本發(fā)明涉及一種光學(xué)活性的β-羥基酯類化合物的制備方法及其中間體。
背景技術(shù)：
4-乙酰氧基氮雜環(huán)丁酮(簡稱4AA)，是一種重要的醫(yī)藥精細(xì)化學(xué)品，主要用于合成各類培南類的抗生素，如亞胺培南。比阿培南、羅美培南和法拉培南等。這些藥物用途廣泛，對革蘭氏陰性菌和陽性菌、需氧菌、厭氧菌等均具有廣譜強效抗菌作用，因而受到人們極大重視。目前，在4-AA的合成工藝中，以外消旋的2-苯甲酰胺甲基-3-羰基丁酸甲酯(4-AA-1)為原料的合成路線相對較為優(yōu)越，其合成路線通常為：
目前已有的報道中方法中，由化合物4-AA-2在進行氨基保護基的脫除時，羧酸甲酯中的甲基也同時脫除，得到化合物4-AA-3，其在進行環(huán)化反應(yīng)制備化合物4-AA-5時，仍然需要將羧酸進行酯化生成化合物4-AA-4，然后再環(huán)化反應(yīng)；這導(dǎo)致了制備方法中步驟增多，操作復(fù)雜，成本增加，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有的以外消旋的2-苯甲酰胺甲基-3-羰基丁酸甲酯為原料制備4-乙酰氧基氮雜環(huán)丁酮的方法中，在進行氨基保護基的脫除時，羧酸甲酯中的甲基也同時脫除，使得制備方法中步驟增多，操作復(fù)雜，成本增加，不利于工業(yè)化生產(chǎn)等的缺陷，而提供了一種光學(xué)活性的β-羥基酯類化合物的制備方法及其中間體。本發(fā)明的制備方法通過對底物結(jié)構(gòu)的選擇，配合上特定的水解酶，在進行氨基保護基的脫除時，羧酸甲酯中的甲基不受任何影響，可以直接進行后續(xù)的環(huán)化反應(yīng)，步驟短，操作簡單，成本低，更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明提供了一種光學(xué)活性的β-羥基酯類化合物(2S,3R)-2-胺甲基-3-氨基丁酸甲酯(5-1)的制備方法，其包含下列步驟：水中，在青霉素?；傅淖饔孟?，將(2S,3R)-2-(2-苯乙酰胺甲基)-3-羥基丁酸甲酯(4-1)進行水解反應(yīng)，即可；
本發(fā)明中，化合物(5-1)的制備方法較佳地包括下列步驟：水中，在pH值為8.0-9.5的條件下，在青霉素?；傅淖饔孟?，將化合物(4-1)進行所述的水解反應(yīng)，制得化合物(5-1)；更佳地包括下列步驟：在pH值為8.0-9.5的條件下，將化合物(4-1)和水的混合液，與青霉素?；富旌?，進行所述的水解反應(yīng)，制得化合物(5-1)。其中，所述的青霉素?；篙^佳地為青霉素G?；?。所述的青霉素G酰化酶較佳地為固定化青霉素G?；?。所述的固定化青霉素G?；缚蔀楸绢I(lǐng)域常規(guī)的用于生產(chǎn)6-APA的固定化青霉素G?；福缯憬橈L(fēng)海德爾有限公司生產(chǎn)的用于生產(chǎn)6-APA的固定化青霉素G?；?，或者湖南福來格生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的用于生產(chǎn)6-APA的固定化青霉素G?；?。所述的水的用量可不作具體限定，只要不 影響反應(yīng)的進行，即可。所述的青霉素?；傅挠昧靠蔀楸绢I(lǐng)域常規(guī)的用量，較佳地，所述的青霉素酰化酶與化合物(4-1)的質(zhì)量比為1:25-1:60，更佳地為1:30-1:50(例如1:40)。所述的水解反應(yīng)的溫度可為本領(lǐng)域此類反應(yīng)常規(guī)的溫度，較佳地為20℃-50℃，更佳地為30℃-45℃，最佳地為40℃。所述水解反應(yīng)的進程可按照本領(lǐng)域常規(guī)的檢測方法進行監(jiān)測(例如TLC、GC、HPLC等)，一般以化合物(4-1)消失時作為反應(yīng)的終點。所述的水解反應(yīng)的時間可為本領(lǐng)域此類反應(yīng)常規(guī)的時間，較佳地為6小時-24小時，更佳地為8-12小時，最佳地為10小時。
化合物(5-1)的制備方法中，較佳地以堿性物質(zhì)控制反應(yīng)體系的pH值在8.0-9.5之間。所述的堿性物質(zhì)可為本領(lǐng)域常規(guī)的用于調(diào)節(jié)pH的堿性物質(zhì)，只要不影響反應(yīng)進行，即可，較佳地為磷酸氫二鉀水溶液。所述的磷酸氫二鉀水溶液的摩爾濃度和用量可不作具體限定，只要能夠控制反應(yīng)體系的pH值在8.0-9.5之間即可。所述的磷酸氫二鉀水溶液的摩爾濃度較佳地為0.05mol/L-0.2mol/L(例如0.1mol/L)。所述的水解反應(yīng)在進行過程中，較佳地，對反應(yīng)體系中的pH值進行監(jiān)測，若反應(yīng)體系的pH值低于8.0，可用氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值至8.0-9.5之間。所述的氨水的濃度和用量可不作具體限定，只要能夠調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值至8.0-9.5之間即可。
所述的水解反應(yīng)結(jié)束后，較佳地還可進一步包含后處理的操作。所述的后處理的方法和條件可為本領(lǐng)域有機合成后處理常規(guī)的方法和條件，本發(fā)明中，所述的后處理較佳地包括下列步驟：將水解反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液，進行固液分離(例如過濾)，除去濾液中的水(例如減壓蒸餾)，得到的殘留物與乙醇混合，攪拌，再次進行固液分離(例如過濾)，除去濾液中的乙醇(例如減壓蒸餾)，即得目標(biāo)化合物。其中，所述的乙醇的用量可不作具體限定，較佳地，其與化合物(4-1)的體積質(zhì)量比為8mL/g-15mL/g(例如10mL/g)。
所述的(2S,3R)-2-胺甲基-3-氨基丁酸甲酯(5-1)的制備方法，較佳地還可進一步包含下列步驟：水中，在氫供體和輔酶因子存在的條件下，在羰基還原酶的作用下，將3-氧代-2-(2-苯乙酰胺甲基)丁酸甲酯(2-2)進行催化還 原反應(yīng)，制得所述的(2S,3R)-2-(2-苯乙酰胺甲基)-3-羥基丁酸甲酯(4-1)；
本發(fā)明中，化合物(4-1)的制備方法較佳地包括下列步驟：在水中，pH值為6.0-9.0的條件下，在氫供體和輔酶因子存在的條件下，在羰基還原酶的作用下，將3-氧代-2-(2-苯乙酰胺甲基)丁酸甲酯(2-2)進行所述的催化還原反應(yīng)。其中，所述的還原反應(yīng)的pH值較佳地為7.0-8.5，更佳地為8.0。
化合物(4-1)的制備方法中，所述的羰基還原酶較佳地為克菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)來源的羰基還原酶的突變體。所述的克菲爾乳桿菌來源的羰基還原酶的突變體的氨基酸序列較佳地如申請公布號為CN101883846A的中國專利申請中序列表SEQ NO ID：6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或62所示；更佳地如申請公布號為CN101883846A的中國專利申請中序列表SEQ NO ID：6、8、10、12、14、24、60或62所示，最佳地如申請公布號為CN101883846A的中國專利申請中序列表SEQ NO ID：10所示。所述的羰基還原酶較佳地存在于重組表達該羰基還原酶的基因工程大腸桿菌誘導(dǎo)表達后的菌體細(xì)胞破碎液(簡稱酶液)中，即所述的羰基還原酶較佳地以重組表達該羰基還原酶的基因工程大腸桿菌誘導(dǎo)表達后的菌體細(xì)胞破碎液的形式使用。所述的重組表達該羰基還原酶的基因工程大腸桿菌誘導(dǎo)表達菌體細(xì)胞破碎液的制備方法可為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，較佳地包括下列步驟：將所述的重組表達該羰基還原酶的基因工程大腸桿菌誘導(dǎo)表達后的發(fā)酵液，進行離心得到菌體后與水混合，采用超聲波進行細(xì)胞破碎，即可。其中，所述的菌體細(xì)胞破碎液的制備方法中，所述的菌體與水的用量關(guān)系可不作具體限定，較佳地，所述水與菌體的體積質(zhì)量比為1mL/g-20mL/g， 更佳地為5mL/g-15mL/g(例如10mL/g)。所述的重組表達該羰基還原酶的基因工程大腸桿菌誘導(dǎo)表達后的菌體細(xì)胞破碎液的用量可不作具體限定，較佳地，其與化合物(2-2)的體積質(zhì)量比為1mL/g-100mL/g，更佳地為5mL/g-25mL/g，最佳地為10mL/g。
化合物(4-1)的制備方法中，所述的重組表達該羰基還原酶的基因工程大腸桿菌發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法和條件可為本領(lǐng)域常規(guī)的方法和條件，具體可參見CN101883846A說明書第68頁-69頁實施例1和2。
化合物(4-1)的制備方法中，所述的水的用量可不作具體限定，較佳地，其與化合物(2-2)的體積質(zhì)量比為5mL/g-50mL/g，更佳地為10mL/g-30mL/g。所述的氫供體較佳地為異丙醇。所述的氫供體的用量可為本領(lǐng)域常規(guī)的用量，較佳地，所述的氫供體與水的體積比較佳地為1:3-1:4。通常情況下，氫供體的用量較輔酶因子多，因此，氫供體可與水一起作為上述催化還原反應(yīng)的溶劑。所述的輔酶因子較佳地為NaNADP。所述的輔酶因子與水的質(zhì)量體積比較佳地為0.001g/L-0.1g/L，更佳地為0.005g/L-0.05g/L；更佳地為0.03g/L。所述的催化還原反應(yīng)的溫度可為本領(lǐng)域常規(guī)的溫度，較佳地為20℃-45℃，更佳地為30℃-40℃，最佳地為35℃。所述的催化還原反應(yīng)的進程可采用本領(lǐng)域常規(guī)的檢測方法進行監(jiān)測(例如TLC、GC、HPLC等，優(yōu)選TLC)，一般以化合物(2-2)反應(yīng)完全時作為反應(yīng)的終點。所述的催化還原反應(yīng)的時間較佳地為4-24小時，更佳地為6-12小時。
化合物(4-1)的制備方法中，較佳地以堿性物質(zhì)控制反應(yīng)體系的pH值在6.0-9.0之間。所述的堿性物質(zhì)可為本領(lǐng)域常規(guī)的用于調(diào)節(jié)pH的堿性物質(zhì)，只要不影響反應(yīng)進行，即可，較佳地為氫氧化鈉水溶液或氨水。所述的氫氧化鈉水溶液或氨水的摩爾濃度或用量可不作具體限定，只要能夠控制反應(yīng)體系的pH值在6.0-9.0即可。
化合物(4-1)的制備方法中，所述的催化還原反應(yīng)結(jié)束后，較佳地還可進一步包括后處理的操作。所述的后處理的方法和條件可為本領(lǐng)域此類反應(yīng)常規(guī)的方法和條件，較佳地包括下列步驟：將催化還原反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng) 液，進行固液分離(優(yōu)選采用離心進行固液分離或者高溫例如70℃以上使酶變性后，采用濾紙過濾進行固液分離)，濾液用有機溶劑(優(yōu)選酯類溶劑，例如乙酸乙酯)萃取，合并有機層后，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水洗滌(優(yōu)選洗滌一次)，有機層用無水硫酸鈉干燥后，除去有機溶劑(優(yōu)選利用減壓蒸餾除去溶劑)，即得目標(biāo)化合物。
在本發(fā)明一較佳實施例中，化合物(4-1)的制備方法中，所述的催化還原反應(yīng)結(jié)束后，較佳地，不經(jīng)后處理，直接將催化還原反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液，在青霉素?；傅淖饔孟?，進行所述的水解反應(yīng)，制得化合物(5-1)。
所述的(2S,3R)-2-胺甲基-3-氨基丁酸甲酯(5-1)的制備方法，較佳地還可進一步包含下列步驟：有機溶劑中，在路易斯酸的作用下，將N-羥甲基-2-苯乙酰胺(1-2)和乙酰乙酸甲酯(2-1)進行如下所示的縮合反應(yīng)，制得所述的化合物(2-2)；
所述的化合物(2-2)的制備方法中，所述的縮合反應(yīng)的方法和條件可為本領(lǐng)域此類反應(yīng)常規(guī)的方法和條件，本發(fā)明較佳地包括下列步驟：將化合物(1-2)與有機溶劑的混合溶液，與路易斯酸和化合物(2-1)混合，進行所述的縮合反應(yīng)，即可。所述的有機溶劑可為本領(lǐng)域此類反應(yīng)常規(guī)的有機溶劑，較佳地為鹵代烴類溶劑。所述的鹵代烴類溶劑較佳地為二氯甲烷。所述的路易斯酸可為本領(lǐng)域此類反應(yīng)常規(guī)的路易斯酸，較佳地為三氯化鐵(FeCl3)。所述的路易斯酸的用量可為本領(lǐng)域常規(guī)的用量，較佳地，其為化合物(1-2)質(zhì)量的1％-20％，更佳地為5％-15％，最佳地為10％。所述的化合物(1-2)和所述的化合物(2-1)的用量關(guān)系可不作具體限定，較佳地，所述的化合物(1-2)和所述的化合物(2-1)的摩爾比為1:1-1:5，更佳地為1:1-1:1.5。所述的有機溶劑的用量可為本領(lǐng)域此類反應(yīng)常規(guī)的用量，較佳地，其與化合物(1-2)的體積質(zhì)量比為1mL/g-50mL/g，更佳地為5mL/g-30mL/g，最佳地 為10mL/g。所述的縮合反應(yīng)的溫度可為本領(lǐng)域此類反應(yīng)常規(guī)的溫度，較佳地為10℃-30℃。所述的縮合反應(yīng)的進程可按照本領(lǐng)域常規(guī)的檢測方法進行監(jiān)測(例如TLC、GC、HPLC等)，一般以化合物(2-1)消失時作為反應(yīng)的終點。所述的縮合反應(yīng)的時間可為本領(lǐng)域此類反應(yīng)常規(guī)的時間。
所述的化合物(2-2)的制備方法中，所述的縮合反應(yīng)結(jié)束后，較佳地還可進一步包含后處理的操作。所述的后處理的方法和條件可為本領(lǐng)域此類反應(yīng)常規(guī)的方法和條件，較佳地包含下列步驟：將上述縮合反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液用有機溶劑(例如使用酯類溶劑萃取，如乙酸乙酯)進行萃取，有機層進行水洗(例如水洗2次)、干燥(例如使用無水硫酸鈉或無水硫酸鎂干燥)后，除去有機溶劑(例如減壓旋蒸除去有機溶劑)，即可。
本發(fā)明還提供了一種(2S,3R)-2-(2-苯乙酰胺甲基)-3-羥基丁酸甲酯(4-1)的制備方法，其包含下列步驟：溶劑中，在氫供體和輔酶因子存在的條件下，在羰基還原酶的作用下，將3-氧代-2-(2-苯乙酰胺甲基)丁酸甲酯(2-2)進行如下所示的催化還原反應(yīng)，制得所述的(2S,3R)-2-(2-苯乙酰胺甲基)-3-羥基丁酸甲酯(4-1)；
其中，所述的催化還原反應(yīng)的方法和條件均同前所述。
本發(fā)明還提供了一種如式(2-2)所示的化合物或如式(4-1)所示的化合物：
在不違背本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。
本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
本發(fā)明室溫是指10-30℃。
本發(fā)明中，在重組表達該羰基還原酶的基因工程大腸桿菌發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法中，使用的水一般為去離子水或無菌水。
本發(fā)明的積極進步效果在于：
本發(fā)明的制備方法通過對底物結(jié)構(gòu)的選擇，配合上特定的水解酶，在進行氨基保護基的脫除時，羧酸甲酯中的甲基不受任何影響，可以直接進行后續(xù)的環(huán)化反應(yīng)，步驟短，操作簡單，成本低，更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。另外，本發(fā)明的制備方法，目標(biāo)化合物的收率和ee值高，由化合物(2-2)制備化合物(4-2)，目標(biāo)化合物的收率在95％以上，ee值>99.9％。由化合物(4-1)制備化合物(5-1)，目標(biāo)化合物的收率在95％以上，兩步總收率在90％以上。
具體實施方式
下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
下述實施例中原料來源信息：
固定化青霉素G?；纲徸哉憬橈L(fēng)海德爾有限公司。
實施例1 N-羥甲基-2-苯乙酰胺(1-2)的制備
將30.0g苯乙酰胺(1-1)加入到300mL甲苯中，再加入8.6g多聚甲醛和1.8g乙酸鈉，升溫至80℃反應(yīng)3小時。反應(yīng)結(jié)束，降至室溫攪拌過夜，有大量白色固體析出，過濾，濾餅少量甲苯洗，真空干燥后得到33.0g白色 固體N-羥甲基-2-苯乙酰胺(1-2)，收率90％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.67(s,1H),7.36–7.14(m,5H),5.58(s,1H),4.49(s,2H),3.41(s,2H).；MS(ESI)m/z＝166(M++1).
實施例2 3-氧代-2-((2-苯乙酰胺基)甲基丁酸甲酯(2-2)的制備
將10.0g N-羥甲基-2-苯乙酰胺(1-2)加入到100ml二氯甲烷中，加入1.0g三氯化鐵和9.2g乙酰乙酸甲酯(2-1)，該混合物室溫反應(yīng)過夜，直至原料完全消失后停止反應(yīng)。往反應(yīng)液中加入100mL水和200mL乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢璺謱?，有機相用2×50mL水洗，無水硫酸鈉干燥后旋干，得到9.4g無色粘稠液體3-氧代-2-((2-苯乙酰胺基)甲基丁酸甲酯(2-2)，收率60.0％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.32(ddd,J＝22.5,9.8,4.2Hz,3H),7.24–7.18(m,2H),6.16(s,1H),3.83(t,J＝6.3Hz,1H),3.67(s,3H),3.64(dd,J＝10.5,4.3Hz,2H),3.50(s,2H),2.22(s,3H)；MS(ESI)m/z＝264(M++1).
其他反應(yīng)條件下的結(jié)果：
實施例3(2S,3R)-3-羥基-2-((2-苯乙酰胺基)甲基)丁酸甲酯(4-1)的制備
1、酶液的制備
培養(yǎng)基配制方法：
LB培養(yǎng)基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化鈉，pH7.2，121℃高溫高壓滅菌20min；
TB培養(yǎng)基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4.3H2O、2.31g/L KH2PO4、5g/L甘油，pH 7.0-7.5，121℃高溫高壓滅菌20min；
斜面培養(yǎng)基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化鈉、20g/L瓊脂粉，混勻后按30-40mL裝液量分裝到茄子瓶，豎立放置于121℃高溫高壓滅菌20min，降溫后加入100μg/mL硫酸卡那霉素，擺放成斜面，待冷凝成固體即可。
(1)種子活化：取重組表達該羰基還原酶KRED10的基因工程大腸桿菌(該大腸桿菌獲得方法為本領(lǐng)域常規(guī)方法，表達該羰基還原酶KRED10的序列具體見申請公布號為CN101883846A的中國專利申請中說明書第73頁表5公開的從克菲爾乳桿菌的突變序列表SEQ ID No.10)甘油保藏管中100μL菌種保藏液，用接種環(huán)均勻涂抹于茄子瓶中的斜面培養(yǎng)基上，然后置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜(18h)；
(2)種子培養(yǎng)：取100 mL無菌水導(dǎo)入茄子瓶做成菌懸液，取菌懸液50μL接入裝有50mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶，30℃，220 rpm培養(yǎng)16h；
(3)發(fā)酵：將上述培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液全部接入裝有1L TB培養(yǎng)基的5L搖瓶，37℃，220rpm培養(yǎng)4-6h后，加入0.3 mM的IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)并降溫至28℃，220rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)12h。
(4)菌體收集：收集發(fā)酵液，置于離心機4000rpm離心30min，棄上清后收集菌泥，放置于-20℃冷凍收藏。
(5)酶液制備：稱取菌體0.5g，然后加入5mL的去離子水重懸浮后，通過超聲波進行細(xì)胞破碎，得到的破碎液即為酶液，放置于冰浴中待用。
2、酶反應(yīng)操作
稱取5.0g 3-氧代-2-((2-苯乙酰胺基)甲基丁酸甲酯(2-2)，加入1L搖瓶中，加入150mL水混勻，用1M氫氧化鈉溶液調(diào)pH8.0左右，放入搖床中升溫至35℃，然后加入50mL異丙醇、50mL KRED10酶液，最后加入0.03g/L的NaNADP，即開始反應(yīng)，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，溫度35℃。反應(yīng)6小時后經(jīng)TLC檢測已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化。將反應(yīng)液離心除去沉淀，水相用2×150mL乙酸乙酯萃取，合并的有機相用分別飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水洗一次，無水硫酸鈉干燥后，旋干乙酸乙酯得到4.8g無水透明液體(2S,3R)-3-羥基-2-((2-苯乙酰胺基)甲基)丁酸甲酯(4-1)，收率95％，ee值>99.9％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.43–7.22(m,6H),6.06(s,1H),3.96(d,J＝3.0Hz,1H),3.92–3.79(m,2H),3.61(s,3H),3.60(s,2H),3.32(ddd,J＝14.4,5.1,3.4Hz,1H),2.56–2.38(m,1H),1.20(d,J＝6.3Hz,3H)；MS(ESI)m/z＝266(M++1).
其中，化合物(4-1)的構(gòu)型，是通過化合物(5-1)的旋光數(shù)據(jù)與文獻(Org.Biomol.Chem.,2007,5,2812–2825)對比確定的。
實施例4(2S,3R)-3-羥基-2-胺甲基丁酸甲酯(5-1)的制備
將20.0g(2S,3R)-3-羥基-2-((2-苯乙酰胺基)甲基)丁酸甲酯(4-1)加入到0.1M的磷酸氫二鉀水溶液中，加入0.5g固定化青霉素G?；?，升溫至40℃反應(yīng)10小時，反應(yīng)過程中用氨水調(diào)節(jié)pH＝8.5。反應(yīng)結(jié)束，過濾，濾液旋干，在殘留物中加入200mL乙醇攪拌30分鐘，過濾除去不溶的鹽，濾液旋干得到目標(biāo)產(chǎn)物10.5g，收率95.6％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.25–4.19(m,1H),3.78(s,3H),3.33–3.28(m,2H),2.77–2.73(m,1H),1.28(d,J＝6.3Hz, 3H)；MS(ESI)m/z＝148(M++1),[α]25D＝-6.5(c 0.8,MeOH).
其他反應(yīng)條件下的結(jié)果：
實施例5(2S,3R)-3-羥基-2-胺甲基丁酸甲酯(5-1)的制備
將15.0g 3-氧代-2-((2-苯乙酰胺基)甲基丁酸甲酯(2-2)加入2L搖瓶中，加入500ml水混勻，用1M氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8.0左右，放入搖床中升溫至35℃，然后加入150mL異丙醇、150mL KRED10酶液，最后加入0.03g/L的NaNADP，即開始反應(yīng)，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，溫度35℃。反應(yīng)6小時后經(jīng)TLC檢測已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化。再加入到0.1M的磷酸氫二鉀水溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0左右，加入0.3g固定化青霉素?；窯，升溫至40℃反應(yīng)10小時，反應(yīng)過程中用氨水調(diào)節(jié)pH＝8.5。反應(yīng)結(jié)束，過濾，濾液旋干，在殘留物中加入150mL乙醇攪拌30分鐘，過濾除去不溶的鹽，濾液旋干得到目標(biāo)產(chǎn)物7.7g，兩步收率91.3％。氫譜數(shù)據(jù)見實施例4。
對比實施例1(2S,3R)-3-羥基-2-((2-苯甲酰胺基)甲基)丁酸甲酯(6-2)的制備
將30.0g 3-氧代-2-((2-苯甲酰胺基)甲基丁酸甲酯(6-1)加入3L搖瓶中，加入1000mL水混勻，用1M氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8.0左右，放入搖床中升溫至35℃，然后加入300mL異丙醇、300mL KRED10酶液，最后加入0.03g/L的NaNADP，即開始反應(yīng)，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，溫度35℃。反應(yīng)8小時后經(jīng)TLC檢測已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化。將反應(yīng)液離心除去沉淀，水相用2×300mL乙酸乙酯萃取，合并的有機相用分別飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水洗一次，無水硫酸鈉干燥后，旋干乙酸乙酯得到25.8g無水透明液體(2S,3R)-3-羥基-2-((2-苯甲酰胺基)甲基)丁酸甲酯(6-2)，收率85.3％，ee值>99.9％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.51(s,1H),7.80–7.78(m,2H),7.54–7.44(m,3H),5.00(s,1H),3.83–3.81(m,1H),3.63–3.61(m,1H),3.58(s,3H),2.67–2.66(m,1H),1.10(d,J＝6.3Hz,3H)；MS(ESI)m/z＝252(M++1).
對比實施例2(2S,3R)-3-羥基-2-胺甲基丁酸甲酯(5-1)的制備
將25.8g(2S,3R)-3-羥基-2-((2-苯甲酰胺基)甲基)丁酸甲酯(6-2)加入到0.1M的磷酸氫二鉀水溶液中，加入1.0g固定化青霉素G?；福郎刂?0℃反應(yīng)24小時，反應(yīng)過程中用氨水調(diào)節(jié)pH＝8.5。TLC確定，反應(yīng)不能進行，反應(yīng)物(2S,3R)-3-羥基-2-((2-苯甲酰胺基)甲基)丁酸甲酯(6-2)沒有變化，沒有產(chǎn)物生成。
對比實施例3(2S,3R)-2-((1,3-二氧代異吲哚-2-基)甲基)-3-羥基丁酸甲酯(8-2)的制備
將20.0g 2-((1,3-二氧代異吲哚-2-基)甲基)-3-氧代甲基丁酸甲酯(8-1)加入2L搖瓶中，加入800mL水混勻，用1M氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8.0左右，放入搖床中升溫至35℃，然后加入200mL異丙醇、200mL KRED10酶液，最后加入0.03g/L的NaNADP，即開始反應(yīng)，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，溫度35℃。這時發(fā)現(xiàn)原料2-((1,3-二氧代異吲哚-2-基)甲基)-3-氧代甲基丁酸甲酯(8-1)在體系中溶解度不好，體系渾濁，而且反應(yīng)24小時后仍有許多原料不能反應(yīng)。