抗乙型流感病毒血凝素抗體和使用方法與流程

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技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供抗乙型流感病毒血凝素抗體、包含抗乙型流感病毒血凝素抗體的組合物和使用這些抗體的方法。
背景技術(shù)：
：流感病毒感染每年在全世界造成三百萬(wàn)至五百萬(wàn)嚴(yán)重疾病病例和250,000和500,000例死亡。單在美國(guó)，每年5％至20％的人群感染流感病毒，這些感染大部分由甲型流感病毒引起。(參見(jiàn)，例如，Dushoff等人,(2006)AmJEpidemiology163:181-187；Thompson等人,(2004)JAMA292:1333-1340；Thompson等人,(2003)JAMA289:179-186)。然而，乙型流感病毒感染單在美國(guó)每年就占據(jù)大約10,000-100,000的流感住院病例，顯示年度間高度變異性(1％-40％全部住院的流感病毒病例是乙型流感病毒感染，均數(shù)為17％)。(參見(jiàn)Zhou等人(2012)ClinInfDis54:1427-1436)。與流感病毒感染相關(guān)的醫(yī)療費(fèi)用和生產(chǎn)力損失負(fù)擔(dān)是龐大的。住院和死亡主要地出現(xiàn)在高風(fēng)險(xiǎn)群組，如老年人、兒童和慢性病患者中。神經(jīng)氨酸酶抑制劑經(jīng)批準(zhǔn)用于治療門(mén)診患者和預(yù)防甲型流感和乙型流感病毒感染。奧司他韋是針對(duì)甲型流感和乙型流感病毒感染廣泛使用的預(yù)防性和早期治療性治療選擇。(參見(jiàn)，例如，Kandel和Hartshorn(2001)BioDrugs:ClinicalImmunotherapy,BiopharmaceuticalsandGeneTherapy15:303-323；Nicholson等人,(2000)Lancet355:1845-1850；Treanor等人,(2000)JAMA283:1016-1024；和Welliver等人,(2001)JAMA285:748-754)。然而，奧司他韋治療必須在癥狀初起48小以?xún)?nèi)開(kāi)始以提供明顯的臨床益處。(參見(jiàn)，例如，Aoki等人,(2003)JAntimicrobialChemotherapy51:123-129)。這種必要性損害了奧司他韋治療嚴(yán)重病情患者的能力，這些患者一般在尋求治療時(shí)超出最佳48小時(shí)治療窗口之外。另外，與治療甲型流感病毒感染相比，奧司他韋治療乙型流感病毒感染不太有效，可能部分歸因于與甲型流感神經(jīng)氨酸酶相比其對(duì)乙型流感神經(jīng)氨酸酶的IC50值高10倍。因此，近來(lái)人們明顯關(guān)注鑒定治療乙型流感病毒感染的住院患者的乙型流感病毒治療藥。在1988-1989期間，從乙型流感病毒祖先世系出現(xiàn)乙型流感病毒的兩個(gè)高度不同的抗原變體。這些病毒在抗原性上與乙型流感病毒B/維多利亞/2/87或B/山行/16/88相關(guān)。(參見(jiàn)，例如，Rota等人(1990)Virology175:59-68)。因此需要開(kāi)發(fā)針對(duì)乙型流感病毒感染的療法，所述療法有效對(duì)抗乙型流感病毒祖先世系、維多利亞(Victoria)世系和山行(Yamagata)世系。最新報(bào)告已經(jīng)描述了結(jié)合血凝素并中和乙型流感病毒的單克隆抗體(mAb)。(參見(jiàn)Kubota-Koketsu等人(2009)BiochemBiophysResComm387:180-185；Yasugi等人(2013)PLOSPathogens9:e1003150,1-12；Dreyfus等人(2012)ScienceExpress337:1343-1348；國(guó)際申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO2013/007770、WO2013/132007、WO2013/114885、WO2010/073647和美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)US2009/0092620、US2011/0319600和US2011/0319660)。盡管這些報(bào)道，在本領(lǐng)域仍然需要有效對(duì)抗一系列眾多乙型流感病毒毒株的乙型流感病毒新療法，包括有效治療或預(yù)防祖先世系、山行世系和維多利亞世系乙型流感病毒感染的乙型流感病毒療法。本發(fā)明滿(mǎn)足這種需求并提供治療和預(yù)防乙型流感病毒感染的其他益處。發(fā)明概述本發(fā)明提供抗乙型流感病毒血凝素抗體(即，抗血凝素抗體，抗乙型流感病毒抗體)、包含抗乙型流感病毒血凝素抗體的組合物和使用這些抗體的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含三個(gè)重鏈高變區(qū)(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三個(gè)輕鏈高變區(qū)(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：(a)HVR-H1包含SEQIDNO:61的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含選自SEQIDNO:64和65的氨基酸序列；(c)HVR-H3包含SEQIDNO:75的氨基酸序列；(d)HVR-L1包含SEQIDNO:55的氨基酸序列；(e)HVR-L2包含SEQIDNO:57的氨基酸序列；和(f)HVR-L3包含SEQIDNO:59的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)和/或六個(gè)高變區(qū)(HVR)序列的分離的抗血凝素抗體，其中：(a)HVR-H1包含SEQIDNO:61的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含選自SEQIDNO:64和65的氨基酸序列；(c)HVR-H3包含SEQIDNO:75的氨基酸序列；(d)HVR-L1包含SEQIDNO:55的氨基酸序列；(e)HVR-L2包含SEQIDNO:57的氨基酸序列；和(f)HVR-L3包含SEQIDNO:59的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含三個(gè)輕鏈高變區(qū)(HVR-L1、HVR-L2和LVR-L3)的分離的抗血凝素抗體，其中：(a)HVR-L1包含SEQIDNO:55的氨基酸序列；(b)HVR-L2包含SEQIDNO:57的氨基酸序列；和(c)HVR-L3包含SEQIDNO:59的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含三個(gè)重鏈高變區(qū)(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)的分離的抗血凝素抗體，其中：(a)HVR-H1包含SEQIDNO:61的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含選自SEQIDNO:64和65的氨基酸序列；并且(c)HVR-H3包含SEQIDNO:75的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)輕鏈高變區(qū)(HVR)序列的分離的抗血凝素抗體，其中：(a)HVR-L1包含SEQIDNO:55的氨基酸序列；(b)HVR-L2包含SEQIDNO:57的氨基酸序列；和(c)HVR-L3包含SEQIDNO:59的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)重鏈高變區(qū)(HVR)序列的分離的抗血凝素抗體，其中：(a)HVR-H1包含SEQIDNO:61的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含選自SEQIDNO:64和65的氨基酸序列；并且(c)HVR-H3包含SEQIDNO:75的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中重鏈可變區(qū)包含選自SEQIDNO:79和83的氨基酸序列，并且輕鏈可變區(qū)包含選自SEQIDNO:78、82和86的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含選自SEQIDNO:78、82和86的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含選自SEQIDNO:79和83的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包含選自SEQIDNO:81、85和88的氨基酸序列，并且輕鏈包含選自SEQIDNO:80、84和87的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含輕鏈，所述輕鏈包含選自SEQIDNO:80、84和87的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含重鏈，所述重鏈包含選自SEQIDNO:81、85和88的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含三個(gè)重鏈高變區(qū)(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三個(gè)輕鏈高變區(qū)(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：(a)HVR-H1包含SEQIDNO:62的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含SEQIDNO:66的氨基酸序列；(c)HVR-H3包含SEQIDNO:76的氨基酸序列；(d)HVR-L1包含SEQIDNO:55的氨基酸序列；(e)HVR-L2包含SEQIDNO:57的氨基酸序列；和(f)HVR-L3包含SEQIDNO:59的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)和/或六個(gè)高變區(qū)(HVR)序列的分離的抗血凝素抗體，其中：(a)HVR-H1包含SEQIDNO:62的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含SEQIDNO:66的氨基酸序列；(c)HVR-H3包含SEQIDNO:76的氨基酸序列；(d)HVR-L1包含SEQIDNO:55的氨基酸序列；(e)HVR-L2包含SEQIDNO:57的氨基酸序列；和(f)HVR-L3包含SEQIDNO:59的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含三個(gè)輕鏈高變區(qū)(HVR-L1、HVR-L2和LVR-L3)的分離的抗血凝素抗體，其中：(a)HVR-L1包含SEQIDNO:55的氨基酸序列；(b)HVR-L2包含SEQIDNO:57的氨基酸序列；和(c)HVR-L3包含SEQIDNO:59的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含三個(gè)重鏈高變區(qū)(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)的分離的抗血凝素抗體，其中：(a)HVR-H1包含SEQIDNO:62的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含SEQIDNO:66的氨基酸序列；和(c)HVR-H3包含SEQIDNO:76的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)輕鏈高變區(qū)(HVR)序列的分離的抗血凝素抗體，其中：(a)HVR-L1包含SEQIDNO:55的氨基酸序列；(b)HVR-L2包含SEQIDNO:57的氨基酸序列；和(c)HVR-L3包含SEQIDNO:59的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)重鏈高變區(qū)(HVR)序列的分離的抗血凝素抗體，其中：(a)HVR-H1包含SEQIDNO:62的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含SEQIDNO:66的氨基酸序列；和(c)HVR-H3包含SEQIDNO:76的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:89的氨基酸序列，并且輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:78的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:78的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:89的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包含SEQIDNO:90的氨基酸序列，并且輕鏈包含SEQIDNO:80的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含輕鏈，所述輕鏈包含SEQIDNO:80的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含重鏈，所述重鏈包含SEQIDNO:90的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含三個(gè)重鏈高變區(qū)(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三個(gè)輕鏈高變區(qū)(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：(a)HVR-H1包含SEQIDNO:63的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含選自SEQIDNO:67、68、69、70、71、72、73和74的氨基酸序列。(c)HVR-H3包含SEQIDNO:77的氨基酸序列；(d)HVR-L1包含SEQIDNO:56的氨基酸序列；(e)HVR-L2包含SEQIDNO:58的氨基酸序列；并且(f)HVR-L3包含SEQIDNO:60的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)和/或六個(gè)高變區(qū)(HVR)序列的分離的抗血凝素抗體，其中：(a)HVR-H1包含SEQIDNO:63的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含選自SEQIDNO:67、68、69、70、71、72、73和74的氨基酸序列。(c)HVR-H3包含SEQIDNO:77的氨基酸序列；(d)HVR-L1包含SEQIDNO:56的氨基酸序列；(e)HVR-L2包含SEQIDNO:58的氨基酸序列；并且(f)HVR-L3包含SEQIDNO:60的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含三個(gè)輕鏈高變區(qū)(HVR-L1、HVR-L2和LVR-L3)的分離的抗血凝素抗體，其中：(a)HVR-L1包含SEQIDNO:56的氨基酸序列；(b)HVR-L2包含SEQIDNO:58的氨基酸序列；和(c)HVR-L3包含SEQIDNO:60的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含三個(gè)重鏈高變區(qū)(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)的分離的抗血凝素抗體，其中：(a)HVR-H1包含SEQIDNO:63的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含選自SEQIDNO:67、68、69、70、71、72、73和74的氨基酸序列；并且(c)HVR-H3包含SEQIDNO:77的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)輕鏈高變區(qū)(HVR)序列的分離的抗血凝素抗體，其中：(a)HVR-L1包含SEQIDNO:56的氨基酸序列；(b)HVR-L2包含SEQIDNO:58的氨基酸序列；和(c)HVR-L3包含SEQIDNO:60的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)重鏈高變區(qū)(HVR)序列的分離的抗血凝素抗體，其中：(a)HVR-H1包含SEQIDNO:63的氨基酸序列；(b)HVR-H2包含選自SEQIDNO:67、68、69、70、71、72、73和74的氨基酸序列；并且(c)HVR-H3包含SEQIDNO:77的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中重鏈可變區(qū)包含選自SEQIDNO:92、95、97、99、101、103、105和107的氨基酸序列，并且輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:91的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:91的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含選自SEQIDNO:92、95、97、99、101、103、105和107的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包含選自SEQIDNO:94、96、98、100、102、104、106，和108的氨基酸序列，并且輕鏈包含SEQIDNO:93的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含輕鏈，所述輕鏈包含SEQIDNO:93的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體包含重鏈，所述重鏈包含選自SEQIDNO:94、96、98、100、102、104、106和108的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的抗血凝素抗體特異性結(jié)合乙型流感病毒血凝素。在一些實(shí)施方案中，分離的抗血凝素抗體是特異性結(jié)合乙型流感病毒血凝素的分離的抗血凝素單克隆抗體。本發(fā)明也提供編碼本發(fā)明抗血凝素抗體的分離核酸。本發(fā)明也提供載體，所述載體包含編碼本發(fā)明抗血凝素抗體的核酸。本發(fā)明也提供包含本發(fā)明核酸或載體的宿主細(xì)胞。載體可以是任何類(lèi)型，例如，重組載體如表達(dá)載體?？梢允褂枚喾N宿主細(xì)胞中的任一種。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，例如，大腸桿菌(E.coli)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生本發(fā)明抗血凝素抗體的方法。例如，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生抗血凝素抗體(如本文定義，其包括全長(zhǎng)抗體及其片段)的方法，所述方法包括在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼抗血凝素抗體或其片段的本發(fā)明重組載體，從而產(chǎn)生該抗體或其片段。在一些實(shí)施方案中，該方法包括培養(yǎng)包含編碼本發(fā)明抗血凝素抗體(或其片段)的核酸的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)該核酸。該方法還可以包括從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物或宿主細(xì)胞培養(yǎng)基回收抗血凝素抗體或其片段。本發(fā)明也提供包含本發(fā)明抗血凝素抗體和可藥用載體的藥物制劑。藥物制劑還可以包含額外的治療藥(例如，神經(jīng)氨酸酶抑制劑如奧司他韋或扎那米韋；另一種抗體如另一種抗血凝素抗體或抗M2抗體等)。本發(fā)明也提供包含本發(fā)明抗血凝素抗體的組合物。該組合物還可以包含額外的治療藥(例如，神經(jīng)氨酸酶抑制劑如奧司他韋或扎那米韋；另一種抗體如另一種抗血凝素抗體或抗M2抗體等)。本發(fā)明也提供一種用于預(yù)防乙型流感病毒感染的包含本發(fā)明抗血凝素抗體的組合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防乙型流感病毒感染的包含本發(fā)明抗血凝素抗體的藥物組合物。本發(fā)明還提供一種用于治療乙型流感病毒感染的包含本發(fā)明抗血凝素抗體的組合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于治療乙型流感病毒感染的包含本發(fā)明抗血凝素抗體的組合物。本發(fā)明還提供一種用于抑制乙型流感病毒感染的包含本發(fā)明抗血凝素抗體的組合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于抑制乙型流感病毒感染的包含本發(fā)明抗血凝素抗體的藥物組合物。包含本發(fā)明抗血凝素抗體的組合物也可以用于制造藥物。該藥物可以用于抑制、治療或預(yù)防乙型流感病毒。在某些實(shí)施方案中，該藥物還可以包含額外的治療藥(例如，神經(jīng)氨酸酶抑制劑如奧司他韋或扎那米韋；另一種抗體如另一種抗血凝素抗體或抗M2抗體等)。本發(fā)明也提供一種用于抑制乙型流感病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用有效量的包含本發(fā)明抗血凝素抗體的組合物，因而抑制乙型流感病毒感染。本發(fā)明也提供一種用于治療乙型流感病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用有效量的包含本發(fā)明抗血凝素抗體的組合物，因而治療乙型流感病毒感染。本發(fā)明也提供一種用于預(yù)防乙型流感病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用有效量的包含本發(fā)明抗血凝素抗體的組合物，因而預(yù)防乙型流感病毒感染。本發(fā)明也提供一種用于抑制、治療或預(yù)防乙型流感病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包含本發(fā)明抗血凝素抗體的組合物，并向該患者施用有效量的額外治療藥，因而抑制、治療或預(yù)防乙型流感病毒感染。在一些實(shí)施方案中，額外的治療藥是神經(jīng)氨酸酶抑制劑如奧司他韋或扎那米韋。在其他實(shí)施方案中，額外的治療藥是另一種抗血凝素抗體。在另外的其他實(shí)施方案中，額外的治療藥是抗M2抗體。在這類(lèi)聯(lián)合治療的多個(gè)方面，治療藥在大致相同的時(shí)間施用、同時(shí)施用或依次或連續(xù)施用。在具體的實(shí)施方案中，抗神經(jīng)氨酸酶抑制劑在施用本發(fā)明的抗血凝素抗體之前施用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗乙型流感病毒血凝素抗體有效中和、抑制、治療或預(yù)防因不同世系(包括祖先世系、山行世系和維多利亞世系)乙型流感病毒毒株所致的乙型流感病毒感染。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的抗血凝素抗體在制造藥物中的用途。該藥物可以用于抑制、治療或預(yù)防乙型流感病毒。在某些實(shí)施方案中，該藥物還可以包含額外的治療藥(例如，神經(jīng)氨酸酶抑制劑如奧司他韋或扎那米韋；另一種抗體如另一種抗血凝素抗體或抗M2抗體等)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的核酸在制造藥物中的用途。該藥物可以用于抑制、治療或預(yù)防乙型流感病毒。在某些實(shí)施方案中，該藥物還可以包含額外的治療藥(例如，神經(jīng)氨酸酶抑制劑如奧司他韋或扎那米韋；另一種抗體如另一種抗血凝素抗體或抗M2抗體等)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的表達(dá)載體在制造藥物中的用途。該藥物可以用于抑制、治療或預(yù)防乙型流感病毒。在某些實(shí)施方案中，該藥物還可以包含額外的治療藥(例如，神經(jīng)氨酸酶抑制劑如奧司他韋或扎那米韋；另一種抗體如另一種抗血凝素抗體或抗M2抗體等)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的宿主細(xì)胞在制造藥物中的用途。該藥物可以用于抑制、治療或預(yù)防乙型流感病毒。在某些實(shí)施方案中，該藥物還可以包含額外的治療藥(例如，神經(jīng)氨酸酶抑制劑如奧司他韋或扎那米韋；另一種抗體如另一種抗血凝素抗體或抗M2抗體等)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的制造品在制造藥物中的用途。該藥物可以用于抑制、治療或預(yù)防乙型流感病毒。在某些實(shí)施方案中，該藥物還可以包含額外的治療藥(例如，神經(jīng)氨酸酶抑制劑如奧司他韋或扎那米韋；另一種抗體如另一種抗血凝素抗體或抗M2抗體等)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的試劑盒在制造藥物中的用途。該藥物可以用于抑制、治療或預(yù)防乙型流感病毒。在某些實(shí)施方案中，該藥物還可以包含額外的治療藥(例如，神經(jīng)氨酸酶抑制劑如奧司他韋或扎那米韋；另一種抗體如另一種抗血凝素抗體或抗M2抗體等)。在多個(gè)方面中，本發(fā)明的抗血凝素抗體結(jié)合乙型流感病毒的血凝素。在其他方面，本發(fā)明的抗血凝素抗體結(jié)合血凝素并中和乙型流感病毒。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗血凝素抗體在體外、在體內(nèi)，或在體外及體內(nèi)中和乙型流感病毒。附圖簡(jiǎn)述圖1A和圖1B描述了多種乙型流感病毒分離株分別被單克隆抗體34B5A和單克隆抗體33F8在體外中和的數(shù)據(jù)。圖2描述了顯示多種乙型流感病毒分離株被單克隆抗體46B8A在體外中和的數(shù)據(jù)。圖3描述了顯示單克隆抗體34B5C和單克隆抗體46B8C影響血凝集抑制作用的數(shù)據(jù)。圖4描述了通過(guò)體外蝕斑抑制測(cè)定法顯示多種乙型流感病毒分離株被單克隆抗體46B8C中和的數(shù)據(jù)。圖5描述了顯示單克隆抗體34B5C和單克隆抗體46B8C影響血凝素介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合的數(shù)據(jù)。圖6A和圖6B描述了顯示與施用奧司他韋(達(dá)菲)的小鼠(圖6B)相比，以乙型流感病毒B/維多利亞/2000感染并施用各種量的單克隆抗體34B5A(圖6A)的小鼠的存活百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)。圖7A和圖7B分別描述了顯示以乙型流感病毒B/威斯康辛/2000感染并施用各種量的單克隆抗體34B5C的小鼠在感染后48小時(shí)或感染后72小時(shí)的存活百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)。圖8A、圖8B、圖8C和圖8D描述了顯示分別以乙型流感病毒B/威斯康辛/2010、B/維多利亞/2000、B/俄羅斯/1969和B/馬薩諸塞/1966感染小鼠和單克隆抗體46B8C在感染后24、48或72小時(shí)施用的存活百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)。圖9A和圖9B描述了顯示分別以乙型流感病毒B/威斯康辛/2010和B/維多利亞/2000感染小鼠并在感染后72小時(shí)施用各種量的單克隆抗體46B8C的存活百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)。圖10A和圖10B描述了分別顯示以乙型流感病毒B/維多利亞/2000感染并施用單克隆抗體46B8C或奧司他韋(達(dá)菲)的小鼠的存活百分?jǐn)?shù)和體重(BW)變化百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)。圖11A和圖11B描述了顯示施用單獨(dú)或組合的單克隆抗體46B8C和奧司他韋(達(dá)菲)分別對(duì)小鼠中存活百分?jǐn)?shù)和肺部病毒滴度的影響的數(shù)據(jù)。圖12A和圖12B描述了顯示共施用單克隆抗體46B8C和奧司他韋(達(dá)菲)的影響的數(shù)據(jù)圖13描述了本發(fā)明抗乙型流感病毒抗體的輕鏈高變區(qū)和重鏈高變區(qū)的氨基酸序列。圖14描述了mAb34B5A的輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、輕鏈和重鏈的氨基酸序列。圖15描述了mAb34B5B的輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、輕鏈和重鏈的氨基酸序列。圖16描述了mAb34B5C的輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、輕鏈和重鏈的氨基酸序列。圖17描述了mAb33F8的輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、輕鏈和重鏈的氨基酸序列。圖18描述了mAb46B8A的輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、輕鏈和重鏈的氨基酸序列。圖19描述了mAb46B8B的輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、輕鏈和重鏈的氨基酸序列。圖20描述了mAb46B8C的輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、輕鏈和重鏈的氨基酸序列。圖21描述了mAb46B8D的輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、輕鏈和重鏈的氨基酸序列。圖22描述了mAb46B8E的輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、輕鏈和重鏈的氨基酸序列。圖23描述了mAb46B8F的輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、輕鏈和重鏈的氨基酸序列。圖24描述了mAb46B8G的輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、輕鏈和重鏈的氨基酸序列。圖25描述了mAb46B8H的輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、輕鏈和重鏈的氨基酸序列。圖26A和圖26B描述了分別顯示以乙型流感病毒B/布里斯班/2008感染并施用單克隆抗體46B8C的小鼠的存活百分?jǐn)?shù)和體重(BW)變化百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)。本發(fā)明實(shí)施方案的詳細(xì)描述I.定義出于本文目的，“接納體人類(lèi)構(gòu)架”是這樣的構(gòu)架，它包含源自人免疫球蛋白構(gòu)架的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)構(gòu)架或重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)構(gòu)架或如下文定義的人共有序列構(gòu)架的氨基酸序列?！把苌浴比嗣庖咔虻鞍讟?gòu)架或人共有構(gòu)架的接納體人類(lèi)構(gòu)架可以包含其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列變化。在一些實(shí)施方案中，氨基酸變化的數(shù)目是10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小、或2或更小。在一些實(shí)施方案中，VL接納體人類(lèi)構(gòu)架在序列上與VL人免疫球蛋白構(gòu)架序列或人類(lèi)共有構(gòu)架序列相同。“親和力”指分子(例如，抗體)的單一結(jié)合位點(diǎn)及其結(jié)合配偶體(例如，抗原)之間總計(jì)非共價(jià)相互作用的強(qiáng)度。除非另外指出，否則如本文所用，“結(jié)合親和力”指反映結(jié)合對(duì)子的成員(例如，抗體和抗原)之間1:1相互作用的固有結(jié)合親和力。分子X(jué)對(duì)其配偶物Y的親和力可以通常由解離常數(shù)(Kd)代表。親和力可以由本領(lǐng)域已知的常見(jiàn)方法測(cè)量，包括本文所述的那些方法。在下文中描述用于測(cè)量結(jié)合親和力的具體示意性和示例性實(shí)施方案?！坝H和力成熟的”抗體指在一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)(HVR)中存在一個(gè)或多個(gè)改變的抗體，其中與不擁有這些改變的親本抗體相比，這類(lèi)改變導(dǎo)致抗體對(duì)抗原的親和力改善。術(shù)語(yǔ)“抗血凝素抗體”和“與血凝素結(jié)合的抗體”指這樣的抗體，所述抗體以足夠親和力結(jié)合血凝素，從而該抗體可用作靶向血凝素、包括靶向流感病毒血凝素中的診斷劑和/或治療劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗血凝素抗體與不相關(guān)的非血凝素蛋白結(jié)合的程度小于該抗體與血凝素結(jié)合的程度約10％，如通過(guò)放射免疫測(cè)定(RIA)所測(cè)量。在某些實(shí)施方案中，與血凝素結(jié)合的抗體具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更小、例如從10-8M至10-13M、例如從10-9M至10-13M)的解離常數(shù)(Kd)。在某些實(shí)施方案中，抗血凝素抗體與來(lái)自乙型流感病毒不同毒株、亞型和分離株的血凝素之間的乙型流感病毒保守血凝素表位(如，祖先世系、維多利亞世系或山行世系乙型流感病毒的血凝素的表位)結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“抗體”在本文中以最廣意義使用并且涵蓋多種抗體結(jié)構(gòu)物，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們顯示出所需的抗原結(jié)合活性即可?！翱贵w片段”指不同于完整抗體的分子，所述分子包括完整抗體的一部分，該部分結(jié)合完整抗體所結(jié)合的抗原。抗體片段還指除完整抗體之外的分子，所述分子包含完整抗體的結(jié)合血凝素并中和甲型流感病毒的部分?？贵w片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；雙體抗體(diabodies)；線性抗體(linearantibodies)；單鏈抗體分子(例如scFv)；和從抗體片段形成的多特異性抗體。“與參考抗體結(jié)合相同表位的抗體”指在競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法中阻斷參考抗體與其抗原結(jié)合達(dá)50％或更多的抗體，并且反過(guò)來(lái)，參考抗體在競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法中阻斷該抗體與其抗原結(jié)合達(dá)50％或更多。本文提供示例性競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法。術(shù)語(yǔ)“嵌合”抗體指一種抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分衍生自特定來(lái)源或物種，而重鏈和/或輕鏈的剩余部分衍生自不同來(lái)源或物種?？贵w的“類(lèi)”指由其重鏈擁有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類(lèi)型。存在五個(gè)主要類(lèi)別的抗體：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且這些類(lèi)別中的幾種可以進(jìn)一步劃分成亞類(lèi)(同種型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同類(lèi)別免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱(chēng)作α、δ、ε、γ和μ。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性劑”指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或造成細(xì)胞死亡或破壞的物質(zhì)。細(xì)胞毒性劑包括但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化療藥或藥物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、長(zhǎng)春堿類(lèi)生物堿(長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、依托泊苷)、多柔比星、美法侖、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥、佐柔比星或其他嵌入劑)；生長(zhǎng)抑制劑；酶及其片段如溶核酶；抗生素；毒素如細(xì)菌源、真菌源、植物源或動(dòng)物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體；和下文公開(kāi)的各種抗腫瘤劑或抗癌劑?！靶?yīng)子功能”指隨抗體同種型變動(dòng)的歸因于抗體Fc區(qū)的那些生物學(xué)活性。抗體效應(yīng)子功能的例子包括：C1q結(jié)合和補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性(CDC)；Fc受體結(jié)合作用；抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性(ADCC)；吞噬；下調(diào)細(xì)胞表面受體(例如，B細(xì)胞受體)；和B細(xì)胞活化。藥劑(例如，藥物制劑)的“有效量”指有效實(shí)現(xiàn)所需治療性或預(yù)防性結(jié)果的量、以實(shí)現(xiàn)前述結(jié)果的劑量和持續(xù)實(shí)現(xiàn)前述結(jié)果所需要的時(shí)間段。術(shù)語(yǔ)“Fc區(qū)”在本文中用來(lái)定義免疫球蛋白重鏈的含有至少一部分恒定區(qū)的C端區(qū)域。該術(shù)語(yǔ)包括天然序列Fc區(qū)和變體Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人IgG重鏈Fc區(qū)從Cys226或從Pro230延伸至重鏈的羧基端。然而，F(xiàn)c區(qū)的C端賴(lài)氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外說(shuō)明，否則Fc區(qū)或恒定區(qū)中的氨基酸殘基的編號(hào)根據(jù)如Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInteres,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991中所述的EU編號(hào)體系，也稱(chēng)作EU索引?！皹?gòu)架”或“FR”指除高變區(qū)(HVR)殘基之外的可變結(jié)構(gòu)域殘基?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的FR通常由以下4個(gè)FR結(jié)構(gòu)域組成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下序列出現(xiàn)在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。術(shù)語(yǔ)“全長(zhǎng)抗體”、“完好抗體”和“完整抗體”在本文中可互換地用來(lái)指一種抗體，所述抗體具有基本上與天然抗體結(jié)構(gòu)相似的結(jié)構(gòu)或具有含有如本文定義的Fc區(qū)的重鏈。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞系”和“宿主細(xì)胞培養(yǎng)物”互換使用并且指已經(jīng)向其中引入外源核酸的細(xì)胞，包括這類(lèi)細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞包括“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”，其包括原代轉(zhuǎn)化細(xì)胞和從其衍生的后代，而無(wú)論傳代次數(shù)是多少。后代可以在核酸含量方面不與親本細(xì)胞完全相同，反而可以含有突變。本文包括具有與最初轉(zhuǎn)化細(xì)胞中所篩選或選擇的相同功能或生物學(xué)活性的突變后代。“人抗體”是這樣的抗體，其擁有對(duì)應(yīng)于人或人細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列或從利用人抗體庫(kù)或其他編碼人抗體的序列的非人來(lái)源衍生。人抗體的這種定義特別排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體?！叭祟?lèi)共有構(gòu)架”是這樣的構(gòu)架，它代表在人免疫球蛋白VL或VH構(gòu)架序列的選擇中最常出現(xiàn)的氨基酸殘基。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的選擇來(lái)自可變結(jié)構(gòu)域序列的亞組。通常，序列亞組是如Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，NIHPublication91-3242,BethesdaMD(1991)，第1-3卷中描述的亞組。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于VL，該亞組是如上文Kabat等人中描述的亞組κI。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于VH，該亞組是如上文Kabat等人中描述的亞組III?！叭嗽椿笨贵w指包含來(lái)自非人類(lèi)HVR的氨基酸殘基和來(lái)自人FR的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體將包含至少1個(gè)、并且一般2個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)與非人抗體的那些HVR對(duì)應(yīng)并且全部或基本上全部的FR區(qū)與人抗體的那些FR對(duì)應(yīng)。人源化抗體任選地可以包含從人抗體衍生的抗體恒定區(qū)的至少一部分。抗體的“人源化形式”例如，非人抗體，指已經(jīng)歷過(guò)人源化的抗體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”或“HVR”指抗體可變結(jié)構(gòu)域的下述每個(gè)區(qū)域，所述區(qū)域在序列上高變(“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”)和/或形成結(jié)構(gòu)上確定的環(huán)(“高變環(huán)”)，和/或含有抗原接觸殘基(“抗原觸點(diǎn)”)。通常，抗體包含六個(gè)HVR：VH中三個(gè)(H1、H2、H3)和VL中三個(gè)(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包括：(a)出現(xiàn)在第26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)氨基酸殘基處的高變環(huán)(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；(b)出現(xiàn)在第24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)氨基酸殘基處的CDR(Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991))；(c)出現(xiàn)在氨基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)處的抗原觸點(diǎn)(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和(d)(a)、(b)和/或(c)的組合，包括HVR氨基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。除非另外說(shuō)明，否則HVR殘基和可變結(jié)構(gòu)域中的其他殘基(例如，F(xiàn)R殘基)在本文中根據(jù)上文Kabat等人編號(hào)?！懊庖呔Y合物”是與一個(gè)或多個(gè)異源分子(包括但不限于細(xì)胞毒性劑)綴合的抗體?！皞€(gè)體”或“受試者”是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括但不限于馴化動(dòng)物(例如，奶牛、綿羊、貓、犬和馬)、靈長(zhǎng)類(lèi)(例如，人和非人靈長(zhǎng)類(lèi)如猴)、兔和嚙齒類(lèi)(例如，小鼠和大鼠)。在某些實(shí)施方案中，個(gè)體或受試者是人。“分離的”抗體是已經(jīng)與其自然環(huán)境的組分分離的一種抗體。在一些實(shí)施方案中，將抗體純化至大于95％或99％純度，如通過(guò)例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細(xì)管電泳法)或色譜(例如，離子交換或反相HPLC)所確定。關(guān)于評(píng)估抗體純度的方法的綜述，參見(jiàn)，例如，F(xiàn)latman等人,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)?！胺蛛x的”核酸指已經(jīng)與其自然環(huán)境的組分分離的核酸分子。分離的核酸包括含于細(xì)胞內(nèi)的核酸分子，所述細(xì)胞通常含有該核酸分子，但是該核酸分子存在于染色體外或與其天然染色體位置不同的染色體位置處?！熬幋a抗血凝素抗體的分離核酸”指編碼抗體重鏈和輕鏈(或其片段)的一個(gè)或多個(gè)核酸分子，包括在單一載體或獨(dú)立載體中的這類(lèi)核酸分子和在宿主細(xì)胞中一個(gè)或多個(gè)位置處存在的這類(lèi)核酸分子。如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指從基本上均一的抗體群體獲得的抗體，即，構(gòu)成該群體的各個(gè)抗體是相同的和/或結(jié)合相同的表位，除了可能的變體抗體之外(例如，含有天然存在突變或在產(chǎn)生單克隆抗體制備物期間出現(xiàn))，這類(lèi)變體通常以微小的量存在。與一般包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物相反，單克隆抗體制備物的每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。因此，修飾語(yǔ)“單克隆的”指示該抗體的特征為從基本上均一的抗體群體獲得，并且不得解釋為要求通過(guò)任何特定方法產(chǎn)生該抗體。例如，可以通過(guò)多種技術(shù)產(chǎn)生待根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體，所述技術(shù)包括但不限于雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，本文中描述了用于產(chǎn)生單克隆抗體的這類(lèi)方法和其他示例性方法?！奥憧贵w”指不與異源部分(例如，細(xì)胞毒部分)或放射標(biāo)記物綴合的抗體。裸抗體可以存在于藥物制劑中。“天然抗體”指具有不同結(jié)構(gòu)的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是由二硫鍵結(jié)合的兩條相同輕鏈和兩條相同重鏈組成的約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。從N端至C端，每條重鏈具有一個(gè)可變區(qū)(VH)，也稱(chēng)作可變重鏈結(jié)構(gòu)域或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，隨后是三個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2和CH3)。類(lèi)似地，從N端至C端，每條輕鏈具有一個(gè)可變區(qū)(VL)，也稱(chēng)作可變輕鏈結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，隨后一個(gè)恒定輕鏈(CL)結(jié)構(gòu)域。抗體的輕鏈可以基于其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列而劃分成兩種類(lèi)型之一，稱(chēng)作κ(κ)和λ(λ)。術(shù)語(yǔ)“包裝插頁(yè)”用來(lái)指治療產(chǎn)品的商業(yè)包裝中習(xí)慣性包括的說(shuō)明書(shū)，所述說(shuō)明書(shū)含有關(guān)于適應(yīng)癥、用法、劑量、施用、聯(lián)合療法、禁忌癥和/或涉及此類(lèi)治療產(chǎn)品用途之警告的信息。相對(duì)于參考多肽序列，將“氨基酸序列同一性百分?jǐn)?shù)(％)”定義為比對(duì)序列并根據(jù)需要引入空位以實(shí)現(xiàn)最大序列同源性百分?jǐn)?shù)并且不考慮任何保守性置換作為序列同一性的部分之后，候選序列中與參考多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)。用于確定氨基酸序列同一性百分?jǐn)?shù)的比對(duì)可以按本領(lǐng)域能力范圍內(nèi)的多種方式實(shí)現(xiàn)，例如，使用可公開(kāi)獲得的計(jì)算機(jī)軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于比對(duì)序列的適宜參數(shù)，包括為實(shí)現(xiàn)正在比較的全長(zhǎng)序列范圍內(nèi)最大比對(duì)所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2產(chǎn)生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech,Inc.授權(quán)，并且源代碼已經(jīng)隨用戶(hù)文檔提交至華盛頓特區(qū)20559的美國(guó)版權(quán)局，在那里它以美國(guó)版權(quán)登記號(hào)TXU510087登記。ALIGN-2程序從Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,加利福尼亞州可公開(kāi)獲得或可以從源代碼匯編。應(yīng)當(dāng)將ALIGN-2程序匯編在UNIX操作系統(tǒng)(包括數(shù)字式UNIXV4.0D)上使用。全部序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定并且不變動(dòng)。在使用ALIGN-2比較氨基酸序列的情況下，如下計(jì)算給定氨基酸序列A與給定氨基酸序列B、同給定氨基酸序列B或針對(duì)給定氨基酸序列B(這可以備選地描述為與給定氨基酸序列B、同給定氨基酸序列B或針對(duì)給定氨基酸序列B具有或包含某個(gè)氨基酸序列同一性％的給定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％：100乘以分?jǐn)?shù)X/Y其中X是由序列比對(duì)程序ALIGN-2在該程序的A和B比對(duì)結(jié)果中評(píng)定為相同匹配的氨基酸殘基的數(shù)目，并且其中Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)。將可以理解在氨基酸序列A的長(zhǎng)度不等于氨基酸序列B的長(zhǎng)度時(shí)，A相對(duì)于B的氨基酸序列同一性％將不等于B相對(duì)于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特別聲明，否則本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如緊接前段中所述那樣使用ALIGN-2計(jì)算機(jī)程序獲得。術(shù)語(yǔ)“藥物制劑”指一種制備物，所述制備物處于這類(lèi)形式從而允許其中所含的有效成分的生物學(xué)活性有效，并且不含有對(duì)于將會(huì)施用該制劑的受試者不可接受地有毒的額外組分?！翱伤幱幂d體”指藥物制劑中除有效成分之外的對(duì)受試者無(wú)毒的成分?？伤幱幂d體包括但不限于緩沖劑、賦形劑、穩(wěn)定劑或防腐劑。除非另外說(shuō)明，否則如本文所用的術(shù)語(yǔ)“血凝素”指來(lái)自任何流感病毒來(lái)源的任何天然血凝素。本術(shù)語(yǔ)涵蓋“全長(zhǎng)”、未加工的血凝素”以及因流感病毒或流感病毒感染的細(xì)胞中加工過(guò)程產(chǎn)生的任何形式的血凝素。本術(shù)語(yǔ)還涵蓋天然存在的血凝素變體，例如，剪接變體或等位變體。來(lái)自多種乙型流感病毒毒株或世系的示例性血凝素蛋白的氨基酸序列是本領(lǐng)域輕易可獲得的。如本文所用，名詞“治療”(和其語(yǔ)法變型如動(dòng)詞“治療”或分詞“治療”)指意欲改變正在接受治療的個(gè)體的天然過(guò)程的臨床介入，并且可以旨在預(yù)防或在臨床病理學(xué)過(guò)程期間實(shí)施。想要的治療效果包括但不限于防止疾病出現(xiàn)或復(fù)發(fā)(例如，預(yù)防乙型流感病毒感染的出現(xiàn)或復(fù)發(fā))，減少(例如，減少)或減輕癥狀、減小疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果、降低病情進(jìn)展速率、改善或緩和疾病狀態(tài)，以及緩解或預(yù)后改善。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用來(lái)延緩疾病發(fā)展或用來(lái)減慢疾病的進(jìn)展。術(shù)語(yǔ)“可變區(qū)”或“可變結(jié)構(gòu)域”指抗體重鏈或輕鏈的參與抗體結(jié)合至抗原的結(jié)構(gòu)域。天然抗體重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域(分別是VH和VL)通常具有相似的結(jié)構(gòu)，每種結(jié)構(gòu)域包含四個(gè)保守的構(gòu)架區(qū)(FR)和三個(gè)高變區(qū)(HVR)。(參見(jiàn)，例如，Kindt等人,KubyImmunology,第6版,W.H.FreemanandCo.,第91頁(yè)(2007))。單個(gè)VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域可能足以賦予抗原結(jié)合特異性。另外，結(jié)合特定抗原的抗體可以利用來(lái)自結(jié)合該抗原的抗體的VH或VL結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分離以分別篩選互補(bǔ)性VL結(jié)構(gòu)域或VH結(jié)構(gòu)域的文庫(kù)。參見(jiàn)，例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature352:624-628(1991)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“載體”指能夠增殖與其連接的另一種核酸的核酸分子。該術(shù)語(yǔ)包括作為自我復(fù)制型核酸結(jié)構(gòu)的載體以及并入已經(jīng)將該載體引入其中的宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)的載體。某些載體能夠指導(dǎo)與它們有效連接的核酸表達(dá)。此類(lèi)載體在本文中稱(chēng)作“表達(dá)載體”。II.組合物和方法在一個(gè)方面，本發(fā)明部分地基于抗血凝素抗體及其用途。在某些實(shí)施方案中，提供與血凝素結(jié)合的抗體。本發(fā)明的抗體例如用于診斷、治療或預(yù)防甲型流感病毒感染。A.示例性抗血凝素抗體在一個(gè)方面，本發(fā)明提供與血凝素結(jié)合的分離抗體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗血凝素抗體結(jié)合血凝素，結(jié)合來(lái)自乙型流感病毒的血凝素，結(jié)合來(lái)自乙型流感病毒山行世系的血凝素，結(jié)合來(lái)自乙型流感病毒維多利亞世系的血凝素，結(jié)合來(lái)自乙型流感病毒祖先世系的血凝素，或結(jié)合來(lái)自乙型流感病毒山行世系、維多利亞世系和祖先世系的血凝素。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗血凝素抗體在體外中和乙型流感病毒。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗血凝素抗體在體內(nèi)中和乙型流感病毒。在另外的其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗血凝素抗體減少乙型流感病毒感染、預(yù)防乙型流感病毒感染、抑制乙型流感病毒感染或治療乙型流感病毒感染。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗血凝素抗體預(yù)防、抑制或減少血凝素介導(dǎo)的流感病毒膜和感染細(xì)胞內(nèi)體膜之間的融合(由此預(yù)防、抑制或減少病毒RNA進(jìn)入感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，因此預(yù)防、抑制或減少流感病毒感染的進(jìn)一步傳播)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗血凝素抗體，所述抗血凝素抗體包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)選自以下的HVR：(a)包含SEQIDNO:61的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:64的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:75的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:57的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:59的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗血凝素抗體，所述抗血凝素抗體包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)選自以下的HVR：(a)包含SEQIDNO:61的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:65的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:75的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:57的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:59的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供提供一種抗體，所述抗體包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)選自以下的VHHVR序列：(a)包含SEQIDNO:61的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:64的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:75的氨基酸序列的HVR-H3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供提供一種抗體，所述抗體包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)選自以下的VHHVR序列：(a)包含SEQIDNO:61的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:65的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:75的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗體，所述抗體包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)選自以下的VLHVR序列：(a)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:57的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:59的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗體，所述抗體包含了(a)包含SEQIDNO:61的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:64的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:75的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:57的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含選自SEQIDNO:59的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗體，所述抗體包含了(a)包含SEQIDNO:61的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:65的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:75的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:57的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含選自SEQIDNO:59的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含重鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含選自SEQIDNO:79和83的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含輕鏈可變區(qū)的抗體，所述輕鏈可變區(qū)包含選自SEQIDNO:78、82和86的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含選自SEQIDNO:79和83的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含選自SEQIDNO:78、82和86的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:79的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:78的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:83的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:82的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:83的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:86的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含重鏈的抗體，所述重鏈包含選自SEQIDNO:81、85和88的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含輕鏈的抗體，所述輕鏈包含選自SEQIDNO:80、84和87的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈包含選自SEQIDNO:81、85和88的氨基酸序列，所述輕鏈包含選自SEQIDNO:80、84和87的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈包含SEQIDNO:81的氨基酸序列，所述輕鏈包含SEQIDNO:80的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈包含SEQIDNO:85的氨基酸序列，所述輕鏈包含選自SEQIDNO:84的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈包含SEQIDNO:88的氨基酸序列，所述輕鏈包含SEQIDNO:87的氨基酸序列。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗血凝素抗體，所述抗血凝素抗體包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)選自以下的HVR：(a)包含SEQIDNO:62的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:66的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:76的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:57的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:59的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供提供一種抗體，所述抗體包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)選自以下的VHHVR序列：(a)包含SEQIDNO:62的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:66的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:76的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗體，所述抗體包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)選自以下的VLHVR序列：(a)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:57的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:59的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗體，所述抗體包含了(a)包含SEQIDNO:62的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:66的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:76的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:57的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含選自SEQIDNO:59的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含重鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:89的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含輕鏈可變區(qū)的抗體，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:78的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:89的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:78的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈包含SEQIDNO:90的氨基酸序列，所述輕鏈包含SEQIDNO:80的氨基酸序列。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗血凝素抗體，所述抗血凝素抗體包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)選自以下的HVR：(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含選自SEQIDNO:67、68、69、70、71、72、73和74的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗血凝素抗體，所述抗血凝素抗體包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)選自以下的HVR：(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:67的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗血凝素抗體，所述抗血凝素抗體包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)選自以下的HVR：(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:68的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗血凝素抗體，所述抗血凝素抗體包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)選自以下的HVR：(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:69的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗血凝素抗體，所述抗血凝素抗體包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)選自以下的HVR：(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:70的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗血凝素抗體，所述抗血凝素抗體包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)選自以下的HVR：(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:71的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗血凝素抗體，所述抗血凝素抗體包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)選自以下的HVR：(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:72的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗血凝素抗體，所述抗血凝素抗體包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)選自以下的HVR：(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:73的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗血凝素抗體，所述抗血凝素抗體包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)選自以下的HVR：(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:74的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供提供一種抗體，所述抗體包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)選自以下的VHHVR序列：(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:67的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供提供一種抗體，所述抗體包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)選自以下的VHHVR序列：(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:68的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供提供一種抗體，所述抗體包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)選自以下的VHHVR序列：(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:69的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供提供一種抗體，所述抗體包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)選自以下的VHHVR序列：(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:70的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供提供一種抗體，所述抗體包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)選自以下的VHHVR序列：(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:71的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供提供一種抗體，所述抗體包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)選自以下的VHHVR序列：(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:72的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供提供一種抗體，所述抗體包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)選自以下的VHHVR序列：(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:73的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供提供一種抗體，所述抗體包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)選自以下的VHHVR序列：(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:74的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗體，所述抗體包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)選自以下的VLHVR序列：(a)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗體，所述抗體包含了(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:67的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含選自SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗體，所述抗體包含了(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:68的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含選自SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗體，所述抗體包含了(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:69的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含選自SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗體，所述抗體包含了(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:70的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含選自SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗體，所述抗體包含了(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:71的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含選自SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗體，所述抗體包含了(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:72的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含選自SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供提供一種抗體，所述抗體包含了：(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:73的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含選自SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗體，所述抗體包含了(a)包含SEQIDNO:63的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:74的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:77的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含選自SEQIDNO:60的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含重鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含選自SEQIDNO:92、95、97、99、101、103、105和107的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含輕鏈可變區(qū)的抗體，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:91的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)包含選自SEQIDNO:92、95、97、99、101、103、105和107的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:91的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:92的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:91的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:95的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:91的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:97的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:91的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:99的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:91的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:101的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:91的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:103的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:91的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:105的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:91的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:107的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:91的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含重鏈的抗體，所述重鏈包含選自SEQIDNO:94、96、98、100、102、104、106和108的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含輕鏈的抗體，所述輕鏈包含SEQIDNO:93的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含重鏈和輕鏈的抗體，其中所述重鏈包含選自SEQIDNO:NO:94、96、98、100、102、104、106和108的氨基酸序列，所述輕鏈包含SEQIDNO:93的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈包含SEQIDNO:94的氨基酸序列，所述輕鏈包含SEQIDNO:93的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈包含SEQIDNO:96的氨基酸序列，所述輕鏈包含SEQIDNO:93的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈包含SEQIDNO:98的氨基酸序列，所述輕鏈包含SEQIDNO:93的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈包含SEQIDNO:100的氨基酸序列，所述輕鏈包含SEQIDNO:93的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈包含SEQIDNO:102的氨基酸序列，所述輕鏈包含SEQIDNO:93的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈包含SEQIDNO:104的氨基酸序列，所述輕鏈包含SEQIDNO:93的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈包含SEQIDNO:106的氨基酸序列，所述輕鏈包含SEQIDNO:93的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈包含SEQIDNO:108的氨基酸序列，所述輕鏈包含SEQIDNO:93的氨基酸序列。在任一以上實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗血凝素抗體是人源化的。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗血凝素抗體包含如以上實(shí)施方案的任一項(xiàng)中的HVR，并且還包含接納體人類(lèi)構(gòu)架，例如，人免疫球蛋白構(gòu)架或人類(lèi)共有構(gòu)架。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的抗血凝素抗體包含與選自SEQIDNO:79、83、89、92、95、97、99、101、103、105和107的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)序列。在某些實(shí)施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相對(duì)于參考序列含有置換(例如，保守性置換)、插入或缺失，但是包含該序列的抗血凝素抗體保留與血凝素結(jié)合的能力。在某些實(shí)施方案中，已經(jīng)在SEQIDNO:79、83、89、92、95、97、99、101、103、105或107中置換、插入和/或缺失總計(jì)1至10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，置換、插入或缺失出現(xiàn)在HVR外部的區(qū)域內(nèi)(即，在FR中)。任選地，抗血凝素抗體包含在SEQIDNO:79、83、89、92、95、97、99、101、103、105或107中的VH序列，包括該序列的翻譯后修飾。在另一個(gè)方面，提供抗血凝素抗體，其中該抗體包含與選自SEQIDNO:78、82、86和91的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)。在某些實(shí)施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相對(duì)于參考序列含有置換(例如，保守性置換)、插入或缺失，但是包含該序列的抗血凝素抗體保留與血凝素結(jié)合的能力。在某些實(shí)施方案中，已經(jīng)在SEQIDNO:78、82、86或91中置換、插入和/或缺失總計(jì)1至10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，置換、插入或缺失出現(xiàn)在HVR外部的區(qū)域中(即，在FR中)。任選地，抗血凝素抗體包含在SEQIDNO:78、82、86或91中的VL序列，包括該序列的翻譯后修飾。在另一個(gè)方面，提供一種抗血凝素抗體，其中該抗體包含如上文提供的任一個(gè)實(shí)施方案中的VH和如上文提供的任一個(gè)實(shí)施方案中的VL。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含分別在SEQIDNO:79、83、89、92、95、97、99、101、103、105或107和SEQIDNO:78、82、86或91中的VH和VL序列，包括這些序列的翻譯后修飾。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種抗體，所述抗體與本文提供的抗血凝素抗體相同的表位結(jié)合。例如，在某些實(shí)施方案中，提供與下述抗血凝素抗體的相同表位結(jié)合的抗體，所述抗血凝素抗體包含SEQIDNO:79的VH序列和SEQIDNO:78的VL序列；SEQIDNO:83的VH序列和SEQIDNO:82的VL序列；SEQIDNO:83的VH序列和SEQIDNO:86的VL序列；SEQIDNO:89的VH序列和SEQIDNO:78的VL序列；SEQIDNO:92的VH序列和SEQIDNO:91的VL序列；SEQIDNO:95的VH序列和SEQIDNO:91的VL序列；SEQIDNO:97的VH序列和SEQIDNO:91的VL序列；SEQIDNO:99的VH序列和SEQIDNO:91的VL序列；SEQIDNO:101的VH序列和SEQIDNO:91的VL序列；SEQIDNO:103的VH序列和SEQIDNO:91的VL序列；SEQIDNO:105的VH序列和SEQIDNO:91的VL序列；SEQIDNO:107的VH序列和SEQIDNO:91的VL序列。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，根據(jù)任一個(gè)以上實(shí)施方案的抗血凝素抗體是單克隆抗體，包括嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗血凝素抗體是抗體片段，例如，F(xiàn)v、Fab、Fab’、scFv、雙體抗體或F(ab’)2片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體是全長(zhǎng)抗體，例如，完整IgG1抗體或如本文定義的其他抗體類(lèi)別或同種型。在又一個(gè)方面，根據(jù)任一個(gè)以上實(shí)施方案的抗血凝素抗體可以單獨(dú)或以組合方式合并如下文1-7部分中所述的任一特征：1.抗體親和力在某些實(shí)施方案中，本文提供的抗體具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如從10-8M至10-13M，例如，從10-9M至10-13M)的解離常數(shù)(Kd)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)放射標(biāo)記的抗原結(jié)合測(cè)定法(RIA)測(cè)量Kd。在一個(gè)實(shí)施方案中，用Fab形式的目的抗體及其抗原實(shí)施RIA。例如，通過(guò)以下方式測(cè)量Fab對(duì)抗原的溶液結(jié)合親和力：在未標(biāo)記抗原的滴定系列存在下用最低濃度的(125I)標(biāo)記的抗原平衡Fab，隨后用抗Fab抗體包被的平板捕獲結(jié)合的抗原(參見(jiàn)，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。為了建立該測(cè)定法的條件，將多孔板(ThermoScientific)用50mM碳酸鈉(pH9.6)中的5μg/mL抗Fab捕獲抗體(CappelLabs)包被過(guò)夜并隨后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室溫(大約23℃)封閉2至5小時(shí)。在不吸附性平板(Nunc#269620)中，將100pM或26pM[125I]-抗原與目的Fab的系列稀釋物(例如，與Presta等人,CancerRes.57:4593-4599(1997)中評(píng)估抗VEGF抗體Fab-12一致)混合。隨后將目的Fab溫育過(guò)夜；然而，溫育可以持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間(例如，約65小時(shí))以確保達(dá)到平衡。此后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕獲平板以便在室溫溫育(例如，1小時(shí))。隨后移除溶液并將平板用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20洗滌8次。當(dāng)平板已經(jīng)干燥時(shí)，添加150μl/孔閃爍體(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且將平板在TOPCOUNTTMγ計(jì)數(shù)器(Packard)上計(jì)數(shù)10分鐘。選擇產(chǎn)生小于或等于20％最大結(jié)合作用的每種Fab的濃度用于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法中。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，使用表面等離子體共振測(cè)定法測(cè)量Kd。例如，在25℃采用固定化抗原CM5芯片以約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)進(jìn)行使用-2000或-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的測(cè)定法。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)供應(yīng)商說(shuō)明書(shū)，以鹽酸N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物傳感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。將抗原用10mM乙酸鈉，pH4.8稀釋至5μg/ml(約0.2μM)，隨后以5μl/分鐘的流速上樣以實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)蛋白的大約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)。注射抗原后，注入1M乙醇胺以封閉未反應(yīng)的基團(tuán)。對(duì)于動(dòng)力學(xué)測(cè)量，在25℃以大約25μL/分鐘的流速注入含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性劑的PBS中(PBST)的2倍系列Fab稀釋物(例如，0.78nM至500nM)。使用簡(jiǎn)單一對(duì)一Langmuir結(jié)合模型(評(píng)價(jià)軟件3.2版)，通過(guò)同時(shí)擬合締合和解離傳感圖(sensorgram)，計(jì)算締合速率(kon)和解離速率(koff)。將平衡解離常數(shù)(Kd)計(jì)算為koff/kon比。參見(jiàn)，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通過(guò)以上表面等離子體共振測(cè)定法顯示締合速率超過(guò)106M-1s-1，則可以使用熒光猝滅技術(shù)測(cè)定締合速率，其中在如光譜儀(如配備止流閥(stop-flow)的分光光度計(jì)(AvivInstruments)或具有攪拌型比色皿的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度計(jì)(ThermoSpectronic))中所測(cè)量的增加濃度的抗原存在下，所述熒光猝滅技術(shù)在25℃測(cè)量在PBS,pH7.2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)的熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)＝295nm；發(fā)射＝340nm，16nm帶通)增加或減少。2.抗體片段在某些實(shí)施方案中，本文提供的抗體是抗體片段?？贵w片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段和下文描述的其他片段。關(guān)于某些抗體片段的綜述，參見(jiàn)Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)。關(guān)于scFv片段的綜述，見(jiàn)例如Pluckthün,引自ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore編著,(Springer-Verlag,NewYork,第269-315頁(yè)(1994)；還參見(jiàn)WO93/16185；和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,571,894和5,587,458。關(guān)于包含救援受體(salvagereceptor)結(jié)合表位殘基和具有增加的體內(nèi)半壽期的Fab和F(ab')2片段的討論，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,869,046。雙體抗體是具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段，所述兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)可以是雙價(jià)或雙特異性的。參見(jiàn)例如，EP404,097；WO1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)也描述了三體抗體和四體抗體。單結(jié)構(gòu)域抗體是包含抗體的全部或一部分重鏈可變結(jié)構(gòu)域或全部或一部分輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體片段。在某些實(shí)施方案中，單一結(jié)構(gòu)域抗體是人單一結(jié)構(gòu)域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,248,516B1)?？贵w片段可以通過(guò)多種技術(shù)產(chǎn)生，所述多種技術(shù)包括但不限于蛋白酶解消化完整抗體以及由重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生(例如，大腸桿菌或噬菌體)，如本文所述。3.嵌合抗體和人源化抗體在某些實(shí)施方案中，本文提供的抗體是嵌合抗體。某些嵌合抗體例如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中描述。在一個(gè)例子中，嵌合抗體包含非人類(lèi)可變區(qū)(例如，源自小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類(lèi)如猴的可變區(qū))和人類(lèi)恒定區(qū)。在又一個(gè)例子中，嵌合抗體是“類(lèi)轉(zhuǎn)換”抗體，其中類(lèi)或亞類(lèi)已經(jīng)相對(duì)親本抗體發(fā)生改變。嵌合抗體包括其抗原結(jié)合片段。在某些實(shí)施方案中，嵌合抗體是人源化抗體。一般地，將非人抗體人源化以降低對(duì)人的免疫原性，同時(shí)保留親本非人抗體的特異性和親和力。通常，人源化抗體包含其中HVR(例如，CDR)(或其部分)衍生自非人類(lèi)抗體并且FR(或其部分)衍生自人抗體序列的一個(gè)或多個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。人源化抗體任選地也將包含人恒定區(qū)的至少一部分。在一些實(shí)施方案中，將人源化抗體中的一些FR殘基置換為來(lái)自非人類(lèi)抗體(例如，從中衍生HVR殘基的抗體)的相應(yīng)殘基，例如，以恢復(fù)或改善抗體特異性或親和力。人源化抗體和制造它們的方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且例如還在Riechmann等人,Nature332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods36:25-34(2005)(描述特異性決定區(qū)(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人,Methods36:43-60(2005)(描述“FR改組”)；和Osbourn等人,Methods36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述針對(duì)FR改組的“導(dǎo)向選擇”方案)中綜述?？梢杂糜谌嗽椿娜藰?gòu)架區(qū)包括但不限于：使用“最佳配合”法選擇的構(gòu)架區(qū)(參見(jiàn)，例如，Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993))；從具有特定亞組的輕鏈可變區(qū)或重鏈可變區(qū)的人抗體的共有序列衍生的構(gòu)架區(qū)(參見(jiàn)，例如，Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(體細(xì)胞突變的)構(gòu)架區(qū)或人種系構(gòu)架區(qū)(參見(jiàn)，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和從篩選FR文庫(kù)衍生的構(gòu)架區(qū)(參見(jiàn)，例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。4.人抗體在某些實(shí)施方案中，本文提供的抗體是人抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的多種技術(shù)或使用本文所述的技術(shù)產(chǎn)生人抗體。人抗體總體上在vanDijk和vandeWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中描述?？梢酝ㄟ^(guò)施用免疫原至轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備人抗體，其中所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已經(jīng)被修飾成響應(yīng)于抗原攻擊而產(chǎn)生完整人抗體或具有人可變區(qū)的完整抗體。這類(lèi)動(dòng)物一般含有替換內(nèi)源免疫球蛋白基因座或在染色體外存在或隨機(jī)整合入動(dòng)物染色體的全部或部分人免疫球蛋白基因座。在這類(lèi)轉(zhuǎn)基因小鼠中，內(nèi)源免疫球蛋白基因座通常已經(jīng)失活。關(guān)于從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物獲得人抗體的方法的綜述，見(jiàn)Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。還見(jiàn)，例如，描述XENOMOUSETM技術(shù)的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,075,181和6,150,584；描述技術(shù)的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,770,429；描述K-M技術(shù)的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,041,870，和描述Veloci技術(shù)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)US2007/0061900)?？梢赃M(jìn)一步修飾由這類(lèi)動(dòng)物產(chǎn)生的完整抗體的人可變區(qū)，例如，通過(guò)與不同的人類(lèi)恒定區(qū)組合。也可以通過(guò)基于雜交瘤的方法產(chǎn)生人抗體。已經(jīng)描述了用于產(chǎn)生人單克隆抗體的人骨髓瘤細(xì)胞系和小鼠-人雜合骨髓瘤細(xì)胞系。(參見(jiàn)，例如，KozborJ.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,第51-63頁(yè)(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)；和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。借助人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的人抗體還在Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中描述。額外的方法包括例如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,189,826(描述從雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生單克隆人IgM抗體)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人雜交瘤)中描述的那些方法。人雜交瘤技術(shù)(三體瘤技術(shù))還在Vollmers和Brandlein,HistologyandHistopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中描述。也可以通過(guò)分離從人衍生的噬菌體展示文庫(kù)中選擇的Fv克隆可變結(jié)構(gòu)域序列產(chǎn)生人抗體。這類(lèi)可變結(jié)構(gòu)域序列隨后可以與所需的人恒定域組合。下文描述用于從抗體文庫(kù)選擇人抗體的技術(shù)。5.文庫(kù)衍生的抗體可以通過(guò)對(duì)組合文庫(kù)篩選具有所需一種活性或多種活性的抗體，來(lái)分離本發(fā)明的抗體。例如，本領(lǐng)域已知用于產(chǎn)生噬菌體展示文庫(kù)并對(duì)這類(lèi)文庫(kù)篩選擁有所需結(jié)合特征的抗體的多種方法。這類(lèi)方法例如綜述于Hoogenboom等人,引自MethodsinMolecularBiology178:1-37(O'Brien等人編著,HumanPress,Totowa,NJ,2001)中并且例如還在McCafferty等人,Nature348:552-554；Clackson等人,Nature352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,引自MethodsinMolecularBiology248:161-175(Lo編著,HumanPress,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)中描述。在某些噬菌體展示法中，VH基因庫(kù)和VL基因庫(kù)分別由聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)克隆并且在噬菌體文庫(kù)中隨機(jī)重組，其中隨后可以對(duì)所述噬菌體文庫(kù)篩選結(jié)合抗原的噬菌體，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌體一般將抗體片段展示為單鏈Fv(scFv)片段或展示為Fab片段。來(lái)自免疫來(lái)源的文庫(kù)在不要求構(gòu)建雜交瘤的情況下提供針對(duì)免疫原的高親和力抗體。備選地，可以(例如，從人)克隆天然庫(kù)以在不進(jìn)行任何免疫的情況下，提供針對(duì)廣泛類(lèi)型非自身抗原的抗體和還針對(duì)自身抗原的抗體的單一來(lái)源，如Griffiths等人,EMBOJ,12:725-734(1993)所述。最后，也可以通過(guò)從干細(xì)胞克隆未重排的V-基因區(qū)段并使用含有隨機(jī)序列以編碼高度可變的CDR3區(qū)并實(shí)現(xiàn)體外重排的PCR引物，合成地產(chǎn)生天然文庫(kù)，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗體噬菌體文庫(kù)的專(zhuān)利公布例如包括：美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,750,373和美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。將從人抗體文庫(kù)分離的抗體或抗體片段視為本文中的人抗體或人抗體片段。6.多特異性抗體在某些實(shí)施方案中，本文提供的抗體是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體是對(duì)至少兩個(gè)不同位點(diǎn)具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，所述結(jié)合特異性之一針對(duì)血凝素，并且另一特異性針對(duì)任何其他抗原。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體可以結(jié)合血凝素的2個(gè)不同表位。雙特異性抗體也可以用來(lái)使細(xì)胞毒性劑局限至表達(dá)血凝素的細(xì)胞。雙特異性抗體可以被制備為全長(zhǎng)抗體或抗體片段。用于產(chǎn)生多特異性抗體的技術(shù)包括但不限于重組共表達(dá)具有不同特異性的兩個(gè)免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(參見(jiàn)Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature305:537(1983)、WO93/08829和Traunecker等人,EMBOJ.10:3655(1991))和“結(jié)入扣”工程化(例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,731,168)。也可以通過(guò)以下方式產(chǎn)生多特異性抗體：工程化靜電轉(zhuǎn)向效應(yīng)用于產(chǎn)生抗體Fc-異二聚體分子(WO2009/089004A1)；交聯(lián)兩個(gè)或更多個(gè)抗體或片段(例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,676,980，和Brennan等人,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉鏈以產(chǎn)生雙特異性抗體(例如，參見(jiàn)J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“雙體抗體(diabody)”技術(shù)以產(chǎn)生雙特異性抗體片段(例如，參見(jiàn)Hollinger等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用單鏈Fv(sFv)二聚體(例如，參見(jiàn)Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及制備三特異性抗體，如在例如Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991))中所述那樣。本文中還包括具有三個(gè)或更多個(gè)功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的工程化抗體，包括“八抗體(Octopusantibody)”(參見(jiàn)，例如US2006/0025576A1)。本文的抗體或片段還包括“雙重功能FAb”或“DAF”，其包含與血凝素以及另一種不同抗原結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)(例如參見(jiàn)，US2008/0069820)。7.抗體變體在某些實(shí)施方案中，構(gòu)思了本文提供的抗體的氨基酸序列變體。例如，可能想要改善該抗體的結(jié)合親和力和/或其他生物學(xué)特性。可以通過(guò)向編碼抗體的核苷酸序列引入適宜修飾或通過(guò)肽合成制備該抗體的氨基酸序列變體。此類(lèi)修飾包括例如，從抗體的氨基酸序列內(nèi)部缺失殘基和/或?qū)埢迦胨霭被嵝蛄兄泻?或置換所述氨基酸序列中的殘基?？梢援a(chǎn)生缺失、插入和置換的任意組合以獲得最終構(gòu)建體，只要所述最終構(gòu)建體擁有想要的特征，例如抗原結(jié)合作用。a)置換變體、插入變體和缺失變體在某些實(shí)施方案中，提供具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換的抗體變體。用于置換誘變的目的位點(diǎn)包括HVR和FR。表1中在“優(yōu)選置換”的標(biāo)題下顯示保守性置換。表1中在“示例性置換”標(biāo)題下顯示并且參考氨基酸側(cè)鏈類(lèi)別如下文進(jìn)一步描述更明顯的變化?？梢詫被嶂脫Q引入目的抗體中并且對(duì)產(chǎn)物篩選所需的活性，例如，保留/改善的抗原結(jié)合作用、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。表1原始?xì)埢纠灾脫Q優(yōu)選的置換Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Asp、Lys；ArgGlnAsp(D)Glu；AsnGluCys(C)Ser；AlaSerGln(Q)Asn；GluAsnGlu(E)Asp；GlnAspGly(G)AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu，Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸LeuLeu(L)正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Trp；Leu；Val；Ile；Ala；TyrTyrPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)Val；SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸Leu可以根據(jù)常見(jiàn)的側(cè)鏈特性分組氨基酸：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu；Ile；(2)中性親水：Cys、Ser、Thr、Asn；Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)堿性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈方向的殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。非保守性置換將使這些類(lèi)別之一的成員交換為另一個(gè)類(lèi)別的成員。一個(gè)置換變體類(lèi)型涉及置換親本抗體(例如，人源化或人抗體)的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基。通常，經(jīng)選擇用于進(jìn)一步研究的所得變體將相對(duì)于親本抗體在某些生物學(xué)特性方面(例如，增加的親和力、降低的免疫原性)具有修飾(例如，改善)和/或?qū)⒕哂杏H本抗體的基本上保留的某些生物學(xué)特性。示例性置換變體是親和力成熟抗體，所述抗體可以例如，使用基于噬菌體展示的親和力成熟技術(shù)如本文所述的那些技術(shù)便利地產(chǎn)生。簡(jiǎn)而言之，將一個(gè)或多個(gè)HVR殘基突變并且將變體抗體在噬菌體上展示并篩選特定生物學(xué)活性(例如，結(jié)合親和力)?？梢栽贖VR中做出改變(例如，置換)，例如以改善抗體親和力。這類(lèi)改變可以在HVR“熱點(diǎn)”(即，在體細(xì)胞成熟過(guò)程期間以高頻率經(jīng)歷突變的密碼子所編碼的殘基(參見(jiàn)，例如，Chowdhury,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008))和/或接觸抗原的殘基中做出，同時(shí)對(duì)所產(chǎn)生的變體VH或VL測(cè)試結(jié)合親和力。已經(jīng)例如在Hoogenboom等人,引自MethodsinMolecularBiology178:1-37(O'Brien等人編著，HumanPress,Totowa,NJ,(2001))中描述了通過(guò)構(gòu)建次級(jí)文庫(kù)并從中重新選擇實(shí)現(xiàn)親和力成熟。在親和力成熟的一些實(shí)施方案中，通過(guò)多種方法(例如，易錯(cuò)PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變)中的任一種方法，將多樣性引入所選擇用于成熟的可變基因中。隨后產(chǎn)生次級(jí)文庫(kù)。隨后篩選該文庫(kù)以鑒定具有所需親和力的任何抗體變體。另一種引入多樣性的方法涉及HVR指導(dǎo)的方案，其中將幾個(gè)HVR殘基(例如，一次4-6個(gè)殘基)隨機(jī)分組?？梢蕴貏e地鑒定參與抗原結(jié)合的HVR殘基，例如，使用丙氨酸掃描法誘變或建模。特別地經(jīng)常靶向CDR-H3和CDR-L3。在某些實(shí)施方案中，可以在一個(gè)或多個(gè)HVR內(nèi)部出現(xiàn)置換、插入或缺失，只要這類(lèi)改變不實(shí)質(zhì)降低抗體結(jié)合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出不實(shí)質(zhì)降低結(jié)合親和力的保守性改變(例如，如本文中提供的保守性置換)。這類(lèi)改變可以例如是在HVR中的抗原接觸殘基外部。在上文提供的變體VH和VL序列的某些實(shí)施方案中，每個(gè)HVR或者不予改變或者含有不多于一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氨基酸置換。一種用于鑒定可以被靶向以便誘變的抗體殘基或區(qū)域的有用方法稱(chēng)作“丙氨酸掃描法誘變法”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在這種方法中，鑒定一個(gè)殘基或靶殘基組(例如，帶電荷殘基如arg、asp、his、lys和glu)并且用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替換以確定該抗體與抗原的相互作用是否受影響?？梢栽趯?duì)于初始置換顯示功能敏感的氨基酸位置處引入其他置換。備選地或額外地，測(cè)定抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以鑒定抗體和抗原之間的接觸點(diǎn)。可以將這類(lèi)接觸殘基和鄰近殘基作為置換候選物打靶或消除。可以篩選變體以確定它們是否含有所需的特性。氨基酸序列插入包括長(zhǎng)度從1個(gè)殘基至含有成百個(gè)或更多個(gè)殘基的多肽間變動(dòng)的氨基端和/或羧基端融合，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨?；鶜埢目贵w?？贵w分子的其他插入性變體包括抗體的N末端或C末端與酶(例如，針對(duì)ADEPT的酶)或增加該抗體血清半壽期的多肽融合。b)糖基化變體在某些實(shí)施方案中，改變本文提供的抗體以增加或減少抗體發(fā)生糖基化的程度?？梢酝ㄟ^(guò)改變氨基酸序列從而創(chuàng)造或移除一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)，由此便利地實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體添加或刪除糖基化位點(diǎn)。在抗體包含F(xiàn)c區(qū)的情況下，可以改變與之連接的糖。哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的天然抗體一般包含分枝的雙天線狀低聚糖，所述低聚糖通常借助N聯(lián)連接至Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域的Asn297。例如參見(jiàn)，Wright等人,TIBTECH15:26-32(1997)。低聚糖可以包括各種糖，例如，甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及與雙天線狀低聚糖結(jié)構(gòu)的“莖部”中GlcNAc連接的巖藻糖。在一些實(shí)施方案中，可以修飾本發(fā)明抗體中的低聚糖以產(chǎn)生某些特性改善的抗體變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有糖結(jié)構(gòu)的抗體變體，所述糖結(jié)構(gòu)缺少與Fc區(qū)(直接或間接)連接的巖藻糖。例如，這種抗體中巖藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通過(guò)以下方式確定巖藻糖的量：相對(duì)于如通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜法所測(cè)量的與Asn297連接的全部糖結(jié)構(gòu)(例如復(fù)雜結(jié)構(gòu)、雜合結(jié)構(gòu)和高甘露糖結(jié)構(gòu))的總和，計(jì)算糖鏈內(nèi)部Asn297處巖藻糖的平均量，例如，如WO2008/077546中所述。Asn297指位于Fc區(qū)內(nèi)約位置297處的天冬酰胺殘基(Fc區(qū)殘基的Eu編號(hào))；然而，Asn297也可以位于位置297的上游或下游±3個(gè)氨基酸附近，即，位置294和位置300之間，原因在于抗體中的微小序列變異。這類(lèi)巖藻糖化變體可以具有改善的ADCC功能。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(KyowaHakkoKogyoCo.,Ltd)。與“去巖藻糖化”或“缺乏巖藻糖的”抗體變體相關(guān)的出版物的例子包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能夠產(chǎn)生去巖藻糖化抗體的細(xì)胞系的例子包括在蛋白質(zhì)巖藻糖化方面缺陷的Lec13CHO細(xì)胞(Ripka等人,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朥S2003/0157108A1，Presta,L；和WO2004/056312A1，Adams等人,特別地在實(shí)施例11)中，和敲除細(xì)胞系，如α-1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因FUT8敲除CHO細(xì)胞(見(jiàn)，例如，Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。還可以為抗體變體提供雙分低聚糖，例如，其中與抗體Fc區(qū)連接的雙天線狀低聚糖由GlcNAc對(duì)分。這類(lèi)抗體變體可以具有減少的巖藻糖化和/或改善的ADCC功能。這類(lèi)抗體變體的例子例如在WO2003/011878(Jean-Mairet等人)；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,602,684(Umana等人)；和US2005/0123546(Umana等人)中描述。也提供低聚糖中至少一個(gè)半乳糖殘基與Fc區(qū)連接的抗體變體。這類(lèi)抗體變體可以具有改善的CDC功能。這類(lèi)抗體變體例如在WO1997/30087(Patel等人)；WO1998/58964(Raju,S.)；和WO1999/22764(Raju,S)中描述。c)Fc區(qū)變體在某些實(shí)施方案中，可以將一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾引入本文提供的抗體的Fc區(qū)中，因而產(chǎn)生Fc區(qū)變體。Fc區(qū)變體可以包含人Fc區(qū)序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū))，所述的人Fc區(qū)序列在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處包含氨基酸修飾(例如，置換)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明構(gòu)思了擁有一些但非全部效應(yīng)子功能的抗體變體，這使所述抗體變體成為下述應(yīng)用的有利候選物，在應(yīng)用中抗體的體內(nèi)半壽期重要，而某些效應(yīng)子功能(如補(bǔ)體和ADCC)是不必要或有害的?？梢詫?shí)施體外和/或體內(nèi)細(xì)胞毒性測(cè)定法以證實(shí)CDC和/或ADCC活性降低/耗盡。例如，可以實(shí)施Fc受體(FcR)結(jié)合測(cè)定法以確?？贵w缺少FcγR結(jié)合作用(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn結(jié)合能力。介導(dǎo)ADCC的原代細(xì)胞-NK細(xì)胞僅表達(dá)FcγRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464頁(yè)上的表3中總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。評(píng)估目的分子的ADCC活性的體外測(cè)定法的非限制性例子在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,500,362(參見(jiàn)，例如，Hellstrom,I.等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；5,821,337(參見(jiàn)Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中描述。備選地，可以使用非放射性分析方法(參見(jiàn)，例如，用于流式細(xì)胞術(shù)的ACTITM非放射性細(xì)胞毒性測(cè)定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA；和CytoTox非放射性細(xì)胞毒性測(cè)定法(Promega,Madison,WI)。用于此類(lèi)測(cè)定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。備選地或額外地，可以在體內(nèi)，例如，在動(dòng)物模型中，如在Clynes等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95:652-656(1998)中公開(kāi)的那種動(dòng)物模型中評(píng)估目的分子的ADCC活性。也可以實(shí)施C1q結(jié)合測(cè)定法以證實(shí)抗體不能結(jié)合C1q并因此缺少CDC活性。參見(jiàn)，例如，WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c結(jié)合ELISA。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行CDC測(cè)定法(見(jiàn)，例如，Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。也可以使用本領(lǐng)域已知的方法確定FcRn結(jié)合作用和體內(nèi)清除率/半壽期(見(jiàn)，例如，Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。效應(yīng)子功能減少的抗體包括置換了一個(gè)或多個(gè)Fc區(qū)殘基238、265、269、270、297、327和329(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,737,056)的那些抗體。這類(lèi)Fc突變體包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的兩個(gè)或更多個(gè)位置處具有置換的Fc突變體，包括殘基265和297置換成丙氨酸的所謂“DANA”Fc突變體(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,332,581)。描述了具有FcR結(jié)合作用改善或削弱的某些抗體變體。(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,737,056；WO2004/056312，和Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。在某些實(shí)施方案中，抗體變體包含具有改善ADCC的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換(例如，在Fc區(qū)的位置298、333和/或334處的置換)(殘基的EU編號(hào))的Fc區(qū)。在一些實(shí)施方案中，在Fc區(qū)內(nèi)做出改變，所述改變導(dǎo)致變更(即改善或削弱)的C1q結(jié)合作用和/或補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性(CDC)，例如，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,194,551、WO99/51642和Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。在US2005/0014934A1(Hinton等人)中描述了半壽期增加和新生兒Fc受體(FcRn)結(jié)合作用改善的抗體，所述新生兒Fc受體負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)移母源IgG至胎兒(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994)。這些抗體包含其中具有一個(gè)或多個(gè)置換的Fc區(qū)，其中所述置換改善Fc區(qū)與FcRn的結(jié)合。這類(lèi)Fc變體包括在一個(gè)或多個(gè)Fc區(qū)殘基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434處具有置換(例如，F(xiàn)c區(qū)殘基434的置換)的那些Fc變體(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,371,826)。也參見(jiàn)涉及Fc區(qū)變體其他例子的Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988)；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,648,260；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,624,821；和WO94/29351。d)半胱氨酸工程化抗體變體在某些實(shí)施方案中，可能想要產(chǎn)生半胱氨酸工程化的抗體，例如，“硫代MAb”，其中所述抗體的一個(gè)或多個(gè)殘基用半胱氨酸殘基置換。在具體的實(shí)施方案中，置換的殘基出現(xiàn)在抗體的可及位點(diǎn)處。通過(guò)用半胱氨酸置換這些殘基，因而將反應(yīng)性巰基安置在抗體的可及位點(diǎn)處并且可以用來(lái)使抗體綴合至其他部分，如藥物部分或接頭-藥物部分以產(chǎn)生免疫綴合物，如本文中進(jìn)一步所述。在某些實(shí)施方案中，可以用半胱氨酸置換以下殘基的任何一個(gè)或多個(gè)：輕鏈的V205(Kabat編號(hào))；重鏈的A118(EU編號(hào))；和重鏈Fc區(qū)的S400(EU編號(hào))?？梢岳缑绹?guó)專(zhuān)利號(hào)7,521,541中所述那樣產(chǎn)生半胱氨酸工程化的抗體。e)抗體衍生物在某些實(shí)施方案中，可以進(jìn)一步修飾本文提供的抗體以含有本領(lǐng)域已知并輕易可獲得的額外的非蛋白質(zhì)部分。適于抗體衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊環(huán)、聚1,3,6-三烷、亞乙基/馬來(lái)酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或無(wú)規(guī)共聚物)和葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇和它們的混合物。聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的優(yōu)點(diǎn)，原因在于其在水中的穩(wěn)定性。這種聚合物可以具有任何分子量，并可以是分枝或不分枝的。與抗體連接的聚合物的數(shù)目可以變動(dòng)，并且如果連接多于一個(gè)聚合物，它們可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的數(shù)目和/或類(lèi)型可以基于以下考慮事項(xiàng)確定，包括但不限于待改善的抗體特定特性或功能、抗體衍生物是否將用于限定情況下的療法中等等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了抗體的綴合物和非蛋白質(zhì)部分，其可以通過(guò)暴露于輻射而選擇性加熱。在一個(gè)實(shí)施方案中，非蛋白質(zhì)部分是碳納米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。輻射可以具有任何波長(zhǎng)，并包括但不限于這樣的波長(zhǎng)，所述波長(zhǎng)不傷害普通細(xì)胞，但是使非蛋白質(zhì)部加熱至殺傷臨近于抗體-非蛋白質(zhì)部分的細(xì)胞的溫度。B.重組方法和組合物可以使用重組方法和組合物產(chǎn)生抗體，例如，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,816,567中所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了編碼本文所述的抗血凝素抗體的分離核酸。這種核酸可以編碼包含抗體VL的氨基酸序列和/或包含抗體VH的氨基酸序列(例如，抗體的輕鏈和/或重鏈)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種或多種包含這種核酸的載體(例如，表達(dá)載體)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含這種核酸的宿主細(xì)胞。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含以下載體(例如，已經(jīng)用以下載體轉(zhuǎn)化)：(1)包含核酸的載體，所述核酸編碼包含抗體的VL的氨基酸序列和包含抗體的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一載體，所述核酸編碼包含抗體的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二載體，所述核酸編碼包含抗體的VH的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核的，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞(例如，Y0、NS0、Sp20細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種產(chǎn)生抗血凝素抗體的方法，其中所述方法包括在適于表達(dá)抗體的條件下培養(yǎng)如上文提供的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含編碼抗體的核酸，和任選地從宿主細(xì)胞(或宿主細(xì)胞培養(yǎng)基)回收抗體。為了重組產(chǎn)生抗血凝素抗體，將編碼抗體的核酸(例如，如上文所述)分離并插入一種或多種載體中用于宿主細(xì)胞中進(jìn)一步克隆和/或表達(dá)?？梢允褂贸Ｒ?guī)方法(例如，通過(guò)使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)，輕易地分離這種核酸并將其測(cè)序?？寺』虮磉_(dá)編碼抗體的載體的合適宿主細(xì)胞包括本文所述的原核或真核細(xì)胞。例如，可以在細(xì)菌中產(chǎn)生抗體，尤其當(dāng)不需要糖基化和Fc效應(yīng)子功能時(shí)。對(duì)于細(xì)菌中表達(dá)抗體片段和多肽，參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,648,237、5,789,199和5,840,523。(還參見(jiàn)Charlton,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo編著,HumanaPress,Totowa,NJ,2003)，第245-254頁(yè)，其描述在大腸桿菌中表達(dá)抗體片段)。在表達(dá)后，可以將抗體從細(xì)菌細(xì)胞糊狀物分離于可溶性級(jí)分中并且可以進(jìn)一步純化抗體。除原核生物之外，真核微生物如絲狀真菌或酵母是編碼抗體的載體的合適克隆宿主或表達(dá)宿主，包括其糖基化途徑已經(jīng)“人源化”的真菌和酵母菌株，導(dǎo)致產(chǎn)生具有部分或完全人類(lèi)糖基化模式的抗體。參見(jiàn)Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)，和Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。表達(dá)糖基化抗體的合適宿主細(xì)胞還源自多細(xì)胞生物(無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物)。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的例子包括植物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞。已經(jīng)鑒定了可以與昆蟲(chóng)細(xì)胞一起使用、尤其用于轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞的許多桿狀病毒毒株。也可以利用植物細(xì)胞培養(yǎng)物作為宿主。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生抗體的PLANTIBODIESTM技術(shù))。也可以使用脊椎動(dòng)物細(xì)胞作為宿主。例如，適應(yīng)于懸浮培育的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系可以是有用的。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的其他例子是由SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎系(如Graham等人,J.GenVirol.36:59(1977)中所述的293或293T細(xì)胞)；幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK)；小鼠支持細(xì)胞(如在例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4細(xì)胞)；猴腎細(xì)胞(CV1)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA)；犬腎細(xì)胞(MDCK；布法羅大鼠肝臟細(xì)胞(BRL3A)；人肺細(xì)胞(W138)；人肝臟細(xì)胞(HepG2)；小鼠乳腺瘤細(xì)胞(MMT060562)；TRI細(xì)胞，如在例如Mather等人,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC5細(xì)胞和FS4細(xì)胞。其他有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，包括DHFR-CHO細(xì)胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤細(xì)胞系如Y0、NS0和Sp2/0。關(guān)于適于產(chǎn)生抗體的某些哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的綜述，見(jiàn)，例如，Yazaki和Wu,MethodsinMolecularBiology，第248卷(B.K.C.Lo編著,HumanaPress，Totowa，NJ)，第255-268頁(yè)(2003)。C.測(cè)定法可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種測(cè)定法，鑒定、篩選或表征本文提供的抗血凝素抗體的物理/化學(xué)特性和/或生物學(xué)活性。1.結(jié)合測(cè)定法和其他測(cè)定法在一個(gè)方面，例如，通過(guò)已知的方法如ELISA、蛋白質(zhì)印跡法等，測(cè)試本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合活性。在另一個(gè)方面，競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法可以用來(lái)鑒定與本文所述的任何抗血凝素抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合血凝素的抗體。在某些實(shí)施方案中，這種競(jìng)爭(zhēng)性抗體與本文描述的抗血凝素抗體(例如，包含SEQIDNO:79的VH序列和SEQIDNO:78的VL序列；SEQIDNO:83的VH序列和SEQIDNO:82的VL序列；SEQIDNO:83的VH序列和SEQIDNO:86的VL序列；SEQIDNO:89的VH序列和SEQIDNO:78的VL序列；SEQIDNO:92的VH序列和SEQIDNO:91的VL序列；SEQIDNO:95的VH序列和SEQIDNO:91的VL序列；SEQIDNO:97的VH序列和SEQIDNO:91的VL序列；SEQIDNO:99的VH序列和SEQIDNO:91的VL序列；SEQIDNO:101的VH序列和SEQIDNO:91的VL序列；SEQIDNO:103的VH序列和SEQIDNO:91的VL序列；SEQIDNO:105的VH序列和SEQIDNO:91的VL序列；SEQIDNO:107的VH序列和SEQIDNO:91的VL序列的抗血凝素抗體)結(jié)合的相同表位(例如，線性表位或構(gòu)象表位)結(jié)合。用于定位與抗體結(jié)合的表位的詳細(xì)示例性方法在Morris(1996)“EpitopeMappingProtocols(表位定位法)”,引自MethodsinMolecularBiology第66卷(HumanaPress,Totowa,NJ)中提供。在示例性競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法中，將固定的血凝素在溶液中溫育，所述溶液包含與血凝素結(jié)合的第一標(biāo)記抗體和正在測(cè)試與第一抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合血凝素的能力的第二未標(biāo)記抗體。第二抗體可以存在于雜交瘤上清液中。作為對(duì)照，將固定的血凝素在包含第一標(biāo)記抗體但是不包含第二未標(biāo)記抗體的溶液中溫育。在允許第一抗體與血凝素結(jié)合的條件下溫育后，移除過(guò)多的未結(jié)合的抗體，并且測(cè)量與固定的血凝素結(jié)合的標(biāo)記物的量。如果與固定的血凝素結(jié)合的標(biāo)記物的量在測(cè)試樣品中相對(duì)于對(duì)照樣品實(shí)質(zhì)降低，則這表示第二抗體正在與第一抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合血凝素。參見(jiàn)Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual第14章(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY)。2.活性測(cè)定法在一個(gè)方面，提供了用于鑒定具有生物學(xué)活性的抗血凝素抗體及其片段的測(cè)定法。生物學(xué)活性可以包括，例如，與乙型流感病毒血凝素血凝素特異性結(jié)合、中和乙型流感病毒等。還提供在體內(nèi)和/或在體外具有這種生物學(xué)活性的抗體或包含這類(lèi)抗體或其片段的組合物。在某些實(shí)施方案中，對(duì)本發(fā)明的抗體測(cè)試這種生物學(xué)活性。關(guān)于此類(lèi)測(cè)定法的示例性描述，參見(jiàn)實(shí)施例3-16。D.免疫綴合物本發(fā)明也提供了包含與一種或多種細(xì)胞毒性劑如化療劑或藥物、生長(zhǎng)抑制劑、毒素(例如，細(xì)菌源、真菌源、植物源或動(dòng)物源的蛋白質(zhì)毒素、酶活性毒素)或放射性同位素綴合的本文抗血凝素抗體的免疫綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫綴合物是抗體-藥物綴合物(ADC)，其中抗體與一種或多種藥物綴合，所述藥物包括但不限于類(lèi)美登素(maytansinoid)(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,208,020、5,416,064和歐洲專(zhuān)利EP0425235B1)；澳瑞司他汀如單甲基澳瑞司他汀藥物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,635,483和5,780,588和7,498,298)；海兔毒素(dolastatin)；刺孢霉素或其衍生物(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人,CancerRes.53:3336-3342(1993)；和Lode等人,CancerRes.58:2925-2928(1998))；蒽環(huán)類(lèi)如柔紅霉素或多柔比星(參見(jiàn)Kratz等人,CurrentMed.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362(2006)；Torgov等人,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834(2000)；Dubowchik等人,Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002)；King等人,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,630,579)；甲氨蝶呤；長(zhǎng)春地辛；紫杉烷類(lèi)(taxane)如多西紫杉醇、紫杉醇、拉羅他賽(larotaxel)、替司他賽(tesetaxel)和沃塔紫杉醇(ortataxel)；單端孢菌毒素；和CC1065。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫綴合物包含與酶活性毒素或其片段綴合的如本文所述的抗體，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉毒素A鏈、白喉毒素的無(wú)結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒蛋白A鏈、α-帚曲菌素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陸(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制蛋白、麻瘋樹(shù)毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制蛋白、多花白樹(shù)毒蛋白、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊諾霉素和單端孢霉烯族類(lèi)化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫綴合物包含與放射性原子綴合以形成放射綴合物的如本文所述的抗體。多種放射性同位素可用于產(chǎn)生放射綴合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。當(dāng)放射綴合物用于檢測(cè)時(shí)，它可以包含用于閃爍法研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或核磁共振(NMR)成像的自旋標(biāo)記物(也稱(chēng)作磁共振成像，mri)，再次如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵?？梢允褂枚喾N雙官能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑產(chǎn)生抗體和細(xì)胞毒性劑的綴合物，所述雙官能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酯的雙官能衍生物(如己二亞氨二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛(如戊二醛)、雙-疊氮化合物(如雙(對(duì)-重氮鹽苯甲?；?己二胺)、雙-重氮鹽衍生物(如雙-(對(duì)-重氮鹽苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(如2,6-二異氰酸甲苯酯)和雙活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人,Science238:1098(1987)中所述那樣制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-標(biāo)記的1-異硫氰酸根合芐基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核素與抗體綴合的示例性螯合劑。見(jiàn)WO94/11026。接頭可以是促進(jìn)細(xì)胞毒性藥在細(xì)胞中釋放的“可切割接頭”。例如，可以使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感接頭、光不穩(wěn)定接頭、二甲基接頭或含有二硫鍵的接頭(Chari等人,CancerRes.52:127-131(1992)；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,208,020)。免疫綴合物或ADC在本文中明確地構(gòu)思，但不限于采用交聯(lián)試劑制備的這類(lèi)綴合物，所述交聯(lián)試劑包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB和可商業(yè)獲得的SVSB(琥珀酰亞胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)(例如，來(lái)自PPierceBiotechnology,Inc.，Rockford，伊利諾伊州，美國(guó))。E.用于診斷和檢測(cè)的方法和組合物在某些實(shí)施方案中，本文提供的任一種抗血凝素抗體可用于檢測(cè)血凝素或乙型流感病毒在生物樣品中的存在。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)”涵蓋定量性或定性檢測(cè)。在某些實(shí)施方案中，生物樣品包括細(xì)胞或組織，例如，肺、上呼吸道、鼻道、血液、痰，或包括通過(guò)鼻拭子或咽拭子獲得的生物樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供在診斷或檢測(cè)方法中使用的抗血凝素抗體。在又一個(gè)方面，提供一種檢測(cè)血凝素或乙型流感病毒在生物樣品中存在的方法。在某些實(shí)施方案中，該方法包括：使生物樣品與如本文所述的抗血凝素抗體在允許抗血凝素抗體與血凝素結(jié)合的條件下接觸，并且檢測(cè)抗血凝素抗體和血凝素之間是否形成復(fù)合物。這種方法可以是體外或體內(nèi)方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗血凝素抗體用來(lái)選擇適于用抗血凝素抗體治療的受試者，例如其中血凝素是選擇患者的生物標(biāo)記物。可以使用本發(fā)明抗體診斷的示例性病癥包括甲型流感病毒感染，包括兒童、嬰兒、成人和老年人中的乙型流感病毒感染。在某些實(shí)施方案中，提供了標(biāo)記的抗血凝素抗體。標(biāo)記物包括但不限于直接檢測(cè)到的標(biāo)記物或部分(如熒光、發(fā)色、電子致密、化學(xué)發(fā)光和放射性標(biāo)記)，以及間接檢測(cè)到(例如借助酶促反應(yīng)或分子相互作用)的部分，如酶或配體。示例性標(biāo)記物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I、熒光團(tuán)如稀土元素螯合物或熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹磺酰、傘形酮、螢光素酶例如螢火蟲(chóng)螢光素酶和細(xì)菌螢光素酶(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,737,456)、螢光素、2,3-二氫二氮雜萘二酮、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、雜環(huán)氧化酶如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，其與利用過(guò)氧化氫來(lái)氧化染料前體的酶如HRP、乳過(guò)氧化物酶或微過(guò)氧化物酶偶聯(lián)，生物素/抗生物素蛋白、自旋標(biāo)記物、噬菌體標(biāo)記物、穩(wěn)定的自由基等。F.藥物制劑通過(guò)以下方式制備凍干制劑或水溶液劑形式的如本文所述的抗血凝素抗體的藥物制劑：將具有所需純度的這種抗體與一種或多種任選的可藥用載體混合(Remington'sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.編著(1980))?？伤幱幂d體總體上在所用的劑量和濃度對(duì)接受者無(wú)毒，并且包括但不限于：緩沖劑如磷酸、檸檬酸和其他有機(jī)酸；抗氧化劑(包括抗壞血酸和甲硫氨酸)；防腐劑(如十八烷基芐基二甲基氯化銨；六甲氯銨；苯扎氯銨、苯扎溴銨；苯酚、丁醇或芐醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；兒茶酚；雷瑣辛；環(huán)己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴(lài)氨酸；單糖、二糖和其他糖類(lèi)包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成鹽的反離子如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)和/或非離子表面活性劑如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可藥用載體還包括間質(zhì)藥物分散劑如可溶性中性活性透明質(zhì)酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明質(zhì)酸酶糖蛋白，如rHuPH20(BaxterInternational,Inc.)。在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。在一個(gè)方面，sHASEGP與一種或多種額外的糖胺聚糖酶如軟骨素酶組合。在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,267,958中描述了示例性?xún)龈煽贵w制劑。水質(zhì)抗體制劑包括在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,171,586和WO2006/044908中描述的那些制劑，后一類(lèi)制劑包括組氨酸-乙酸鹽緩沖劑。本文中的制劑也可以根據(jù)正在治療的特定適應(yīng)癥需要而含有多于一種有效成分，優(yōu)選地是具有并未相互不利影響的互補(bǔ)活性的那些有效成分。例如，可能想要進(jìn)一步提供神經(jīng)氨酸酶抑制劑、抗血凝素抗體、抗M2抗體等。這種有效成分以有效用于預(yù)期目的的量適當(dāng)?shù)亟M合存在。有效成分可以包埋于例如分別通過(guò)凝聚技術(shù)或界面聚合制備的微膠囊(例如，羥甲基纖維素微膠囊或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、膠態(tài)藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳液、納米粒子和納米膠囊)或乳濁液中。此類(lèi)技術(shù)在Remington'sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.編著(1980)中公開(kāi)?？梢灾苽涑掷m(xù)釋放制品。持續(xù)釋放制品的合適例子包括含有抗體的固態(tài)疏水性聚合物半通透性基質(zhì)，所述基質(zhì)處于成型制品(例如薄膜或微膠囊)形式。待用于體內(nèi)施用的制劑通常是無(wú)菌的?？梢岳缤ㄟ^(guò)借助無(wú)菌濾膜過(guò)濾輕易地實(shí)現(xiàn)無(wú)菌性。G.治療方法和組合物本文提供的任何抗血凝素抗體可以用于治療方法中。在一個(gè)方面，提供了作為藥物使用的抗血凝素抗體。在其他方面，提供用于治療、預(yù)防或抑制乙型流感病毒感染的抗血凝素抗體。在某些實(shí)施方案中，提供了用于治療方法中的抗血凝素抗體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗血凝素抗體用于治療患有乙型流感病毒感染的個(gè)體的方法中，所述方法包括向個(gè)體施用有效量的抗血凝素抗體。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，該方法還包括向該個(gè)體施用有效量的至少一種額外治療藥，例如，如下文描述的額外治療藥。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了防止、抑制或減少血凝素介導(dǎo)的乙型流感病毒包膜和感染細(xì)胞內(nèi)體膜之間的融合，因此防止病毒RNA進(jìn)入感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)并預(yù)防感染進(jìn)一步傳播的抗血凝素抗體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在預(yù)防、抑制或治療個(gè)體中乙型流感病毒感染的方法中使用的抗血凝素抗體，所述方法包括向個(gè)體施用有效量的抗血凝素抗體以預(yù)防、抑制或治療乙型流感病毒感染。根據(jù)以上實(shí)施方案中任一個(gè)實(shí)施方案的“個(gè)體”優(yōu)選地是人。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供抗血凝素抗體在制造或制備藥物中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物用于治療乙型流感病毒感染。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物用于治療乙型流感病毒感染的方法中，所述方法包括向患有乙型流感病毒感染的個(gè)體施用有效量的藥物。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，該方法還包括向該個(gè)體施用有效量的至少一種額外治療藥，例如，如下文描述的額外治療藥。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物用于防止、抑制或減少血凝素介導(dǎo)的乙型流感病毒包膜和感染細(xì)胞內(nèi)體膜之間的融合，因此防止病毒RNA進(jìn)入感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)并預(yù)防感染進(jìn)一步傳播的抗血凝素抗體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物用于預(yù)防、抑制或治療個(gè)體中乙型流感病毒感染的方法中，所述方法包括向該個(gè)體施用有效量的藥物體以預(yù)防、抑制或減少乙型流感病毒感染。根據(jù)以上實(shí)施方案中任一個(gè)實(shí)施方案的“個(gè)體”可以是人。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于治療乙型流感病毒感染的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括向患有乙型流感病毒感染的個(gè)體施用有效量的抗血凝素抗體。在這樣一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括向該個(gè)體施用有效量的如本文描述的至少一種額外治療藥。根據(jù)以上實(shí)施方案中任一個(gè)實(shí)施方案的“個(gè)體”可以是人。本發(fā)明提供有效抑制、預(yù)防或治療個(gè)體(例如，受試者或患者)中乙型流感病毒感染的抗血凝素抗體。在一些方面，本發(fā)明的抗血凝素抗體有效預(yù)防性治療個(gè)體以防止乙型流感病毒感染該個(gè)體。在一些方面，適于用本發(fā)明抗血凝素抗體治療的個(gè)體是患有或疑似患有乙型流感病毒感染的個(gè)體。在一些實(shí)施方案中，這類(lèi)個(gè)體包括嬰兒、兒童、成人和老年人。在一些實(shí)施方案中，該個(gè)體在患有乙型流感病毒感染的情況下住院。在其他實(shí)施方案中，具有乙型流感病毒感染的個(gè)體患有一種或多種共病，例如，免疫缺陷、妊娠、肺部疾病、心臟病、腎疾病或共感染(例如，細(xì)菌性感染或病毒性感染，如細(xì)菌性或病毒性肺炎)。在一些方面，用本發(fā)明的抗血凝素抗體治療個(gè)體降低了乙型流感病毒感染的嚴(yán)重程度、減少乙型流感病毒感染時(shí)間長(zhǎng)度或減少乙型流感病毒感染性。在其他方面，用本發(fā)明的抗血凝素抗體治療乙型流感病毒感染提供了額外的益處，包括住院時(shí)間長(zhǎng)度的縮減、減少或避免使用重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)的需求、減少或避免輔助通氣或機(jī)械通氣的需求、減少或避免補(bǔ)充用氧的需求和降低死亡率。在一些方面，住院時(shí)間長(zhǎng)度縮減了1天、2天、3天、4天、5天、或超過(guò)5天。在一些方面，重癥監(jiān)護(hù)室使用需求減少了1天、2天、3天、4天、5天或超過(guò)5天。在一些方面，輔助通氣或機(jī)械通氣需求減少了1天、2天、3天、4天、5天或超過(guò)5天。在一些方面，補(bǔ)充氧需求減少了1天、2天、3天、4天、5天、或超過(guò)5天。在一些方面，用本發(fā)明的抗血凝素抗體治療的個(gè)體減少了乙型流感病毒感染的疾病癥狀，例如，發(fā)熱、鼻炎、冷顫、咽喉痛、肌肉疼痛、身體疼痛、頭痛、咳嗽、鼻充血、虛弱或乏力、眼刺激或眼流淚和周身不適。在一些方面，用本發(fā)明的抗血凝素抗體對(duì)個(gè)體的治療縮減至呼吸功能正?；臅r(shí)間，如縮減至呼吸速率正?；臅r(shí)間或縮減至氧飽和度正?；臅r(shí)間。在一些方面，用本發(fā)明的抗血凝素抗體對(duì)個(gè)體的治療縮短了返回至正常氧飽和度(例如，返回氧飽和度至約92％或更高)的時(shí)間，如在不施用補(bǔ)充氧的情況下在24小時(shí)范圍內(nèi)測(cè)量。在其他方面，用本發(fā)明的抗血凝素抗體對(duì)個(gè)體的治療縮短了至生命體征如心率、血壓、呼吸速率和體度正?；臅r(shí)間。在一些方面，用本發(fā)明的抗血凝素抗體治療個(gè)體改善了病毒學(xué)終點(diǎn)，例如，流感病毒滴度?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方式測(cè)量病毒滴度，例如，病毒曲線下面積(AUC)，如通過(guò)例如qPCR或組織培養(yǎng)感染量(TCID50)來(lái)測(cè)量。在一些方面，治療導(dǎo)致病毒AUC減少大于或等于50％，如通過(guò)PCR或TCID50所測(cè)量。在本發(fā)明的多個(gè)方面，在癥狀初起(例如，病情初起)后約12小時(shí)處、約24小時(shí)處、約36小時(shí)處、約48小時(shí)處、約60小時(shí)處、約72小時(shí)處、約84小時(shí)處和約96小時(shí)處施用時(shí)，本文提供的抗血凝素抗體有效治療乙型流感病毒感染。在其他方面，在癥狀初起后約24小時(shí)和48小時(shí)之間(例如，個(gè)體在24小時(shí)和48小時(shí)之間具有癥狀)施用時(shí)、在癥狀初起后約48小時(shí)和72小時(shí)之間施用或在癥狀初起后約72小時(shí)和96小時(shí)之間施用時(shí)，本文提供的抗血凝素抗體有效治療乙型流感病毒感染。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗血凝素抗體有效治療或減少乙型流感病毒感染并且延長(zhǎng)現(xiàn)行護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)(例如，奧司他韋)的治療窗口期超出癥狀初起后48小時(shí)。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本文提供的任何抗血凝素抗體的藥物制劑，例如，用于前述任一個(gè)治療方法中。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑包含本文提供的任何抗血凝素抗體和可藥用載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑包含本文提供的任何抗血凝素抗體和至少一種額外治療藥，例如，如下文描述。本發(fā)明的抗體可以在療法中單獨(dú)或與其他藥物組合使用。例如，本發(fā)明的抗體可以與至少一種額外治療藥共施用。在某些實(shí)施方案中，額外治療藥是神經(jīng)氨酸酶抑制劑(例如，扎那米韋、磷酸奧司他韋、金剛烷胺、金剛乙胺)、抗M2抗體、一種抗血凝素抗體等。在一些方面，與單獨(dú)用任一種藥物治療相比，用與神經(jīng)氨酸酶抑制劑共施用的本發(fā)明抗血凝素抗體治療患有乙型流感病毒感染的個(gè)體提供了協(xié)同的治療效果。上文所示的這類(lèi)聯(lián)合療法涵蓋聯(lián)合施用(其中在相同或獨(dú)立的制劑中包含兩種或更多種治療劑)，和獨(dú)立施用，在這種情況下，本發(fā)明抗體的施用可以在施用額外的治療藥或治療藥類(lèi)之前、同時(shí)和/或之后進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗血凝素抗體的施用和額外治療藥的施用彼此相隔約1個(gè)月內(nèi)，或約1周、2周或3周內(nèi)，或約1、2、3、4、5或6日內(nèi)、或約1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、20或24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。本發(fā)明的抗體(和任何額外的治療藥)可以通過(guò)任何合適的手段施用，所述的合適手段包括腸胃外、肺內(nèi)和鼻內(nèi)以及(如果局部治療需要)病灶內(nèi)施用。腸胃外輸注包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹內(nèi)或皮下施用。給藥可以通過(guò)任何合適的途徑進(jìn)行，例如通過(guò)注射，如靜脈內(nèi)或皮下注射，這部分地取決于施用是否為短暫或長(zhǎng)期。本文中構(gòu)思了各種給藥方案，包括但不限于單次或在各種時(shí)間點(diǎn)多次施用、濃注施用(bolusadministration)和脈沖輸注。本發(fā)明的抗體將以符合良好醫(yī)學(xué)實(shí)踐的方式配制、定劑量和施用。在這種情況下考慮的因素包括正在治療的具體病癥、正在治療的具體哺乳動(dòng)物、個(gè)體患者的臨床狀況、病癥原因、送遞藥物的部位、施用方法、施用計(jì)劃和醫(yī)療執(zhí)業(yè)者已知的其他因素。該抗體不需要與目前用來(lái)預(yù)防或治療所討論病癥的一種或多種藥物一起配制，但是任選地與它們一起配制。這類(lèi)其他藥物的有效量取決于該制劑中存在的抗體的量、疾病類(lèi)型或療法和上文討論的其他因素。這些藥物通常以與本文所述相同的劑量并且采用與本文所述相同的施用途徑使用，或以約1％至99％的本文所述劑量使用，或以經(jīng)驗(yàn)地/臨床上確定適宜的任何劑量和任何途徑使用。對(duì)于預(yù)防或治療疾病，本發(fā)明抗體的適宜劑量(當(dāng)單獨(dú)或與一種或多種其他額外治療藥組合使用時(shí))將取決于待治療疾病的類(lèi)型、抗體的類(lèi)型、疾病的嚴(yán)重性和過(guò)程，抗體是否出于預(yù)防或治療目的施用、先前療法、患者的臨床史和對(duì)抗體的反應(yīng)以及主治醫(yī)師的決定。將抗體適當(dāng)?shù)匕匆淮位蚪?jīng)過(guò)一系列治療施用至患者。取決于疾病的類(lèi)型和嚴(yán)重性，約1μg/kg至約45mg/kg(例如，約1.0mg/kg至約15mg/kg)抗體可以是向患者施用的初始候選劑量，無(wú)論是否例如通過(guò)一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)施用或通過(guò)連續(xù)輸注來(lái)施用。取決于上文提到的因素，一個(gè)常見(jiàn)的每日劑量可能是從約1μg/kg至100mg/kg或更多。對(duì)于在幾日或更長(zhǎng)時(shí)間范圍內(nèi)重復(fù)施用，取決于病狀，治療通常將持續(xù)直至對(duì)疾病癥狀的所需抑制作用出現(xiàn)?？贵w的示例性劑量將處于約1.0mg/kg至約45mg/kg、約1.0mg/kg至約30mg/kg、約1.0mg/kg至約15mg/kg、約1.0mg/kg至約10mg/kg或約1.0mg/kg至約5mg/kg范圍內(nèi)。因此，可以向患者施用約1.0mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、30mg/kg或45mg/kg的一種或多種劑量(或其任意組合)。這類(lèi)劑量可以斷續(xù)地施用，例如，每日、每?jī)扇?、每三日等?？梢允┯幂^高的初始負(fù)荷劑量，隨后是一個(gè)或多個(gè)較低劑量。也可以按固定劑量給藥，例如，200mg、400mg、600mg、800mg、1000mg、1200mg、1400mg、1500mg、1600mg、1800mg、2000mg、2200mg、2400mg、2500mg、2600mg、2800mg、3000mg、3200mg、3400mg、3600mg等。通過(guò)常規(guī)技術(shù)和測(cè)定法容易地監(jiān)測(cè)這種療法的進(jìn)程?？梢岳斫猓笆鋈我环N制劑或治療方法可以使用本發(fā)明的免疫綴合物替代抗血凝素抗體或除抗血凝素抗體之外還使用本發(fā)明的免疫綴合物來(lái)實(shí)施。制造物在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種制造物，所述制造物含有上文描述的可用于治療、預(yù)防和/或診斷病癥的物質(zhì)。該制造物包括容器和或在該容器上或與之結(jié)合的標(biāo)簽或包裝插頁(yè)。合適的容器包括例如瓶、小藥瓶、注射器、靜脈內(nèi)輸液袋等。容器可以從多種材料如玻璃或塑料中形成。該容器容納了本身或與另一種組合物組合時(shí)有效治療、預(yù)防和/或診斷病癥的組合物并且可以具有無(wú)菌接入口(例如該容器可以是靜脈內(nèi)輸液袋或是具有皮下注射針頭可穿透的瓶塞的小藥瓶)。組合物中的至少一種活性物質(zhì)是本發(fā)明的抗體。標(biāo)簽或包裝插頁(yè)說(shuō)明該組合物用于治療選擇的病狀。另外，制造物可以包含(a)其中含有組合物的第一容器，其中所述組合物包含本發(fā)明的抗體；和(b)其中含有組合物的第二容器，其中所述組合物包含其他細(xì)胞毒性劑或治療藥。在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案中制造物還可以包含指示組合物可以用來(lái)治療特定病狀的包裝插頁(yè)。備選地或額外地，該制造物可以還包含第二(或第三)容器，其包含可藥用緩沖劑，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、林格溶液和葡萄糖溶液。它可以還包括從商業(yè)和用戶(hù)觀點(diǎn)看受歡迎的其他材料，包括其他緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器?？梢岳斫?，替代抗血凝素抗體或除抗血凝素抗體之外，前述任一者制造物可以包含本發(fā)明的免疫綴合物。III實(shí)施例以下是本發(fā)明方法和組合物的例子。應(yīng)當(dāng)理解，鑒于上文提供的一般性描述，可以實(shí)施多個(gè)其他實(shí)施方案。實(shí)施例1.漿母細(xì)胞富集和增殖為了發(fā)現(xiàn)并鑒定針對(duì)乙型流感病毒血凝素的罕有抗體，開(kāi)發(fā)了以下的漿母細(xì)胞富集和增殖技術(shù)。(參見(jiàn)待決專(zhuān)利申請(qǐng)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)14/077,414和國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2013/69567，二者均于2013年11月12日提交，和Nakamura等人(2013)CellHost&Microbe,14:93-103，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用的方式完整并入本文)。從太平洋血液中心(SanFrancisco，CA)獲得來(lái)自正常人供體的Leukopac，其中所述正常人供體在他們捐贈(zèng)血液之前7日接受季節(jié)性流感疫苗(Novartis批號(hào)111796P1)。使用標(biāo)準(zhǔn)方法從Leukopac分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。六至八周齡雌性SCID/beige小鼠從CharlesRiverLaboratories(Hollister,CA)購(gòu)買(mǎi)并且在Genentech根據(jù)美國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)護(hù)理指南圈養(yǎng)及維持。全部實(shí)驗(yàn)研究均根據(jù)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南及適用法律和法規(guī)，在GenentechLabAnimalResearch研究機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)下在AAALACi認(rèn)證的設(shè)施中實(shí)施。在提供書(shū)面知情同意書(shū)并且從西部機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)給予倫理批準(zhǔn)后從健康的人供體獲得Leukopac或血液。如下使用脾內(nèi)PBMC移植，進(jìn)行體內(nèi)抗原驅(qū)動(dòng)型漿母細(xì)胞富集和增殖。分離的PBMC與血凝素抗原(見(jiàn)下文)(每一百萬(wàn)個(gè)B細(xì)胞0.1-2μg抗原)重懸并在37℃溫育30分鐘(PBMC/抗原預(yù)混)。在這次溫育之后，洗滌PBMC以移走未結(jié)合的抗原。為了富集產(chǎn)生對(duì)乙型流感病毒特異的交叉反應(yīng)性血凝素抗體的漿母細(xì)胞，特別地選擇用于PBMC/抗原預(yù)混和單細(xì)胞分選的血凝素抗原變體，以不同于流感疫苗內(nèi)部所含的血凝素抗原變體。這項(xiàng)研究中使用的血凝素抗原因此包括來(lái)自以下乙型流感病毒分離株的血凝素：B/香港/1973(在抗原-預(yù)混物和FACS中使用)；B/馬里蘭/1/1959和B/威斯康辛/2010(在ELISA篩選中使用)；和B/布里斯班/2008(在疫苗中和ELISA篩選中使用)。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)在Genentech產(chǎn)生血凝素抗原。使用銫137源，用350拉德對(duì)6-8周齡雌性SCID/beige小鼠(CharlesRiverLaboratories，Hollister，CA)進(jìn)行亞致死照射。在照射之后，添加多粘菌素B(110mg/L)和新霉素(1.1g/L)至飲用水，添加7日。在照射后4小時(shí)，將每只小鼠的左側(cè)剃毛并用(PurduePharma,Stamford,CT)和70％乙醇做好手術(shù)準(zhǔn)備。使用無(wú)菌外科手術(shù)法，在麻醉下進(jìn)行外科手術(shù)。緊鄰每只小鼠的肋緣下方形成一個(gè)1cm皮膚切口，隨后形成腹壁和腹膜的切口。小心地暴露每只小鼠的脾并且用重懸于30μLPBS中的50×106個(gè)人PBMC注射。分別使用5-O縫線(Ethicon，Somerville，NJ)和外科釘(surgicalstaple)，閉合肌肉層中和皮膚中的切口。對(duì)于抗原特異性細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)，在移植后8日處死小鼠，并收獲它們的脾。將獲自小鼠的脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液用定義人IgG+漿母細(xì)胞為CD38高/IgG+表達(dá)的抗人單克隆抗體CD38PECy7(BDBiosciences,SanJose,CA)和IgGDylight(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.,WestGrove,PA)的混合物染色。為了鑒定分離的脾細(xì)胞懸液內(nèi)部的乙型流感病毒血凝素交叉反應(yīng)性漿母細(xì)胞，將細(xì)胞用來(lái)自乙型流感病毒株B/香港/1973的血凝素染色，其中使用Lightning-標(biāo)記試劑盒(InnovaBiosciences，Cambridge，UK)，使所述血凝素事先分別與FITC或PE綴合。在使用上文描述的方法鑒定的大約2018個(gè)抗原特異性漿母細(xì)胞當(dāng)中，7種mAb針對(duì)至少一種乙型流感病毒株顯示病毒中和作用，并且3種mAb針對(duì)測(cè)試的全部乙型流感病毒株(包括來(lái)自祖先世系、山行世系和維多利亞世系的乙型流感病毒毒株)顯示病毒中和作用。實(shí)施例2.從單個(gè)漿母細(xì)胞克隆IgG對(duì)(上文描述的)乙型流感病毒血凝素交叉反應(yīng)的人漿母細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分選，產(chǎn)生大約2018個(gè)抗原特異性漿母細(xì)胞。將單個(gè)漿母細(xì)胞直接分選至含有具5％低IgG胎牛血清的50μlRPMI的U底96孔微量孔平板中。將平板以600xg(BeckmanCoulter,Brea,CA)離心5分鐘，并通過(guò)抽吸小心地移除培養(yǎng)基。將細(xì)胞重懸并且按照相同程序在90μlPBS中洗滌2次。為了產(chǎn)生編碼可變重鏈和輕鏈的cDNA，將每個(gè)細(xì)胞重懸于6μl逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)反應(yīng)混合物中，所述反應(yīng)混合物含有2單位RNaseout(Invitrogen，GrandIsland，NY)、0.5mM4種dNTP(PerkinElmer，Waltham，MA)、1.5mMMgCl2、37.5mMKCl、10mMDTT(二硫蘇糖醇)、0.25％NonidetP40(USBiological,Marblehead,MA)、0.1mg/ml牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)、25mMTrispH8.3、0.25pmol的IgG1-4恒定區(qū)、κ鏈恒定區(qū)和λ鏈恒定區(qū)特異性寡核苷酸(下文顯示)和40USuperscriptIII(Invitrogen，GrandIsland，NY)。IgG1-4恒定：GAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG(SEQIDNO:1)κ恒定：CTCAGCGTCAGGGTGYTGCTGAG(SEQIDNO:2)λ恒定：GGGTKTGGTSGTCTCCAC(SEQIDNO:3)將反應(yīng)分別在45℃、50℃和55℃溫育3x30分鐘間隔。在溫育之后，將反應(yīng)混合物用TE緩沖液(10mmTrisHCl，1mMEDTA)稀釋至15μl。使用來(lái)自以上的2μl稀釋的RT混合物和Advantage-GC2聚合酶混合物(Clontech，MountainView，CA)，按照制造商提供的方案進(jìn)行初始聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，以擴(kuò)增IgG重鏈、κ鏈和λ鏈。使用下文顯示的基于可變重鏈和可變輕鏈種系和恒定區(qū)序列的簡(jiǎn)并寡核苷酸，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。重鏈和輕鏈PCR擴(kuò)增反應(yīng)分別如下分成兩個(gè)反應(yīng)：重鏈家族VH.1、2、3(引物IGVH1a、IGVH1b、IGVH2、IGVH3)和VH.4、5、6、7(引物IGVH4、IGVH5、IGVH6和IGVH7)；κ鏈家族VK.1、2、3(引物IGKV1、IGKV2和IGKV3)和VK.4、5、6(引物IGVK4、IGVK5和IGVK6)；和λ鏈家族VL.1、2、3、4、5(IGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4和IGLV5)和VL.6、7、8、9(引物IGLV6、IGLV7、IGLV8和IGLV9)。將降落PCR擴(kuò)增方案用于溫度循環(huán)。在反應(yīng)之后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用核酸外切酶1(Exo)和蝦堿性磷酸酶(SAP)處理以從每個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)移除過(guò)多的核苷酸和引物(U.S.Biologicals,Marblehead,MA)。使用Sanger測(cè)序法，對(duì)初始PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序以確定重鏈和輕鏈的可變序列。使用種系匹配的重鏈和輕鏈可變寡核苷酸，進(jìn)行第二巢式PCR擴(kuò)增，目的是使用以下寡核苷酸引物插入哺乳動(dòng)物信號(hào)和恒定區(qū)克隆序列。sVH1a:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAG(SEQIDNO:30)sVH2:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGATCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTACGCTGGTG(SEQIDNO:31)sVH3vv:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTC(SEQIDNO:32)sVH3gl:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTG(SEQIDNO:33)sVH4:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGG(SEQIDNO:34)sVH5:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAG(SEQIDNO:35)sVH6:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACT(SEQIDNO:36)sVH7:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTG(SEQIDNO:37)sVK1:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTG(SEQIDNO:38)sVK2:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGATATTGTGATGACTCAGTCTCACTCTCCCTGC(SEQIDNO:39)sVK3:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTG(SEQIDNO:40)sVK4:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTG(SEQIDNO:41)sVK5:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAAACGACACTCACGCAGTCTCCAGC(SEQIDNO:42)sVK6:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTTCG(SEQIDNO:43)sVL1:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGTCTGTGYTGACKCAGCCRCCCTC(SEQIDNO:44)sVL2:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGTCTGCCCTGACTCAGCCT(SEQIDNO:45)sVL3:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCATCCTATGAGCTGACWCAGSHVCCCKC(SEQIDNO:46)sVL4:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGCCTGTGCTGACTCARTCVCCCTC(SEQIDNO:47)sVL5:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGCCTGTGCTGACTCAGCCAACTTC(SEQIDNO:48)sVL6:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAAATTTTATGCTGACTCAGCCCCAC(SEQIDNO:49)sVL7:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGCTGTGGTGACTCAGGAGCCC(SEQIDNO:50)sVL8:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGACTGTGGTGACCCAGGAGCC(SEQIDNO:51)wVL9:CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGCCTGTGCTGACTCAGCCACC(SEQIDNO:52)重鏈恒定:GCCAGGGGGAAGACCGATG(SEQIDNO:53)κ恒定:CTGGGATAGAAGTTATTCAGCAGGCACACAACAGAAGCAGTTCCAGATTTCAACTGCTC(SEQIDNO:54)λ恒定:CTTGRAGCTCCTCAGAGGAG(SEQIDNO:29)根據(jù)制造商的推薦，使用含有GC的PrimeStarHSDNA聚合酶(TakaraBio，Shiga，日本)建立PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，將擴(kuò)增產(chǎn)物用如上文所述的Exo/SAP處理。使用無(wú)限制性核酸內(nèi)切酶的操作，將編碼可變重鏈和可變輕鏈的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。使用Kunkel誘變方案，使20μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)性到IgG1鏈、κ鏈和λ鏈的單鏈DNA人模板上(參見(jiàn)Kunkel(1985)PNAS82:488-492)。通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)正確插入的構(gòu)建體。使用Fugene轉(zhuǎn)染試劑(RocheDiagnostic,Indianapolis,IN)，將含有編碼重鏈和輕鏈的核酸的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T人胚腎細(xì)胞用于瞬時(shí)表達(dá)，并如下文所述那樣分析表達(dá)和結(jié)合作用。實(shí)施例3.血凝素ELISA篩選分析通過(guò)ELISA如下檢驗(yàn)使用如上文所述那樣獲得的每種單克隆抗血凝素抗體(即，抗乙型流感病毒抗體)結(jié)合來(lái)自不同乙型流感病毒分離株的各種血凝素亞型的能力。將表達(dá)各種血凝素的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中；這些血凝素包括來(lái)自乙型流感病毒毒株B/馬里蘭/1/1959、B/維多利亞/2000和B/布里斯班/2008的血凝素。在兩日后，將細(xì)胞在50mMTris、pH8、5mMEDTA、150mMNaCl，1％TritonX-100外加蛋白酶抑制劑混合物(Roche)中裂解。通過(guò)離心清除胞核并且將所產(chǎn)生的裂解物貯存在-80℃。對(duì)于ELISA篩選，將384孔平板(NuncMaxiSorp)用PBS中的5μg/ml雪花蓮(Galanthusnivalis)凝集素(Sigma)包被。將平板洗滌并且隨后用含有多種已表達(dá)的血凝素的細(xì)胞裂解物的稀釋物包被。將平板洗滌并且與抗血凝素抗體的各種稀釋物溫育并隨后與山羊抗人HRP第二抗體(Jackson)的稀釋物溫育。將平板洗滌并處理，用于TMB(3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺)底物檢測(cè)。從上文在實(shí)施例2中描述的單細(xì)胞分選獲得大約2018個(gè)漿母細(xì)胞。其中，在293T細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)并通過(guò)ELISA篩選的98種單克隆抗體顯示與來(lái)自乙型流感病毒毒株B/馬里蘭/1/1959、B/維多利亞/2000和B/布里斯班/2008的血凝素結(jié)合。實(shí)施例4.體外乙型流感病毒中和作用如下檢驗(yàn)了本發(fā)明的抗乙型流感病毒血凝素抗體激發(fā)廣泛的血凝素亞型結(jié)合作用并在體外中和一組乙型流感病毒分離株的能力。在96孔黑壁透明底成像平板(Costar3904)中，將MDCK細(xì)胞在補(bǔ)充有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中培育為25％匯合單層。將每個(gè)乙型流感病毒亞型稀釋于流感培養(yǎng)基(DMEM，0.2％來(lái)自Gibco目錄號(hào)15260的BSA，10mMHEPES，來(lái)自Gibco目錄號(hào)10378的青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺，來(lái)自Sigma目錄號(hào)T1426的2μg/mLTPCK處理的胰蛋白酶)中至MOI為1并且在37℃與不同濃度(范圍從0.02nM至1600nM)的mAb34B5A和mAb33F8溫育1小時(shí)。隨后，允許每種抗體/流感病毒混合物在37℃在5％CO2培養(yǎng)箱中感染MDCK細(xì)胞16小時(shí)，之后用100％冷乙醇固定細(xì)胞。隨后用Hoechst33342(Invitrogen，目錄號(hào)H3570)染色固定的細(xì)胞，以可視化細(xì)胞核并確定總細(xì)胞數(shù)目。還將細(xì)胞用乙型流感病毒核蛋白(NP)特異的廣泛反應(yīng)性單克隆抗體(Millipore目錄號(hào)MAB8258)和AlexaFluor488-綴合的山羊抗小鼠第二抗體(Invitrogen目錄號(hào)A11029)染色以確定感染細(xì)胞的數(shù)目。使用ImageExpressMicro儀(MolecularDevices)，對(duì)細(xì)胞成像，并且使用MetaXpress3.1軟件分析數(shù)據(jù)圖像。確定感染細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)并且在Y軸上相對(duì)于X-軸上的抗體濃度(Log10)作圖。全部中和分析均一式三份完成并將數(shù)據(jù)作為nM計(jì)的IC50值連同95％置信區(qū)間(95％CI)報(bào)告。用非線性回歸劑量反應(yīng)曲線擬合數(shù)據(jù)以生成IC50和95％CI。使用本文所述的單克隆抗體的各種濃度，針對(duì)一個(gè)大組的乙型流感病毒株產(chǎn)生體外中和劑量-反應(yīng)曲線。圖1A和圖1B分別顯示mAb34B5A和mAb33F8針對(duì)一組乙型流感病毒株的中和曲線。如圖1A和圖1B中所示，mAb34B5A和mAb33F8在體外有效中和一大組的乙型流感病毒株，包括針對(duì)乙型流感病毒祖先世系以及乙型流感病毒山行世系和維多利亞世系的體外中和活性。下表2顯示從上文對(duì)mAb34B5A描述的實(shí)驗(yàn)計(jì)算的體外中和活性。表2乙型流感病毒株世系IC50(nM)95％CI(nM)B/威斯康辛/1/2010山行2.91.3–6.4B/布里斯班/2008維多利亞0.0540.047–0.063B/孟加拉/2007維多利亞0.190.17–0.21B/馬來(lái)西亞/2004維多利亞0.0380.024–0.059B/維多利亞/504/2000山行0.0920.088–0.096B/俄羅斯/1969祖先0.790.61–1.0B/馬薩諸塞/3/1966祖先0.380.33–0.44B/馬里蘭/1/1959祖先0.0380.029–0.050B/李/10/1940祖先0.140.13–0.15圖2顯示mAb46B8A針對(duì)一組乙型流感病毒株的體外中和曲線。另外，如圖2中所示，mAb46B8A在體外有效中和一大組的乙型流感病毒株，包括針對(duì)乙型流感病毒祖先世系以及乙型流感病毒山行世系和維多利亞世系的體外中和活性。這些結(jié)果顯示本發(fā)明的單克隆抗體能夠在體外以劑量-依賴(lài)性方式中和多種乙型流感病毒分離株/毒株。另外，這些結(jié)果顯示，本發(fā)明的單克隆抗體能夠中和祖先乙型流感病毒分離株以及來(lái)自山行世系和維多利亞世系趨異后的乙型流感病毒分離株，包括中和乙型流感病毒株威斯康辛/2010、布里斯班/2008、孟加拉/2007、馬來(lái)西亞/2004、維多利亞/2000、俄羅斯/1969、馬薩諸塞/1966、馬里蘭/1959和李/1940。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的單克隆抗體有效治療和預(yù)防乙型流感病毒感染和來(lái)自祖先世系、山行世系和維多利亞世系的乙型流感病毒株。實(shí)施例5.乙型流感病毒血凝抑制分析為了檢查mAb46B8C和mAb34B5C中和的機(jī)制，使用以下兩種乙型流感病毒進(jìn)行血凝抑制(HI)分析：B/維多利亞/504/2000和B/威斯康辛/1/2010。對(duì)于每種乙型流感病毒，在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中一式兩份以5倍進(jìn)階制得8個(gè)系列稀釋物，始于1:5。將50μl每種稀釋物轉(zhuǎn)移至V形底96孔板(Costar3894)中。將火雞紅細(xì)胞(TRBCs，來(lái)自LampireBiologicalLaboratories目錄號(hào)7249408)在PBS中稀釋成0.5％并且將50μl添加至含有病毒的每個(gè)孔。將平板在室溫溫育1小時(shí)。通過(guò)直接觀察法確定阻止TRBC聚集的最末病毒稀釋度(對(duì)應(yīng)于最低病毒濃度)并該稀釋度用于血凝集抑制(HI)分析。用mAb46B8C和mAb34B5C(兩種具有寬泛乙型流感病毒血凝素亞型結(jié)合作用的人單克隆抗體(huMab))和單純皰疹病毒(HSV)糖蛋白D特異的對(duì)照huMabgD5237進(jìn)行HI分析。將每種抗體的5倍進(jìn)階的范圍從0.0032–250μg/ml的8個(gè)系列稀釋物(一式三份)與預(yù)定量的B/維多利亞/504/2000或B/威斯康辛/1/2010病毒在PBS中混合并且在37℃溫育1小時(shí)，如上文所述。將50μl病毒-抗體混合物轉(zhuǎn)移至V形底96孔板。將TRBC在PBS中稀釋成0.5％并且將50μl添加至含有50μl病毒-抗體混合物的每個(gè)孔。將每塊平板在室溫溫育1小時(shí)并且通過(guò)直接觀察確定每種抗體的HI滴度(即，有效抑制血凝集的最低抗體濃度)。如圖3中所示，mAb34B5C有效抑制B/維多利亞/504/2000和B/威斯康辛/1/2010乙型流感病毒對(duì)火雞紅細(xì)胞(TRBC)的血凝集作用。與之相反，mAb46B8C和對(duì)照gD5237抗體均不顯示對(duì)任一乙型流感病毒所致的血凝集產(chǎn)生抑制，甚至在測(cè)試的最高抗體濃度也是如此。這些結(jié)果表明，mAb34B5C與乙型流感病毒血凝素的首基(headgroup)中的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合并且因此阻礙病毒與TRBC上的唾液酸受體結(jié)合。這些結(jié)果還表明，mAb46B8C與乙型流感病毒血凝素上受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域外部的區(qū)域結(jié)合(例如，莖(或桿)區(qū))。實(shí)施例6.通過(guò)蝕斑抑制測(cè)定法分析體外乙型流感病毒中和作用進(jìn)一步如下分析了本發(fā)明的抗乙型流感病毒血凝素抗體中和多種乙型流感病毒分離株的能力。如下通過(guò)噬斑測(cè)定法測(cè)定乙型流感病毒滴度。在6孔組織培養(yǎng)板(Costar3516)中，將MDCK細(xì)胞在補(bǔ)充有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中培育為匯合單層。這些研究中使用的全部乙型流感病毒株均購(gòu)自ViraPur(DanDiego,CA)。為了測(cè)定病毒滴度，將每種病毒原液稀釋于流感培養(yǎng)基(DMEM，0.2％來(lái)自Gibco目錄號(hào)15260的BSA，10mMHEPES，來(lái)自Gibco目錄號(hào)10378的青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺，來(lái)自Sigma目錄號(hào)T1426的2μg/mLTPCK處理的胰蛋白酶)中。以10倍進(jìn)階制得每種病毒的六個(gè)系列稀釋物，從1:102至1:107，并且將1ml每種稀釋物用來(lái)感染6孔平板中的MDCK細(xì)胞。感染后2小時(shí)，移除病毒并且將細(xì)胞用2ml2X流感培養(yǎng)基:2％瓊脂糖為1:1的混合物覆蓋。將平板在室溫保持30分鐘并且隨后在37℃于5％CO2培養(yǎng)箱中溫育。三天后，通過(guò)暗光下直接觀察計(jì)數(shù)蝕斑，并且每種病毒的滴度以蝕斑形成單位(PFU)/ml確定。隨后通過(guò)蝕斑抑制測(cè)定法如下檢查本發(fā)明單克隆抗體對(duì)乙型流感病毒中和作用的影響。在6孔組織培養(yǎng)板(Costar3516)中，將MDCK細(xì)胞在補(bǔ)充有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中培育為匯合單層。對(duì)于每種乙型流感病毒，在蝕斑抑制測(cè)定法中使用在6孔平板中產(chǎn)生20至200個(gè)蝕斑/孔(如上文所述測(cè)定)的病毒量。將mAb46B8C的3倍進(jìn)階的范圍從0.16nM至38.4nM的六個(gè)系列稀釋物與每種病毒在流感培養(yǎng)基中混合并且在37℃溫育1小時(shí)。1ml病毒-抗體混合物用來(lái)感染6孔板中的MDCK細(xì)胞，并且每次感染在3個(gè)重復(fù)平板中實(shí)施。mAb46B8C的相同系列稀釋物在2X流感培養(yǎng)基中制得并按1:1與2％瓊脂糖混合。感染后兩小時(shí)，移除病毒-抗體混合物并將細(xì)胞用2ml抗體-瓊脂糖混合物覆蓋。將平板在室溫保持30分鐘并且隨后在37℃于5％CO2培養(yǎng)箱中溫育。5-6日后，通過(guò)暗光下直接觀察計(jì)數(shù)蝕斑。通過(guò)以下方式確定感染百分?jǐn)?shù)：對(duì)最高蝕斑數(shù)(在最低抗體濃度處)歸一化并且在Y軸上相對(duì)于X軸上的Log10抗體濃度作圖。將數(shù)據(jù)用非線性回歸劑量-反應(yīng)曲線擬合以生成IC50值(產(chǎn)生50％抑制作用的濃度)連同95％置信區(qū)間(95％CI)。如圖4中所示，mAb46B8C在體外以劑量依賴(lài)性方式阻斷測(cè)試的所有乙型流感病毒株的蝕斑形成。下表3顯示從蝕斑形成測(cè)定法中生成的數(shù)據(jù)用上文描述的mAb46B8C計(jì)算的IC50值。如表3中所見(jiàn)，mAb46B8C在很低的濃度阻斷蝕斑形成，顯示小于1nM的IC50值。表3流感毒株世系IC50(nM)95％CI(nM)B/威斯康辛/1/2010山行0.640.53–0.76B/布里斯班/2008維多利亞0.860.72–1.0B/孟加拉/2007維多利亞0.750.62–0.92B/馬來(lái)西亞/2004維多利亞0.580.36–0.91B/維多利亞/504/2000山行0.670.62–0.73B/俄羅斯/1969祖先0.730.61–0.86B/馬薩諸塞/3/1966祖先0.800.65–0.98B/馬里蘭/1/1959祖先0.950.71–1.3B/李/10/1940祖先0.680.55–0.85總之，使用蝕斑中和測(cè)定法，這些數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明的單克隆抗體有效抑制并中和乙型流感病毒(包括來(lái)自祖先世系、山行世系和維多利亞世系的乙型流感病毒分離株)體外形成蝕斑。另外，這些結(jié)果顯示，本發(fā)明的單克隆抗體在低于1nM的IC50值抑制乙型流感病毒體外形成蝕斑。實(shí)施例7.乙型流感病毒血凝素融合抑制測(cè)定法為了進(jìn)一步探索mAb46B8C和mAb34B5C中和的機(jī)制，如下檢查了在血凝素介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞融合測(cè)定法中，這些抗體在病毒進(jìn)入期間避開(kāi)受體初始結(jié)合步驟的抑制性作用。在6孔組織培養(yǎng)板(Costar3516)中，將Hela細(xì)胞在DMEM+10％FBS中培育至40％匯合。將每個(gè)孔中的細(xì)胞用10mg表達(dá)B/威斯康辛/1/2010血凝素的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。17小時(shí)后，從細(xì)胞移除轉(zhuǎn)染混合物并且將含有10mM丁酸鈉的新鮮培養(yǎng)基添加至細(xì)胞。6小時(shí)后再次更換培養(yǎng)基并且允許細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)夜至約80％匯合，此后進(jìn)行融合抑制測(cè)定法。將細(xì)胞在PBS中洗滌并用PBS中的5mg/mlTPCK胰蛋白酶(Sigma目錄號(hào)T1426)在37℃處理7分鐘。移除胰蛋白酶，添加含有50mg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑(CalBiochem目錄號(hào)65035)的培養(yǎng)基并且在37℃溫育細(xì)胞10分鐘。隨后將細(xì)胞于37℃在含有20mg/ml或200mg/ml的mAb46B8C、mAb34B5C或單純皰疹病毒(HSV)糖蛋白D特異的對(duì)照人mAbgD5237的培養(yǎng)基中溫育。在1小時(shí)后，移除抗體并且將細(xì)胞在流感培養(yǎng)基(pH4.85)中在37℃溫育5分鐘。移除低pH培養(yǎng)基并將細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中在37℃溫育過(guò)夜以允許合胞體充分形成。在10X物鏡下用NikonEclipseTE2000-E顯微鏡和NIS-ElementsAR3.2軟件拍攝細(xì)胞的分期圖片。表達(dá)乙型流感病毒B/威斯康辛/1/2010血凝素的Hela細(xì)胞與20μg/ml或200μg/mlmAb46B8C、mAb34B5C或?qū)φ誱AbgD5237溫育，之后暴露于低pH培養(yǎng)基。合胞體在pH降低的數(shù)小時(shí)以?xún)?nèi)出現(xiàn)并且在過(guò)夜培養(yǎng)后充分形成。mAb46B8C在20μg/ml和200μg/ml均抑制合胞體形成；與之相反，mAb34B5C和對(duì)照mAbgD5237在任一個(gè)檢查的濃度均不阻斷細(xì)胞-細(xì)胞融合。(參見(jiàn)圖5)與上文實(shí)施例5中描述的血凝集抑制(HI)測(cè)定法獲得的結(jié)果一致，這些結(jié)果表明，mAb46B8C是結(jié)合血凝素莖桿的抗體并且因此能夠阻斷乙型流感病毒膜融合需要的pH誘導(dǎo)所致的血凝素莖桿中的構(gòu)象變化。這些結(jié)果還表明，mAb34B5C可能與血凝素的頭基團(tuán)結(jié)合并通過(guò)阻斷初始的受體結(jié)合步驟(在本文所述細(xì)胞-細(xì)胞融合測(cè)定法中避開(kāi)的步驟)中和乙型流感病毒。實(shí)施例8.mAb46B8C對(duì)多種乙型流感病毒血凝素的親和力如下測(cè)定mAb46B8對(duì)多種乙型流感病毒血凝素的親和力。將50μL在結(jié)合緩沖液(含2％FBS，50mMHEPES，pH7.2和0.1％疊氮鈉的DMEM)中含有固定濃度的碘化抗乙型流感病毒抗體(mAb46B8C)和濃度系列稀釋的未標(biāo)記抗乙型流感病毒抗體(mAb46B8C)的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)混合物置于96孔板中。將瞬時(shí)表達(dá)乙型流感病毒各種毒株的293細(xì)胞以結(jié)合緩沖液中50000個(gè)細(xì)胞/0.2ml的密度添加至競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)混合物。將含細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系在室溫溫育2小時(shí)。在2小時(shí)溫育后，將競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至MilliporeMultiscreen濾板并用結(jié)合緩沖液洗滌4次以將游離的抗體與結(jié)合的碘化抗體分離。在WallacWizard1470γ計(jì)數(shù)器(PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences；Wellesley,MA)上對(duì)濾器計(jì)數(shù)。使用NewLigand軟件(Genentech)評(píng)價(jià)結(jié)合數(shù)據(jù)，所述軟件使用Munson和Rodbard擬合算法以確定結(jié)合親和力(Munson和Rodbard(1980)AnalBiochem7:2239)。下表X顯示mAb46B8C對(duì)來(lái)自多種乙型流感病毒的在293T細(xì)胞表面上重組表達(dá)的血凝素三聚體的Scatchard結(jié)合分析。如下表4中所示，mAb46B8C對(duì)各種乙型流感病毒血凝素展示低nM親和力。表4實(shí)施例9.mAb34B5A在小鼠中針對(duì)B/維多利亞/2000和B/威斯康辛/2010的體內(nèi)效力如下實(shí)施mAb34B5A對(duì)小鼠中乙型流感病毒感染的體內(nèi)效力。將DBA/2J小鼠(JacksonLab，BarHarbor，ME)用50μl按照最小LD100劑量(1x104個(gè)病毒/小鼠)稀釋于流感培養(yǎng)基(DMEM，0.2％BSA，2μg/mlTPCK處理的胰蛋白酶)中的乙型流感病毒株B/維多利亞/2000鼻內(nèi)感染。允許流感病毒感染推進(jìn)72小時(shí)(對(duì)于B/維多利亞/2000感染而言)，之后靜脈內(nèi)施用mAb34B5A。在乙型流感病毒B/維多利亞/2000感染72小時(shí)后，將多種量的mAb34B5A按200μlPBS中15mg/kg、3mg/kg、0.6mg/kg和0.12mg/kg的劑量靜脈內(nèi)施用至小鼠。以最高測(cè)試的mAb34B5A的等效劑量(即，大約15mg/kg)向?qū)φ仗幚淼膭?dòng)物施用mAbgD5237。對(duì)小鼠每日監(jiān)測(cè)體況和存活，并且還每日稱(chēng)重，直至感染后21日。圖6A顯示了以乙型流感病毒B/維多利亞/2000感染后72小時(shí)，施用多種量mAb34B5A的小鼠的存活百分?jǐn)?shù)(隨時(shí)間推移，以日計(jì))。如圖6A中所示，截止第10日在施用對(duì)照抗體的感染小鼠中觀察到100％死亡率。但是，施用本發(fā)明單克隆抗體的感染小鼠顯示存活增加。尤其是，在治療劑量15mg/kg的mAb34B5A時(shí)在乙型流感病毒B/維多利亞/2000感染的小鼠中觀察到100％存活率。進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，旨在將mAb34B5A的有效性與達(dá)菲(奧司他韋)比較。達(dá)菲按10mg/kg、30mg/kg或100mg/kgBID施用，病毒感染后72小時(shí)啟用。盡管與運(yùn)載體對(duì)照處理的動(dòng)物相比，達(dá)菲的確向乙型流感病毒B/維多利亞/2000感染的小鼠提供某種保護(hù)作用，但截至第11日觀察到100％死亡率，甚至在施用的最高劑量也是如此。(參見(jiàn)圖6B)。這些結(jié)果顯示本發(fā)明的單克隆抗體有效治療乙型流感病毒體內(nèi)感染。另外，這些數(shù)據(jù)顯示當(dāng)乙型流感病毒感染后直至至少72小時(shí)施用時(shí)，本發(fā)明的單克隆抗體有效治療乙型流感病毒體內(nèi)感染?？傊?，這些結(jié)果額外地顯示，當(dāng)病毒感染后72小時(shí)施用時(shí)，本發(fā)明的單克隆抗體與達(dá)菲相比在小鼠中顯示更好的體內(nèi)效力。實(shí)施例10.mAb34B5C在小鼠中針對(duì)乙型流感病毒B/威斯康辛/2010的體內(nèi)效力如下實(shí)施mAb34B5C對(duì)小鼠中乙型流感病毒感染的體內(nèi)效力。將DBA/2J小鼠(JacksonLab，BarHarbor，ME)用50μl按照最小LD100劑量(1x106個(gè)病毒/小鼠)稀釋于流感培養(yǎng)基(DMEM，0.2％BSA，2μg/mlTPCK處理的胰蛋白酶)中的乙型流感病毒株B/威斯康辛/2010鼻內(nèi)感染。允許流感病毒感染推進(jìn)48小時(shí)或72小時(shí)，之后靜脈內(nèi)施用mAb34B5C。在乙型流感病毒B/威斯康辛/2010感染48小時(shí)或72小后，將多種量的mAb34B5C按200μlPBS中15mg/kg、5mg/kg和1.7mg/kg的劑量靜脈內(nèi)施用至小鼠。以mAb34B5C的最高測(cè)試的等效劑量(即，大約15mg/kg)向?qū)φ仗幚淼膭?dòng)物施用mAbgD5237。對(duì)小鼠每日監(jiān)測(cè)體況和存活，并且還每日稱(chēng)重，直至感染后21日。圖7A和圖7B分別顯示了以乙型流感病毒B/威斯康辛/2010感染后48小時(shí)或72小時(shí)施用多種量mAb34B5C的小鼠的存活百分?jǐn)?shù)(隨時(shí)間推移，以日計(jì))。如圖7A和圖7B中所示，截止第9日或第10日在施用對(duì)照抗體的感染小鼠中觀察到100％死亡率。然而，施用mAb34B5C的感染小鼠顯示存活增加。(參見(jiàn)圖7A和圖7B)。這些結(jié)果顯示本發(fā)明的單克隆抗體有效治療多種乙型流感病毒感染。另外，這些數(shù)據(jù)顯示當(dāng)乙型流感病毒感染后直至至少72小時(shí)施用時(shí)，本發(fā)明的單克隆抗體有效治療乙型流感病毒感染。實(shí)施例11.mAb46B8C在小鼠中針對(duì)乙型流感病毒B/威斯康辛/2010的體內(nèi)效力為了檢驗(yàn)mAb46B8C在小鼠中的體內(nèi)效力，將該抗體靜脈內(nèi)施用至用4種不同乙型流感病毒株(B/威斯康辛/2010、B/維多利亞/2000、B/俄羅斯/1969和B/馬薩諸塞/1966)感染的小鼠。DBA/2J小鼠(JacksonLab，BarHarbor，ME)用50μl按照1xLD100劑量稀釋入流感培養(yǎng)基(DMEM，0.2％BSA，2μg/mlTPCK處理的胰蛋白酶)中的不同乙型流感病毒株鼻內(nèi)感染。在一組實(shí)驗(yàn)中，使用以下乙型流感病毒分離株：B/威斯康辛/2010、B/維多利亞/2000、B/俄羅斯/1969和B/馬薩諸塞/1966。在感染后24、48、或72小時(shí)，將抗血凝素mAb46B8C按200μlPBS中大約15mg/kg靜脈內(nèi)施用。向?qū)φ仗幚淼膭?dòng)物給予mAbgD5237(15mg/kg)。對(duì)小鼠監(jiān)測(cè)體況和存活，并且還稱(chēng)重，直至感染后21日。如圖8A和圖8B中所示，在分別施用乙型流感病毒株B/威斯康辛/2010和B/維多利亞/2000的小鼠中，截止第10日和第9日在對(duì)照處理組中觀察到100％死亡率。在B/維多利亞/2000或B/馬薩諸塞/1966感染后24、48或72小時(shí)按15mg/kg施用的單劑量mAb46B8C導(dǎo)致小鼠100％存活。(參見(jiàn)圖8B和圖8D)。在B/威斯康辛/2010或B/俄羅斯/1969(以及B/維多利亞/2000或B/Mass/1966)感染后24或48小時(shí)按15mg/kg施用的單劑量mAb46B8C導(dǎo)致小鼠100％存活。(參見(jiàn)圖8A、圖8B、圖8C和圖8D)。這些結(jié)果顯示，mAb46B8C有效治療乙型流感病毒多種毒株的體內(nèi)感染。尤其是，這些結(jié)果顯示，在感染后24、48或72小時(shí)施用時(shí)，mAb46B8C有效治療乙型流感病毒感染并改善存活?？傊?，這些結(jié)果顯示，本發(fā)明的單克隆抗體有效治療來(lái)自祖先世系、山行世系和維多利亞世系的乙型流感病毒分離株，甚至感染后長(zhǎng)達(dá)至少72小時(shí)施用時(shí)也是如此。實(shí)施例12.當(dāng)乙型流感病毒感染后72小時(shí)施用時(shí)小鼠中mAb46B8C的體內(nèi)效力如下實(shí)施多種劑量的mAb34B5C對(duì)小鼠中乙型流感病毒感染的體內(nèi)效力。DBA/2J小鼠(JacksonLab，BarHarbor，ME)用50μl按照最小LD100劑量稀釋于流感培養(yǎng)基(DMEM，0.2％BSA，2μg/mlTPCK處理的胰蛋白酶)中的乙型流感病毒株B/威斯康辛/2010或B/維多利亞/2000鼻內(nèi)感染。允許流感病毒感染進(jìn)展72小時(shí)，之后靜脈內(nèi)施用多種劑量的mAb46B8C。在乙型流感病毒感染72小時(shí)后，將多種量的mAb46B8C按200μlPBS中45mg/kg、15mg/kg或5mg/kg的劑量靜脈內(nèi)施用至小鼠中。以測(cè)試的最高等效劑量大約45mg/kg向?qū)φ仗幚淼膭?dòng)物施用mAbgD5237。對(duì)小鼠每日監(jiān)測(cè)體況和存活，并且還每日稱(chēng)重，直至感染后21日。如圖9A和圖9B中所示，乙型流感病毒感染后72小時(shí)按45mg/kg或15mg/kg施用mAb46B8C導(dǎo)致分別被B/威斯康辛/2010或B/維多利亞/2000感染的小鼠100％存活。與對(duì)照處理的動(dòng)物相比，mAb46B8C的甚至在5mg/kg劑量的施用顯示出如通過(guò)小鼠存活百分?jǐn)?shù)所度量的針對(duì)乙型流感病毒B/威斯康辛/2010和B/維多利亞/2000的治療性治療效力。該數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)至少直到乙型流感病毒感染后72小時(shí)施用時(shí)，mAb46B8C有效治療乙型流感病毒感染。實(shí)施例13.比較mAb46B8C和奧司他韋在小鼠重度乙型流感病毒感染中的體內(nèi)效力為了在小鼠中比較本發(fā)明抗乙型流感病毒血凝素抗體與磷酸奧司他韋的效力，進(jìn)行以下研究。將6周齡的Balb/c小鼠(CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室，Hollister，CA)用50μl乙型流感病毒株B/維多利亞/2000按4xLD100鼻內(nèi)感染。在感染后48小時(shí)，將mAb46B8C以45mg/kg單劑量或?qū)φ誌gG在200μlPBS中靜脈內(nèi)施用。在這些實(shí)驗(yàn)中，由2mg每日二次給藥(BID)持續(xù)五日組成的奧司他韋給藥方案與mAb46B8C的約15mg/kg單次靜脈內(nèi)劑量比較。本文所述的任何實(shí)施例中使用的(奧司他韋(即，)從TorontoResearchChemicals獲得，目錄號(hào)186003498)。如圖10A中所示，截止第9日在對(duì)照IgG(mAbgD5237)治療的動(dòng)物中觀察到100％死亡率，并且截止第11日在達(dá)菲治療的動(dòng)物中觀察到100％死亡率。但是，mAb46B8C的15mg/kg單次劑量保護(hù)75％的感染動(dòng)物幸免于致死性乙型流感病毒攻擊。另外，mAb46B8C治療的動(dòng)物顯示體重變化％恢復(fù)。(參見(jiàn)圖10B)。實(shí)施例14.mAb46B8C與達(dá)菲聯(lián)用是安全的并且降低肺部滴度為了在小鼠中進(jìn)一步檢驗(yàn)本發(fā)明抗乙型流感病毒血凝素抗體相對(duì)于磷酸奧司他韋的用途和效力，進(jìn)行以下研究。將6周齡的Balb/c小鼠(CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室，Hollister，CA)用50μl乙型流感病毒株B/維多利亞/2000按1xLD100鼻內(nèi)感染。在感染后48小時(shí)，將抗血凝素抗體mAb46B8C以15mg/kg單劑量或?qū)φ誌gG在200μlPBS中靜脈內(nèi)施用。在這些實(shí)驗(yàn)中，由2mg每日二次給藥(BID)持續(xù)五日組成的奧司他韋給藥方案(100mg/kg)與mAb46B8C的約15mg/kg單次靜脈內(nèi)劑量比較。還進(jìn)行了聯(lián)合治療。如圖11A中所示，截止第11日在對(duì)照IgG(mAbgD5237)治療的動(dòng)物中觀察到100％死亡率。但是，當(dāng)單獨(dú)或與達(dá)菲聯(lián)合施用時(shí)，mAb46B8C的15mg/kg單次劑量導(dǎo)致小鼠100％存活。另外，這個(gè)體內(nèi)乙型流感病毒感染模型中用mAb46B8C和達(dá)菲的聯(lián)合治療動(dòng)物是安全和有效的。如圖11B中所示，與對(duì)照處理的動(dòng)物中或僅用達(dá)菲治療的動(dòng)物中所觀察到相比，單獨(dú)或聯(lián)合達(dá)菲施用mAb46B8C顯示降低了乙型流感肺部病毒滴度。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的單克隆抗體與神經(jīng)氨酸酶抑制劑(例如，奧司他韋)聯(lián)合使用時(shí)安全并有效。實(shí)施例15.mAb46B8C與奧司他韋在小鼠重度乙型流感病毒感染模型中的協(xié)同為了在小鼠中進(jìn)一步檢驗(yàn)共施用本發(fā)明的抗乙型流感病毒血凝素抗體和磷酸奧司他韋的效力，進(jìn)行了以下研究。將6周齡的Balb/c小鼠(CharlesRiver實(shí)驗(yàn)室，Hollister，CA)用50μl乙型流感病毒株B/維多利亞/2000按4xLD100鼻內(nèi)感染。在感染后48小時(shí)，將抗血凝素抗體mAb46B8C以15mg/kg或5mg/kg單劑量或?qū)φ誌gG在200μlPBS中靜脈內(nèi)施用。在這些實(shí)驗(yàn)中，由2mg每日二次給藥(BID)持續(xù)五日組成的奧司他韋給藥方案與mAb46B8C的約15mg/kg單次靜脈內(nèi)劑量比較。在這些實(shí)驗(yàn)中，奧司他韋給藥方案由2mg每日二次給藥(BID)持續(xù)五日組成(100mg/kg)。將動(dòng)物用對(duì)照抗體、僅用mAb46B8C、僅用奧司他韋、或mAb46B8C和奧司他韋聯(lián)合處理。如圖12A和圖12B中所示，僅施用對(duì)照抗體或僅施用達(dá)菲的動(dòng)物截止第9日或第10日顯示100％死亡率。另外，在這個(gè)重度乙型流感病毒感染模型中，按5mg/kg施用mAb46B8C的動(dòng)物截止第9日顯示100％死亡率。但是，mAb46B8C和達(dá)菲聯(lián)合治療在5mg/kg或15mg/kg的劑量導(dǎo)致存活增加。這些結(jié)果表明，與任何單一治療相比，使用本發(fā)明抗體連同奧司他韋的聯(lián)合治療在治療結(jié)局方面提供某種程度的協(xié)同。實(shí)施例16.競(jìng)爭(zhēng)ELISA使用乙型流感病毒(例如，B/維多利亞/2000、B/威斯康辛/2010等)血凝素，開(kāi)發(fā)了競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定法。使血凝素包被的ELISA平板結(jié)合多種濃度的測(cè)試抗體(X-軸)，之后添加飽和濃度的生物素標(biāo)記的本發(fā)明單克隆抗體(例如，mAb48B8C等)。如果測(cè)試抗體競(jìng)爭(zhēng)本發(fā)明單克隆抗體的乙型流感病毒血凝素表位，則生物素ELISA信號(hào)(Y-軸)隨測(cè)試抗體濃度漸增而減少。將結(jié)合數(shù)據(jù)用非線性劑量反應(yīng)曲線擬合以確定按nM給出的EC50值。通過(guò)胺偶聯(lián)法，根據(jù)制造商的推薦方案(Sulfo-NHS-LC-LC,Pierce,Rockford,IL)，將本發(fā)明的單克隆抗體進(jìn)行生物素酰化。生物素?；痬Ab的母液最終濃度例如是13.2mM。為了確定最佳使用濃度，將生物素酰化的mAb針對(duì)固定化的乙型流感病毒血凝素連續(xù)滴定。將重組血凝素蛋白在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中稀釋至2μg/ml并且分配(100μl)到96孔NuncMaxisorp平板(Nunc,Rochester,NY)上。將平板在4℃包被過(guò)夜，在PBS中淋洗，并且隨后在室溫用含有1％牛血清白蛋白(BSA,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的PBS封閉1小時(shí)。每塊平板隨后接受100μl在含有1.0％BSA和0.05％聚山梨醇酯20(Sigma-Aldrich)的PBS中以初始濃度88nM開(kāi)始按1/3稀釋度系列稀釋的生物素?；痬Ab。在1小時(shí)溫育后，將平板洗滌并且隨后在室溫與100μl鏈霉親和素綴合的辣根過(guò)氧化物酶(CaltagLaboratories,Carlsbad,CA)的1:5000稀釋物溫育30分鐘。在溫育之后，將平板洗滌并且用100μlTMB底物(KirkegaardandPerryLaboratories,Inc.Gaithersburg,MD)顯色。在SpectraMax平板讀數(shù)儀(MolecularDevices,Sunnyvale,CA.)上在O.D.450nM處讀取平板。確定生物素酰化mAb的最佳濃度是例如1nM。實(shí)施例17.mAb46B8C在小鼠中針對(duì)乙型流感病毒B/布里斯班/2008的體內(nèi)效力為了檢驗(yàn)mAb46B8C在小鼠中針對(duì)乙型流感病毒B/布里斯班/2008(維多利亞世系的乙型流感病毒)(Viapur，LLC，圣迭戈，CA)的體內(nèi)效力，進(jìn)行以下研究。DBA/2J小鼠用最小1xLD100劑量(1X104PFU/小鼠)的乙型流感病毒B/布里斯班/2008鼻內(nèi)感染。在感染后24、48和72小時(shí)，對(duì)8只雌性小鼠/組按15mg/kg在0.1mLPBS中靜脈內(nèi)施用mAb46B8C。對(duì)小鼠監(jiān)測(cè)存活并且稱(chēng)重，直至感染后21日。作為對(duì)照，感染后72小時(shí)，將一組感染的小鼠用15mg/kg人IgG1抗體抗gD(小鼠中沒(méi)有已知的靶)處理。如圖26A中所示，施用乙型流感病毒B/布里斯班/2008的小鼠中，截止第11日在對(duì)照處理組中觀察到100％死亡率。在乙型流感病毒B/布里斯班/2008感染后24、48或72小時(shí)按15mg/kg施用的單劑量mAb46B8C導(dǎo)致小鼠100％存活。(參見(jiàn)圖26B)。圖26B顯示在上文描述的各種條件和處理下小鼠中體重的變化。這些結(jié)果顯示，mAb46B8C有效治療來(lái)自維多利亞世系的乙型流感病毒B/布里斯班/2008的感染。統(tǒng)計(jì)分析使用JMP第9.0.2版軟件(SASInstitute)計(jì)算統(tǒng)計(jì)結(jié)果。使用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)比較存活率實(shí)驗(yàn)。將P值<0.05視為顯著。使用GraphpadPrism第5.0版軟件繪制IC50曲線并計(jì)算IC50值。雖然已經(jīng)出于清晰理解的目的，以說(shuō)明和舉例方式某種程度地詳細(xì)描述了前述發(fā)明，但是這些說(shuō)明和例子不應(yīng)當(dāng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。本文中援引的全部專(zhuān)利和科學(xué)文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用方式明確地完整并入。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3