白純化(ProteinPurification)，詹森(Janson)和賴登(Ryden)編輯，VCH出版社(VCHPublishers)，紐約，1989)。在一個(gè)替代性方面中，該多肽未被回收，而是使用表達(dá)該多肽的本發(fā)明的宿主細(xì)胞作為該多肽來(lái)源。發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物。發(fā)酵液產(chǎn)物進(jìn)一步包含在發(fā)酵過(guò)程中使用的另外的成分，例如像，細(xì)胞(包括含有編碼本發(fā)明的多肽的基因的宿主細(xì)胞，這些宿主細(xì)胞被用于產(chǎn)生感興趣的多肽)、細(xì)胞碎片、生物質(zhì)、發(fā)酵介質(zhì)和/或發(fā)酵產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，該組合物是含有一種或多種有機(jī)酸、殺死的細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片以及培養(yǎng)基的細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵液”是指由細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)生、不經(jīng)歷或經(jīng)歷最低限的回收和/或純化的制劑。例如，當(dāng)微生物培養(yǎng)物生長(zhǎng)至飽和，在碳限制條件下孵育以允許蛋白質(zhì)合成(例如，由宿主細(xì)胞進(jìn)行酶的表達(dá))并且分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中時(shí)，產(chǎn)生發(fā)酵液。發(fā)酵液可以包含在發(fā)酵結(jié)束時(shí)得到的發(fā)酵材料的未分級(jí)的或分級(jí)的內(nèi)容物。典型地，發(fā)酵液是未分級(jí)的并且包括在例如通過(guò)離心除去微生物細(xì)胞(例如，絲狀真菌細(xì)胞)后存在的耗盡的培養(yǎng)基和細(xì)胞碎片。在一些實(shí)施例中，發(fā)酵液包含用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)基、胞外酶、以及有活力的和/或無(wú)活力的微生物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，該發(fā)酵液配制品和細(xì)胞組合物包括一種第一有機(jī)酸組分(包括至少一種1-5碳的有機(jī)酸和/或其鹽)以及一種第二有機(jī)酸組分(包括至少一種6碳或更多碳的有機(jī)酸和/或其鹽)。在一個(gè)具體實(shí)施例中，該第一有機(jī)酸組分是乙酸、甲酸、丙酸、其鹽，或前述酸中的兩種或更多種的混合物；并且該第二有機(jī)酸組分是苯甲酸、環(huán)己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其鹽，或前述酸中的兩種或更多種的混合物。在一方面，該組合物包含一種或多種有機(jī)酸，并且任選地進(jìn)一步包含殺死的細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片。在一個(gè)實(shí)施例中，從細(xì)胞殺死全培養(yǎng)液中去除這些殺死的細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片，以提供不含這些組分的組合物。這些發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物可以進(jìn)一步包括防腐劑和/或抗微生物(例如，抑菌)劑，包括但不限于山梨醇、氯化鈉、山梨酸鉀、以及本領(lǐng)域中已知的其他試劑。細(xì)胞殺死全培養(yǎng)液或組合物可以含有在發(fā)酵結(jié)束時(shí)衍生的發(fā)酵材料的未分級(jí)的內(nèi)容物。典型地，該細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液或組合物包含用過(guò)的培養(yǎng)基以及在微生物細(xì)胞(例如，絲狀真菌細(xì)胞)生長(zhǎng)至飽和、在碳限制條件下孵育以允許蛋白合成之后存在的細(xì)胞碎片。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞殺死全培養(yǎng)液或組合物含有耗盡的細(xì)胞培養(yǎng)基、胞外酶、和殺死的絲狀真菌細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，可以使用本領(lǐng)域已知方法來(lái)使細(xì)胞殺死全培養(yǎng)液或組合物中存在的微生物細(xì)胞透性化和/或裂解。在此描述的全培養(yǎng)液或細(xì)胞組合物典型地是液體，但是可以含有不溶組分，例如殺死的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基組分、和/或一種或多種不溶性酶。在一些實(shí)施例中，可以除去不溶性組分以提供澄清的液體組合物?？梢酝ㄟ^(guò)WO90/15861或WO2010/096673所述的方法產(chǎn)生本發(fā)明的全培養(yǎng)液配制品和細(xì)胞組合物。發(fā)酵液根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵液包含產(chǎn)生感興趣的蛋白質(zhì)的細(xì)胞，且感興趣的蛋白質(zhì)部分地作為晶體和/或非晶形沉淀存在?？墒褂萌魏伪绢I(lǐng)域中已知的細(xì)胞。所述細(xì)胞可為微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的微生物可為任何屬的微生物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，感興趣的蛋白質(zhì)可從細(xì)菌或真菌來(lái)源獲得。例如，感興趣的蛋白質(zhì)可以從革蘭氏陽(yáng)性菌獲得，如芽孢桿菌菌株，例如嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、或蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌屬菌株，例如變鉛青鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；或從革蘭氏陰性細(xì)菌獲得，例如大腸桿菌或假單胞菌菌屬。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該細(xì)胞是芽孢桿菌屬細(xì)胞。感興趣的蛋白質(zhì)可以從真菌來(lái)源獲得，例如酵母菌株，如假絲酵母、克魯維酵母、畢赤酵母、酵母屬、裂殖酵母，或亞羅酵母屬(Yarrowia)菌株，例如卡爾斯伯酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母菌株。感興趣的蛋白質(zhì)可以從絲狀真菌菌株獲得，如枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、網(wǎng)孢菌屬(Filobasidium)、鐮孢屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、梨抱菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、裂糟菌屬(Schizoptyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)或木霉屬(Trichoderma)菌株，具體地該感興趣的多肽可以從以下獲得：棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、桿孢狀鐮孢(Fusariumbactridioides)、禾谷鐮孢(Fusariumcerealis)、克地鐮刀菌(Fusariumcrookwellense)、黃色鐮孢菌(Fusariumculmorum)、禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、Fusariumgraminum、異孢鐮孢(Fusariumheterosporum)、合歡木鐮孢(Fusariumnegundi)、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)、多枝鐮孢(Fusariumreticulatum)、粉紅鐮孢(Fusariumroseum)、接骨木鐮孢(Fusariumsambucinum)、Fusariumsarcochroum、擬枝孢鐮刀菌(Fusariumsporotrichioides)、硫色鐮刀菌(Fusariumsulphureum)、Fusariumtorulosum、擬絲孢鐮刀菌(Fusariumtrichothecioides)、鑲片鐮孢菌(Fusariumvenenatum)、特異腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉、或綠色木霉菌株。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對(duì)于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection，NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)菌為單細(xì)胞。一些真菌可產(chǎn)生為酵母樣形式。對(duì)真菌細(xì)胞亦可如WO2005/042758中所述進(jìn)行破碎和/或破壞。出于本發(fā)明的目的，用于本文與給定的來(lái)源相聯(lián)的術(shù)語(yǔ)“從……獲得”，意思是感興趣的蛋白質(zhì)由所述來(lái)源產(chǎn)生，或由其中插入了來(lái)自所述來(lái)源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生。細(xì)胞可通過(guò)本領(lǐng)域中任何已知的方法發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基可為包含復(fù)合氮源和/或碳源的復(fù)合培養(yǎng)基，如大豆粉，棉籽粉，玉米漿，酵母提取物，酪蛋白水解物，糖蜜等。發(fā)酵培養(yǎng)基可以是在化學(xué)上定義的培養(yǎng)基，例如WO98/37179中所定義的。在發(fā)酵培養(yǎng)基中的幾種商業(yè)成分是不溶的并含有在發(fā)酵期間將留在發(fā)酵培養(yǎng)基中的不消化的組分，并且其需要在發(fā)酵之后從所希望的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。因此本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，在發(fā)酵后的發(fā)酵培養(yǎng)基將根據(jù)本發(fā)明包含若干種固體組分，這些固體組分包括處于部分結(jié)晶或非晶形形式的感興趣的蛋白質(zhì)、細(xì)胞和細(xì)胞碎片以及發(fā)酵培養(yǎng)基中的不溶性剩余物。發(fā)酵可作為補(bǔ)料分批、重復(fù)的補(bǔ)料分批或連續(xù)發(fā)酵工藝進(jìn)行。在發(fā)酵期間感興趣的蛋白質(zhì)產(chǎn)生并且對(duì)于有效的工業(yè)發(fā)酵，經(jīng)常觀察到感興趣的蛋白質(zhì)形成沉淀，因?yàn)樗窃诟信d趣的蛋白質(zhì)的溶解度以上的濃度中產(chǎn)生的。在發(fā)酵后的感興趣的蛋白質(zhì)的純化期間，感興趣的蛋白質(zhì)的沉淀為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了挑戰(zhàn)，其中細(xì)胞、細(xì)胞碎片以及生長(zhǎng)培養(yǎng)基的固體剩余物通過(guò)固體/流體分離的已知的方法(如過(guò)濾)從流體進(jìn)行分離。如果感興趣的蛋白質(zhì)是完全或部分可用于固體形式，它將以這種分離跟隨固體并從而降低產(chǎn)量。本發(fā)明的方法提供了用于純化感興趣的蛋白質(zhì)的方法，其中感興趣的蛋白質(zhì)以固體形式、以結(jié)晶形式或以非晶形形式或其混合物存在。本領(lǐng)域熟知的是，從當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的濃度超過(guò)了溶解度的極限時(shí)，蛋白質(zhì)連同其他化學(xué)化合物從溶液中沉淀。因此當(dāng)以高量生產(chǎn)感興趣的蛋白質(zhì)時(shí)，本發(fā)明的方法是特別有用的。因此優(yōu)選地，在發(fā)酵液中的感興趣的蛋白質(zhì)的濃度優(yōu)選地高于3g/l，如高于4g/l，如高于5g/l，如高于6g/l，如高于7g/l，如高于8g/l，如高于9g/l，如高于10g/l，如高于11g/l，如高于12g/l，如高于13g/l，如高于14g/l，如高于15g/l，如高于16g/l，如高于17g/l，如高于18g/l，如高于19g/l，如高于20g/l。在本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中的術(shù)語(yǔ)固體形式用于描述當(dāng)感興趣的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)已經(jīng)達(dá)到超過(guò)了具體蛋白質(zhì)的溶解度極限的足夠高的水平時(shí)，在發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)的固體形式。固體形式可以通過(guò)處于結(jié)晶形式意指這些分子規(guī)則地排列于結(jié)構(gòu)中，該結(jié)構(gòu)通過(guò)規(guī)則的形狀和角度來(lái)表征，并在貫穿整個(gè)結(jié)構(gòu)中具有分子的同一組織。由于晶體的常規(guī)組織，通常晶體可以按固定角度衍射光。固體形式還可以處于被理解為較少規(guī)則結(jié)構(gòu)的非晶形形式，其中分子比晶體中發(fā)現(xiàn)的更少規(guī)則排列并且從結(jié)構(gòu)的一部分到結(jié)構(gòu)的其它部分分子的組織不同。固體形式還可以處于部分結(jié)晶形式，其中所述材料的一部分處于結(jié)晶形式，其與處于非晶形形式的所述固體材料的其他部分混合。發(fā)酵液中的固體形式(感興趣的蛋白質(zhì)存在于其中)不以任何方式限制本發(fā)明，與此相反，本發(fā)明的方法適用于在低pH下具有更可溶的特性的任何感興趣的蛋白質(zhì)，與在此pH下發(fā)酵液的溶解度相比。針對(duì)pH的調(diào)節(jié)，幾乎可以使用任何酸。該酸可為無(wú)機(jī)或有機(jī)的。一些實(shí)例為鹽酸、硫酸、亞硫酸、亞硝酸、磷酸、乙酸、檸檬酸和甲酸。出于本發(fā)明的目的，基于成本和考慮關(guān)于哪些酸將在以下純化方法中是可接受的，一般技術(shù)人員將能夠選擇適合的酸。優(yōu)選的酸為磷酸、甲酸、檸檬酸和乙酸。當(dāng)發(fā)酵液的pH被調(diào)節(jié)到低pH值時(shí)，感興趣的蛋白質(zhì)將開(kāi)始再增溶，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的溶解度由于pH的變化已經(jīng)增加。固體形式的感興趣的蛋白質(zhì)的溶解可以是快速的或其可以是緩慢的，取決于容器內(nèi)的具體條件和具體蛋白質(zhì)的性質(zhì)。像其他的溶解方法一樣，與相應(yīng)的情況下不攪拌混合物相比，該混合物被加速攪拌例如通過(guò)攪拌混合物。在pH調(diào)節(jié)后采用保持時(shí)間段，以便允許感興趣的蛋白質(zhì)溶解，之后將發(fā)酵液用后處理方法處理，例如用一個(gè)或另外的純化步驟。保持時(shí)間段應(yīng)足夠長(zhǎng)，以確保后處理前感興趣的蛋白質(zhì)的令人滿意的溶解。典型地，該保持時(shí)間段將是至少5分鐘，例如至少10分鐘，例如至少20分鐘，例如至少30分鐘，例如至少40分鐘，例如至少50分鐘，例如至少60分鐘，例如至少70分鐘，例如至少80分鐘，例如至少90分鐘，例如至少100分鐘，例如至少110分鐘，例如至少120分鐘。在pH調(diào)節(jié)和任選的保持時(shí)間段之后，具有感興趣的蛋白質(zhì)的發(fā)酵液被后處理以便得到最終所希望的產(chǎn)物。典型地，后處理的第一個(gè)步驟分離過(guò)程，其中將溶液中的含有感興趣的蛋白質(zhì)的發(fā)酵液的液體部分從不溶部分(如細(xì)胞和細(xì)胞碎片以及生長(zhǎng)培養(yǎng)基的剩余物)分離。本發(fā)明并不限于任何具體類型的分離方法，但能夠從不溶物中分離流體的任何類型的分離方法原則上可以使用，如過(guò)濾、離心或傾析。分離后可以采用另外的步驟以便得到處于所希望的形式、純度以及配制品的感興趣的蛋白質(zhì)，這些步驟如濃縮、色譜、穩(wěn)定化、噴霧干燥、造粒。本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包括在固/液分離之前將發(fā)酵液預(yù)處理，如稀釋步驟，其中將發(fā)酵液用水或水性溶液稀釋，在純化期間添加鹽或添加具有有益效果的其它化合物，如聚合物或穩(wěn)定劑等。該預(yù)處理步驟可以發(fā)生在調(diào)節(jié)pH至低于組氨酸的pKa值之前或之后。優(yōu)選實(shí)施例現(xiàn)在，通過(guò)以下實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明：1.用于純化如下過(guò)程中蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法，其中該蛋白質(zhì)的至少一部分具有位于該蛋白質(zhì)表面上的2-6個(gè)組氨酸殘基；該過(guò)程包括以下步驟：a.提供發(fā)酵液，b.任選地將pH調(diào)節(jié)至低于組氨酸側(cè)鏈的pKa的值；c.任選地保持該混合物一段時(shí)間；并且d.從來(lái)自發(fā)酵液的至少一部分固體物質(zhì)中分離溶解的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。2.如實(shí)施例1所述的方法，其中組氨酸側(cè)鏈的pKa是6.0。3.如實(shí)施例1或2所述的方法，其中位于蛋白質(zhì)的表面上的所述2-6個(gè)組氨酸位于一級(jí)序列內(nèi)部。4.如實(shí)施例3所述的方法，其中在感興趣的蛋白質(zhì)的表面上的2-6個(gè)組氨酸殘基中的至少一個(gè)通過(guò)取代或插入被提供。5.如實(shí)施例1或2所述的方法，其中位于蛋白質(zhì)的表面上的所述2-6個(gè)組氨酸處于該蛋白質(zhì)的C-末端和/或N-末端延伸的形式。6.如實(shí)施例1-5所述的方法，其中該蛋白質(zhì)產(chǎn)物是酶。7.如實(shí)施例6所述的方法，其中該酶選自水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶、或轉(zhuǎn)移酶。8.如實(shí)施例7所述的方法，其中該酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、綠色熒光蛋白、葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。9.如實(shí)施例8所述的方法，其中該酶是蛋白酶，選自金屬蛋白酶和枯草桿菌酶。10.如實(shí)施例9所述的方法，其中該酶是與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、IDNO:4或SEQIDNO:25具有至少80％序列一致性的蛋白酶。11.如實(shí)施例10所述的方法，其中該酶是與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、IDNO:4或SEQIDNO:25具有至少85％序列一致性的蛋白酶。12.如實(shí)施例11所述的方法，其中該酶是與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、IDNO:4或SEQIDNO:25具有至少90％序列一致性的蛋白酶。13.如實(shí)施例12所述的方法，其中該酶是與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、IDNO:4或SEQIDNO:25具有至少95％序列一致性的蛋白酶。14.如實(shí)施例13所述的方法，其中該酶是與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、IDNO:4或SEQIDNO:25具有至少96％序列一致性的蛋白酶。15.如實(shí)施例14所述的方法，其中該酶是與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、IDNO:4或SEQIDNO:25具有至少97％序列一致性的蛋白酶。16.如實(shí)施例15所述的方法，其中該酶是與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、IDNO:4或SEQIDNO:25具有至少98％序列一致性的蛋白酶。17.如實(shí)施例16所述的方法，其中該酶是與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、IDNO:4或SEQIDNO:25具有至少99％序列一致性的蛋白酶。18.如實(shí)施例8所述的方法，其中該酶是與SEQIDNO:18具有至少80％序列一致性的溶菌酶。19.如實(shí)施例18所述的方法，其中該酶是與SEQIDNO:18具有至少85％序列一致性的溶菌酶。20.如實(shí)施例19所述的方法，其中該酶是與SEQIDNO:18具有至少90％序列一致性的溶菌酶。21.如實(shí)施例20所述的方法，其中該酶是與SEQIDNO:18具有至少95％序列一致性的溶菌酶。22.如實(shí)施例21所述的方法，其中該酶是與SEQIDNO:18具有至少96％序列一致性的溶菌酶。23.如實(shí)施例22所述的方法，其中該酶是與SEQIDNO:18具有至少97％序列一致性的溶菌酶。24.如實(shí)施例23所述的方法，其中該酶是與SEQIDNO:18具有至少98％序列一致性的溶菌酶。25.如實(shí)施例24所述的方法，其中該酶是與SEQIDNO:18具有至少99％序列一致性的溶菌酶。26.如前述實(shí)施例中的任一項(xiàng)所述的方法，其中感興趣的蛋白質(zhì)在pH4.5下的溶解度高于pH7.0下的溶解度至少10％，優(yōu)選地高于至少20％，優(yōu)選地高于至少30％，優(yōu)選地高于至少40％，優(yōu)選地高于至少50％，優(yōu)選地高于至少60％，優(yōu)選地高于至少70％，優(yōu)選地高于至少80％，優(yōu)選地高于至少90％，優(yōu)選地高于至少100％。27.根據(jù)前述實(shí)施例中的任一項(xiàng)所述的方法，其中發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的濃度是至少3g/l，如至少4g/l，如至少5g/l，如至少6g/l；如至少7g/l，如至少8g/l，如至少9g/l；如至少10g/l，如至少11g/l，如至少12g/l；如至少13g/l，如至少14g/l，如至少15g/l；如至少16g/l，如至少17g/l，如至少18g/l；如至少19g/l，如至少20g/l。28.根據(jù)前述實(shí)施例中的任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟b)中的pH被調(diào)節(jié)至低于6.0，優(yōu)選地低于5.5，優(yōu)選地低于5.0，優(yōu)選地低于4.5的pH值。29.根據(jù)前述實(shí)施例中的任一項(xiàng)所述的方法，該方法包括步驟c中的保持時(shí)間段，并且其中該保持時(shí)間段在10秒至90分鐘的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在1分鐘至90分鐘的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在1分鐘至60分鐘的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在1分鐘至30分鐘的范圍內(nèi)，如在5分鐘至30分鐘的范圍內(nèi)，并且最優(yōu)選地在10分鐘至20分鐘的范圍內(nèi)。30.如前述實(shí)施例中的任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物來(lái)提供發(fā)酵液。31.如實(shí)施例30所述的方法，其中該微生物選自細(xì)菌和真菌。32.如實(shí)施例31所述的方法，其中該微生物選自屬于芽胞桿菌屬的細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌以及地衣芽孢桿菌。33.如實(shí)施例31所述的方法，其中該微生物選自屬于曲霉屬、木霉屬、青霉屬、鐮孢屬的真菌，例如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、醬油曲霉、里氏木霉、長(zhǎng)枝木霉或綠色木霉；或優(yōu)選地選自屬于酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬、漢森酵母屬(Hanensula)、克魯維酵母屬(Klyveromyces)的酵母；如釀酒酵母、葡萄汁酵母、畢赤酵母、乳酸克魯維酵母。34.如前述實(shí)施例中的任一項(xiàng)所述的方法，其中使用過(guò)濾、離心或傾析進(jìn)行步驟d中的分離。35.根據(jù)前述實(shí)施例中的任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括在步驟d中的分離之前的預(yù)處理步驟。36.如實(shí)施例35所述的方法，其中該預(yù)處理步驟選自稀釋、添加鹽以及添加聚合物。37.如前述實(shí)施例中的任一項(xiàng)所述的方法，其中該蛋白產(chǎn)物包含具有給出的氨基酸序列的感興趣的蛋白質(zhì)和除了2-6個(gè)組氨酸殘基的C-末端和/或N-末端延伸外具有相同氨基酸序列的修飾的蛋白質(zhì)。38.如實(shí)施例37所述的方法，其中通過(guò)用重組微生物發(fā)酵底物來(lái)提供發(fā)酵液，該重組微生物包含編碼感興趣的蛋白質(zhì)的基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝和編碼修飾的蛋白質(zhì)的修飾的基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝，該修飾的蛋白質(zhì)由2-6個(gè)組氨酸殘基的C-和/或N-末端延伸的感興趣的蛋白質(zhì)的序列組成。39.如實(shí)施例38所述的方法，其中該重組微生物包含編碼感興趣的蛋白質(zhì)的基因的兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)或八個(gè)拷貝和修飾的基因的一個(gè)或兩個(gè)拷貝。40.如前述實(shí)施例中的任一項(xiàng)所述的方法，該方法包括步驟c中的保持時(shí)間段，并且其中該保持時(shí)間段在10秒至90分鐘的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在1分鐘至90分鐘的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在1分鐘至60分鐘的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在1分鐘至30分鐘的范圍內(nèi)，如在5分鐘至30分鐘的范圍內(nèi)，并且最優(yōu)選地在10分鐘至20分鐘的范圍內(nèi)。41.一種重組微生物，其包含編碼感興趣的蛋白的至少一種多核苷酸，該至少一種多核苷酸可操作地連接至指導(dǎo)該感興趣的蛋白的生產(chǎn)的一個(gè)或多個(gè)控制序列上；和編碼修飾蛋白的至少一種多核苷酸，與該感興趣的蛋白相比該修飾蛋白被修飾為包含位于蛋白質(zhì)的表面上的2-6個(gè)組氨酸殘基，經(jīng)修飾的基因可操作地連接至指導(dǎo)該修飾蛋白的生產(chǎn)的一個(gè)或多個(gè)控制序列上。42.如實(shí)施例41所述的重組微生物，該重組微生物是原核細(xì)胞，優(yōu)選地是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞，更優(yōu)選地是芽胞桿菌屬細(xì)胞；最優(yōu)選地是嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、或蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。43.如實(shí)施例41所述的重組微生物，該重組微生物是真核細(xì)胞，優(yōu)選地是真菌細(xì)胞，更優(yōu)選地是曲霉屬、木霉屬或酵母屬或畢赤酵母屬細(xì)胞；最優(yōu)選地是黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、棘孢曲霉、里氏木霉、哈茨木霉、綠色木霉、釀酒酵母、葡萄汁酵母、或巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。44.如實(shí)施例41-43中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其包含編碼感興趣的蛋白質(zhì)的多核苷酸的至少兩個(gè)拷貝，優(yōu)選地至少三個(gè)拷貝，更優(yōu)選地至少四個(gè)拷貝并且最優(yōu)選地編碼感興趣的蛋白質(zhì)的多核苷酸的至少五個(gè)拷貝。45.如實(shí)施例41-44中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其包含編碼同一個(gè)感興趣的蛋白質(zhì)的至少兩個(gè)不同的多核苷酸，優(yōu)選地至少三個(gè)，更優(yōu)選地至少四個(gè)并且最優(yōu)選地至少五個(gè)編碼同一個(gè)感興趣的蛋白質(zhì)的多核苷酸。46.根據(jù)實(shí)施例41至45中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中感興趣的蛋白質(zhì)是一種酶。47.如實(shí)施例46所述的重組微生物，其中該酶是水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶、或轉(zhuǎn)移酶。48.如實(shí)施例47所述的重組微生物，其中該酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、綠色熒光蛋白、葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。49.如實(shí)施例48所述的重組微生物，其中該酶是蛋白酶；優(yōu)選地該蛋白酶是金屬蛋白酶或枯草桿菌酶。50.如實(shí)施例49所述的重組微生物，其中該蛋白酶具有如下氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:25中的一個(gè)具有至少80％序列一致性，優(yōu)選地至少90％序列一致性，優(yōu)選地至少95％序列一致性，優(yōu)選地至少96％序列一致性，優(yōu)選地至少97％序列一致性，優(yōu)選地至少98％序列一致性，優(yōu)選地至少99％序列一致性。51.如實(shí)施例50所述的重組微生物，其中該蛋白酶選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:25。52.如實(shí)施例48所述的重組微生物，其中該酶是溶菌酶；優(yōu)選地該溶菌酶是GH25溶菌酶。53.如實(shí)施例52所述的重組微生物，其中該溶菌酶具有如下氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO:18具有至少80％序列一致性，優(yōu)選地至少90％序列一致性，優(yōu)選地至少95％序列一致性，優(yōu)選地至少96％序列一致性，優(yōu)選地至少97％序列一致性，優(yōu)選地至少98％序列一致性，優(yōu)選地至少99％序列一致性。54.如實(shí)施例53所述的重組微生物，其中該溶菌酶具有SEQIDNO:18的氨基酸序列。55.如實(shí)施例41-54中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中這些多核苷酸被整合到宿主細(xì)胞染色體的不同基因座中。56.一種生產(chǎn)酶的方法，所述方法包括在有益于產(chǎn)生所述酶的條件下培養(yǎng)如實(shí)施例41-54中的任一項(xiàng)所定義的細(xì)胞的步驟。57.如實(shí)施例56所述的方法，該方法進(jìn)一步包括回收該酶的步驟。58.一種重組微生物，其包含編碼感興趣的蛋白的至少一種多核苷酸，該至少一種多核苷酸可操作地連接至指導(dǎo)該感興趣的蛋白的生產(chǎn)的一個(gè)或多個(gè)控制序列上；和編碼修飾蛋白的至少一種多核苷酸，與該感興趣的蛋白相比該修飾蛋白被修飾為包含位于蛋白質(zhì)的表面上的2-6個(gè)組氨酸殘基，經(jīng)修飾的基因可操作地連接至指導(dǎo)該修飾蛋白的生產(chǎn)的一個(gè)或多個(gè)控制序列上。59.如實(shí)施例58所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中該修飾的蛋白質(zhì)包含附接至蛋白質(zhì)的C-末端和/或N-末端上的2-6個(gè)組氨酸殘基。60.如實(shí)施例58或59所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中感興趣的蛋白質(zhì)是一種酶。61.如實(shí)施例60所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中該酶是水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶、或轉(zhuǎn)移酶。62.如實(shí)施例61所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中該酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、綠色熒光蛋白、葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。63.如實(shí)施例62所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中該酶是蛋白酶；優(yōu)選地該蛋白酶是金屬蛋白酶或枯草桿菌酶。64.如實(shí)施例63所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中該蛋白酶具有如下氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:25中的一個(gè)具有至少80％序列一致性，優(yōu)選地至少90％序列一致性，優(yōu)選地至少95％序列一致性，優(yōu)選地至少96％序列一致性，優(yōu)選地至少97％序列一致性，優(yōu)選地至少98％序列一致性，優(yōu)選地至少99％序列一致性。65.如實(shí)施例64所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中該蛋白酶選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4或SEQIDNO:25。66.如實(shí)施例62所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中感興趣的酶是溶菌酶；優(yōu)選地該溶菌酶是GH25溶菌酶。67.如實(shí)施例66所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中該蛋白酶具有如下氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO:18具有至少80％序列一致性，優(yōu)選地至少90％序列一致性，優(yōu)選地至少95％序列一致性，優(yōu)選地至少96％序列一致性，優(yōu)選地至少97％序列一致性，優(yōu)選地至少98％序列一致性，優(yōu)選地至少99％序列一致性。68.如實(shí)施例67所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中該溶菌酶具有SEQIDNO:18的氨基酸序列?，F(xiàn)在進(jìn)一步用實(shí)例描述本發(fā)明，這些實(shí)例僅提供說(shuō)明并且不應(yīng)理解為以任何方式限定。實(shí)例材料與方法蛋白酶測(cè)定(Suc-AAPF-pNA測(cè)定)pNA底物：Suc-AAPF-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1400)。溫：室溫(25℃)測(cè)定緩沖液：100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％TritonX-100，pH9.0。將20μl蛋白酶(在0.01％TritonX-100中稀釋)與100μl測(cè)定緩沖液混合。通過(guò)添加100μlpNA底物(50mg溶解于1.0mlDMSO并且用0.01％TritonX-100進(jìn)一步稀釋45x)起始測(cè)定。監(jiān)測(cè)OD405的增加作為蛋白酶活性的量度。溶菌酶活性(LSU(A)DV)的測(cè)定溶菌酶(EC3.2.1.17)是降解在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖的酶。在溶菌酶的分析中，溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)ATCC號(hào)4698(SigmaM3770)被降解，其中在表1中的條件下測(cè)量的在450nm處的吸光度降低。吸光度的降低與呈現(xiàn)于樣品中的LSU(A)DV酶活性成正比。表1.標(biāo)準(zhǔn)(193-81114:23000LSU(A)DV/g)0.5000g/100ml醋酸鹽0.1M，NaCl50mM，Triton–X1000.1％，pH4.5常規(guī)分子生物學(xué)方法PCR、克隆、連接核苷酸等的一般方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的并且可以例如發(fā)現(xiàn)于“分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecularcloning:Alaboratorymanual)”，薩拉布魯克(Sambrook)等人(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(ColdSpringHarborlab.)，冷泉港，紐約；奧蘇貝爾(Ausubel)，F(xiàn)·M等人(編輯)；“分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(CurrentprotocolsinMolecularBiology)”，約翰威立父子公司(JohnWileyandSons)，(1995)；哈伍德(Harwood)，C·R和卡廷(Cutting)，S·M(編輯)；“DNA克?。簩?shí)用方法(DNACloning:APracticalApproach)，I和II卷”，D.N.格洛弗(Glover)編輯(1985)；“寡核苷酸合成”(OligonucleotideSynthesis)，M.J.蓋特(Gait)編輯(1984)；“核酸雜交(NucleicAcidHybridization)”，B.D.黑姆斯(Hames)&S.J.希金斯(Higgins)編輯(1985)；“分子克隆實(shí)用指南(APracticalGuideToMolecularCloning)”，B.帕柏爾(Perbal)(1984)。表2.通用PCR條件：3步循環(huán)：培養(yǎng)基和試劑用于緩沖液和底物的化學(xué)品是分析等級(jí)的商品：-Cove：342.3g/L蔗糖、20ml/LCOVE鹽溶液、10mM乙酰胺、30g/L諾布爾(noble)瓊脂。-Cove頂層瓊脂：342.3g/L蔗糖、20ml/LCOVE鹽溶液、10mM乙酰胺、10g/L低熔點(diǎn)瓊脂糖-Cove-2：30g/L蔗糖、20ml/LCOVE鹽溶液、10mM乙酰胺、30g/L諾布爾瓊脂。-COVE鹽溶液由以下構(gòu)成：26gKCl、26gMgSO4·7H2O、76gKH2PO4和50mlCove痕量金屬，水補(bǔ)足至1升。-用于COVE的痕量金屬溶液由以下構(gòu)成：0.04gNaB4O7·10H2O、0.4g的CuSO4·5H2O、1.2g的FeSO4·7H2O、1.0g的MnSO4·H2O、0.8g的中性淀粉酶IIMoO2·2H2O、和10.0g的ZnSO4·7H2O，水補(bǔ)足至1升。-淀粉糖苷酶痕量金屬溶液由以下構(gòu)成：6.8gZnCl2·7H2O、2.5gCuSO4·5H2O、0.24gNiCl2·6H2O、13.9gFeSO4·7H2O、13.5gMnSO4·H2O和3g檸檬酸，水補(bǔ)足至1升。-YPG由以下構(gòu)成：4g的酵母提取物、1g的KH2PO4、0.5g的MgSO4·7H2O和15g的葡萄糖(pH6.0)，水補(bǔ)足至1升。-STC緩沖液由以下構(gòu)成：0.8M的山梨醇、25mM的Tris(pH8)、和25mM的CaCl2，水補(bǔ)足至1升。STPC緩沖液由以下構(gòu)成：在STC緩沖液中的40％PEG4000。黑曲霉轉(zhuǎn)化如克里斯滕森(Christensen)等人；生物技術(shù)(Biotechnology)198861419-1422所述，完成曲霉屬轉(zhuǎn)化。以下描述了優(yōu)選程序。將黑曲霉宿主菌株接種至100ml的補(bǔ)充有10mM尿苷的YPG培養(yǎng)基上，并且在32℃下在80rpm下孵育16hr。將球粒進(jìn)行收集并且用0.6MKcl洗滌，并且將其重懸于含有商業(yè)β-葡聚糖酶產(chǎn)品(GLUCANEXTM，諾維信公司(NovozymesA/S)，鮑斯韋(Bagsvaerd)，丹麥)的20ml0.6MKCl(終濃度為20mg/ml)中。將懸浮液在32℃下在80rpm下孵育直到形成原生質(zhì)體，并且然后用STC緩沖液洗滌兩次。將這些原生質(zhì)體用血紅蛋白計(jì)計(jì)數(shù)，并且在8:2:0.1的STC:STPC:DMSO溶液中重懸并調(diào)整至終濃度為2.0x107個(gè)原生質(zhì)體/ml。將大約4μg的質(zhì)粒DNA添加至100μl的原生質(zhì)體懸浮液中，輕輕混合，并且在冰上孵育30分鐘。添加1ml的SPTC，并且將原生質(zhì)體懸浮液在37℃下孵育20分鐘。在添加10ml的50℃Cove頂層瓊脂糖之后，將反應(yīng)液傾例于Cove瓊脂板上，并且將板于32℃下孵育5天。SDS-PAGE用于溶菌酶分析使用的SDS凝膠是來(lái)自伯樂(lè)公司(BioRad)的任何kDTMTGX無(wú)染色TM凝膠。在凝膠上，上樣十六ul的樣品(八μl的每種樣品與8ul的上樣緩沖液混合)。也采用十ul的MW標(biāo)記物：(針對(duì)SDS電泳的低分子量定標(biāo)用具箱#17-0446-01，來(lái)自安瑪西亞公司(Amersham))。將凝膠在200V的恒定電壓下在1xSDS緩沖液(伯樂(lè)公司)中電泳25min，并通過(guò)使用伯樂(lè)公司標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)按制造商推薦的進(jìn)行分析。實(shí)例1變體的制備和表達(dá)下面總結(jié)了突變和表達(dá)盒到枯草芽孢桿菌的引入。所有DNA操縱是通過(guò)PCR(例如薩姆布魯克(Sambrook)等人；分子克隆(MolecularCloning)；冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress))進(jìn)行并且可以由本領(lǐng)域每位技術(shù)人員重復(fù)。使用編碼枯草桿菌酶變體的重組枯草桿菌構(gòu)建體來(lái)接種含有富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(例如，PS-1:100g/L蔗糖(丹尼斯克目錄號(hào)109-0429)、40g/L大豆殼(大豆粉)、10g/LNa2HPO412H2O(默克(Merck)目錄號(hào)6579)、0.1ml/L替換-Dowfax63N10(陶氏化學(xué)(Dow))的搖瓶。典型地在30℃下在220rpm的振搖下進(jìn)行4天的培養(yǎng)。生成以下蛋白質(zhì)實(shí)例2將參照物和實(shí)施例1中產(chǎn)生的變體在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵罐中使用EP1520012B1、實(shí)施例2中描述的方法進(jìn)行發(fā)酵，不添加MGP。在發(fā)酵期間觀察到這些變體形成沉淀。發(fā)酵中的活性顯示，參照物、1HIS、2HIS、3HIS以及4HIS的發(fā)酵給出了大致相同的產(chǎn)量，而3intHIS變體發(fā)酵給出了比參照物低的產(chǎn)量。實(shí)例3將來(lái)自實(shí)例2的發(fā)酵液用水稀釋三倍并使用HCl將pH調(diào)節(jié)至在40℃下的pH4.5，并將發(fā)酵液攪拌60分鐘。在pH調(diào)節(jié)后立即測(cè)定上清液中的蛋白酶活性并在60分鐘后使用以上的蛋白酶測(cè)定。在pH調(diào)節(jié)設(shè)定為1后，立即測(cè)定相對(duì)于參照物中的濃度的蛋白酶濃度。結(jié)果示于表3中表3.獲得的相對(duì)活性：T＝0T＝60參照物11,41HIS5.88.82HIS45593HIS56594HIS54573IntHIS1.55結(jié)果清楚地表明，本發(fā)明的所有變體在低pH下與親本(＝參照物)相比具有更高的溶解度。數(shù)據(jù)還表明，即使對(duì)于本發(fā)明的變體的溶解度是從一開(kāi)始就高，但是在60分鐘的保持時(shí)間段內(nèi)甚至更多酶進(jìn)入溶液中。實(shí)例4變體的制備和表達(dá)下面總結(jié)了突變和表達(dá)盒到地衣芽孢桿菌的引入。所有DNA操縱是通過(guò)PCR(例如薩姆布魯克(Sambrook)等人；分子克隆(MolecularCloning)；冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress))進(jìn)行并且可以由本領(lǐng)域每位技術(shù)人員重復(fù)。制備兩個(gè)重組體地衣芽孢桿菌。通過(guò)將編碼Savinase(SEQIDNo:2)的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化為地衣芽孢桿菌宿主菌株，并選擇具有用Savinase基因整合的表達(dá)盒的5個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)化體來(lái)制備參照菌株，并且一種菌株具有表達(dá)盒的5個(gè)拷貝，該表達(dá)盒包含編碼Savinase的用附接N-末端的4個(gè)氨酸殘基修飾的基因。重組生物體和參照生物體在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐中發(fā)酵，并在發(fā)酵期間觀察到蛋白質(zhì)沉淀。在發(fā)酵中的活性表明，參照物和4HIS的發(fā)酵給出大致相同的產(chǎn)量。實(shí)例5純化將來(lái)自實(shí)例4的發(fā)酵液用水稀釋六倍并使用乙酸將pH調(diào)節(jié)至在40℃下的pH4.5，添加鹽以控制導(dǎo)電性并將發(fā)酵液在水浴中在40℃下攪拌60分鐘。在pH調(diào)節(jié)后立即測(cè)定上清液中的蛋白酶活性并在60分鐘后使用以上的蛋白酶測(cè)定。在pH調(diào)節(jié)設(shè)定為1后，立即測(cè)定相對(duì)于參照物中的濃度的蛋白酶濃度。表4.獲得的相對(duì)活性(％)：結(jié)果清楚地表明，與僅用感興趣的基因轉(zhuǎn)化的參照重組微生物相比，使用具有修飾的基因的5個(gè)拷貝的重組微生物導(dǎo)致了在低pH下的更高溶解度。數(shù)據(jù)還表明，即使對(duì)于本發(fā)明的變體的溶解度是從一開(kāi)始就高，但是在60分鐘的保持時(shí)間段內(nèi)甚至更多酶進(jìn)入溶液中。實(shí)例6下面總結(jié)了突變和表達(dá)盒到地衣芽孢桿菌的引入。所有DNA操縱是通過(guò)PCR(例如薩姆布魯克(Sambrook)等人；分子克隆(MolecularCloning)；冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress))進(jìn)行并且可以由本領(lǐng)域每位技術(shù)人員重復(fù)。兩種表達(dá)盒，一種具有編碼Savinase變體(SEQIDNo:3)的基因和一種具有修飾的Savinase變體，該Savinase變體具有SEQIDNO:3的序列，用4個(gè)組氨酸殘基(SEQIDNO:3+His-標(biāo)簽)延伸的C-末端。通過(guò)將編碼Savinase變體(SEQIDNo:3)的表達(dá)盒和包含修飾的基因的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化為地衣芽孢桿菌宿主菌株，并選擇具有用Savinase變體基因和修飾基因(用4個(gè)組氨酸殘基延伸)的一個(gè)拷貝整合的表達(dá)盒的5個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)化體來(lái)制備重組菌株。重組生物體在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐中發(fā)酵，并在發(fā)酵期間觀察到蛋白質(zhì)沉淀。將發(fā)酵液用水稀釋六倍并使用乙酸將pH調(diào)節(jié)至在40℃下的pH4.5，并將發(fā)酵液在水浴中在40℃下攪拌60分鐘。在pH調(diào)節(jié)后立即測(cè)定上清液中的蛋白酶活性并在120分鐘后使用以上的蛋白酶測(cè)定。在pH調(diào)節(jié)設(shè)定為1后，立即測(cè)定相對(duì)于參照物中的濃度的蛋白酶濃度。表5.獲得的相對(duì)活性(％)：結(jié)果表明，使用的感興趣的蛋白酶(SEQIDNo:3)的5個(gè)拷貝和相同的蛋白酶的His-標(biāo)記的變體的一個(gè)拷貝的組合導(dǎo)致沉淀的蛋白酶的高溶解并且?guī)缀跬耆芙狻Ｏ啾容^而言，當(dāng)感興趣的蛋白酶單獨(dú)發(fā)酵(在生產(chǎn)菌株中沒(méi)有His-標(biāo)簽變體的副本)時(shí)，在pH降低至4.5后顯著地更少的蛋白酶溶解，并且在測(cè)試條件下甚至120分鐘后只有更小部分的產(chǎn)物溶解。結(jié)果證實(shí)，與只包含含有感興趣的蛋白酶的表達(dá)盒的對(duì)照微生物相比，使用包含含有感興趣的蛋白酶的表達(dá)盒的5個(gè)拷貝和含有具有附接至C-末端的4個(gè)組氨酸的感興趣的蛋白酶的表達(dá)盒的一個(gè)拷貝的重組微生物，可以在低pH下獲得更好的溶解性的益處。實(shí)例7下面總結(jié)了突變和表達(dá)盒到地衣芽孢桿菌的引入。所有DNA操縱是通過(guò)PCR(例如薩姆布魯克(Sambrook)等人；分子克隆(MolecularCloning)；冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress))進(jìn)行并且可以由本領(lǐng)域每位技術(shù)人員重復(fù)。兩種表達(dá)盒，一種具有編碼Savinase變體(SEQIDNo:3)的基因和一種具有修飾的Savinase變體，該Savinase變體具有SEQIDNO:4的序列，用4個(gè)組氨酸殘基(SEQIDNO:4+His-標(biāo)簽)延伸的C-末端。通過(guò)將編碼Savinase變體(SEQIDNo:4)的表達(dá)盒和包含修飾的基因的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化為地衣芽孢桿菌宿主菌株，并選擇具有用Savinase變體基因和修飾基因(用4個(gè)組氨酸殘基延伸)的一個(gè)拷貝整合的表達(dá)盒的5個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)化體來(lái)制備重組菌株。重組生物體在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐中發(fā)酵，并在發(fā)酵期間觀察到蛋白質(zhì)沉淀。將發(fā)酵液用水稀釋六倍并使用乙酸將pH調(diào)節(jié)至在40℃下的pH4.5，并將發(fā)酵液在水浴中在40℃下攪拌60分鐘。在pH調(diào)節(jié)后立即測(cè)定上清液中的蛋白酶活性并在120分鐘后使用以上的蛋白酶測(cè)定。在pH調(diào)節(jié)設(shè)定為1后，立即測(cè)定相對(duì)于參照物中的濃度的蛋白酶濃度。表6.獲得的相對(duì)活性(％)：結(jié)果表明，使用的感興趣的蛋白酶(SEQIDNo:3)的5個(gè)拷貝和相同的蛋白酶的His-標(biāo)記的變體的一個(gè)拷貝的組合導(dǎo)致沉淀的蛋白酶的高溶解并且?guī)缀跬耆芙狻Ｏ啾容^而言，當(dāng)感興趣的蛋白酶單獨(dú)發(fā)酵(在生產(chǎn)菌株中沒(méi)有His-標(biāo)簽變體的副本)時(shí)，在pH降低至4.5后顯著地更少的蛋白酶溶解，并且在測(cè)試條件下甚至120分鐘后只有更小部分的產(chǎn)物溶解。結(jié)果證實(shí)，與只包含含有感興趣的蛋白酶的表達(dá)盒的對(duì)照微生物相比，使用包含含有感興趣的蛋白酶的表達(dá)盒的5個(gè)拷貝和含有具有附接至C-末端的4個(gè)組氨酸的感興趣的蛋白酶的表達(dá)盒的一個(gè)拷貝的重組微生物，可以在低pH下獲得更好的溶解性的益處。實(shí)例8黑曲酶中的溶菌酶表達(dá)曲霉屬表達(dá)盒pJaL1470的構(gòu)建。通過(guò)在844bp、2972bp、3514bp、155bp、1548bp以及2633bp上的以下6種PCR片段通過(guò)引物集oJaL519(GTTGTAAAACGACGGCCAGTTTCATCTTGAAGTTCCTA，SEQIDNO:5)/oJaL522(CTGGCCGTCGTTTTAC，SEQIDNO:6)、oJaL521(GGATTTAGTCTTGATCGCGGCCGCACCATGCGTTTCATTTC，SEQIDNO:7)/oJaL524(ATCAAGACTAAATCCTC，SEQIDNO:8)、oJaL523(TGGAAGTTACGCTCGCATTCTGTAAACGGGC，SEQIDNO:9)/oJaL526(CGAGCGTAACTTCCACC，SEQIDNO:10)、oJaL525(GAGGGGATCGATGCGTCCGCGGGCGGAGAAGAAG，SEQIDNO:11)/oJaL528(CGCATCGATCCCCTCGTC，SEQIDNO:12)、oJaL527(GATATCGGAGAAGCGTCCGCAGTTGATGAAGG，SEQIDNO:13)/oJaL530(GCTTCTCCGATATCAAG，SEQIDNO:14)以及oJaL529(AGCTTGGCGTAATCATG，SEQIDNO:15)/oJaL520(ACCATGATTACGCCAAGCTGCATGCATTAATTAACTTG，SEQIDNO:16)分別擴(kuò)增，使用質(zhì)粒pHUda1260作為模板，來(lái)制造表達(dá)載體pJaL1468。通過(guò)根據(jù)生產(chǎn)說(shuō)明注入克隆將這6種PCR片段連接在一起，并從而創(chuàng)建質(zhì)粒pJaL1468。對(duì)于編碼GH25溶菌酶SEQIDNO:18的嗜堿枝頂菌基因(SEQIDNO:17)而言，將含有內(nèi)含子的編碼區(qū)(SEQIDNO:17)按照878bp上的PCR片段(SEQIDNO.:19)通過(guò)引物集oJaL513(CAACTGGGGGCGGCCGCACCATGAAGCTTCTTCCCTCC，SEQIDNO:20)和oJaL514(GTGTCAGTCACCGCGATCGCTTAGTCTCCGTTAGCGAG，SEQIDNO:21)使用嗜堿枝頂菌基因組DNA作為模板而被擴(kuò)增。將該878bpPCR片段用AsiSII和NotII消化，產(chǎn)生852bp片段。將該852bpAsiSI-NotI片段克隆進(jìn)pJaL1468中的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)，給出質(zhì)粒pJaL1470。pHUda1260的構(gòu)建通過(guò)從構(gòu)巢曲霉乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶基因(pyrG)改變?yōu)樵趐Rika147中的構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶基因(amdS)構(gòu)建質(zhì)粒pHUda1260。質(zhì)粒pRika147(在WO2012160093中的實(shí)施例9中描述)用SphI和SpeI消化，并且遵循制造商的方案(NEB，新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(NewEnglandBiolabs,Inc.))通過(guò)使用T4DNA聚合酶將其兩端填充。將片段通過(guò)使用TAE緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，其中將9,241bp片段從凝膠切離并使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。質(zhì)粒pHUda1019(在WO2012160093中的實(shí)施例2中描述)用XbaI和AvrII消化，并且遵循制造商的方案(NEB，新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(NewEnglandBiolabs,Inc.))通過(guò)使用T4DNA聚合酶將其兩端填充。將片段通過(guò)使用TAE緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，其中含有amdS基因、米曲霉tef1(翻譯延長(zhǎng)因子1)啟動(dòng)子和米曲霉niaD(硝酸還原酶)終止子的3,114bp片段從凝膠切出，并使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。將9241bp片段與3,114bp片段在反應(yīng)中連接，該反應(yīng)由1μl的9241bp片段、3μl的3,114bp片段、1μl的5X連接酶緩沖液，5μl的2X連接酶緩沖液以及1μl的連接酶(羅氏(Roche)快速DNA連接試劑盒)組成。將連接反應(yīng)物在室溫下孵育10分鐘。將五μl的連接混合物轉(zhuǎn)化到DH5-α化學(xué)感受肽的大腸桿菌細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化體涂布在LB加氨比西林平板上并在37℃下孵育過(guò)夜。使用QIA小量制備試劑盒將質(zhì)粒DNA從若干種轉(zhuǎn)化體進(jìn)行純化。通過(guò)使用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶，隨后通過(guò)使用TAE緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳將質(zhì)粒DNA進(jìn)行篩選用于正確連接。一種質(zhì)粒被指定為pHUda1260。表達(dá)質(zhì)粒pHiTe158的構(gòu)建將來(lái)自嗜堿枝頂菌的溶菌酶基因的0.85kb區(qū)域從質(zhì)粒pJaL1470通過(guò)PCR用引物對(duì)HTJP-483(agtcttgatcggatccaccatgaagcttcttccctccttg，SEQIDNO:22)和HTJP-504(cgttatcgtacgcaccacgtgttagtggtggtggtggtctccgttagcgagagc，SEQIDNO:23)進(jìn)行擴(kuò)增。將獲得的0.85kbDNA片段通過(guò)HD克隆試劑盒(克隆技術(shù)實(shí)驗(yàn)室有限公司(ClontechLaboratories，Inc))連接進(jìn)入pHiTe50(NZ12683)中，該pHiTe50用BamHI和PmlI消化以創(chuàng)建pHiTe158。黑曲霉中的溶菌酶基因的轉(zhuǎn)化如WO2012/160093中所描述的，用具有amdS選擇性標(biāo)記的C末端四個(gè)組氨酸標(biāo)簽基因(pHiTe158)進(jìn)行染色體插入天然溶菌酶(pJaL1470)的黑曲霉(描述于WO2012/160093中的NN059280的衍生物)或其變體。將生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行純化，并且經(jīng)受Southern印跡分析以確認(rèn)在pJaL1470或pHiTe158中的溶菌酶基因是否正確引入在NA1、NA2、SP288或PAY基因座處。以下用以制備非放射性探針的引物組被用來(lái)分析所選擇的轉(zhuǎn)化體。對(duì)于溶菌酶編碼區(qū)：HTJP-483Agtcttgatcggatccaccatgaagcttcttccctccttg(SEQIDNO:22)HTJP-513Ctggtagcagtggtaggg(SEQIDNO:24)將從所選擇的轉(zhuǎn)化體提取的基因組DNA通過(guò)SpeI和PmlI消化，然后用溶菌酶編碼區(qū)進(jìn)行探測(cè)。通過(guò)正確基因引入事件，以上所描述的探測(cè)觀察通過(guò)SpeI和PmlI消化的5.1kb(NA1)、1.9kb(SP288)、3.1kb(NA2)和4.0kb(PAY)大小的雜交信號(hào)。在給出NA1、NA2、SP288以及PAY基因座處的基因的4個(gè)拷貝的正確的整合事件的菌株中，選擇具有天然溶菌酶(1470-C3085-11)的一個(gè)菌株和具有his-標(biāo)記的變體(158-C3085-2)的一個(gè)菌株。實(shí)例9.在溶菌酶的C-末端添加四個(gè)組氨酸標(biāo)簽對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的作用。具有his-標(biāo)記的溶菌酶的菌株和具有天然溶菌酶基因的參照菌株在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的罐中發(fā)酵。用于溶菌酶生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模罐培養(yǎng)按分批補(bǔ)料發(fā)酵來(lái)完成發(fā)酵(H.佩德森(Pedersen)2000，應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)(ApplMicrobiolBiotechnol)，53:272-277)。將所選擇菌株在液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，然后將生長(zhǎng)的菌絲體轉(zhuǎn)移到罐中用于酶產(chǎn)生的進(jìn)一步培養(yǎng)。在pH4.75下在34℃下培養(yǎng)7天，用葡萄糖和銨進(jìn)行給料而不過(guò)度給予(其阻止酶產(chǎn)生)。使用離心后的培養(yǎng)液和上清液用于酶測(cè)定在對(duì)于天然溶菌酶的發(fā)酵液中觀察到晶體形成，但在對(duì)于His-標(biāo)簽形式的發(fā)酵液中沒(méi)有觀察到晶體形成。遵循以上所述的這些方法測(cè)量它們的酶活性(LSU活性)；結(jié)果示于下面的表7中。表7假設(shè)：培養(yǎng)物的密度約是1kg/L。這些菌株的LSU活性，其中來(lái)自1470-C3085-11中的發(fā)酵液(在192h的發(fā)酵下制備)的溶菌酶產(chǎn)率被標(biāo)準(zhǔn)化為1.00。通過(guò)在用水稀釋培養(yǎng)液后在50℃下熱處理1小時(shí)，在發(fā)酵期間形成于1470-C3085-11中的不溶的溶菌酶(晶體)是(部分地)可溶的。將來(lái)自pHiTe158的轉(zhuǎn)化體中的不具有晶體的樣品進(jìn)行相等的處理。將來(lái)自黑曲霉菌株的發(fā)酵的上清液樣品經(jīng)受SDS-PAGE分析，以查看和比較溶菌酶的溶解程度。正如預(yù)期的，在整個(gè)發(fā)酵中，由于結(jié)晶，來(lái)自1470-C3085-11的樣品中的溶菌酶顯著地降低(圖1A，泳道2-6和表8A)，而來(lái)自158-C3085-2的樣品中的那些持續(xù)增加(圖1B，泳道2-6和表8A)，這表明溶菌酶的溶解度被條件下的his-標(biāo)簽添加而強(qiáng)烈地增強(qiáng)。表8A這些菌株的LSU活性，其中來(lái)自1470-C3085-11中的上清液(在97h的發(fā)酵下制備)的溶菌酶產(chǎn)率被標(biāo)準(zhǔn)化為1.00。表8B這些菌株的LSU活性，其中來(lái)自158-C3085-2中的上清液(在97h的發(fā)酵下制備)的溶菌酶產(chǎn)率被標(biāo)準(zhǔn)化為1.00。當(dāng)前第1頁(yè)1 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