一種杏鮑菇下腳料粗多糖及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種杏鮑菇下腳料粗多糖，其是由如下方法制備得到的：粗多糖的提取、乙醇沉淀、透析及干燥。本發(fā)明制備的杏鮑菇下腳料粗多糖得率高，蛋白質含量低，同時粗多糖中β-葡聚糖含量大大增加。
【專利說明】一種杏鮑菇下腳料粗多糖及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明主要涉及食用菌提取領域，具體的說，涉及一種杏鮑菇下腳料粗多糖及其 制備方法。
【背景技術】
[0002] 杏鮑菇（Pleurotus Eryngii)是近年來開發(fā)栽培成功的集食用、藥用于一體的珍 稀食用菌新品種?，F(xiàn)代藥理學研究表明，杏鮑菇多糖含量豐富，是主要的活性成分之一，其 在抗血栓、調血脂、調節(jié)免疫功能和抗腫瘤、抗放射方面都具有顯著的藥理作用。
[0003] 杏鮑菇下腳料是菌腳、菇片、菌柄基部等杏鮑菇加工副產物，在加工過程中因難以 食用或商品價值低而被廢棄。
[0004] 常規(guī)粗多糖提取只是將杏鮑菇下腳料粉碎為粗粉，獲得的多糖粗品得率低且多糖 含量低，尤其是普通粉碎很難使胞壁多糖得到大量釋放，使多糖粗品中β-葡聚糖含量偏 低。同時，普通粉碎提取多糖蛋白質含量高，但現(xiàn)有的脫蛋白技術較為復雜，且會造成多糖 的損失，不利于規(guī)?；a。
【發(fā)明內容】
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種杏鮑菇下腳料粗多糖及其制備方法，以 克服現(xiàn)有技術中粗多糖提取得率低，粗多糖中β -葡聚糖含量低，難以工業(yè)化生產的缺點。
[0006] 本發(fā)明首先提供了一種杏鮑菇下腳料粗多糖，其是由如下方法制備得到的：
[0007] 粗多糖的提?。簩⑿吁U菇下腳料粉碎成納米級別粉末，沸水提取l_2h得到粗多糖 提取液；
[0008] 乙醇沉淀：粗多糖提取液中加入無水乙醇，至乙醇含量達到70% -80%，室溫靜置 12_15h，收集沉淀；
[0009] 透析及干燥：將沉淀加水溶解，用截留分子量為3500Da透析袋透析，將透析后的 溶液冷凍干燥，即得杏鮑菇下腳料粗多糖。
[0010] 具體的說，本發(fā)明的杏鮑菇下腳料粗多糖是通過如下方法制備得到的：
[0011] 粗多糖的提取：以杏鮑菇下腳料為原料，粉碎成納米級別粉末，加入15-20倍重量 的水中，常溫浸泡30-60min，加熱至沸騰，保持微沸60-120min，9700g離心10-15min ;上清 液減壓濃縮至料液比（質量/體積）為1:6-1:7 ;
[0012] 乙醇沉淀：向濃縮液中緩慢加入無水乙醇，邊加邊攪拌，至乙醇含量達到 70% -80%，室溫靜置12-15h，離心去除醇沉上清，收集沉淀。
[0013] 透析及干燥：沉淀加水溶解，用截留分子量為3500Da透析袋對粗多糖溶液4°C透 析3-4d，將透析后的溶液冷凍干燥，即得杏鮑菇粗多糖。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種制備杏鮑菇下腳料粗多糖的制備方法，其包括如下步驟：
[0015] 粗多糖的提?。簩⑿吁U菇下腳料粉碎成納米級別粉末，沸水提取l-2h得到粗多糖 提取液；
[0016] 乙醇沉淀：粗多糖提取液中加入無水乙醇，至乙醇含量達到70% -80%，室溫靜置 12-15h，收集沉淀；
[0017] 透析及干燥：將沉淀加水溶解，用截留分子量為3500Da透析袋透析，將透析后的 溶液冷凍干燥，即得杏鮑菇粗多糖。
[0018] 本發(fā)明制備得到的杏鮑菇下腳料粗多糖得率高，超過10%，多糖含量達到 60%以上，蛋白質含量低，同時粗多糖中β-葡聚糖含量大大增加，含量超過30 %。 HPSEC-MALLS-RI分析顯示粗多糖主要有三個糖峰，單糖分析結果顯示粗多糖主要由葡萄糖 組成，且粗多糖對RAW264.7巨噬細胞株釋放Ν0有明顯的促進作用。所以本制備方法是一 種簡便、高效、成本低、粗多糖得率及含量高、廢棄物綜合利用的適合規(guī)?；a的方法。
[0019] 本發(fā)明通過將杏鮑菇下腳料納米級粉碎，使胞壁多糖大量釋放，從而提高了粗糖 得率，并使多糖含量和β-葡聚糖含量大大增加。同時，粗多糖表現(xiàn)出很好的細胞免疫活 性。
[0020] 因而，利用杏鮑菇下腳料提取杏鮑菇粗多糖，不但原料來源豐富、生產成本低，而 且節(jié)約資源、減少環(huán)境污染，達到杏鮑菇資源綜合利用的目的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021] 圖1粗多糖的分子量分布
[0022] 圖2粗多糖的單糖組成
[0023] 圖3粗多糖促進RAW264. 7巨噬細胞株釋放的Ν0量
【具體實施方式】：
[0024] 實施例1 :
[0025] 1、杏鮑菇粗多糖的提取：以杏鮑菇下腳料（杏韓，上海國森生物科技有限公司）為 原料，粉碎成納米級別粉末（秦皇島太極環(huán)納米制品有限公司粉碎設備CJM-SY-B，粉碎時 間6h，粒度10-1000nm)，稱取10g，加入200mL蒸餾水，常溫浸泡60min，加熱至沸騰，保持微 沸120min，9700g離心12min。沉淀重復上述步驟，再提取1次，合并上清液。
[0026] 2、多糖粗提液的濃縮：上清液于旋轉蒸發(fā)儀中減壓濃縮至60mL。
[0027] 3、乙醇沉淀：向濃縮液中緩慢加入無水乙醇，邊加邊攪拌，至乙醇含量達到70%， 室溫靜置12h，離心去除醇沉上清，收集沉淀。
[0028] 4、透析及干燥：沉淀加70mL水溶解，用截留分子量為3500Da透析袋（國藥集團 化學試劑有限公司）對粗多糖溶液4°C透析3d，去除小分子物質。將透析好的粗多糖溶液 置于-20°C冰箱中凍存2h，然后再放到-80°C冰箱中冷凍3h，最后放入冷凍干燥機中冷凍干 燥，即得粗多糖干品。
[0029] 制備所得粗多糖得率為12.30%，多糖含量為61.55%，β-葡聚糖含量為 31. 63%。
[0030] 分析天平稱量粗多糖干品的重量。按以下公式計算粗多糖得率。
[0031] 粗多糖得率：％) = ^f!f^y.g)xi〇Q% 稱取樣品重量g)
[0032] 多糖和β -葡聚糖含量的檢測：
[0033] 多糖含量測定：用苯酚一硫酸法測定，精密稱取本品5mg置2ml離心管中，加蒸餾 水lml，加熱助溶后冷卻至室溫，離心。上清液稀釋100倍，精密吸取樣品1. 0ml，置15ml試 管中，分別加入苯酚、硫酸試劑，充分反應后在490nm處測定吸光度值，以葡聚糖為標準品 計算樣品的糖含量。
[0034] β -葡聚糖含量測定：參照Megazyme公司的酵母和蘑燕β -葡聚糖檢測試劑盒中 的方法對多糖樣品中β_葡聚糖含量進行測定。
[0035] 實施例2 :
[0036] 1、杏鮑菇粗多糖的提?。阂孕吁U菇下腳料（杏韓，上海國森生物科技有限公司）為 原料，粉碎成納米級別粉末（秦皇島太極環(huán)納米制品有限公司粉碎設備CJM-SY-B，粉碎時 間6h，粒度10-1000nm)，稱取10g，加入150mL蒸餾水，常溫浸泡30min，加熱至沸騰，保持微 沸120min，9700g離心12min。沉淀重復上述步驟，再提取1次，時間為60min，合并上清液。
[0037] 2、多糖粗提液的濃縮：上清液于旋轉蒸發(fā)儀中減壓濃縮至70mL。
[0038] 3、乙醇沉淀：向濃縮液中緩慢加入無水乙醇，邊加邊攪拌，至乙醇含量達到75%， 室溫靜置15h，離心去除醇沉上清，收集沉淀。
[0039] 4、透析及干燥：沉淀加50mL水溶解，用截留分子量為3500Da透析袋（國藥集團 化學試劑有限公司）對粗多糖溶液4°C透析3d，去除小分子物質。將透析好的粗多糖溶液 置于-20°C冰箱中凍存2h，然后再放到-80°C冰箱中冷凍3h，最后放入冷凍干燥機中冷凍干 燥，即得粗多糖干品。
[0040] 制備所得粗多糖得率為10.97%，多糖含量為67.33 %，β-葡聚糖含量為 35. 60%。
[0041] 實施例3:
[0042] 1、樣品制備：稱取5mg實施例1制備得到的粗多糖，加入lmLHPLC流動相，充分溶 解，13200r/min離心10min，上清液經0. 25 μ m的水相微孔膜過濾后進行HPSEC-MALLS-RI 分析。
[0043] 2、色譜分析條件：分析柱選TSK PWXL6000和TSK PWXL3000凝膠色譜柱串聯(lián)后分 析，流動相為含0.05111〇1/1的似托?04和0.15111〇1/1的似勵 3溶液（?!1=7,0.02%疊氮鈉）， 流速為0. 5mL/min，色譜柱溫用柱溫箱恒定在35°C ;激光檢測器光源波長選用623. 8nm。多 糖在溶液中的折光指數(shù)增量（dn/dc)按照0. 146mL/g計算。
[0044] 3、分子量計算：使用 Astra (version6. 1. 1，Wyatt Technology, Santa Barbara，CA)數(shù)據(jù)分析軟件對光散射數(shù)據(jù)進行采集和分析，計算分子量和其他多糖分子特 性。
[0045] HPSEC-MALLS-RI分析圖譜如圖1所示。杏鮑菇下腳料經納米粉粉碎處理后所得粗 多糖組分主要含有3個峰，且分子量分布范圍較寬，為25萬到500萬道爾頓之間。實施例 4 ：
[0046] 1、樣品制備：稱取實施例2制備得到的粗多糖2mg加入帶蓋玻璃瓶，加入2mL的 2mol/L的三氟乙酸，110°C油浴4h，冷卻至室溫，50°C氮吹儀吹干，再加甲醇吹干，重復兩次 至無酸味，用2mL超純水沖洗玻璃瓶于離心管中，13200r/min離心10min，對上清液上高效 陰離子色譜（HPAEC)分析。
[0047] 2、色譜條件：色譜柱 CarboPac?PA20 (3X 150nm);流動相 0· 8% NaOH 溶液（pH = 12);時間 30min ;柱溫 30°C ;流速 0· 45mL/min ;進樣量 25 μ L。
[0048] 經高效陰離子色譜檢測所得單糖組成如圖2所示。粗多糖組分經水解后由阿拉 伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖五種單糖組成，其中葡萄糖所占比例最高，達到70%以 上，其次是甘露糖、半乳糖，約為10%，而木糖、阿拉伯糖比例很低。
[0049] 實施例5 :
[0050] 杏鮑菇下腳料粗多糖體外刺激巨噬細胞釋放N0的活性測定：
[0051] 1、樣品準備：分別精確稱取實施例1和實施例2制備得到的杏鮑菇下腳料粗多糖 樣品于滅過菌的eppendorf管中，用無菌的PBS配制成濃度5mg/mL的樣品液。充分溶解后 以15000r/min離心40min，無菌條件下將上清轉移至新的無菌eppendorf管中，將樣品稀釋 成 2mg/ml、0. 5mg/ml 待用。
[0052] 2、細胞培養(yǎng)：取對數(shù)生長期的RAW264. 7巨噬細胞株（購自中科院細胞所），用 DMEM完全培養(yǎng)基（Gibco公司）在37°C、含5% C02條件下傳代培養(yǎng)，用0. 05%胰酶（Gibco 公司）消化，混懸液l〇〇〇rpm/min離心3min后收集細胞，計數(shù)備用。
[0053] 3、試劑配制及標準曲線繪制
[0054] Griess試劑：在燒杯中加入6. 25ml Η3Ρ03，加入蒸饋水250ml，分別加入2. 5g磺胺 (sulfanilamide，Sigma公司）和 0· 25g萘基乙二胺二鹽酸鹽（naphthyl ethyylenediamine dihydrochloride，Sigma公司），用磁力攪拌器至全部溶解，棕色試劑瓶4°C冰箱保存。
[0055] 標準曲線繪制：配成不同濃度的亞硝酸鈉溶液，濃度梯度為0、5、10、15、20、25、 30、35、40 μ Μ共九個；取100 μ L于96孔板孔，加入50 μ L Griess試劑，測定543nm吸光 值，標準曲線每個濃度3個重復，根據(jù)吸光值繪制標準曲線。
[0056] 4、樣品刺激巨噬細胞釋N0量的測定：收集RAW264. 7細胞，用無色RPMI1640(10% 胎牛血清+1 %抗生素液體，Gibco公司）培養(yǎng)基將細胞稀釋至5 X 105/mL，加入96孔板，每孔 加入180μ L，然后再加入20μ L待測樣品，陽性對照為LPS(1 μ g/mL，Sigma公司），37°C培 養(yǎng)48h。取100 μ L上清于96孔板孔，加入50 μ 1 Griess試劑，室溫孵浴10min，測定543nm 吸光值。根據(jù)標準曲線計算細胞NO的釋放量。
[0057] 結果見附圖3,由此結果可以看出，實施例1和實施例2制備得到的杏鮑菇下腳料 粗多糖對RAW264. 7巨噬細胞株釋放N0有明顯的促進作用，可明顯增強巨噬細胞的吞噬殺 傷能力，從而增強機體的抗腫瘤能力。
【權利要求】
1. 一種杏鮑菇下腳料粗多糖的，其特征在于其是由如下方法制備得到的： 粗多糖的提?。簩⑿吁U菇下腳料粉碎成納米級別粉末，沸水提取l-2h得到粗多糖提取 液； 乙醇沉淀：粗多糖提取液中加入無水乙醇，至乙醇含量達到70 % -80%，室溫靜置 12-15h，收集沉淀； 透析及干燥：將沉淀加水溶解，用截留分子量為3500Da透析袋透析，將透析后的溶液 冷凍干燥，即得杏鮑菇下腳料粗多糖。
2. 根據(jù)權利要求1所述的杏鮑菇下腳料粗多糖，其特征在于其是通過如下方法制備得 到的： 粗多糖的提?。阂孕吁U菇下腳料為原料，粉碎成納米級別粉末，加入15-20倍重量的水 中，常溫浸泡30-60min，加熱至沸騰，保持微沸60-120min，9700g離心10-15min ;;上清液 減壓濃縮至料液比（質量/體積）為1:6-1:7 ; 乙醇沉淀：向濃縮液中緩慢加入無水乙醇，邊加邊攪拌，至乙醇含量達到70% -80%， 室溫靜置12-15h，離心去除醇沉上清，收集沉淀； 透析及干燥：沉淀加水溶解，用截留分子量為3500Da透析袋對粗多糖溶液4°C透析 3-4d，將透析后的溶液冷凍干燥，即得杏鮑菇粗多糖。
3. -種制備權利要求1或2所述杏鮑菇下腳料粗多糖的方法，其特征在于其包括如下 步驟： 粗多糖的提?。簩⑿吁U菇下腳料粉碎成納米級別粉末，沸水提取l_2h得到粗多糖提取 液； 乙醇沉淀：粗多糖提取液中加入無水乙醇，至乙醇含量達到70% -80%，室溫靜置 12-15h，收集沉淀； 透析及干燥：將沉淀加水溶解，用截留分子量為3500Da透析袋透析，將透析后的溶液 冷凍干燥，即得杏鮑菇粗多糖。
【文檔編號】C08B37/00GK104059161SQ201410293210
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月25日 優(yōu)先權日:2014年6月25日
【發(fā)明者】張勁松, 薛令坤, 劉艷芳, 唐慶九, 周帥, 楊焱, 吳迪, 顏夢秋, 馮娜, 賈薇, 唐傳紅, 汪雯翰, 馮杰 申請人:上海市農業(yè)科學院