一種氟甲基酮肽系列化合物的制備方法與流程

本發(fā)明涉及一種化合物的制備方法，具體涉及一種氟甲基酮肽系列化合物的制備方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種主要形式，普遍存在于生物體的生長(zhǎng)進(jìn)程中，它對(duì)于生命體正常發(fā)育以及某些疾病的控制具有十分重要的意義。許多疾病的治療需要對(duì)疾病相關(guān)的細(xì)胞凋亡進(jìn)行控制或加以改變。在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，胱冬肽酶(Caspase)起著關(guān)鍵作用。

Caspase是一類對(duì)天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶,在其活性中心含有半胱氨酸結(jié)構(gòu),能夠特異性地剪切肽鏈上天冬氨酸后面的位點(diǎn)，它們對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病家族成員有重要的酶解修飾作用，包括Caspase1～10等。

Caspase酶原包括3個(gè)部分：原域、大亞單位和小亞單位。酶原本身的活性很低，但可以通過(guò)不同的方式被激活。一旦原域以及大、小亞單位之間的連結(jié)被切除，大小亞單位之間相互作用形成一個(gè)異二聚體，其中包含一個(gè)活性位點(diǎn)；兩個(gè)異二聚體形成一個(gè)四聚體，成為Caspase的活化形式?；罨腃aspase是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵酶類，通過(guò)特異性地裂解底物而發(fā)揮其執(zhí)行細(xì)胞凋亡的功能。

近年來(lái)Caspase抑制劑的設(shè)計(jì)、合成主要是基于Caspase底物切割位點(diǎn)的特異性即根據(jù)不同Caspase的特異性底物模型，連接一些化學(xué)基團(tuán)從而達(dá)到抑制的效果，許多肽類抑制劑如氟甲基酮肽系列化合物就具有上述特點(diǎn)?，F(xiàn)有的技術(shù)中，通常采用有機(jī)合成的方法進(jìn)行制備光學(xué)活性的或外消旋的C端修飾為氟甲基酮的肽。

目前，國(guó)內(nèi)外已有部分關(guān)于Caspase抑制劑氟甲基酮肽的報(bào)道，大部分是采用液相有機(jī)合成的方法。

WO93/05071報(bào)道了一些Caspase抑制劑的結(jié)構(gòu)式：

Z-Q₂-Asp-Q₁

其中，Z是N端保護(hù)基；Q₂是0-4個(gè)氨基酸，且Q₂-Asp至少是Ala-Tyr-Val-His-Asp的一個(gè)部分；Q₁是電負(fù)性離去基團(tuán)。如：Boc-His-Asp-CH₂F，Boc-Tyr-Asp-CH₂F及Z-His-Asp-CH₂F等。

另外，文獻(xiàn)(Tetrahedron Lett.35:9693-9696,1994)介紹了三肽烷基乙酯的制備方法，該化合物的游離酸是一有效的Caspase抑制劑，它的乙酯作為相應(yīng)酸的前藥。該法于-60℃下，以2-氟乙醇及3-硝基丙酸酯為原料，合成得到氟甲基 酮中間體；然后連接丙氨酸和Z-纈氨酸，再經(jīng)Dess-Martin氧化仲醇得到氟甲基酮，最后經(jīng)水解、修飾得到目標(biāo)產(chǎn)物。該法合成過(guò)程中要求溫度降到-60℃，不利于工業(yè)化放大。

上述Caspase抑制劑存在的普遍問(wèn)題是口服在胃腸道和體內(nèi)容易被水解而喪失活性，同時(shí)也有較明顯的毒副作用，且液相合成繁瑣。

此外，文獻(xiàn)(Liau M L,Panicker R C,Yao S Q.Tetrahedron Lett.,2003,44:1043-1046)也報(bào)道了一種合成氟甲基酮肽的方法，該方法要求低溫，條件苛刻，同樣不適用工業(yè)化生產(chǎn)。

專利CN 1285356A報(bào)道了系列二肽的氟甲酮肽，其也以純液相合成為主。

專利CN 102234309A提供了一種固相制備C端修飾為氟甲基酮肽的系列化合物的方法，該法直接將已連接在樹(shù)脂上的Asp主鏈羧基進(jìn)行氟化，不同于常規(guī)的液相方法。該法用到了氟化氫/吡啶溶液作為氟元素的供體，腐蝕性強(qiáng)、惡臭，不利于操作人員身心健康，廢氣廢液難以處理不利環(huán)境，工業(yè)化生產(chǎn)受限。

綜上所述，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)及專利中報(bào)道了不少Caspase抑制劑氟甲基酮肽的合成方法，主要為液相合成，也有的采用了純固相合成。純液相合成條件繁瑣，反應(yīng)條件需要較低溫(部分反應(yīng)要求低至-60℃甚至-78℃)，一些反應(yīng)需要消旋體的拆分，條件苛刻，且后處理不便，三廢嚴(yán)重，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。此外，純固相合成的報(bào)道，其總合成收率為29.5～32.5％，產(chǎn)品純度僅為96.3～98.8％；采用的載體樹(shù)脂連接臂不易制備，采用的反應(yīng)試劑腐蝕性強(qiáng)、惡臭，不利于操作人員身心健康，廢氣廢液難以處理不利環(huán)境，工業(yè)化生產(chǎn)受限。

本發(fā)明的目的是提供一種治療與半胱氨酸蛋白酶導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病的藥物--Caspase抑制劑氟甲基酮肽系列化合物的固-液相結(jié)合的制備方法，方法新穎、合成條件溫和、工藝簡(jiǎn)單且工藝穩(wěn)定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的氟甲基酮肽系列化合物具有如下通式：

其中，A_n為由n個(gè)選自α天然氨基酸組成的肽鏈，其中1≤n≤10(n為整數(shù))；R₁為A_n末端氨基酸氨基酸α位氨基的保護(hù)基；R₂為碳端Asp側(cè)鏈羧基保護(hù)基。

合成路線如下所示：

本發(fā)明Caspase抑制劑氟甲基酮肽的制備方法，包括以下步驟：

1)以Fmoc-Asp(OR₀)-OH制備Fmoc-Asp(OR₀)-FMK；

2)將Fmoc-Asp(OR₀)-FMK的側(cè)鏈保護(hù)基R₀脫除，得到側(cè)鏈羧基裸露的Fmoc-Asp-FMK；

3)選用2-CTC樹(shù)脂為固相載體合成Fmoc-Asp-FMK-CTC氨基酸樹(shù)脂；

4)由Fmoc-Asp-FMK-CTC順序偶聯(lián)保護(hù)的氨基酸至肽鏈A_n，得到R₁-A_n-Asp-FMK-CTC；

5)選用20％TFE/DCM的試劑將R₁-An-Asp-FMK-CTC肽樹(shù)脂進(jìn)行切割得到全保護(hù)肽R1-A_n-Asp-FMK；

6)液相條件下，將R₁-A_n-Asp-FMK中碳端Asp的側(cè)鏈羧基進(jìn)行修飾保護(hù)，得到全保護(hù)肽R₁-A_n-Asp(OR₂)-FMK；

7)以TFA/H₂O/EDT＝95/3/2(V/V)為裂解液將全保護(hù)肽的R_1-A_n-Asp(OR₂)-FMK進(jìn)行保護(hù)基的脫除，得到目標(biāo)化合物R₁-A_n-Asp(OR₂)-FMK。

所述步驟1)中，所述Fmoc-Asp(OR₀)-OH中的Asp為α天冬氨酸，R₀為Asp側(cè)鏈羧基保護(hù)基；

所述步驟1)包括以下步驟：，

步驟1-1)由Fmoc-Asp(OR₀)-OH進(jìn)行主鏈羧基的重氮化，

步驟1-2)將Fmoc-Asp(OR₀)-N₂進(jìn)行溴代得到Fmoc-Asp(OR₀)-N₂，

步驟1-3)將Fmoc-Asp(OR₀)-Br的氟元素F以溴元素Br取代得到Fmoc-Asp(OR₀)-FMK；

所述步驟1-3)中，F(xiàn)moc-Asp(OR₀)-Br的氟元素F以溴元素Br取代是以四氫呋喃為回流溶劑，以四丁基氟化銨(2～10eq)及對(duì)甲苯磺酸(2～6eq)為反應(yīng)試劑進(jìn)行反應(yīng)；最優(yōu)地，反應(yīng)試劑為四丁基氟化銨(6eq)及對(duì)甲苯磺酸(6eq)；

所述步驟2)中，脫除側(cè)鏈保護(hù)基R₀，采用的是-10～0℃，30％甲酸/DCM或 50％TFA/DCM溶液或TiCl₄(2～6eq)，最優(yōu)地，采用-10℃和TiCl₄(4eq)；

優(yōu)選地，所述步驟2)中將30％甲酸/DCM降溫至0℃，并加入Fmoc-Asp(OtBu)-FMK(1eq)，攪拌溶解，自然升溫至25℃，攪拌反應(yīng)10小時(shí)后，監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成，去除有機(jī)溶劑，并進(jìn)行萃取、洗滌和干燥。

優(yōu)選地，將50％TFA/DCM降溫至0℃，并加入Fmoc-Asp(OtBu)-FMK(1eq)，攪拌溶解，自然升溫至25℃，攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成，去除有機(jī)溶劑，并進(jìn)行萃取、洗滌和干燥。

優(yōu)選地，將Fmoc-Asp(OtBu)-FMK(1eq)加入1.0L的DCM中，攪拌溶解，降溫至-10℃，緩慢加入TiCl₄(2eq)，保溫-10℃反應(yīng)30分鐘后，監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成，去除有機(jī)溶劑，并進(jìn)行萃取、洗滌和干燥。

優(yōu)選地，將Fmoc-Asp(OtBu)-FMK(1eq)加入1.0L的DCM中，攪拌溶解，降溫至-10℃，緩慢加入TiCl₄(4eq)，保溫-10℃反應(yīng)30分鐘后，監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成，去除有機(jī)溶劑，并進(jìn)行萃取、洗滌和干燥。

優(yōu)選地，將Fmoc-Asp(OtBu)-FMK(1eq)加入DCM中，攪拌溶解，降溫至-10℃，緩慢加入TiCl₄(6eq)，保溫-10℃反應(yīng)30分鐘后，監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成，去除有機(jī)溶劑，并進(jìn)行萃取、洗滌和干燥。

所述步驟3)中，采用的2-CTC樹(shù)脂替代度為0.8-1.5mmol/g，優(yōu)選為1.1mmol/g；

所述步驟4)中，R₁為A_n末端氨基酸α位氨基的保護(hù)基，且其在濃度為20％的六氫吡啶溶液中穩(wěn)定；最優(yōu)選的，R₁為甲酸芐酯保護(hù)基(Z保護(hù)基)；

所述步驟4)中，A_n中連接的第一個(gè)氨基酸的偶聯(lián)采用HBTU(0.99eq)/HOBT(1.2eq)/DIPEA(2.0eq)體系，其他氨基酸的偶聯(lián)均采用HOBT(1.2eq)/DIPCDI(1.2eq)體系；

所述步驟6)中，Asp的側(cè)鏈羧基采用R₂進(jìn)行修飾保護(hù)，優(yōu)選的，R₂選自甲基或者乙基，最優(yōu)選的，R₂選自甲基；

所述步驟7)中，若目標(biāo)化合物肽序中的偶聯(lián)所用的氨基酸無(wú)側(cè)鏈保護(hù)，則制備過(guò)程中無(wú)需進(jìn)行本步驟；

所述步驟7)中，優(yōu)選的，目標(biāo)式I化合物R₁-A_n-Asp(OR₂)-FMK選自但不限于下述化合物：

Z-VAD-FMK；

Z-DEVD-FMK；

Z-YVAD-FMK；

Z-IETD-FMK；

Z-LEHD-FMK；

Z-DQMD-FMK；

Z-WEHD-FMK；

Z-LEED-FMK；

Z-VEID-FMK；

Z-AEVD-FMK；

Z-VDVAD-FMK；

Z-ASTD-FMK；

其中，最優(yōu)選的為Z-VAD-FMK。

本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)

Fmoc指9-芴甲氧羰基；

2-CTC指2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂(2-Chlorotrityl Chloride Resin)；

DIPCDI指N,N-二異丙基碳二亞胺；

FMK指氟甲基酮；

Z保護(hù)基指甲酸芐酯，一種氨基保護(hù)基；

Caspase是一類對(duì)天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶；

TFE指三氟乙醇；

TFA指三氟乙酸；

EDT指1,2-乙二硫醇；

eq指倍量；

TiCl₄指四氯化鈦；

HBTU指O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯；

HOBT指1-羥基苯并三唑；

DIPCDI指N,N-二異丙基碳二亞胺；

DIPEA指N，N-二異丙基乙胺；

THF指四氫呋喃；

DCM指二氯甲烷；

DMF指N,N二甲基甲酰胺；

RP-HPLC指反相高效液相；

DMAP指對(duì)二甲氨基吡啶；

20％DBLK指20％的六氫吡啶的DMF溶液；

α天然氨基酸指甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、色氨酸(W)、絲氨酸(S)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、蘇氨酸(T)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)。

有益效果

本發(fā)明采用固相-液相相結(jié)合的方法，充分利用了液相反應(yīng)的均一高效性以及固相反應(yīng)的簡(jiǎn)便處理、可操作性強(qiáng)的特點(diǎn)，先在液相條件下合成得到主鏈含氟甲 基酮的天冬氨酸，再利用其裸露的側(cè)鏈羧基連接到樹(shù)脂上，從而可以很方便的順次偶聯(lián)其余氨基酸，特別是在肽鏈比較長(zhǎng)(如n為5～10)時(shí)，更顯得方便快捷、高效；同時(shí)，本發(fā)明相比其他方法，無(wú)需采用RP-HPLC的純化方法，通過(guò)重結(jié)晶即可獲得純度達(dá)到99.4％以上，合成總收率可高達(dá)40.65％且最大單雜小于0.1％的產(chǎn)品。本發(fā)明方法新穎、合成條件溫和、工藝簡(jiǎn)單且工藝穩(wěn)定。

附圖說(shuō)明

圖1為Z-VAD-FMK(甲酯化)的HPLC色譜圖。

圖2為Z-VAD-FMK(乙酯化)的HPLC色譜圖。

圖3為Z-VDVAD-FMK(甲酯化)的HPLC色譜圖。

圖4為Z-VDVAD-FMK(乙酯化)的HPLC色譜圖。

圖5為Z-LEHDAVDVAD-FMK(甲酯化)的HPLC色譜圖。

圖6為Z-LEHDAVDVAD-FMK(乙酯化)的HPLC色譜圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 Fmoc-Asp(OtBu)-FMK的制備

1.1 Fmoc-Asp(OtBu)-N₂的制備

將Fmoc-Asp(OtBu)-OH(1eq，0.5mol，206g)以及氮甲基嗎啉(1.25eq，0.625mol，63.2g)加入反應(yīng)釜中，并溶解于THF(2.0L)中，采用冷肼將體系溫度降至約-10℃，緩慢滴入氯甲酸異丁酯(1.15eq，0.575mol，78.5g)，保溫-10℃反應(yīng)30分鐘。再將重氮甲烷-乙醚溶液(4eq，2.0mol，84g)緩慢加入到上述反應(yīng)體系，加畢，自然升溫至25℃反應(yīng)3小時(shí)，TLC點(diǎn)板檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束。

反應(yīng)結(jié)束，緩慢加入3.0L水及0.1L醋酸淬滅，再加入6.0L乙酸乙酯萃取。再將分出的有機(jī)相依次用3.0L飽和食鹽水及5％碳酸氫鈉水溶液洗滌，最后用無(wú)水硫酸鎂將該有機(jī)相干燥。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，并用乙酸乙酯-正庚烷體系重結(jié)晶，烘干得到172g淺黃色固體Fmoc-Asp(OtBu)-N₂，收率95.01％。

1.2 Fmoc-Asp(OtBu)-Br的制備

將Fmoc-Asp(OtBu)-N₂(1eq，0.457mol，172g)加入反應(yīng)釜中，并溶解于THF(2.0L)中，采用冷肼將體系溫度降至約0℃，緩慢滴入33％HBr/(醋酸/水)溶液(450ml)，加畢，自然升溫至25℃反應(yīng)1小時(shí)，TLC點(diǎn)板檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束。

反應(yīng)結(jié)束，緩慢加入3.0L稀釋，再加入6.0L乙酸乙酯萃取。將分出的有機(jī)相 依次用3.0L飽和食鹽水及5％碳酸氫鈉水溶液洗滌，最后用無(wú)水硫酸鎂將該有機(jī)相干燥。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，并用乙酸乙酯-正庚烷體系重結(jié)晶，烘干得到174.6g淺黃色固體Fmoc-Asp(OtBu)-Br，收率92.0％。

1.3 Fmoc-Asp(OtBu)-FMK的制備

將Fmoc-Asp(OtBu)-Br(1eq，0.42mol，174.6g)、四丁基氟化銨(6eq，2.52mol，659g)以及對(duì)甲苯磺酸(3eq，1.26mol，240g)加入反應(yīng)釜中，并溶解于THF(2.0L)中，將體系升溫回流反應(yīng)4小時(shí)，TLC點(diǎn)板檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束。

反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，緩慢加入3.0L水，再加入6.0L乙酸乙酯萃取。再將分出的有機(jī)相依次用3.0L飽和食鹽水、5％碳酸氫鈉水溶液以及5％檸檬酸水溶液洗滌，最后用無(wú)水硫酸鎂將該有機(jī)相干燥。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，并用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，烘干得到119.4g白色固體Fmoc-Asp(OtBu)-FMK，收率80.2％。

實(shí)施例2 Fmoc-Asp(OtBu)-FMK中tBu的脫除

2.1 Fmoc-Asp-FMK的制備

將30％甲酸/DCM降溫至0℃，并加入按照實(shí)施例1的方法制備的Fmoc-Asp(OtBu)-FMK(1eq，0.282mol，100g)，攪拌溶解，自然升溫至25℃，攪拌反應(yīng)10小時(shí)后，TLC點(diǎn)板監(jiān)控。

反應(yīng)結(jié)束，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，加入3.0L乙酸乙酯萃取。再將分出的有機(jī)相依次用3.0L飽和食鹽水以及5％碳酸氫鈉水溶液洗滌，最后用無(wú)水硫酸鎂將該有機(jī)相干燥。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，并用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，烘干得到94.4g白色固體Fmoc-Asp-FMK，收率90.2％。

2.2 Fmoc-Asp-FMK的制備

將50％TFA/DCM降溫至0℃，并加入按照實(shí)施例1的方法制備的Fmoc-Asp(OtBu)-FMK(1eq，0.282mol，100g)，攪拌溶解，自然升溫至25℃，攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，TLC點(diǎn)板監(jiān)控。

反應(yīng)結(jié)束，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，加入3.0L乙酸乙酯萃取。再將分出的有機(jī)相依次用3.0L飽和食鹽水以及5％碳酸氫鈉水溶液洗滌，最后用無(wú)水硫酸鎂將該有機(jī)相干燥。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，并用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，烘干得到99.7g白色固體Fmoc-Asp-FMK，收率95.2％。

2.3 Fmoc-Asp-FMK的制備

將按照實(shí)施例1的方法制備的Fmoc-Asp(OtBu)-FMK(1eq，0.282mol，100g)加入1.0L的DCM中，攪拌溶解，降溫至-10℃，緩慢加入TiCl4(2eq，0.564mol，107g)，保溫-10℃反應(yīng)30分鐘，TLC點(diǎn)板監(jiān)控。

反應(yīng)結(jié)束，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，加入3.0L乙酸乙酯萃取。再將分出的有機(jī)相依次用3.0L飽和食鹽水以及5％碳酸氫鈉水溶液洗滌，最后用無(wú)水硫酸鎂將該有機(jī)相干燥。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，并用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，烘干得到101.8g白色固體Fmoc-Asp-FMK，收率97.2％。

2.4 Fmoc-Asp-FMK的制備

將按照實(shí)施例1的方法制備的Fmoc-Asp(OtBu)-FMK(1eq，0.282mol，100g)加入1.0L的DCM中，攪拌溶解，降溫至-10℃，緩慢加入TiCl₄(4eq，1.128mol，214g)，保溫-10℃反應(yīng)30分鐘，TLC點(diǎn)板監(jiān)控。

反應(yīng)結(jié)束，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，加入3.0L乙酸乙酯萃取。再將分出的有機(jī)相依次用3.0L飽和食鹽水以及5％碳酸氫鈉水溶液洗滌，最后用無(wú)水硫酸鎂將該有機(jī)相干燥。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，并用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，烘干得到103.75g白色固體Fmoc-Asp-FMK，收率99.1％。

2.5 Fmoc-Asp-FMK的制備

將按照實(shí)施例1的方法制備的Fmoc-Asp(OtBu)-FMK(1eq，0.282mol，100g)加入1.0L的DCM中，攪拌溶解，降溫至-10℃，緩慢加入TiCl4(6eq，1.692mol，321g)，保溫-10℃反應(yīng)30分鐘，TLC點(diǎn)板監(jiān)控。

反應(yīng)結(jié)束，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，加入3.0L乙酸乙酯萃取。再將分出的有機(jī)相依次用3.0L飽和食鹽水以及5％碳酸氫鈉水溶液洗滌，最后用無(wú)水硫酸鎂將該有機(jī)相干燥。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，并用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，烘干得到101.14g白色固體Fmoc-Asp-FMK，收率96.6％。

實(shí)施例3 Fmoc-Asp-FMK與2-CTC樹(shù)脂的偶聯(lián)

取替代度為1.1mmol/g的2-CTC樹(shù)脂(1.1eq，296mmol，269g)加入固相反應(yīng)柱，用DMF洗滌2次后溶脹1小時(shí)，抽干。將按照實(shí)施例2中2.4制備的Fmoc-Asp-FMK(1.0eq，269mmol，100g)溶解于700ml DMF中并降溫至2～5℃，加入DIPEA(3.3eq，888mmol，115g)，保溫?cái)嚢?0分鐘后加入到上述固相反應(yīng)柱中，鼓氮?dú)鈹嚢?小時(shí)后加入200ml甲醇鼓氣攪拌30分鐘，再用DMF洗滌4次，抽干DMF備用，得到Fmoc-Asp-FMK-CTC。

實(shí)施例4 Z-VAD-FMK(甲酯化)的制備

4.1 制備Z-VAD-FMK-CTC

將按照實(shí)施例3制備的Fmoc-Asp-FMK-CTC(1.0eq，269mmol)用20％DBLK脫保護(hù)兩次，每次10分鐘，脫畢用DMF洗滌6次。取Fmoc-Ala-OH(3.0eq，807mmol，251g)、HBTU(2.97eq，798.9mmol，303g)和HOBT(3.6eq，968mmol，130g)溶劑于1.6L DMF中，降溫至2～5℃，加入DIPEA(6.0eq，1614mmol，209g)活化5分鐘，傾倒入按照實(shí)施例3制備的氨基酸樹(shù)脂中，鼓氮?dú)夥磻?yīng)2小時(shí)。5％茚三酮/乙醇溶液檢測(cè)無(wú)色透明，反應(yīng)完全，用DMF洗滌3次。

加入20％DBLK脫保護(hù)兩次，每次10分鐘，脫畢用DMF洗滌6次。稱取Z-Val-OH(3.0eq，807mmol，203g)及HOBT(3.6eq，968mmol，130g)溶劑于1.6L DMF中，降溫至2～5℃，加入DIPCDI(3.6eq，968mmol，122g)活化5分鐘，加入固相反應(yīng)柱中反應(yīng)2小時(shí)。5％茚三酮/乙醇溶液檢測(cè)無(wú)色透明，反應(yīng)完全，用DMF洗滌3次。用甲醇鼓氣攪拌收縮3次，每次1.5L及5分鐘，干燥，最后得402.8g肽樹(shù)脂。

4.2 Z-VAD-FMK-CTC的裂解

將上述4.1中制備的402.8g肽樹(shù)脂倒入裂解反應(yīng)釜中，配制4.0L20％TFE/DCM溶液并降溫至-5～0℃后加入到該反應(yīng)釜中，攪拌反應(yīng)2小時(shí)，過(guò)濾后將濾液蒸出至剩1/3，采用無(wú)水乙醚沉淀、洗滌，干燥得到131.7g羧基裸露的Z-VAD-FMK。

4.3 Z-VAD-FMK的制備(甲酯化)

將上述4.2制備的131.7g羧基裸露的Z-VAD-FMK、HOBT(1.2eq，322.8mmol，43.6g)以及DMAP(0.1eq，0.0269mmol，3.3g)溶解于800ml甲醇中，將該體系降溫至2～5℃，滴加DIPCDI(1.2eq，322.8mmol，40.7g)，自然升溫至25℃反應(yīng)6小時(shí)。TLC檢測(cè)反應(yīng)完全。

反應(yīng)結(jié)束，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，加入2.0L水及2.0L乙酸乙酯萃取。再將分出的有機(jī)相依次用2.0L飽和食鹽水以及5％碳酸氫鈉水溶液洗滌，最后用無(wú)水硫酸鎂將該有機(jī)相干燥。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，并用乙酸乙酯重結(jié)晶，烘干得到71.4g白色固體Z-VAD-FMK(甲酯化，色譜如圖1)，總合成收率39.5％，RP-HPLC檢測(cè)純度99.6％，最大單雜0.06％。

實(shí)施例5 Z-VAD-FMK(乙酯化)的制備

依照實(shí)施例4中4.1～4.2制備得到138.7g羧基裸露的Z-VAD-FMK。將其與HOBT(1.2eq，322.8mmol，43.6g)以及DMAP(0.1eq，0.0269mmol，3.3g)溶解于800ml乙醇中，將該體系降溫至2～5℃，滴加DIPCDI(1.2eq，322.8mmol，40.7g)，自然升溫至25℃反應(yīng)6小時(shí)。TLC檢測(cè)反應(yīng)完全。

反應(yīng)結(jié)束，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，加入2.0L水及2.0L乙酸乙酯萃取。再將分出的有機(jī)相依次用2.0L飽和食鹽水以及5％碳酸氫鈉水溶液洗滌，最后用無(wú)水硫酸鎂將該有機(jī)相干燥。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，并用乙酸乙酯重結(jié)晶，烘干得到69.6g白色固體Z-VAD-FMK(乙酯化，色譜如圖2)，總合成收率38.5％，RP-HPLC檢測(cè)純度99.4％，最大單雜0.05％。

實(shí)施例6 Z-VDVAD-FMK的制備

取依照實(shí)施例1～3制備而得的269mmol Fmoc-Asp-FMK-CTC，用20％DBLK脫保護(hù)兩次，每次10分鐘，脫畢用DMF洗滌6次。

取Fmoc-Ala-OH(3.0eq，807mmol，251g)、HBTU(2.97eq，798.9mmol，303g)和HOBT(3.6eq，968mmol，130g)溶劑于1.6L DMF中，降溫至2～5℃，加入DIPEA(6.0eq，1614mmol，209g)活化5分鐘，傾倒入固相反應(yīng)柱中，鼓氮?dú)夥磻?yīng)2小時(shí)。5％茚三酮/乙醇溶液檢測(cè)無(wú)色透明，反應(yīng)完全，用DMF洗滌3次。

加入20％DBLK脫保護(hù)兩次，每次10分鐘，脫畢用DMF洗滌6次。采用HOBT(3.6eq，968mmol，130g)及DIPCDI(3.6eq，968mmol，122g)作為偶聯(lián)劑，順次偶聯(lián)Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH及Z-Val-OH，偶聯(lián)完畢用甲醇鼓氣攪拌收縮3次，每次1.5L及5分鐘，干燥，最后得480.2g肽樹(shù)脂。

依照實(shí)施例4中4.2的方法，將480.2g肽樹(shù)脂進(jìn)行20％TFE/DCM的切割，經(jīng)無(wú)水乙醚沉淀、洗滌，干燥得到212.3g羧基裸露的Z-VDVAD-FMK。

將上述制備的212.3g羧基裸露的Z-VDVAD-FMK、HOBT(1.2eq，322.8mmol，43.6g)以及DMAP(0.1eq，0.0269mmol，3.3g)溶解于800ml甲醇中，將該體系降溫至2～5℃，滴加DIPCDI(1.2eq，322.8mmol，40.7g)，自然升溫至25℃反應(yīng)6小時(shí)。TLC檢測(cè)反應(yīng)完全。

反應(yīng)結(jié)束，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，加入2.0L水及2.0L乙酸乙酯萃取。再將分出的有機(jī)相依次用2.0L飽和食鹽水以及5％碳酸氫鈉水溶液洗滌，最后用無(wú)水硫酸鎂將該有機(jī)相干燥。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，將濃縮干燥得到的224g粗品用500ml的TFA/H2O/EDT＝95/3/2(V/V)進(jìn)行裂解，經(jīng)無(wú)水乙醚沉淀、洗滌，干燥，所的固體采用乙酸乙酯重結(jié)晶，烘干得到120.9g白色固體Z-VDVAD-FMK(甲酯化，色譜如圖3)，總合成收率40.65％，RP-HPLC檢測(cè)純度99.5％，最大單雜0.07％。同法，采用乙醇作為溶劑，制備得到119.2g白色固體Z-VDVAD-FMK(乙酯化，色譜如圖4)，總合成收率39.96％，RP-HPLC檢測(cè)純度99.6％，最大單雜0.06％。

實(shí)施例7 Z-LEHDAVDVAD-FMK的制備

取依照實(shí)施例1～3制備而得的269mmol Fmoc-Asp-FMK-CTC，用20％DBLK脫保護(hù)兩次，每次10分鐘，脫畢用DMF洗滌6次。

取Fmoc-Ala-OH(3.0eq，807mmol，251g)、HBTU(2.97eq，798.9mmol，303g)和HOBT(3.6eq，968mmol，130g)溶劑于1.6L DMF中，降溫至2～5℃，加入DIPEA(6.0eq，1614mmol，209g)活化5分鐘，傾倒入固相反應(yīng)柱中，鼓氮?dú)夥磻?yīng)2小時(shí)。5％茚三酮/乙醇溶液檢測(cè)無(wú)色透明，反應(yīng)完全，用DMF洗滌3次。

加入20％DBLK脫保護(hù)兩次，每次10分鐘，脫畢用DMF洗滌6次。采用HOBT(3.6eq，968mmol，130g)及DIPCDI(3.6eq，968mmol，122g)作為偶聯(lián)劑，順次偶聯(lián)Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH及Z-Leu-OH，偶聯(lián)完畢用甲醇鼓氣攪拌收縮3次，每次1.5L及5分鐘，干燥，最后得681.2g肽樹(shù)脂。

依照實(shí)施例4中4.2的方法，將681.2g肽樹(shù)脂進(jìn)行20％TFE/DCM的切割，經(jīng)無(wú)水乙醚沉淀、洗滌，干燥得到421.2g全保護(hù)但羧基裸露的Z-LEHDAVDVAD-FMK。

將上述制備的421.2g全保護(hù)但羧基裸露的Z-LEHDAVDVAD-FMK、HOBT(1.2eq，322.8mmol，43.6g)以及DMAP(0.1eq，0.0269mmol，3.3g)溶解于800ml甲醇中，將該體系降溫至2～5℃，滴加DIPCDI(1.2eq，322.8mmol，40.7g)，自然升溫至25℃反應(yīng)6小時(shí)。TLC檢測(cè)反應(yīng)完全。

反應(yīng)結(jié)束，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，加入2.0L水及2.0L乙酸乙酯萃取。再將分出的有機(jī)相依次用2.0L飽和食鹽水以及5％碳酸氫鈉水溶液洗滌，最后用 無(wú)水硫酸鎂將該有機(jī)相干燥。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，并用900ml的TFA/H2O/EDT＝95/3/2(V/V)進(jìn)行裂解，經(jīng)無(wú)水乙醚沉淀、洗滌，干燥，所的固體采用乙酸乙酯重結(jié)晶，烘干得到160.4g白色固體Z-LEHDAVDVAD-FMK(甲酯化，色譜如圖5)，總合成收率37.66％，RP-HPLC檢測(cè)純度99.4％，最大單雜0.05％。同法，采用乙醇作為溶劑，制備得到155.7g白色固體Z-LEHDAVDVAD-FMK(乙酯化，色譜如圖6)，總合成收率36.56％，RP-HPLC檢測(cè)純度99.6％，最大單雜0.06％。