是SOD模擬物的金屬絡(luò)合物作為食品試劑和作為化妝品的應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及模擬酶超氧化物歧化酶(SOD)的金屬絡(luò)合物作為食品試劑的應(yīng)用以及它們作為化妝品的應(yīng)用，所述金屬絡(luò)合物記述在專利ES2355784中，并且由大環(huán)聚氮雜環(huán)吡啶烷化合物獲得。技術(shù)狀況抗氧化劑在皮膚保護(hù)和修復(fù)機(jī)制中起重要作用。它們可以作為食品或作為食品補(bǔ)充物消費(fèi)，或可以作為局部制劑涂覆在皮膚上。酶超氧化物歧化酶(SOD)屬于最重要的一組天然抗氧化物質(zhì)?，F(xiàn)有技術(shù)反映SOD在機(jī)體中行使重要功能，諸如，例如，針對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激進(jìn)行保護(hù)和針對(duì)炎性或變性過程進(jìn)行保護(hù)。由SOD酶催化的超氧化物自由基(O2-)成為氧和過氧化氫(H2O2)的歧化反應(yīng)使得該酶在對(duì)暴露于氧的大部分細(xì)胞的抗氧化防御中是非常重要的。因此，SOD保護(hù)細(xì)胞免于O2-自由基的有害反應(yīng)。當(dāng)SOD活性失效時(shí)，氧化應(yīng)激增加，導(dǎo)致人體發(fā)展多種病癥或疾病，諸如，例如，炎性過程、致癌過程或變性過程。盡管還沒有詳細(xì)知曉這些物質(zhì)的潛在作用機(jī)制，但是，存在充分的關(guān)于抗氧化劑的分布、活性和調(diào)控的研究，以使得從營養(yǎng)的觀點(diǎn)研發(fā)作用策略和涉及新抗氧化制劑的化妝品。這些新的項(xiàng)目包括減少由UV光誘發(fā)的癌癥危險(xiǎn)，由光作用引起的衰老，預(yù)防和治療引起皮膚脫皮的疾病以及維持良好的健康和改善衰老作用。一些植物天然產(chǎn)生SOD，諸如花椰菜、小麥和大麥，但是，當(dāng)人體消化SOD時(shí)，SOD被胃酸和腸道酶快速破壞，因此，其幾乎不能到達(dá)血流中。此外，人體在大約10歲的年齡具有SOD產(chǎn)生的最大峰。通過消費(fèi)適量的適當(dāng)前體分子的補(bǔ)充物，可能升高血液SOD水平。還已知，小麥新芽是這些前體的豐富來源。然而，仍然存在相同的消化過程導(dǎo)致的SOD破壞的問題。因此，合成模擬SOD酶的化合物對(duì)于補(bǔ)償內(nèi)源性SOD活性的可能的缺乏或不存在是必要的，并且因此不僅能夠治療具有缺少或缺乏該酶活性的常見病因的多種病理或疾病，而且能夠利用它們作為食品或化妝品試劑的能力。理想地，合成的模擬化合物必須具有低毒性，并且還能夠以最低的可能的化合物濃度進(jìn)行歧化反應(yīng)。使用較低濃度或劑量的SOD模擬物將減少治療成本以及與副作用和免疫原性的發(fā)展相關(guān)的危險(xiǎn)。已知在美容產(chǎn)品中使用SOD以減少皮膚中自由基的傷害，例如，減少由于放療引起的纖維化。主要的專利ES2355784已經(jīng)提到與該作用相關(guān)的文獻(xiàn)目錄。最近也與美容效果相關(guān)的研究是CampanaF.,ZervoudisS.等,2004.Topicalsuperoxidedismutasereducespost-irradiationbreastcancerfibrosis(局部超氧化物歧化酶減輕輻射后乳腺癌纖維化).JCellMolMed.Jan-Mar；8(1):109-16?？赡芙忉孲OD作為能夠逆轉(zhuǎn)纖維化的試劑的作用的機(jī)制是肌成纖維細(xì)胞向成纖維細(xì)胞的可能的回復(fù)。用作化妝品的SOD模擬物的實(shí)例是lipocromano-6(EP2113242)或?qū)＠暾?qǐng)US20130287696中所述的那種，專利申請(qǐng)US20130287696公開了通過使用有效量的聚乙二醇化的SOD模擬物，任選地與第二保存添加劑組合，防止食物變質(zhì)和氧化的方法。該專利的SOD模擬物的具體實(shí)例顯示如下：還已知，口服服用SOD，以去除皺紋或重建組織，但是，沒有證據(jù)表明這些口服產(chǎn)品被機(jī)體吸收。在現(xiàn)有技術(shù)中沒有找到具體公開主要專利ES2355784中開發(fā)的金屬絡(luò)合物的文獻(xiàn)。因此，它們作為化妝品或作為食品試劑的應(yīng)用都沒有被公開。主要專利中所述的金屬絡(luò)合物具有低毒性、低IC50值，并且不引起免疫原性的發(fā)展。這些金屬絡(luò)合物的低IC50值具有重要的含義，原因在于該值越低，引起需要的模仿效應(yīng)所需要的化合物的量越低。因此，使用較低量的絡(luò)合物實(shí)現(xiàn)歧化反應(yīng)將極大地減少副作用。此外，由于它們?cè)谘獫{中的穩(wěn)定性，前述金屬絡(luò)合物具有長(zhǎng)半衰期，并且它們?cè)谑┯煤蟛槐憩F(xiàn)出組織分布的問題。發(fā)明描述本發(fā)明涉及模擬SOD的金屬絡(luò)合物，作為化妝品或食品試劑的應(yīng)用，所述金屬絡(luò)合物由具有連接到分子中心結(jié)構(gòu)上的雜環(huán)喹啉的中間大環(huán)聚氮雜環(huán)吡啶烷化合物獲得。術(shù)語“食品試劑”在本文件中涉及下述備選物中的任一種：食品添加劑、功能食品、膳食補(bǔ)充物或功能飲料。在本文件中，金屬絡(luò)合物涉及式1的中間化合物與至少一個(gè)金屬離子(優(yōu)選Cu(II)、Fe(II)或Mn(II))的任何分子連接，并且最優(yōu)選地，其中所述金屬離子是Mn(II)。在本發(fā)明中，SOD模擬絡(luò)合物涉及能夠模仿、補(bǔ)充并最終改善內(nèi)源性SOD酶的活性和/或功能的金屬絡(luò)合物，其作為化妝品、個(gè)人衛(wèi)生用品或食品試劑。ES2355784中所述的金屬絡(luò)合物可以包括在制劑中用于食品或化妝品應(yīng)用，并且按照現(xiàn)有技術(shù)中的已知技術(shù)以多種方式施用，諸如皮內(nèi)注射或通過膠囊、糖衣丸或片劑口服。作為用于化妝品的制劑或個(gè)人衛(wèi)生用品，它們可以形成除臭劑、止汗劑、頭發(fā)和皮膚護(hù)理產(chǎn)品的一部分，并且可以是，例如，保濕劑、清潔產(chǎn)品或二者的組合。用于化妝品的制劑或個(gè)人衛(wèi)生產(chǎn)品還可以以粉劑或固體條的形式，或其他固體形式，諸如，例如，乳劑、奶液、洗液、乳液、糊劑、液體、凝膠、氣霧劑、固體形式、膠狀物、油膏、面膜、分散液、混懸液、香波、泡沫劑、噴霧劑或無水液體。類似地，用于化妝品應(yīng)用的固體形式可以在存在需要的賦形劑的條件下制備，所述賦形劑選自包括但不限于下述的組：甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、硅膠、滑石、硬脂酸鎂、氧化鈦、染料和抗氧化劑。因此，本發(fā)明更具體地涉及具有至少一個(gè)金屬離子的式1的模擬超氧化物歧化酶的金屬絡(luò)合物作為化妝品或食品試劑的應(yīng)用。所述金屬離子優(yōu)選選自Cu(II)、Fe(II)和Mn(II)，并且更優(yōu)選是Mn(II)。本發(fā)明還涉及具有至少一個(gè)金屬離子的式1的模擬SOD的金屬絡(luò)合物用于制備食品試劑的應(yīng)用(所述食品試劑可以是食品添加劑、功能食品、膳食補(bǔ)充劑或功能飲料)，或用于制備個(gè)人衛(wèi)生產(chǎn)品或化妝品制劑的應(yīng)用。所述金屬離子優(yōu)選選自Cu(II)、Fe(II)和Mn(II)，并且更優(yōu)選是Mn(II)。另外，本發(fā)明還涉及包含至少一種上文定義的具有至少一種金屬離子的式1的模擬SOD的金屬絡(luò)合物的化妝品制劑或個(gè)人衛(wèi)生產(chǎn)品。該化妝品制劑或個(gè)人衛(wèi)生產(chǎn)品可以配制成乳劑、糊劑、奶液、凝膠、洗液、油膏、混懸液、分散液、粉劑、香波、泡沫劑、噴霧劑或固體條。此外，本發(fā)明涉及包含至少上文定義的具有至少一種金屬離子的式1的模擬SOD的金屬絡(luò)合物的食品添加劑、膳食補(bǔ)充物、功能食品或功能飲料。由于它們具有降低的毒性和低IC50值，本發(fā)明的金屬絡(luò)合物克服了現(xiàn)有技術(shù)中列出的問題。本發(fā)明的金屬絡(luò)合物的低IC50具有重要的含義，原因在于，該值越低，引起需要的模仿效應(yīng)所需要的絡(luò)合物的量越小。因此，使用較少量的絡(luò)合物實(shí)現(xiàn)歧化反應(yīng)極大地減少了副作用。另外，本發(fā)明的金屬絡(luò)合物具有高穩(wěn)定性(如主要專利ES2355784中所示的)和半衰期，避免了施用后在組織中的分布問題以及免疫原性的發(fā)展。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及模擬化合物的應(yīng)用，其中結(jié)合在式1的化合物上的金屬離子選自Cu(II)、Fe(II)和Mn(II)。附圖描述圖1:將8期青鳉魚(Medaka)胚胎與氧化劑H2O2和化合物Pytren-4Q+Mn溫育72小時(shí)后獲得的結(jié)果的圖示，詳見實(shí)施例。圖2:將8期青鳉魚(Medaka)胚胎與氧化劑H2O2和化合物Pytren-4Q+Mn溫育14天后獲得的結(jié)果的圖示，如實(shí)施例所述。實(shí)施例1.材料和方法1.1青鳉魚胚胎將個(gè)體成體(品種Cab,CarolinaBiologicalSupply,(NorthCarolina))放在具有連續(xù)的水流的27℃的水箱中，并且有14小時(shí)光和10小時(shí)黑暗的光周期。每天用鹵蟲無節(jié)幼體(Artemianauplii)喂魚兩次，鹵蟲無節(jié)幼體每天從商購的囊孢孵化，并且每天用干食物喂一次。每天收集受精卵，保存在Yamamoto溶液(0.13MNaCl,2.7mMKCl,1.8mMCaCl2和0.24mMNaHCO3,pH7.3)(YamamotoT.,Medaka(killifish):Biologyandstrains.1975,Tokyo:KeigakuPub.Co)中，并且在培養(yǎng)箱中在26℃保持。按照Iwamatsu的描述(IwamatsuT.,StagesofnormaldevelopmentinthemedakaOryziaslatipes.MechDev.2004,Vol.121,第605-618頁)確定胚胎階段。1.2使用青鳉魚胚胎進(jìn)行存活分析將8期青鳉魚胚胎(早期桑葚胚階段，Iwamatsu,2004)分成2個(gè)60個(gè)胚胎的組和一個(gè)30個(gè)胚胎的組。將一個(gè)60個(gè)胚胎的組用以250μM的濃度溶解在Yamamoto溶液中的Pytren-4Q+Mn處理4天。將另一個(gè)60個(gè)胚胎的組在Yamamoto溶液中溫育4天。該組用作陰性對(duì)照。將30個(gè)胚胎的組，即，陽性對(duì)照組，用濃度為100μM的維生素C(抗氧化性化合物)的Yamamoto溶液處理4天。溫育4天后，將胚胎用Yamamoto溶液清洗。將60個(gè)胚胎的組逐一分成兩個(gè)30個(gè)胚胎的組。將所有組的胚胎單獨(dú)放置在96孔板的孔中，每個(gè)孔包含200μl含有不同濃度的H2O2的Yamamoto溶液，濃度取決于觀察死亡率的溫育時(shí)間的延長(zhǎng)。當(dāng)在放置到H2O2Yamamoto溶液中后72小時(shí)觀察死亡率時(shí)，所用的H2O2濃度為22.5mM。將每個(gè)60個(gè)胚胎的原始組的三十個(gè)胚胎和用維生素C處理的組的30個(gè)胚胎用濃度為22.5mM的H2O2Yamamoto溶液處理。當(dāng)在放置到H2O2Yamamoto溶液中后14天觀察死亡率時(shí)，所用的H2O2濃度為7.5mM。將每個(gè)60個(gè)胚胎的原始組的三十個(gè)胚胎用濃度為7.5mM的H2O2Yamamoto溶液處理。該實(shí)驗(yàn)在72小時(shí)的檢測(cè)中共重復(fù)6次，在14天的檢測(cè)中共重復(fù)3次。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析為了評(píng)估存活差異，在比較這3個(gè)檢測(cè)組時(shí)，使用單向方差分析統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)(ANOVA)確定是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。然后，使用Tukey′spost-hoc檢驗(yàn)確定這3個(gè)組中哪一組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。當(dāng)比較2個(gè)檢測(cè)組時(shí)，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)斯氏(Student’s)t檢驗(yàn)。在所有情形中，將顯著性水平設(shè)為p<0.05。所有這些分析使用GraphPadPrism5.0a程序進(jìn)行。2.結(jié)果使用對(duì)胚胎無毒的250μM濃度的化合物Pytren-4Q+Mn進(jìn)行檢測(cè)，并且在兩個(gè)不同的測(cè)定中測(cè)量它們的抗氧化能力。第一個(gè)檢測(cè)測(cè)量在用22.5μMH2O2溫育72小時(shí)后的死亡率(顯示在圖1中)。第二個(gè)檢測(cè)測(cè)量在用22.5μMH2O2溫育14天后的死亡率(顯示在圖2中)。兩個(gè)檢測(cè)表明響應(yīng)由H2O2引起的氧化應(yīng)激的死亡率的顯著下降。在72小時(shí)進(jìn)行的檢測(cè)表明Pytren-4Q+Mn和維生素C二者都降低死亡率，在對(duì)照中為48.44±4.40％，在用Pytren-4Q+Mn處理的胚胎中為24.96±7.11％，并且在用維生素C處理的胚胎中為25.99±5.25％(表1)。因此，本發(fā)明的化合物Pytren-4Q+Mn在所檢測(cè)的濃度發(fā)揮與維生素C相似的抗氧化活性。表1.在溫育72小時(shí)的本發(fā)明的實(shí)施例檢測(cè)中獲得的數(shù)據(jù)。72小時(shí)對(duì)照Pytren-4Q+Mn維生素C重復(fù)162.55040.63重復(fù)256.2543.7543.75重復(fù)35012.915.63重復(fù)443.7515.6314.3重復(fù)546.918.7520.8重復(fù)631.258.720.8平均值48.4424.9625.99標(biāo)準(zhǔn)偏差10.7817.4112.87標(biāo)準(zhǔn)誤差4.407.115.25在14天進(jìn)行的檢測(cè)表明Pytren-4Q+Mn降低死亡率，在對(duì)照中為51.27±3.12％，在用Pytren-4Q+Mn處理的胚胎中為41.47±1.52％(表2)。主要的差異歸因于這樣的事實(shí)：在14天的檢測(cè)盡管更久，但是其更靈敏，原因在于可以在以后檢測(cè)到小的致死性作用。表2.在溫育14天的本發(fā)明的實(shí)施例檢測(cè)中獲得的數(shù)據(jù)。14天對(duì)照Pytren-4Q+Mn重復(fù)146.939.3重復(fù)257.340.7重復(fù)349.644.4平均值51.2741.47標(biāo)準(zhǔn)偏差5.402.64標(biāo)準(zhǔn)誤差3.121.52獲得的數(shù)據(jù)表明化合物Pytren-4Q+Mn在250μM的濃度具有與100μM的維生素C相似的抗氧化特性。當(dāng)前第1頁1 2 3