被鞘氨醇?1?磷酸修飾的透明質(zhì)酸的制作方法

本發(fā)明涉及被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質(zhì)酸。更具體而言，涉及可用作藥物的有效成分的被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質(zhì)酸，該藥物用于預(yù)防和/或治療肝缺血再灌注損傷。

背景技術(shù)：

已知，肝移植、肝切除時(shí)的術(shù)后肝功能衰竭的主要原因是由缺血再灌注產(chǎn)生的缺氧/復(fù)氧(Hypoxia-reoxygenation)；由缺血再灌注導(dǎo)致的肝損傷的預(yù)防中，重要的是肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC)的保護(hù)(Caldwell et al.Hepatology,10,pp.292-299,1989)。由于報(bào)告有，因缺氧/復(fù)氧而產(chǎn)生LSEC凋亡(Neal R.Banga et al.J.Surg.Res.,178,pp.e35-41,2012)，因此，可以認(rèn)為，LSEC是肝缺血再灌注損傷的主要因素。

另外，作為鞘脂介質(zhì)的鞘氨醇-1-磷酸(S1P)是來自作為細(xì)胞膜的構(gòu)成組分的鞘磷脂的鞘氨醇被鞘氨醇激酶磷酸化而產(chǎn)生，通過S1P受體而表現(xiàn)出多彩的生理活性。還報(bào)告有例如，已知S1P具有抗凋亡作用(Cuvillier et al.,Nature,381,pp.800-803,1996)、醇性肝損傷中抑制LSEC的凋亡(Dong-Mei Zheng et al.Hepatology,44,pp.1278-1287,2006)、抑制由缺血再灌注導(dǎo)致的腎損傷(Lee et al.Nephrology,2011)。

由這樣的觀點(diǎn)出發(fā)，可以期待通過使用S1P保護(hù)LSEC來減輕由缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的肝損傷。然而，S1P是構(gòu)成生物膜的鞘脂的代謝產(chǎn)物，大多包含于血小板、內(nèi)皮細(xì)胞，因此存在不能將S1P自身用于以LSEC為靶標(biāo)預(yù)防和/或治療缺血再灌注損傷的問題。

為了解決該問題，嘗試使用作為S1P受體激動(dòng)劑的FTY720(芬戈莫德(Fingolimod)鹽酸鹽：在生物體內(nèi)通過鞘氨醇激酶轉(zhuǎn)換為FTY720磷酸化體)來降低由缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的肝損傷(American Journal of Transplantation,5,pp.40-49,2005)。然而，有該化合物在長(zhǎng)期給藥時(shí)會(huì)作為S1P的拮抗劑起作用的擔(dān)心。另外，該化合物作為整體具有與鞘氨醇類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但是碳鏈中具有亞苯基，因此不是S1P直接的衍生物，也不是用于將S1P自身用于保護(hù)LSEC的化合物。

另外，報(bào)告有透明質(zhì)酸(HA)在血管內(nèi)給藥之后集聚于LSEC(Fraser J et al.Cell Tissue Res.,242,pp.505-510,1985)；還報(bào)告有透明質(zhì)酸受體(HARE/Stabilin-2)在LSEC上特異性地表達(dá)(Bin Zhou et al.J.Biol.Chem.,275,pp.37733-37741,2000)，因此嘗試了通過將S1P搭載于用透明質(zhì)酸覆蓋的脂質(zhì)體而有效地將S1P送達(dá)至LSEC(科學(xué)研究費(fèi)助成事業(yè)，研究課題號(hào):23390319、“使用了S1P·透明質(zhì)酸修飾脂質(zhì)體的對(duì)于難治性肝損傷的新治療藥物的開發(fā)”、大河內(nèi)信弘等、2011～2013年度)。然而，存在如下問題：由于脂質(zhì)體的電荷、分子量的大小等，作為透明質(zhì)酸的配體的功能不充分且不能達(dá)到所希望的DDS效果。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：Caldwell et al.,Hepatology,10,pp.292-299,1989

非專利文獻(xiàn)2：Neal R.Banga et al.,J.Surg.Res.,178,pp.e35-41,2012

非專利文獻(xiàn)3：Cuvillier et al.,Nature,381,pp.800-803,1996

非專利文獻(xiàn)4：Dong-Mei Zheng et al.,Hepatology,44,1278-1287,2006

非專利文獻(xiàn)5：Lee et al.,Nephrology,16,pp.163-173,2011

非專利文獻(xiàn)6：American Journal of Transplantation,5,pp.40-49,2005

非專利文獻(xiàn)7：Fraser J et al.Cell Tissue Res.,242,505-510,1985

非專利文獻(xiàn)8：科學(xué)研究費(fèi)助成事業(yè)、研究課題號(hào):23390319、《S1P·ヒアルロン酸修飾リポソームを用いた難治性肝障害に対する新規(guī)治療薬の開発》(使用了S1P·透明質(zhì)酸修飾脂質(zhì)體的對(duì)于難治性肝損傷的新治療藥物的開發(fā))、大河內(nèi)信弘等、2011～2013年度(2013年外科學(xué)會(huì)：以肝竇內(nèi)皮細(xì)胞為靶標(biāo)的搭載了Sphingosine-1-phosphate的肝再生新型DDS制劑的開發(fā))

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的問題

本發(fā)明目的在于提供能夠通過保護(hù)LSEC來減輕由缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的肝損傷的物質(zhì)。更具體而言，本發(fā)明的課題在于提供通過靜脈內(nèi)給藥等給藥形式效率良好地集聚于LSEC而發(fā)揮抗凋亡作用來保護(hù)LSEC，從而能夠減輕由缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的肝損傷的物質(zhì)。

用于解決問題的方案

本發(fā)明人等為了解決上述問題而進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，被S1P修飾的透明質(zhì)酸極有效率地集聚于LSEC；以及該修飾透明質(zhì)酸對(duì)于由缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的LSEC凋亡的抑制具有高的有效性。還發(fā)現(xiàn)了，例如，通過靜脈內(nèi)給藥等給藥路徑對(duì)包括人的哺乳類動(dòng)物給藥該被S1P修飾的透明質(zhì)酸，能夠有效地預(yù)防和/或治療由缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的肝損傷。本發(fā)明是基于該見解而完成的。

即，通過本發(fā)明，可以提供被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質(zhì)酸。該透明質(zhì)酸是通過使鞘氨醇-1-磷酸與透明質(zhì)酸共價(jià)鍵合而得到的。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，可以提供能夠通過使透明質(zhì)酸與鞘氨醇-1-磷酸縮合而得到的被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質(zhì)酸。該透明質(zhì)酸優(yōu)選通過使透明質(zhì)酸的羧基與鞘氨醇-1-磷酸的氨基酰胺鍵合而得到。

從其他的觀點(diǎn)來看，通過本發(fā)明，可以提供用于預(yù)防和/或治療伴隨著肝缺血再灌注的肝功能衰竭且包含被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質(zhì)酸作為有效成分的藥物；以及用于預(yù)防和/或治療伴隨著肝血流阻斷的肝手術(shù)后的肝功能衰竭且包含被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質(zhì)酸作為有效成分的藥物。作為伴隨著肝血流阻斷的肝手術(shù)，可列舉出例如，肝移植、肝部分切除等。

另外，通過本發(fā)明，可以提供用于預(yù)防和/或治療由肝缺血再灌注產(chǎn)生的缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的肝功能衰竭且包含被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質(zhì)酸作為有效成分的藥物；以及用于抑制由肝缺血再灌注產(chǎn)生的缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡且包含被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質(zhì)酸作為有效成分的藥物。

進(jìn)而，從其他的觀點(diǎn)出發(fā)，通過本發(fā)明，可以提供被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質(zhì)酸在制造上述藥物中的應(yīng)用；伴隨著肝缺血再灌注的肝功能衰竭的預(yù)防和/或治療方法，其包括對(duì)包括人的哺乳類動(dòng)物給藥預(yù)防和/或治療有效量的被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質(zhì)酸的工序；伴隨著肝血流阻斷的肝手術(shù)后的肝功能衰竭的預(yù)防和/或治療方法，其包括對(duì)包括人的哺乳類動(dòng)物給藥預(yù)防和/或治療有效量的被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質(zhì)酸的工序；由肝缺血再灌注產(chǎn)生的缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的肝功能衰竭的預(yù)防和/或治療方法，其包括對(duì)包括人的哺乳類動(dòng)物給藥預(yù)防和/或治療有效量的被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質(zhì)酸的工序；抑制由肝缺血再灌注產(chǎn)生的缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的方法，其包括對(duì)包括人的哺乳類動(dòng)物給藥預(yù)防和/或治療有效量的被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質(zhì)酸的工序。

發(fā)明的效果

由本發(fā)明提供的被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質(zhì)酸極有效地集聚于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞并且能夠抑制由缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。另外，將通過本發(fā)明提供的包含被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質(zhì)酸作為有效成分的藥物對(duì)于由伴隨著肝缺血再灌注的缺氧/復(fù)氧產(chǎn)生的肝功能衰竭的預(yù)防和/或治療具有高的有效性，因此，作為用于預(yù)防和/或治療伴隨著肝血流阻斷的肝手術(shù)后的肝功能衰竭的藥物是極其有用的。

附圖說明

圖1是實(shí)施例的例1中合成的被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質(zhì)酸的NMR圖。

圖2是表示實(shí)施例的例2中的4組實(shí)驗(yàn)步驟的圖。

圖3是表示肝功能(ALT)的測(cè)定結(jié)果的圖。

圖4是表示確認(rèn)了通過蛋白質(zhì)印跡表達(dá)活化型半胱天冬酶(Cleaved caspase)3的結(jié)果的圖。

圖5是表示作為肝臟病理評(píng)價(jià)的HE染色的結(jié)果的圖。

圖6是表示作為肝臟病理評(píng)價(jià)的TUNEL染色的結(jié)果的圖。

圖7是表示用TUNEL染色將顯示出需要的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量化的結(jié)果的圖。

圖8是表示基于電子顯微鏡的肝臟微細(xì)結(jié)構(gòu)的評(píng)價(jià)結(jié)果的圖。

圖9是表示通過蛋白質(zhì)印跡確認(rèn)S1P在肝臟的集聚的結(jié)果的圖。

具體實(shí)施方式

通過本發(fā)明，可以提供被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質(zhì)酸(以下,有時(shí)簡(jiǎn)稱為“HA-S1P”)。HA-S1P可以通過使鞘氨醇-1-磷酸與透明質(zhì)酸共價(jià)鍵合而得到，例如，可以通過使透明質(zhì)酸與鞘氨醇-1-磷酸在縮合劑的存在下縮合而得到。通常情況下，通過縮合使透明質(zhì)酸的羧基與鞘氨醇-1-磷酸的氨基之間生成酰胺鍵即可。當(dāng)然，對(duì)于鞘氨醇-1-磷酸的透明質(zhì)酸的共價(jià)鍵合的方式，并不限定于上述的酰胺鍵，也可以為透明質(zhì)酸的羧基與鞘氨醇-1-磷酸的羥基的酯鍵等。

透明質(zhì)酸是N-乙酰葡糖胺與葡糖醛酸的二糖單元(該單元的分子量大約為400)連接而成的高分子，通常具有5000～8000000左右的分子量。例如，分子量600000的透明質(zhì)酸所包含的二糖單元為約1500個(gè)，分子量8000的透明質(zhì)酸所包含的二糖單元為約20個(gè)。透明質(zhì)酸通常以游離形態(tài)的透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鈉的形式獲得。本說明書中所使用的“透明質(zhì)酸”這樣的術(shù)語包含透明質(zhì)酸鈉。透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鈉可以以食品用、化妝品用的形式提供，也可以以藥物的形式使用。

例如：作為適用于變形性關(guān)節(jié)病的透明質(zhì)酸鈉使用分子量為600000～1200000左右(商品名“ALTS”)、500000～730000左右(商品名“Hyalgan”)的物質(zhì)；在眼科手術(shù)用中使用分子量為600000～1200000左右(商品名“OPEGAN”)、分子量為1900000～3900000左右(商品名“OPEGAN Hi”)、分子量為1900000～3900000左右(商品名“Hyarone”)、1530000～2130000左右(商品名“OPELEAD”)等的物質(zhì)，還通過酶處理提供分子量為10000～100000左右的低分子量的物質(zhì)，進(jìn)而分子量為500～5000左右超低分子量的物質(zhì)等。

對(duì)于作為用于制備本發(fā)明的HA-S1P的原料而使用的透明質(zhì)酸的分子量，沒有特別的限定，除了上述例示的物質(zhì)之外，也可以使用多種分子量的透明質(zhì)酸。例如可以將平均分子量為500000～700000左右的物質(zhì)、通過酶處理使平均分子量為8000左右的透明質(zhì)酸等作為原料來使用。對(duì)于作為用于制備本發(fā)明的被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質(zhì)酸的原料而使用的透明質(zhì)酸的來源，沒有特別的限定，例如可以為來源于雞冠或來源于發(fā)酵等任意來源的物質(zhì)。

對(duì)于本發(fā)明的HA-S1P的制造方法，沒有特別的限定，但例如可以通過使透明質(zhì)酸與鞘氨醇-1-磷酸在縮合劑的存在下縮合來容易地制造。對(duì)于縮合劑的種類，沒有特別的限定，通常能夠使用的縮合劑都可以使用，可以使用例如碳二亞胺系縮合劑、咪唑系縮合劑、三嗪系縮合劑等。作為碳二亞胺系縮合劑，可列舉出例如：N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N,N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)鹽酸鹽等，但特別優(yōu)選使用EDC。作為縮合劑兼羧酸的活化劑，可以使用例如，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)等。

縮合反應(yīng)通常向透明質(zhì)酸(游離形態(tài))添加EDC等縮合劑和NHS等羧酸的活化劑，然后加入鞘氨醇-1-磷酸，在室溫或加溫下使其反應(yīng)幾小時(shí)至幾天左右即可。反應(yīng)可以相對(duì)于透明質(zhì)酸1mg使用鞘氨醇-1-磷酸0.5～2μg左右來進(jìn)行?？s合劑可以相對(duì)于鞘氨醇-1-磷酸使用1～20摩爾當(dāng)量左右，優(yōu)選使用10摩爾當(dāng)量左右。反應(yīng)可以在例如水、甲醇、乙醇、二甲基亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、四氫呋喃(THF)、二氯甲烷等溶劑中或它們的混合溶劑或無溶劑下進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，通?？梢酝ㄟ^透析等方法去除EDC、NHS和未反應(yīng)的鞘氨醇-1-磷酸，由此得到目標(biāo)產(chǎn)物。透明質(zhì)酸鍵合有鞘氨醇-1-磷酸通常可以通過NMR來確認(rèn)。通常，制備1分子透明質(zhì)酸的羧酸的總數(shù)的10～50％左右、優(yōu)選12～40％左右與鞘氨醇-1-磷酸的胺進(jìn)行鍵合而成的修飾體即可。每1分子透明質(zhì)酸鍵合的鞘氨醇-1-磷酸的個(gè)數(shù)可以通過如下計(jì)算來確定：例如利用質(zhì)子NMR由透明質(zhì)酸的N-乙?；?1.8ppm)和鞘氨醇-1-磷酸的脂質(zhì)部分末端甲基和亞甲基(0.9ppm和1.1ppm)取得積分值來計(jì)算。

由本發(fā)明提供的HA-S1P有效地集聚于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞并且能夠抑制由缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，因此，包含HA-S1P作為有效成分的藥物作為用于預(yù)防和/或治療由伴隨著肝缺血再灌注的肝功能衰竭的藥物是有用的。對(duì)于產(chǎn)生肝缺血再灌注的處置、治療的種類沒有特別的限定，可列舉出例如，以伴隨著肝血流阻斷的肝手術(shù)等為代表的處置。作為這樣的肝手術(shù)，可列舉出例如肝移植、肝部分切除等，但并不限定于此，對(duì)于暫時(shí)將通向肝臟的血管夾住而阻斷血流、經(jīng)過幾分鐘至15分鐘左右解除夾具再流通血流這樣的手術(shù)，均可以作為本發(fā)明藥物的適用對(duì)象。不會(huì)拘泥于任何理論，在由肝缺血再灌注產(chǎn)生的缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的肝功能衰竭中，產(chǎn)生了由缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，但本發(fā)明的藥物具有抑制該凋亡的作用。

本發(fā)明的藥物通常通過靜脈內(nèi)給藥、腹腔內(nèi)給藥等非經(jīng)口給藥對(duì)包括人的哺乳類動(dòng)物進(jìn)行給藥。進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥的情況下，可以采用靜脈內(nèi)注射、點(diǎn)滴等通常的方法?；蛘撸部梢栽谑中g(shù)中由門靜脈向血管內(nèi)給藥本發(fā)明的藥物。使用低分子量的透明質(zhì)酸的情況下，有時(shí)也通過經(jīng)口給藥利用液劑、膠囊劑等進(jìn)行給藥。理想的是，給藥在血流阻斷的幾分鐘前至1小時(shí)前左右之間、例如在10分鐘前至30分鐘前左右的時(shí)期進(jìn)行，但只要在血流阻斷之前則沒有特別的限定。進(jìn)行肝移植的情況下，在由供體摘除肝臟的一部分時(shí)，可以預(yù)先給藥本發(fā)明的藥物以使本發(fā)明的藥物在肝臟內(nèi)殘留有充分量，對(duì)于接受移植的患者也可以在剛要進(jìn)行移植之前給藥本發(fā)明的藥物，但這樣的給藥方法可以適宜選擇，并不限定于特定的方式。

本發(fā)明的藥物通常以水溶液的形態(tài)、冷凍干燥品的形態(tài)作為注射劑或點(diǎn)滴劑來提供，但在制劑的制備時(shí)，也可以使用注射劑、點(diǎn)滴劑的制造中通常使用的制劑用添加物。例如，為水溶液的情況下，可以使用pH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定化劑或緩沖劑等；為冷凍干燥制劑的情況下，除了這些之外也可以使用助溶劑等；但并不限定于這些特定的制劑用添加物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)目的選擇適宜的制劑用添加物。

實(shí)施例

以下，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)地進(jìn)行說明，但本發(fā)明的范圍并不限定于以下的實(shí)施例。

例1:HA-S1P的合成

在5ml透明質(zhì)酸(2mg/ml，分子量600000的物質(zhì)或分子量8000的物質(zhì))中加入EDC(100mg/ml)95.85μl、NHS(100mg/ml)57.535μl并充分混合。向其中加入S1P(25mg/ml)67.378μl在55℃下進(jìn)行攪拌使之反應(yīng)24小時(shí)。進(jìn)行透析操作來進(jìn)行EDC、NHS和未鍵合的S1P的去除。S1P的導(dǎo)入通過測(cè)定NMR而存在1.15ppm附近的峰來確認(rèn)(圖1)。與該透明質(zhì)酸的羧酸進(jìn)行鍵合的S1P的量為13.5～40％。

例2

(1)方法

動(dòng)物

200～250g的雄性Sprague-Dawley(以下SD)大鼠通過CLEA Japan,Inc.(日本東京)獲得。對(duì)于4組SD大鼠進(jìn)行了研究。

針對(duì)如下組進(jìn)行研究：作為S1P的溶劑的甲醇給藥組(給藥內(nèi)容為甲醇50μl+3％BSA150μl、總計(jì)200μl)、HA給藥組(給藥內(nèi)容是使8kDa的HA以0.32564g/l溶解于甲醇:超純水＝1:3，總計(jì)200μl)、S1P給藥組(給藥內(nèi)容以S1P給藥量計(jì)，100μg/kg、S1P50μl+3％BSA150μl、總計(jì)200μl)、HA-S1P給藥組(給藥內(nèi)容以S1P給藥量計(jì)為100μg/kg、北大制作的HA-S1P制劑以0.358g/l溶解于甲醇:超純水＝1:3，總計(jì)200μl)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中使用的全部的步驟根據(jù)筑波大學(xué)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的對(duì)策和用途的指南中所述的基準(zhǔn)。

肝缺血模型

對(duì)大鼠尾靜脈注射各藥劑。注射10分鐘之后，使用微型夾具使肝動(dòng)脈、門靜脈、膽管一起阻塞20分鐘。在20分鐘的全肝缺血之后，解除阻塞。在進(jìn)行再灌注120分鐘之后，為了進(jìn)行病理檢查，自各組10～15只大鼠去除肝組織。另外，在要進(jìn)行藥劑注射之前和再灌注的30、60、120分鐘后采集血液。

組織的調(diào)節(jié)

將肝組織在10％緩沖福爾馬林中固定，接著埋入于石蠟中，使用蘇木精和曙紅進(jìn)行染色。對(duì)各組的組織切片進(jìn)行評(píng)價(jià)。在同一視野中包含門靜脈、中心靜脈的中倍率視場(chǎng)(x200)中，觀察竇結(jié)構(gòu)。

免疫組織化學(xué)研究

使用Promega Corporation的DeadEnd(注冊(cè)商標(biāo))Colorimetric TUNEL System(G7360)，免疫組織化學(xué)地檢測(cè)出凋亡陽性細(xì)胞。對(duì)各組的組織切片進(jìn)行評(píng)價(jià)。以隨機(jī)選擇的門靜脈為中心的10強(qiáng)倍率視場(chǎng)(x400)中，對(duì)TUNEL陽性細(xì)胞和肝細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。將其以TUNLE陽性細(xì)胞數(shù)/肝細(xì)胞總數(shù)的比表示，對(duì)于每組進(jìn)行比較。

蛋白提取和蛋白質(zhì)印跡分析

肝組織在-80℃下保存，在150mmol/L的NaCl和50mM的TrisCl、1％NP-40、蛋白分解酶抑制劑中進(jìn)行均化處理。將樣品進(jìn)行離心，采集上清液用于分析。樣品使用12％十二烷基硫酸鹽和聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳使之分離，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(Millipore、Bedford、MA、USA)。作為第一抗體使用抗活化型半胱天冬酶(cleaved caspase)3抗體(9661)和HO-1抗體(5141)(Cell Signaling Technology、Beverly、MA、USA)。作為第二抗體使用抗兔子IgG HRP linked(7074)(Cell Signaling Technology、Beverly、MA、USA)。

生物化學(xué)分析

為了評(píng)價(jià)肝實(shí)質(zhì)損傷，使用自動(dòng)分析儀(FujiPhotoFilmCo.Ltd.7000V、Fuji Film、東京、日本)測(cè)定血清ALT值。

電子顯微鏡

使用電子顯微鏡對(duì)缺血再灌注后的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。再灌注120分鐘后迅速地摘除肝臟。將自肝左葉摘除的樣品切除1mm³并保存于2.5％戊二醛中。后固定中使用了1％四氧化鋨。之后，濃度梯度地通過乙醇脫水并進(jìn)行Epon包埋。超薄切片使用Ultracut S microtome(Leica Aktiengesellschaft、Vienna、Austria)、用銅載網(wǎng)(copper grid)制成。為了強(qiáng)調(diào)對(duì)比度，切片用乙酸鈾酰鹽進(jìn)行調(diào)節(jié)并通過檸檬酸鹽。標(biāo)本使用日立H-7000透射型電子顯微鏡(日立、東京、日本)進(jìn)行觀察。

統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析使用Kruskal Wallis H-test、post hoc test與Mann-Whitney U test with Bonferroni correction。作為統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義，接受p＜0.05。

(2)實(shí)驗(yàn)體系

使用200～250g的SD大鼠制成4個(gè)實(shí)驗(yàn)組(A)～(D)。(A)作為S1P溶劑的甲醇單獨(dú)的溶劑對(duì)照組(甲醇50μl+3％BSA150μl，計(jì)200μl)；(B)透明質(zhì)酸單獨(dú)的HA組(以8000kDa的透明質(zhì)酸成為0.32564g/L的方式溶解于甲醇:超純水＝1:3而成的物質(zhì)，計(jì)200μl)；(C)S1P單獨(dú)的S1P組(作為S1P給藥量為100μg/kg、溶解于甲醇的S1P50μl+3％BSA 150μl，計(jì)200μl)；(D)HA-S1P組(作為S1P給藥量100μg/kg、以HA-S1P成為0.358g/L的方式溶解于甲醇:超純水＝1:3，計(jì)200μl)。使用戊巴比妥和異氟烷對(duì)大鼠進(jìn)行全身麻醉，采血后通過尾靜脈給藥各種藥劑。將大鼠進(jìn)行剖腹，給藥藥劑10分鐘之后使用微型夾具實(shí)施20分鐘的全肝缺血。20分鐘后去除夾具進(jìn)行再灌注，自再灌注起30、60和120分鐘后實(shí)施采血。120分鐘之后，處死大鼠，采集肝組織(左葉)。將實(shí)驗(yàn)步驟示于圖2。

(3)肝功能(ALT)的測(cè)定

血清ALT在再灌注30分鐘之后，與溶劑對(duì)照·S1P組相比較，HA-S1P組為顯著低的值。再灌注60分鐘后，與溶劑對(duì)照·HA·S1P組相比較，HA-S1P組為顯著低的值。再灌注120分鐘后，與HA組相比較，HA-S1P組為顯著低的值。將結(jié)果示于圖3。

(3)利用蛋白質(zhì)印跡的凋亡和肝保護(hù)作用的確認(rèn)

通過文獻(xiàn)記載的方法(Tamura et al.,J Surg Res,178,pp.443-451,2012)利用蛋白質(zhì)印跡確認(rèn)凋亡相關(guān)蛋白即活化型半胱天冬酶(cleaved caspase)3的表達(dá)，結(jié)果，只有HA-S1P組被抑制。由此可知，HA-S1P給藥組顯著地抑制了凋亡。另外，具有肝保護(hù)作用的HO-1的表達(dá)僅在HA-S1P組增加。將結(jié)果示于圖4。

(4)肝臟病理評(píng)價(jià)

HE染色中，HA-S1P中保護(hù)了竇結(jié)構(gòu)，與此相對(duì)，其他的組中，確認(rèn)到了竇的窄小化、蜿蜒曲折(圖5)。TUNEL染色中，HA-S1P組中近乎沒有確認(rèn)到陽性細(xì)胞，其他的組中，以容易受到缺血再灌注損傷的門靜脈附近的Zone1為中心，確認(rèn)到了陽性細(xì)胞(圖6)。另外，TUNEL染色的各樣品中，以Zone1為中心，用400倍視野以每10視野以TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/總肝細(xì)胞數(shù)的形式進(jìn)行計(jì)數(shù)、定量化時(shí)，HA-S1P組中成為TUNEL陽性細(xì)胞率顯著低的結(jié)果(圖7)。

(5)利用電子顯微鏡進(jìn)行肝臟微細(xì)結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)

電子顯微鏡圖像中，HA-S1P組中保存了LSEC的內(nèi)襯結(jié)構(gòu)；與此相對(duì)，其他的組中，確認(rèn)到了LSEC受到損傷而在竇內(nèi)剝離的圖像(圖8)。

例3：利用蛋白質(zhì)印跡的S1P在肝臟集聚的確認(rèn)

用下述的方法，通過蛋白質(zhì)印跡確認(rèn)到肝組織內(nèi)的S1P的表達(dá)。

對(duì)于-80℃下保存的大鼠的肝組織使用各種試劑(150mmol/L NaCl,50mM Tris-Cl,1％NP-40,蛋白分解酶抑制劑)制作的緩沖液進(jìn)行均質(zhì)化處理。為了進(jìn)行分析，將樣品進(jìn)行離心而采集上清液。采集的樣品使用10％SDS-PAGE凝膠進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(Millipore,Bedford,MA)。作為第一抗體使用Anti-S1P antibody(ab140592)(1:1000,rabbit polyclonal,Abcam,Cambridge,UK)。作為第二抗體，使用Anti-rabbit IgG,HRP-linked antibody(#7074S)(1:1000,Cell Signalling Technology,Beverley,MA,USA)。

將結(jié)果示于圖9。相比于S1P單獨(dú)，HA-S1P的樣品中，S1P的表達(dá)增加。由此可知，HA-S1P相比于S1P單獨(dú)，對(duì)肝臟特異地集聚。