擴(kuò)展真核生物遺傳密碼的制作方法與工藝

擴(kuò)展真核生物遺傳密碼本申請(qǐng)是2004.04.16提交的CN200480015171.6，題為“擴(kuò)展真核生物遺傳密碼”的分案申請(qǐng)。相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)是基于Chin等于2003年4月17日提交的題為“擴(kuò)展真核生物遺傳密碼”的申請(qǐng)USSN60/463,869、Chin等于2003年6月18日提交的題為“擴(kuò)展真核生物遺傳密碼”的申請(qǐng)USSN60/479,931、Chin等于2003年8月5日提交的題為“擴(kuò)展真核生物遺傳密碼”的申請(qǐng)USSN60/493,014和Chin等于2003年8月19日提交的題為“擴(kuò)展真核生物遺傳密碼”的申請(qǐng)USSN60/496,548的常規(guī)用途專利申請(qǐng)。本文據(jù)此要求這些在先申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)和利益。關(guān)于在聯(lián)邦資助的研究和發(fā)展中所作發(fā)明權(quán)利的聲明本發(fā)明在國(guó)立衛(wèi)生研究院基金編號(hào)GM62159的政府資助和能源部基金DE-FG0300ER45812的資助下完成。政府擁有本發(fā)明的一定權(quán)利。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于真核細(xì)胞中的翻譯生物化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及在真核細(xì)胞中生產(chǎn)和組合正交tRNA、正交合成酶和它們配對(duì)的方法。本發(fā)明也涉及非天然氨基酸的組合物、蛋白質(zhì)和在真核細(xì)胞中生產(chǎn)包括非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的方法。發(fā)明背景從細(xì)菌到人類，每個(gè)已知生物的遺傳密碼都編碼了相同的二十個(gè)普通氨基酸。這20個(gè)相同的天然氨基酸的不同組合構(gòu)成蛋白質(zhì)，進(jìn)行實(shí)際上所有的復(fù)雜生命過程，從光合作用到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)。為了研究和修飾蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，科學(xué)家們?cè)噲D操縱遺傳密碼和蛋白質(zhì)的氨基酸序列。但是，難以去除由遺傳密碼強(qiáng)加的限制，即將蛋白質(zhì)限于二十個(gè)遺傳編碼的標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建(除了罕用的硒代半胱氨酸(參見，例如，A.Bock等，(1991)，MolecularMicrobiology5：515-20)和吡咯賴氨酸(參見，例如，G.Srinivasan，等，(2002)，Science296：1459-62)。在消除這些限制方面已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，雖然該進(jìn)展已被限制而且合理控制蛋白結(jié)構(gòu)和功能的能力仍就處于萌芽狀態(tài)。例如，化學(xué)家已經(jīng)開發(fā)了合成和操縱小分子結(jié)構(gòu)的方法和策略(參見，例如，E.J.Corey和X.-M.Cheng，化學(xué)合成的邏輯(TheLogicofChemicalSynthesis)(Wiley-Interscience，NewYork，1995))。全合成(參見，例如，B.Merrifield，(1986)，Science232：341-7(1986))和半合成方法(參見，例如，D.Y.Jackson等，(1994)Science266：243-7和P.E.Dawson和S.B.Kent，(2000)，AnnualReviewofBiochemistry69:923-60)使合成肽和小蛋白成為可能，但是這些方法的使用在超過10千道爾頓(kDa)的蛋白質(zhì)中受到限制。誘變法雖然是強(qiáng)大的，但也限于有限數(shù)量的結(jié)構(gòu)改變。在很多情況下，可能在整個(gè)蛋白質(zhì)中競(jìng)爭(zhēng)性摻入與普通氨基酸接近的結(jié)構(gòu)類似物。參見，例如，R.Furter，(1998)，ProteinScience7：419-26；K.Kirshenbaum,等，(2002)，ChemBioChem3：235-7和V.Doring等，(2001)，Science292：501-4。在嘗試擴(kuò)展操縱蛋白結(jié)構(gòu)和功能的能力中，開發(fā)了用化學(xué)?；籺RNA的體外方法，該方法允許在體外響應(yīng)于無義密碼子將非天然氨基酸選擇性摻入(參見，例如，J.A.Ellman,等，(1992)，Science255：197-200)。將具有新結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)的氨基酸選擇性摻入蛋白中，以研究蛋白折疊和穩(wěn)定性，以及生物分子識(shí)別和催化作用。參見，例如，D.Mendel,等，(1995)，AnnualReviewofBiophysicsandBiomolecularStructure24：435-462和V.W.Cornish,等(1995年3月31日)，AngewChem.Int.Ed.Engl.,34：621-633。然而，該方法的化學(xué)計(jì)量性質(zhì)嚴(yán)重限制了可以產(chǎn)生的蛋白量。將非天然氨基酸顯微注射入細(xì)胞。例如，通過顯微注射化學(xué)錯(cuò)酰化嗜熱四膜蟲tRNA(例如，M.E.Saks,等(1996)，用于通過無義抑制將非天然氨基酸體內(nèi)摻入蛋白質(zhì)中的工程四膜蟲tRNAGln，J.Biol.Chem.271：23169-23175)和相應(yīng)的mRNA將非天然氨基酸引入爪蟾卵母細(xì)胞的煙酰乙酰膽堿受體中(例如，M.W.Nowak,等(1998)，將非天然氨基酸體內(nèi)摻入爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的離子通道中，酶學(xué)方法.293：504-529)。這允許通過引入含有物理或化學(xué)性質(zhì)獨(dú)特的側(cè)鏈氨基酸，對(duì)卵母細(xì)胞內(nèi)的受體進(jìn)行詳細(xì)的生物物理研究。參見，例如，D.A.Dougherty(2000)，作為蛋白結(jié)構(gòu)和功能探針的非天然氨基酸，Curr.Opin.Chem.Biol.4：645-652。不幸的是，該方法限于可顯微注射的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，因?yàn)橄嚓P(guān)的tRNA是體外化學(xué)酰化的，不能再酰化，所以蛋白產(chǎn)率很低。為克服這些限制，將新組分加入原核生物大腸桿菌的蛋白生物合成機(jī)器中(例如，L.Wang，等，(2001)，Science292：498-500)，這允許在體內(nèi)遺傳編碼非天然氨基酸。為響應(yīng)琥珀密碼子TAG，用該方法將具有新化學(xué)、物理或生物學(xué)性質(zhì)的一些新氨基酸，包括光親和標(biāo)記和可光致異構(gòu)的氨基酸、酮基氨基酸和糖基化氨基酸以高保真度有效摻入大腸桿菌的蛋白中。參見，例如，J.W.Chin等，(2002)，JournaloftheAmericanChemicalSociety124：9026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz，(2002)，ChemBioChem11：1135-1137；J.W.Chin,等，(2002)，PNASUnitedStatesofAmerica99：11020-11024：和L.Wang和P.G.Schultz，(2002)，Chem.Comm.，1-10。然而，原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的翻譯機(jī)器并不是高度保守的；因此，加入大腸桿菌的生物合成機(jī)器的組分不能經(jīng)常用來將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性地?fù)饺胝婧思?xì)胞的蛋白中。例如，大腸桿菌中使用的詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶/tRNA對(duì)在真核細(xì)胞中是不正交的。此外，tRNA在真核細(xì)胞中，而非在原核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄是通過RNA聚合酶III進(jìn)行的，這限制了可在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的tRNA結(jié)構(gòu)基因的一級(jí)序列。而且，與原核細(xì)胞相反，真核細(xì)胞中的tRNA需要從轉(zhuǎn)錄它們的細(xì)胞核中輸出至胞質(zhì)，以在翻譯中起作用。最后，真核80S核糖體與70S原核核糖體不同。因此，需要開發(fā)改進(jìn)的生物合成機(jī)器組件，以擴(kuò)展真核生物遺傳密碼。本發(fā)明滿足了這些和其它需要，這在下面公開的綜述中顯而易見。發(fā)明概要本發(fā)明提供了具有翻譯組件的真核細(xì)胞，例如，正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)對(duì)和正交tRNA(O-tRNA)，及它們的個(gè)別組件，它們用于真核蛋白生物合成機(jī)器，在真核細(xì)胞中將非天然氨基酸摻入生長(zhǎng)的多肽鏈中。本發(fā)明組合物包括含有正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)(例如，來源于非真核生物，如大腸桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等)的真核細(xì)胞(例如，酵母細(xì)胞(如釀酒酵母細(xì)胞)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等)，其中O-RS在真核細(xì)胞中優(yōu)選地氨酰化具有至少一個(gè)非天然氨基酸的正交tRNA(O-tRNA)。任選地，在給定真核細(xì)胞中可以氨?；瘍煞N或多種OtRNA。在一個(gè)方面，O-RS氨?；纾辽?0%、至少45%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、或甚至90%或更多的具有非天然氨基酸的O-tRNA，與具有氨基酸序列，如SEQIDNO.：86或45中所列序列的O-RS一樣有效。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的O-RS氨?；哂蟹翘烊话被岬腛-tRNA，比O-RS氨?；哂刑烊话被岬腛-tRNA的效率高例如，至少10倍、至少20倍、至少30倍等。在一個(gè)實(shí)施方式中，SEQIDNO.：3-35(例如，3-19、20-35或序列3-35的任何其它亞組)中所列任一個(gè)多核苷酸序列，或與其互補(bǔ)的多核苷酸序列編碼了O-RS或它的一部分。在另一實(shí)施方式中，O-RS包含了SEQIDNO.：36-63(例如，36-47、48-63或36-63的任何其它亞組)和/或86，或其保守變異的氨基酸序列。在另一實(shí)施方式中，O-RS包含氨基酸序列，即與天然產(chǎn)生的酪氨酰氨?；?tRNA合成酶(TyrRS)例如、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%或更多相同，并包含來自A-E族的兩種或多種氨基酸。A族包括與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對(duì)應(yīng)位置上的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸或蘇氨酸。B族包括與大腸桿菌TyrRS的Asn126相對(duì)應(yīng)位置上的天冬氨酸。C族包括與大腸桿菌TyrRS的Asp182相對(duì)應(yīng)位置上的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸、天冬酰胺或甘氨酸。D族包括與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對(duì)應(yīng)位置上的甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸或酪氨酸；E族包括與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對(duì)應(yīng)位置上的絲氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸或丙氨酸。任何這些族組合的亞組是本發(fā)明的特征。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，O-RS具有兩種或多種選自與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對(duì)應(yīng)位置上出現(xiàn)的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、或蘇氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Asp182相對(duì)應(yīng)位置上的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸、或甘氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對(duì)應(yīng)位置上的甲硫氨酸、或酪氨酸；和與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對(duì)應(yīng)位置上的絲氨酸、或丙氨酸的氨基酸。在另一實(shí)施方式中，O-RS包括兩種或多種選自與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對(duì)應(yīng)位置上的甘氨酸、絲氨酸、或丙氨酸，與大腸桿菌TyrRS的Asnl26相對(duì)應(yīng)位置上的天冬氨酸，與大腸桿菌TyrRS的Aspl82相對(duì)應(yīng)位置上的天冬酰胺，與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對(duì)應(yīng)位置上的丙氨酸或纈氨酸和/或和與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對(duì)應(yīng)位置上的甲硫氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、或蘇氨酸。在另一實(shí)施方式中，與天然氨基酸相比，O-RS對(duì)于非天然氨基酸具有一種或多種改進(jìn)或增強(qiáng)的酶性質(zhì)。例如，與天然氨基酸相比對(duì)非天然氨基酸的改進(jìn)或增強(qiáng)的性質(zhì)包括，例如，較高km、較低km、較高kcat、較低kcat、較低kcat/km、較高kcat/km等的任意一種。真核細(xì)胞也任選地包括非天然氨基酸。真核細(xì)胞任選地包括正交tRNA(O-tRNA)(例如，來自非真核生物，如大腸桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌和/或類似物)，其中O-tRNA識(shí)別選擇密碼子，并優(yōu)選地由O-RS氨酰化具有非天然氨基酸的O-tRNA。在一個(gè)方面，O-tRNA介導(dǎo)非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)中，其效率相當(dāng)于包含SEQIDNO.：65中所列多核苷酸序列或在該序列的細(xì)胞中加工的tRNA效率的例如，至少45%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或99%。在另一方面，O-tRNA包含SEQIDNO.：65的序列，O-RS包含選自SEQIDNO.：36-63(例如，36-47、48-63或36-63的任何其它亞組)和/或86和/或它們的保守變異中任意一個(gè)所列氨基酸序列的多肽序列。在另一實(shí)施方式中，真核細(xì)胞包含含有編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸，其中多核苷酸包含O-tRNA識(shí)別的選擇密碼子。在一個(gè)方面，包含非天然氨基酸的感興趣多肽的產(chǎn)率是從多核苷酸缺少選擇密碼子的細(xì)胞中獲得的天然產(chǎn)生的感興趣多肽的例如，至少2.5%、至少5%、至少10%、至少25%、至少30%、至少40%、50%或更多。在另一方面，細(xì)胞在沒有非天然氨基酸的情況下生產(chǎn)感興趣多肽的產(chǎn)率是在有非天然氨基酸的情況下多肽產(chǎn)率的例如，小于35%、小于30%、小于20%、小于15%、小于10%、小于5%、小于2.5%等。本發(fā)明也提供包含正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)、正交tRNA(O-tRNA)、非天然氨基酸和含有編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸的真核細(xì)胞。多核苷酸包含O-tRNA識(shí)別的選擇密碼子。此外，在真核細(xì)胞中O-RS優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的正交tRNA(O-tRNA)，細(xì)胞在沒有非天然氨基酸的情況下生產(chǎn)感興趣多肽的產(chǎn)率是在有非天然氨基酸的情況下多肽產(chǎn)率的例如，小于30%、小于20%、小于15%、小于10%、小于5%、小于2.5%等。包括含有正交tRNA(O-tRNA)的真核細(xì)胞的組合物也是本發(fā)明的特征。一般地，O-tRNA在體內(nèi)介導(dǎo)非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)中，該蛋白質(zhì)通過含有O-tRNA識(shí)別的選擇密碼子的多核苷酸編碼。在一個(gè)實(shí)施方式中，O-tRNA介導(dǎo)非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)中，其效率相當(dāng)于包含SEQIDNO.：65中所列多核苷酸序列或在該序列的細(xì)胞中加工的tRNA效率的例如，至少45%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或甚至99%或更高。在另一實(shí)施方式中，O-tRNA包含SEQIDNO.：65中所列的多核苷酸序列或它的保守變異，或從該序列加工而來。在另一實(shí)施方式中，O-tRNA包含可循環(huán)的O-tRNA。在本發(fā)明的一個(gè)方面，O-tRNA是轉(zhuǎn)錄后修飾的。本發(fā)明也提供在真核細(xì)胞中編碼O-tRNA的核酸或它的互補(bǔ)多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸包含A框和B框。本發(fā)明也表征了生產(chǎn)翻譯組件的方法，例如，O-RSs或O-tRNA/O-RS對(duì)(和這些方法生產(chǎn)的翻譯組件)。例如，本發(fā)明提供了生產(chǎn)正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)的方法，該酶在真核細(xì)胞中優(yōu)選地氨?；哂蟹翘烊话被岬恼籺RNA。該方法包括，例如，將第一種類的生物真核細(xì)胞的群體在非天然氨基酸存在下進(jìn)行正選擇，其中各真核細(xì)胞包含：i)氨?；?tRNA合成酶(RS)文庫(kù)的一員、ii)正交tRNA(O-tRNA)、iii)編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸和iv)編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸；其中在正選擇下存活的細(xì)胞包含在非天然氨基酸存在下氨?；籺RNA(O-tRNA)的活性RS。在沒有非天然氨基酸的情況下將在正選擇下存活的細(xì)胞進(jìn)行負(fù)選擇，以去除氨酰化具有天然氨基酸的O-tRNA的活性RS。這提供了優(yōu)選地氨?；哂蟹翘烊话被岬腛-tRNA的O-RS。在某些實(shí)施方式中，將編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸可操作地連接到效應(yīng)元件上，細(xì)胞還包括a)編碼從效應(yīng)元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白(例如，真核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白等)和b)包含至少一種選擇密碼子的的多核苷酸。通過氨?；哂蟹翘烊话被岬腛-tRNA將非天然氨基酸摻入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白中導(dǎo)致正選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白是轉(zhuǎn)錄激活蛋白(例如，GAL4等)，選擇密碼子是琥珀終止密碼子，例如，其中琥珀終止密碼子位于或基本上接近編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白的DNA結(jié)合域的部分多核苷酸。正選擇標(biāo)記可以是各種分子中任意一種。在一個(gè)實(shí)施方式中，正選擇標(biāo)記包含生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，在缺少營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇。在另一實(shí)施方式中，編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸是例如，ura3、leu2、lys2、lacZ基因、his3(例如，其中his3基因編碼咪唑甘油磷酸脫氫酶，由提供的3-氨基三唑(3-AT)和/或類似物檢測(cè)。在另一實(shí)施方式中，編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸包含選擇密碼子。如同正選擇標(biāo)記一樣，負(fù)選擇標(biāo)記也可以是各種分子中任意一種。在某些實(shí)施方式中，編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸可操作地連接到效應(yīng)元件上，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白從效應(yīng)元件介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。通過氨?；哂刑烊话被岬腛-tRNA將天然氨基酸摻入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白中導(dǎo)致負(fù)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸是例如，ura3基因，負(fù)選擇在含有5-氟乳清酸(5-FOA)的培養(yǎng)基中完成。在另一實(shí)施方式中，用于負(fù)選擇的培養(yǎng)基包含可以被負(fù)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)物質(zhì)的選擇劑或篩選劑。在本發(fā)明的一個(gè)方面，可檢測(cè)物質(zhì)是有毒物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸包括選擇密碼子。在某些實(shí)施方式中，正選擇標(biāo)記和/或負(fù)選擇標(biāo)記包含在合適反應(yīng)物的存在下使發(fā)光反應(yīng)發(fā)熒光或催化發(fā)光反應(yīng)的多肽。在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)或通過發(fā)光檢測(cè)正選擇標(biāo)記和/或負(fù)選擇標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，正選擇標(biāo)記和/或負(fù)選擇標(biāo)記包含基于親和力的篩選標(biāo)記或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，同一多核苷酸編碼正選擇標(biāo)記和負(fù)選擇標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明正選擇標(biāo)記和/或負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸可以包含至少兩個(gè)選擇密碼子，各自或兩者可以包含至少兩個(gè)不同的選擇密碼子或至少兩個(gè)相同的選擇密碼子。選擇/篩選嚴(yán)格性的附加水平也可用于本發(fā)明方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，方法可包括，例如，在步驟(a)、(b)或(a)和(b)提供數(shù)量不等的失活合成酶，其中數(shù)量不等的失活合成酶提供附加水平的選擇或篩選嚴(yán)格性。在一個(gè)實(shí)施方式中，本方法用于生產(chǎn)O-RS的步驟(a)，(b)或步驟(a)和(b)包括不同的選擇或篩選嚴(yán)格性，例如，正和/或負(fù)選擇標(biāo)記的嚴(yán)格性。該方法任選地包括將優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的O-tRNA的O-RS進(jìn)行附加選擇輪，例如，附加正選擇輪、附加負(fù)選擇輪或附加正和負(fù)選擇輪的組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，選擇/篩選包括一種或多種正或負(fù)選擇/篩選，它們選自，例如，氨基酸通透性的改變，翻譯效率的改變，翻譯保真度的改變等。一種或多種改變是基于編碼正交tRNA-tRNA合成酶對(duì)的組件的一種或多種多核苷酸中的突變被用來生產(chǎn)蛋白。一般地，RS文庫(kù)(例如，突變體RS文庫(kù))包含來自至少一種例如，來自非真核生物的氨酰基-tRNA合成酶(RS)的RS。在一個(gè)實(shí)施方式中，RS文庫(kù)來自失活的RS，例如，其中失活RS通過突變活性RS而產(chǎn)生。在另一實(shí)施方式中，失活RS包含氨基酸結(jié)合口袋和一個(gè)或多個(gè)含有用一種或多種不同氨基酸取代結(jié)合口袋的氨基酸，例如，取代的氨基酸用丙氨酸取代。在某些實(shí)施方式中，生產(chǎn)O-RS的方法還包括在編碼RS的核酸上進(jìn)行隨機(jī)突變、位點(diǎn)特異性突變、重組、嵌合構(gòu)建或它們的任意組合，因此產(chǎn)生突變體RS文庫(kù)。在某些實(shí)施方式中，該方法還包括，例如，(c)分離編碼O-RS的核酸；(d)從核酸中產(chǎn)生一組編碼突變O-RS的多核苷酸(例如，通過隨機(jī)誘變、位點(diǎn)特異性誘變、嵌合構(gòu)建、重組或它們的任意組合)；和(e)重復(fù)步驟(a)和/或(b)，直到獲得優(yōu)選地氨?；哂蟹翘烊话被岬腛-tRNA的突變O-RS。在本發(fā)明的一個(gè)方面，步驟(c)-(e)至少進(jìn)行兩次。生產(chǎn)O-tRNA/O-RS對(duì)的方法也是本發(fā)明的特征。在一個(gè)實(shí)施方式中，如上所述地獲得O-RS，通過將第一種類的真核細(xì)胞的群體進(jìn)行負(fù)選擇獲得O-tRNA，其中真核細(xì)胞包括tRNA文庫(kù)的一員，以去除包含被對(duì)真核細(xì)胞內(nèi)源性氨?；?tRNA合成酶(RS)氨?；膖RNA文庫(kù)的一員的細(xì)胞。這提供了與第一種類的真核細(xì)胞正交的tRNA庫(kù)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，tRNA文庫(kù)包含來自至少一種例如，來自非真核生物的tRNA的tRNA。在本發(fā)明的另一方面，氨酰基-tRNA合成酶(RS)文庫(kù)包括來自至少一種例如，來自非真核生物的氨?；?tRNA合成酶(RS)的RS。在本發(fā)明的另一方面，tRNA文庫(kù)包括來自至少一種來自第一種非真核生物的tRNA的tRNAs。氨?；?tRNA合成酶(RS)文庫(kù)任選地包含來自至少一種來自第二種非真核生物的氨?；?tRNA合成酶(RS)的RS。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一種和第二種非真核生物是相同的。另外，第一種和第二種非真核生物可以是不同的。通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的特異性O(shè)-tRNA/O-RS對(duì)也是本發(fā)明的特征。本發(fā)明的另一特征是在一種類中生產(chǎn)翻譯組件和將選擇/篩選的翻譯組件引入第二種類的方法。例如，在第一種類(例如，真核生物，如酵母等)中生產(chǎn)O-tRNA/O-RS對(duì)的方法還包括將編碼O-tRNA的核酸和編碼O-RS的核酸引入第二種類的真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物、昆蟲、真菌、藻類、植物等)。第二種類可以在體內(nèi)用引入的翻譯組件將非天然氨基酸摻入生長(zhǎng)的多肽鏈中，例如，在翻譯過程中。在另一實(shí)施例中，生產(chǎn)在真核細(xì)胞中優(yōu)選地氨?；哂蟹翘烊话被岬恼籺RNA的正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)的方法包括：(a)在非天然氨基酸存在下對(duì)第一種類的真核細(xì)胞群體(例如，真核生物，如酵母或類似物)進(jìn)行正選擇。各第一種類的真核細(xì)胞包括：i)氨酰基-tRNA合成酶(RS)文庫(kù)的一員，ii)正交tRNA(O-tRNA)，iii)編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸，和iv)編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸。能夠在正選擇下存活的細(xì)胞包含在非天然氨基酸存在下氨?；籺RNA(O-tRNA)的活性RS。將在正選擇下存活的細(xì)胞在沒有非天然氨基酸的情況下進(jìn)行負(fù)選擇，以去除氨?；哂刑烊话被岬腛-tRNA的活性RS，因此提供優(yōu)選地氨?；哂蟹翘烊话被岬腛-tRNA的O-RS。將編碼O-tRNA的核酸和編碼O-RS的核酸引入第二種類的真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物、昆蟲、真菌、藻類、植物和/或類似物)。當(dāng)這些組件在第二種類中翻譯時(shí)，這些組件可以用來將非天然氨基酸摻入第二種類中感興趣的蛋白或多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，將O-tRNA和/或O-RS引入第二種類的生物真核細(xì)胞中。在某些實(shí)施方式中，通過將第一種類真核細(xì)胞的群體進(jìn)行負(fù)選擇獲得O-tRNA，其中真核細(xì)胞包含tRNA文庫(kù)的一員，以去除被對(duì)真核細(xì)胞內(nèi)源性氨?；?tRNA合成酶(RS)氨?；膖RNA文庫(kù)的一員的細(xì)胞。這提供了與第一種類和第二種類的真核細(xì)胞正交的tRNA庫(kù)。在一個(gè)方面，本發(fā)明包括含有一種蛋白的組合物，其中該蛋白包含至少一種非天然氨基酸和至少一個(gè)翻譯后修飾，其中至少一個(gè)翻譯后修飾是將含有第二活性基團(tuán)的分子通過[3+2]環(huán)加成附著到含有第一活性基團(tuán)的至少一種非天然氨基酸上。因此，具有至少一種非天然氨基酸的蛋白(或感興趣多肽)也是本發(fā)明的特征。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，具有至少一種非天然氨基酸的蛋白包括至少一個(gè)翻譯后修飾。在一個(gè)實(shí)施方式中，至少一個(gè)翻譯后修飾是將含有第二活性基團(tuán)的分子(例如，染料、聚合物如聚乙二醇的衍生物、光交聯(lián)劑、細(xì)胞毒化合物、親和標(biāo)記、生物素的衍生物、樹脂、第二種蛋白或多肽、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸(例如、DNA、RNA等)等)通過[3+2]環(huán)加成附著到含有第一活性基團(tuán)的至少一種非天然氨基酸上。例如，第一活性基團(tuán)是炔基部分(例如，非天然氨基酸中對(duì)-炔丙基氧基苯丙氨酸)(該基團(tuán)有時(shí)也稱為乙炔部分)，第二活性基團(tuán)是疊氮基部分。在另一個(gè)實(shí)施例中，第一活性基團(tuán)是疊氮基部分(例如，非天然氨基酸中對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸)，第二活性基團(tuán)是炔基部分。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的蛋白包括至少一種含有至少一個(gè)翻譯后修飾的非天然氨基酸(例如，酮式非天然氨基酸)，其中至少一個(gè)翻譯后修飾是糖部分。在某些實(shí)施方式中，在真核細(xì)胞中體內(nèi)進(jìn)行翻譯后修飾。在某些實(shí)施方式中，蛋白包括至少一個(gè)通過真核細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行的翻譯后修飾，其中翻譯后修飾并不是通過原核細(xì)胞進(jìn)行的。翻譯后修飾的例子包括但不限于乙酰化、?；?、脂質(zhì)-修飾、棕櫚?；?、棕櫚酸酯加成、磷酸化、糖脂-連接修飾等。在一個(gè)實(shí)施方式中，翻譯后修飾包括將寡糖通過GlcNAc-天冬酰胺連接附著到天冬酰胺上(例如，其中寡糖包括(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等)。在另一實(shí)施方式中，翻譯后修飾是將寡糖(例如，Gal-GalNAc，Gal-GlcNAc等)通過GalNAc-絲氨酸、GalNAc-蘇氨酸、GlcNAc-絲氨酸或GlcNAc-蘇氨酸連接附著到絲氨酸或蘇氨酸上。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的蛋白或多肽可包含分泌或定位序列、表位標(biāo)記、FLAG標(biāo)記、聚組氨酸標(biāo)記、GST融合蛋白和/或類似物。一般地，蛋白與任意可用蛋白(例如，治療蛋白、診斷蛋白、工業(yè)酶或它們的一部分和/或類似物)的例如，至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或甚至至少99%或更多相同，它們包含一種或多種非天然氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物包括感興趣的蛋白或多肽和賦形劑(例如，緩沖液、藥學(xué)上可接受的賦形劑等)。感興趣的蛋白或多肽可含有至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)、至少九個(gè)、或十個(gè)或更多非天然氨基酸。非天然氨基酸可以是相同或不同的，例如，在包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同的非天然氨基酸的蛋白中可以有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)天然產(chǎn)生形式中存在的至少一種，但少于全部的具體氨基酸被非天然氨基酸取代。一種蛋白(或感興趣多肽)的例子包括但不限于，例如，細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子受體、干擾素、白介素、炎癥分子、癌基因產(chǎn)物、肽激素、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、甾類激素受體、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、胰島素、人生長(zhǎng)激素、α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗體、載脂蛋白、脫輔蛋白質(zhì)、心鈉素、心房鈉尿多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降鈣素、c-kit配體、細(xì)胞因子、CC趨化因子、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-2、單核細(xì)胞趨化蛋白-3、單核細(xì)胞炎癥蛋白-1α、單核細(xì)胞炎癥蛋白-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配體、C-kit配體、膠原、集落刺激因子(CSF)、補(bǔ)體因子5a、補(bǔ)體抑制劑、補(bǔ)體受體1、細(xì)胞因子、DHFR、上皮嗜中性粒細(xì)胞激活肽-78、GROα/MGSA、GROβ、GROγ、MIP-lα、MIP-1δ、MCP-1、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、上皮嗜中性粒細(xì)胞激活肽、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、剝脫性毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、纖維蛋白原、纖連蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺素、生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子受體、Hedgehog蛋白、血紅蛋白、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、胰島素-樣生長(zhǎng)因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干擾素、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白介素、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、乳鐵蛋白、白血病抑制因子、熒光素酶、Neurturin、嗜中性粒細(xì)胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因產(chǎn)物、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、人生長(zhǎng)激素、多效營(yíng)養(yǎng)因子、蛋白A、蛋白G、熱源性外毒素A、B或C、松弛素、腎素、SCF、可溶性補(bǔ)體受體I、可溶性I-CAM1、可溶性白介素受體、可溶性TNF受體、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、促生長(zhǎng)素抑制素、促生長(zhǎng)素、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、甾類激素受體、超氧化物歧化酶(SOD)、中毒性休克綜合征毒素、胸腺素α1、組織纖溶酶原激活物、腫瘤生長(zhǎng)因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGEF)、尿激酶、Mos、Ras、Raf、Met；p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、雌激素受體、孕酮受體、睪酮受體、醛固酮受體、LDL受體、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-1、ICAM-l/LFA-1、透明質(zhì)酸苷(hyalurin)/CD44、皮質(zhì)酮、Genebank或其它可用數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的蛋白等，和/或它們的一部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，感興趣多肽包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白(例如，轉(zhuǎn)錄激活蛋白(如GAL4)，或轉(zhuǎn)錄抑制蛋白等)或它們的一部分。真核細(xì)胞中的GAL4蛋白或其部分的組合物也是本發(fā)明的特征。一般地，GAL4蛋白或其一部分包含至少一種非天然氨基酸。本發(fā)明的真核細(xì)胞提供了合成含大有用量非天然氨基酸的蛋白的能力。例如，生產(chǎn)含有非天然氨基酸的蛋白在細(xì)胞抽提物、緩沖液、藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或類似物中的蛋白濃度是，例如，至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升、或至少500微克/升或更高。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物包括，例如，至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、或至少500微克或更多含有非天然氨基酸的蛋白。在某些實(shí)施方式中，核酸編碼感興趣的蛋白或多肽(或它們的一部分)。一般地，該核酸包含至少一個(gè)選擇密碼子、至少兩個(gè)選擇密碼子、至少三個(gè)選擇密碼子、至少四個(gè)選擇密碼子、至少五個(gè)選擇密碼子、至少六個(gè)選擇密碼子、至少七個(gè)選擇密碼子、至少八個(gè)選擇密碼子、至少九個(gè)選擇密碼子、或甚至十個(gè)或更多選擇密碼子。本發(fā)明也提供在真核細(xì)胞中生產(chǎn)至少一種含有至少一個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)(以及用這種方法生產(chǎn)的蛋白)的方法。方法包括，例如，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有一種核酸的真核細(xì)胞，該核酸包含至少一個(gè)選擇密碼子并編碼該蛋白。真核細(xì)胞也含有細(xì)胞中有功能且能識(shí)別選擇密碼子的正交tRNA(O-tRNA)，以及優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的O-tRNA的正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)，培養(yǎng)基含有非天然氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，O-RS氨酰化具有非天然氨基酸的O-tRNA相當(dāng)于具有如SEQIDNO.：86或45中所列氨基酸序列的O-RS的效率的例如，至少45%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或甚至99%或更高。在另一實(shí)施方式中，O-tRNA包括SEQIDNO.：64或65或其互補(bǔ)多核苷酸序列，或從該序列加工而來，或由該序列編碼。在另一實(shí)施方式中，O-RS包含SEQIDNO.：36-63(例如，36-47、48-63或36-63的任意其它亞組)和/或86中任一個(gè)所列氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法還包括將非天然氨基酸摻入該蛋白中，其中非天然氨基酸包含第一活性基團(tuán)；并將該蛋白與含有第二活性基團(tuán)的分子(例如，染料、聚合物、例如、聚乙二醇的衍生物、光交聯(lián)劑、細(xì)胞毒化合物、親和標(biāo)記、生物素的衍生物、樹脂、第二種蛋白或多肽、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸(例如、DNA、RNA等)等)接觸。第一活性基團(tuán)與第二活性基團(tuán)反應(yīng)，將該分子通過[3+2]環(huán)加成附著到非天然氨基酸上。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一活性基團(tuán)是炔基或疊氮基部分，第二活性基團(tuán)是疊氮基或炔基部分。例如，第一活性基團(tuán)是炔基部分(例如，非天然氨基酸中對(duì)-炔丙基氧基苯丙氨酸)，第二活性基團(tuán)是疊氮基部分。在另一實(shí)施例中，第一活性基團(tuán)是疊氮基部分(例如，非天然氨基酸中對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸)，第二活性基團(tuán)是炔基部分.在某些實(shí)施方式中，編碼蛋白包含治療蛋白、診斷蛋白、工業(yè)酶或它們的一部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過非天然氨基酸進(jìn)一步修飾該方法生產(chǎn)的蛋白。例如，通過如親核-親電子反應(yīng)，經(jīng)由[3+2]環(huán)加成等修飾非天然氨基酸。在另一實(shí)施方式中，通過至少一個(gè)翻譯后修飾(例如，N-糖基化，O-糖基化，乙?；?，?；?，脂質(zhì)-修飾，棕櫚?；?，棕櫚酸酯加成，磷酸化，糖脂-連接修飾等)體內(nèi)修飾該方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。也提供了生產(chǎn)篩選或選擇轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的方法(以及用這種方法生產(chǎn)的篩選或選擇轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白)。方法包括，例如，選擇第一個(gè)多核苷酸序列，其中多核苷酸序列編碼核酸結(jié)合域；將第一個(gè)多核苷酸序列突變，以包括至少一種選擇密碼子。這提供了篩選或選擇多核苷酸序列。方法也包括，例如，選擇第二個(gè)多核苷酸序列，其中第二個(gè)多核苷酸序列編碼轉(zhuǎn)錄激活域；提供構(gòu)建物，它包含可操作地連接于第二個(gè)多核苷酸序列的篩選或選擇多核苷酸序列；和，將構(gòu)建物非天然氨基酸、正交tRNA合成酶(O-RS)和正交tRNA(O-tRNA)引入細(xì)胞。用這些組件，響應(yīng)于篩選或選擇多核苷酸序列中的選擇密碼子，O-RS優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的O-tRNA，O-tRNA識(shí)別選擇密碼子并將非天然氨基酸摻入核酸結(jié)合域中。這提供了篩選或選擇轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物和方法包括真核細(xì)胞。本發(fā)明的真核細(xì)胞包括，例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等的任意一種。本發(fā)明的翻譯組件可以來自各種生物，例如，非真核生物，如原核生物(例如，大腸桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌等)，或古細(xì)菌，或例如，真核生物。本發(fā)明的選擇密碼子擴(kuò)展了真核蛋白生物合成機(jī)器的遺傳密碼子構(gòu)架。本發(fā)明中可以使用各種選擇密碼子的任意一種，包括終止密碼子(例如，琥珀密碼子、赭石密碼子或乳白終止密碼子)、無義密碼子、罕用密碼子、四(或更多)堿基密碼子和/或類似物?？捎糜诒疚拿枋龅慕M合物和方法的非天然氨基酸的例子包括(但不限于)：對(duì)-乙酰基-L-苯丙氨酸、對(duì)-碘代-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、對(duì)-炔丙基氧基苯丙氨酸、對(duì)-炔丙基-苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-氧-乙?；?GlcNAcβ-絲氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸、對(duì)-酰基-L-苯丙氨酸、對(duì)-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦?；z氨酸、膦?；野彼帷?duì)-溴苯丙氨酸、對(duì)-氨基-L-苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、酪氨酸氨基酸的非天然類似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然類似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然類似物；絲氨酸氨基酸的非天然類似物；蘇氨酸氨基酸的非天然類似物；烷基、芳基、?；?、疊氮基、氰基、鹵素、肼、酰肼、羥基、鏈烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒、酯、硫代酸、硼酸、硼酸鹽、磷酰基、膦酰基、膦、雜環(huán)、烯酮、亞胺、醛、羥胺、酮基或氨基取代的氨基酸或它們的任意組合；具有可光敏化的交聯(lián)劑的氨基酸；自旋標(biāo)記的氨基酸；熒光氨基酸；金屬結(jié)合氨基酸；含金屬的氨基酸；放射性氨基酸；光籠蔽(photocaged)和/或可光致異構(gòu)的氨基酸；含有生物素或生物素-類似物的氨基酸；含酮氨基酸；含有聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化學(xué)切割或可光切割的氨基酸；具有延長(zhǎng)側(cè)鏈的氨基酸；含有毒基團(tuán)的氨基酸；糖取代的氨基酸；含有碳-連接糖的氨基酸；具有氧化還原活性的氨基酸；含α-羥基的酸；氨基硫代酸；α,α雙取代的氨基酸；β-氨基酸；除脯氨酸或組氨酸外的環(huán)氨基酸，除苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸外的芳族氨基酸，和/或類似物。本發(fā)明也提供多肽(O-RS)和多核苷酸，例如，0-tRNA，編碼O-RS或其一部分(例如，合成酶的活性位點(diǎn))的多核苷酸，用于構(gòu)建氨酰基-tRNA合成酶突變體的寡核苷酸，編碼含有一種或多種選擇密碼子的感興趣的蛋白或多肽的多核苷酸等。例如，本發(fā)明的多肽包括包含SEQIDNO.：36-63(例如，36-47、48-63或36-63的任意其它亞組)和/或86中任一個(gè)所列氨基酸序列的多肽，包含由SEQIDNO.：3-35(例如，3-19、20-35或序列3-35的任何其它亞組)中任一個(gè)所列多核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽，和具有抗體特異免疫活性的多肽，該抗體對(duì)包含SEQIDNO.：36-63(例如，36-47、48-63或36-63的任意其它亞組)和/或86中任一個(gè)所列氨基酸序列的多肽或包含SEQIDNO.：3-35(例如，3-19、20-35或序列3-35的任何其它亞組)中任一所列多核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽特異。本發(fā)明的多肽也包括與天然產(chǎn)生的酪氨酰氨?；?tRNA合成酶(TyrRS)(例如，SEQIDNO.：2)具有至少90%相同氨基酸序列的多肽，和包含A-E族(上述)中兩種或多種氨基酸的多肽。類似地，本發(fā)明多肽也任選地包括含有SEQIDNO.：36-63(例如，36-47、48-63或36-63的任意其它亞組)和/或86中任意一個(gè)的至少20個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽，和如A-E族中所述的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。含有任一上述多肽的保守變異的氨基酸序列也作為本發(fā)明的多肽包括在內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物包括本發(fā)明的多肽和賦形劑(例如，緩沖液、水、藥學(xué)上可接受的賦形劑等)。本發(fā)明也提供與本發(fā)明多肽具有特異免疫活性的抗體或抗血清。本發(fā)明中也提供了多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸包括那些用一種或多種選擇密碼子編碼本發(fā)明感興趣的蛋白或多肽的多核苷酸。此外，本發(fā)明的多核苷酸包括，例如，含有SEQIDNO.：3-35(例如，3-19、20-35或序列3-35的任意其它亞組)、64-85中任意一個(gè)所列核苷酸序列的多核苷酸；與該多核苷酸序列互補(bǔ)或編碼該多核苷酸序列的多核苷酸；和/或編碼含有SEQIDNO.：36-63(例如，36-47、48-63或36-63的任意其它亞組)和/或86中任意一個(gè)所列氨基酸序列或其保守變異的多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸也包括編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。類似地，在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與上述多核苷酸基本上全長(zhǎng)雜交的核酸是本發(fā)明的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸也包括編碼多肽的多核苷酸，該多肽包含與天然產(chǎn)生的酪氨酰氨?；?tRNA合成酶(TyrRS)(例如，SEQIDNO.：2)至少90%相同的氨基酸序列，和包含A-E族(上述)中兩個(gè)或多個(gè)突變。與上述多核苷酸和/或含有任一上述多核苷酸的保守變異的多核苷酸至少70%(或至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%或更多)相同的多核苷酸也包括在本發(fā)明的多核苷酸中。在某些實(shí)施方式中，載體(例如，質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等)包含本發(fā)明的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，載體是表達(dá)載體。在另一實(shí)施方式中，表達(dá)載體包括可操作地連接于一種或多種本發(fā)明的多核苷酸的啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方式中，細(xì)胞含有包括本發(fā)明的多核苷酸的載體。在另一方面，本發(fā)明提供了化合物的組合物和生產(chǎn)所述化合物的方法。例如，化合物包括，例如，非天然氨基酸(如對(duì)-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸(例如，圖11中的1)，疊氮基染料(如化學(xué)結(jié)構(gòu)4和化學(xué)結(jié)構(gòu)6中所示)，炔基聚乙二醇(例如化學(xué)結(jié)構(gòu)7中所示)，其中n是例如，50和10,000、75和5,000、100和2,000、100和1,000等之間的整數(shù)等。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，炔基聚乙二醇的分子量為，例如約5,000至約100,000Da、約20,000至約50,000Da、約20,000至約10,000Da(例如，20,000Da)。也提供了含有這些化合物的各種組合物，例如，具有蛋白質(zhì)和細(xì)胞。在一個(gè)方面，組合物包括對(duì)-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸，還包括正交tRNA?？蓪⒎翘烊话被峤Y(jié)合到(例如，以共價(jià)方式)正交tRNA，例如，通過氨基-?；I共價(jià)結(jié)合到正交tRNA，共價(jià)結(jié)合到正交tRNA的末端核糖的3'OH或2'OH等。在本發(fā)明的一個(gè)方面，含有疊氮基染料的蛋白質(zhì)(例如，化學(xué)結(jié)構(gòu)4或化學(xué)結(jié)構(gòu)6)還包括至少一種非天然氨基酸(例如，炔氨基酸)，其中疊氮基染料通過[3+2]環(huán)加成附著到非天然氨基酸上。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種蛋白含有化學(xué)結(jié)構(gòu)7的炔基聚乙二醇。在另一實(shí)施方式中，該組合物還包括至少一種非天然氨基酸(例如，疊氮基氨基酸)，其中炔基聚乙二醇通過[3+2]環(huán)加成附著到非天然氨基酸上。本發(fā)明中包括了合成各種化合物的方法。例如，提供了合成對(duì)-(炔丙基氧基)苯丙氨酸化合物的方法。例如，該方法包括(a)將N-叔-丁氧基羰基-酪氨酸和K2C03懸浮在無水DMF中；(b)將炔丙基溴加入(a)的反應(yīng)混合物中，烷化羥基和羧基基團(tuán)，產(chǎn)生具有下述結(jié)構(gòu)的保護(hù)中間化合物：和(c)將保護(hù)中間化合物與無水HC1在MeOH中混合，使胺部分去保護(hù)，從而合成對(duì)-(炔丙基氧基)苯丙氨酸化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法還包括(d)將對(duì)-(炔丙基氧基)苯丙氨酸HCl溶解于NaOH和MeOH溶液中，室溫?cái)嚢瑁?e)將pH調(diào)整到7；和(f)沉淀對(duì)-(炔丙基氧基)苯丙氨酸化合物。也提供了合成疊氮基染料的方法。例如，方法包括：(a)提供含有磺?；u化物部分的染料化合物；(b)在3-疊氮基丙胺和三乙胺的存在下將染料化合物加熱到室溫，將3-疊氮基丙胺的胺部分偶聯(lián)到染料化合物的鹵素位置，從而合成疊氮基染料。在一個(gè)實(shí)施方式中，該染料化合物含有丹磺酰氯，疊氮基染料含有化學(xué)結(jié)構(gòu)4的組合物。在一個(gè)方面，該方法還包括從反應(yīng)混合物中純化疊氮基染料。在另一實(shí)施例中，合成疊氮基染料的方法包括(a)提供含胺染料化合物；(b)將含胺染料化合物與碳二亞胺和4-(3-疊氮基丙基氨基甲?；?-丁酸在合適的溶劑中混合，將酸的羰基與染料化合物的胺部分偶聯(lián)，從而合成疊氮基染料。在一個(gè)實(shí)施方式中，碳二亞胺包括1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)。在一個(gè)方面，含胺染料包括熒光胺(fluoresceinamine)，合適的溶劑包括吡啶。例如，含胺染料包括熒光胺，疊氮基染料包括化學(xué)結(jié)構(gòu)6的組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法還包括(c)沉淀疊氮基染料；(d)用HC1洗滌沉淀；(e)將洗滌過的沉淀溶解在EtOAc中；和(f)在己烷中沉淀疊氮基染料。也提供了合成炔丙基酰胺聚乙二醇的方法。例如，該方法包括在室溫下將炔丙基胺與聚乙二醇(PEG)-羥基琥珀酰亞胺酯在有機(jī)溶劑(例如，CH2Cl2)中反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)結(jié)構(gòu)7的炔丙基酰胺聚乙二醇。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法還包括用乙酸乙酯沉淀炔丙基酰胺聚乙二醇。在一個(gè)方面，該方法還包括在甲醇中再結(jié)晶炔丙基酰胺聚乙二醇；真空下干燥產(chǎn)物。試劑盒也是本發(fā)明的特征。例如，提供了在細(xì)胞中生產(chǎn)包含至少一種非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的試劑盒，其中該試劑盒包括一個(gè)含有編碼O-tRNA或O-tRNA的多核苷酸序列和編碼O-RS或O-RS的多核苷酸序列的容器。在一個(gè)實(shí)施方式中，該試劑盒還包括至少一種非天然氨基酸。在另一實(shí)施方式中，該試劑盒還包括生產(chǎn)該蛋白質(zhì)的指導(dǎo)材料。定義在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于具體裝置或生物系統(tǒng)，當(dāng)然它們可以改變。也應(yīng)理解本文使用的術(shù)語是僅為描述具體實(shí)施方式所用，并不打算限制。如本說明書和所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)，除非該內(nèi)容有明確規(guī)定。因此，例如，“一個(gè)細(xì)胞”的提法包括兩種或多種細(xì)胞的組合；“細(xì)菌”的提法包括細(xì)菌的混合物等。除非本文或下面的說明書剩余部分中有其它限定，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。同源：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和/或蛋白序列天然地或人工地來自共同的祖先蛋白質(zhì)或蛋白序列時(shí)，則它們“同源”。類似地，當(dāng)核酸和/或核酸序列天然地或人工地來自共同的祖先核酸和/或核酸序列時(shí)，則它們“同源”。例如，可以通過任何可行的誘變方法修飾任何天然產(chǎn)生的核酸，使其包括一種或多種選擇密碼子。當(dāng)該誘變的核酸表達(dá)時(shí)，它編碼含有一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸的多肽。當(dāng)然，該突變過程還可以改變一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)密碼子，從而也在所得的突變蛋白中改變一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。同源性通常由兩種或多種核酸或蛋白(或其序列)之間的序列相似性推定。用于確定同源性的序列間相似性精確百分?jǐn)?shù)隨核酸和蛋白而變還有爭(zhēng)論，但通常將少至25%的序列相似性用來確定同源性。較高水平的序列相似性，例如，30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%或更高，也可以用來確定同源性。本文描述了通常可用的確定序列相似性百分?jǐn)?shù)的方法(例如，使用默認(rèn)參數(shù)的BLASTP和BLASTN)。正交：本文使用的術(shù)語“正交”指與細(xì)胞內(nèi)源性組件一起作用，而其效率比相應(yīng)的細(xì)胞或翻譯系統(tǒng)的內(nèi)源性分子、或不能與細(xì)胞內(nèi)源性組件一起作用的分子低的分子(例如，正交tRNA(O-tRNA)和/或正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS))。在指tRNA和氨?；?tRNA合成酶的情況下，正交指不能或效率降低，例如，正交tRNA與內(nèi)源性tRNA合成酶一起作用的效率比內(nèi)源性tRNA與內(nèi)源性tRNA合成酶的效率低，或正交氨?；?tRNA合成酶與內(nèi)源性tRNA一起作用的效率比內(nèi)源性tRNA合成酶與內(nèi)源性tRNA一起作用的效率小于20%、小于10%、小于5%、或小于1%。細(xì)胞中的正交分子缺少功能內(nèi)源性互補(bǔ)分子。例如，由細(xì)胞的任意內(nèi)源性RS氨?；?xì)胞中正交tRNA的效率比由內(nèi)源性RS氨酰化內(nèi)源性tRNA的效率低，或甚至是零。在另一實(shí)施例中，在感興趣的細(xì)胞中，正交RS氨酰化任意內(nèi)源性tRNA的效率比由內(nèi)源性RS氨?；瘍?nèi)源性tRNA的效率低，或甚至是零?？梢詫⒌诙€(gè)正交分子引入細(xì)胞，與第一個(gè)正交分子一起作用。例如，正交tRNA/RS對(duì)包括引入的互補(bǔ)組件，它們?cè)诩?xì)胞中一起發(fā)揮作用，其效率相當(dāng)于相應(yīng)tRNA/RS內(nèi)源對(duì)的效率的(例如，50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、或99%或更高)?；パa(bǔ)：術(shù)語“互補(bǔ)”指可以一起發(fā)揮作用的正交對(duì)、O-tRNA和O-RS組件，例如，其中O-RS使O-tRNA氨?；?。優(yōu)選地氨?；盒g(shù)語“優(yōu)選地氨?；敝概cO-RS氨?；烊划a(chǎn)生的tRNA或用于產(chǎn)生O-tRNA的起始材料相比，以例如，70%、75%、85%、90%、95%或99%或更高的效率氨?；哂蟹翘烊话被岬腛-tRNA。將非天然氨基酸以高保真度摻入生長(zhǎng)的多肽鏈中，例如，對(duì)于給定的選擇密碼子效率大于75%、對(duì)于給定的選擇密碼子效率高于約80%、對(duì)于給定的選擇密碼子效率大于約90%、對(duì)于給定的選擇密碼子效率大于約95%或?qū)τ诮o定的選擇密碼子效率大于約99%或?qū)τ诮o定的選擇密碼子效率更高。選擇密碼子：術(shù)語“選擇密碼子”指在翻譯過程中被O-tRNA識(shí)別而不被內(nèi)源性tRNA識(shí)別的密碼子。O-tRNA抗密碼子環(huán)識(shí)別mRNA上的選擇密碼子并在多肽的這個(gè)位點(diǎn)上摻入其氨基酸，例如，非天然氨基酸。選擇密碼子可包括，例如，無義密碼子，如終止密碼子，如，琥珀、赭石和乳白密碼子；四個(gè)或更多堿基密碼子；罕用密碼子；來自天然或非天然堿基對(duì)和/或類似物的密碼子。抑制型tRNA：抑制型tRNA是在給定翻譯系統(tǒng)中，例如，通過響應(yīng)于選擇密碼子將氨基酸摻入多肽鏈的機(jī)制改變信使RNA(mRNA)的閱讀的tRNA。例如，抑制型tRNA可以通過，例如終止密碼子、四堿基密碼子、罕用密碼子和/或類似物閱讀。可循環(huán)tRNA：術(shù)語“可循環(huán)tRNA”指氨?；膖RNA，可用氨基酸(例如，非天然氨基酸)，通過在翻譯期間將該氨基酸摻入一種或多種多肽鏈，將其重復(fù)地再氨酰化。翻譯系統(tǒng)：術(shù)語“翻譯系統(tǒng)”指將天然產(chǎn)生的氨基酸摻入生長(zhǎng)的多肽鏈(蛋白)中的組分的綜合組。翻譯系統(tǒng)的組分可包括，例如，核糖體、tRNA、合成酶、mRNA、氨基酸等?？蓪⒈景l(fā)明的組件(例如，ORS、OtRNAs、非天然氨基酸等)加入到體外或體內(nèi)翻譯系統(tǒng)例如，真核細(xì)胞，例如，酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、和/或類似物中。非天然氨基酸：本文使用的術(shù)語“非天然氨基酸”指不是20種普通的天然產(chǎn)生的氨基酸、硒半胱氨酸或吡咯賴氨酸之一的任意氨基酸、修飾氨基酸和/或氨基酸類似物。來源于：本文使用的術(shù)語“來源于”指從具體的分子或生物分離或用來自具體分子或生物的信息制成的組件。失活RS：本文使用的術(shù)語“失活RS”指經(jīng)過突變使其不再可用氨基酸氨?；奶烊魂P(guān)聯(lián)tRNA的合成酶。正選擇或篩選標(biāo)記：本文使用的術(shù)語“正選擇或篩選標(biāo)記”指存在時(shí)，例如表達(dá)、激活等，可以從沒有正選擇標(biāo)記的細(xì)胞中鑒定出具有正選擇標(biāo)記的細(xì)胞的標(biāo)記。負(fù)選擇或篩選標(biāo)記：本文使用的術(shù)語“負(fù)選擇或篩選標(biāo)記”指指存在時(shí)，例如表達(dá)、激活等，可以鑒定不具有所需性質(zhì)的細(xì)胞的標(biāo)記(例如，與具有所需性質(zhì)的細(xì)胞相比)。報(bào)道者：本文使用的術(shù)語“報(bào)道者”指可以用來選擇感興趣的系統(tǒng)的靶組件的組件。例如，報(bào)道者可包括熒光篩選標(biāo)記(例如，綠色熒光蛋白)、發(fā)光標(biāo)記(例如，螢火蟲熒光素酶蛋白)、基于親和力的篩選標(biāo)記或可選擇的標(biāo)記基因，如his3、ura3、leu2、lys2、lacZ、β-gal/lacZ(β-半乳糖苷酶)、Adh(醇脫氫酶)等。真核生物：本文使用的術(shù)語“真核生物”指屬于系統(tǒng)發(fā)育域真核生物，例如，動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物、昆蟲、爬蟲、鳥等)、纖毛蟲、植物(例如，單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母、鞭毛蟲、微孢子蟲、原生生物等的生物。非-真核生物：本文使用的術(shù)語“非-真核生物”指非真核生物。例如，屬于真細(xì)菌(例如，大腸桿菌、嗜熱棲熱菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等)系統(tǒng)發(fā)育域，或古細(xì)菌(例如，詹氏甲烷球菌、熱自養(yǎng)甲烷桿菌、鹽桿菌屬如沃氏富鹽菌和鹽桿菌種NRC-1、閃爍古生球菌、激烈火球菌、堀越氏火球菌、敏捷氣熱菌等)系統(tǒng)發(fā)育域的非真核生物?？贵w：本文使用的術(shù)語“抗體"包括但不限于基本上通過一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白基因編碼的多肽，或其片段，它特異性結(jié)合并識(shí)別分析物(抗原)。例子包括多克隆、單克隆、嵌合和單鏈抗體等。本發(fā)明使用的術(shù)語“抗體”也包括免疫球蛋白的片段，包括Fab片段和表達(dá)文庫(kù)包括噬菌體展示產(chǎn)生的片段?？贵w結(jié)構(gòu)和術(shù)語參見，例如，Paul，《基本免疫學(xué)》(FundamentalImmunology)，第4版，1999，RavenPress，紐約。保守變體：術(shù)語“保守變體”指翻譯組件，例如，保守變體O-tRNA或保守變體O-RS，其功能類似保守變體基于的組件，例如，O-tRNA或O-RS，但序列上有變化。例如，O-RS將氨酰化具有非天然氨基酸的互補(bǔ)O-tRNA或保守變體O-tRNA，雖然O-tRNA和保守變體O-tRNA并不具有相同序列。保守變體在序列中可具有例如，一種變化、兩種變化、三種變化、四種變化或五種或更多的變化，只要保守變體與相應(yīng)的O-tRNA或O-RS互補(bǔ)。選擇或篩選劑：本文使用的術(shù)語“選擇或篩選劑”指存在時(shí)，可以從群體中選擇/篩選某種組分的試劑。例如，選擇或篩選劑包括但不限于，例如，營(yíng)養(yǎng)物、抗生素、光波長(zhǎng)，抗體，表達(dá)的多核苷酸(例如，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白)等。選擇劑可隨，例如，濃度、強(qiáng)度等而不同。可檢測(cè)物質(zhì)：本文使用的術(shù)語“可檢測(cè)物質(zhì)”指當(dāng)激活、改變、表達(dá)等時(shí)，可以從群體中選擇/篩選某種組分的試劑。例如，可檢測(cè)物質(zhì)可以是化學(xué)試劑，例如，5-氟乳清酸(5-FOA)，它在某些條件下，例如，URA3報(bào)道基因表達(dá)下，成為可檢測(cè)的，例如，能夠殺死表達(dá)URA3報(bào)道基因的細(xì)胞的有毒產(chǎn)物。附圖簡(jiǎn)要描述圖1，A、B和C組以圖解說明通常用于擴(kuò)展真核細(xì)胞例如，釀酒酵母遺傳密碼的正和負(fù)選擇方案，A組圖解說明報(bào)道基因的激活轉(zhuǎn)錄，它是通過GAL4中TAG密碼子的琥珀抑制驅(qū)動(dòng)的。條紋框指出DNA結(jié)合域，陰影框指出主要和隱蔽的激活域。B組說明報(bào)道基因的例子，例如，MaV203中的HIS3、LacZ、URA3。C組圖解說明可以用于選擇方案的質(zhì)粒，例如，pEcTyrRS/tRNACUA和pGADGAL4xxTAG。圖2說明在選擇性培養(yǎng)基上第一代GAL4報(bào)道基因的EcTyrRS和tRNACUA依賴性表型。DB-AD是GAL4DNA結(jié)合域和激活域間的融合。DB-TAG-AD在合成接頭DB和AD之間有代替酪氨酸密碼子的TAG密碼子。A5是EcTyrRS的失活型，其中活性位點(diǎn)中的5個(gè)殘基突變?yōu)楸彼?。圖3，A和B組說明在選擇性培養(yǎng)基上第二代GAL4報(bào)道基因的EcTyrRS和tRNACUA依賴性表型。條紋框指出DNA結(jié)合域，陰影框指出主要和隱蔽的激活域。A組說明GAL4中具有單個(gè)氨基酸突變的構(gòu)建物。B組說明GAL4中具有兩個(gè)氨基酸突變的構(gòu)建物。圖4A、B和C組說明有或不沒有EcTyrRS的pGADGAL4(T44TAG、R110TAG)，以及MaV203中的各種報(bào)道基因。A組顯示在X-gal、-Ura或-Leu、-Trp存在下的結(jié)果。B組顯示在不同濃度的3-AT存在下的結(jié)果。C組顯示在不同百分?jǐn)?shù)的5-FOA存在下的結(jié)果。圖5A和B組說明ONPG水解各種GAL4突變體，例如，其中殘基T44(A)和R110(B)是允許位點(diǎn)。A組說明用T44位點(diǎn)上各種類型的突變測(cè)定的ONPG水解。B組說明用Rl10位點(diǎn)上各種類型的突變測(cè)定的ONPG水解?！瓽AL4’是轉(zhuǎn)染了pCL1的MaV203，超出標(biāo)度～600ONPG水解單位。‘沒有’是分別用編碼GAL4DB和GAL4AD的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化MaV203。圖6顯示了活性EcTyrRS克隆的選擇。將含有1：10的pEcTyrRS-tRNACUA：pA5-tRNACUA混合物的MaV203以103稀釋度鋪板于(-Leu，-Trp)平板(左)或(-Leu,-Trp,-His+50mM3-AT)平板(右)，用XGAL覆蓋處理。圖7，A和B組。A組說明結(jié)合了酪氨酸的嗜熱脂肪芽孢桿菌酪氨酰-tRNA合成酶的活性位點(diǎn)的立體視圖。顯示了突變的殘基，并與來自大腸桿菌酪氨酰-tRNA合成酶Tyr37(嗜熱脂肪芽孢桿菌TyrRS殘基Tyr34)、Asn126(Asn123)、Asp182(Asp176)、Phe183(Phel77)和Leu186(Leu180)的殘基相對(duì)應(yīng)。B組說明非天然氨基酸例子(從左至右)對(duì)-乙?；?L-苯丙氨酸(1)、對(duì)-苯甲?；?L-苯丙氨酸(2)、對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸(3)、0-甲基-L-酪氨酸(4)和對(duì)-碘代-L-酪氨酸(5)的結(jié)構(gòu)式。圖8，A、B、C和D組。A組說明可以用于選擇/篩選正交tRNA的載體和報(bào)道構(gòu)建物、真核細(xì)胞中的正交氨?；铣擅富蛘籺RNA/RS對(duì)。B組說明含有GAL4反應(yīng)型HIS3、URA3以及l(fā)acZ反應(yīng)型報(bào)道者的酵母的表型，在選擇培養(yǎng)基上，響應(yīng)于活性(TyrRS)或失活(A5RS)氨?；?tRNA合成酶。C組說明一個(gè)選擇方案的例子，用于在真核細(xì)胞例如，UAA是非天然氨基酸的釀酒酵母中選擇編碼附加氨基酸的突變體合成酶。D組說明從具有對(duì)-乙?；?L-苯丙氨酸的選擇中分離酵母的表型。圖9說明人超氧化物歧化酶(hSOD)(33TAG)HIS在釀酒酵母中的蛋白表達(dá)，它遺傳編碼非天然氨基酸，如圖7B組中所示。圖10，A-H組說明如圖7B組中所示的含有非天然氨基酸(標(biāo)為Y*)的胰蛋白酶肽VY*GSIK(SEQIDNO：87)的串聯(lián)質(zhì)譜分析。A組說明具有非天然氨基酸p-乙?；?L-苯丙氨酸的胰蛋白酶肽(1)的串聯(lián)質(zhì)譜分析。B組說明具有非天然氨基酸對(duì)-苯甲?；?L-苯丙氨酸的胰蛋白酶肽(2)的串聯(lián)質(zhì)譜分析。C組說明具有非天然氨基酸對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸的胰蛋白酶肽(3)的串聯(lián)質(zhì)譜分析。D組說明具有非天然氨基酸鄰-甲基-L-酪氨酸的胰蛋白酶肽(4)的串聯(lián)質(zhì)譜分析。E組說明具有非天然氨基酸對(duì)-碘代-L-酪氨酸的胰蛋白酶肽(5)的串聯(lián)質(zhì)譜分析。F組說明在Y*位置有色氨酸(W)的胰蛋白酶肽的串聯(lián)質(zhì)譜分析。G組說明在Y*位置有酪氨酸(Y)的胰蛋白酶肽的串聯(lián)質(zhì)譜分析。H組說明在Y*位置有亮氨酸(L)的胰蛋白酶肽的串聯(lián)質(zhì)譜分析。圖11說明兩種非天然氨基酸的例子，(1)對(duì)-炔丙基氧基苯丙氨酸和(2)對(duì)-疊氮基苯丙氨酸。圖12，A、B和C組說明在圖11中所示的非天然氨基酸1和2存在或不存在的情況下SOD的表達(dá)。A組說明Gelcode藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)。B組說明用抗-SOD抗體的Western印跡實(shí)驗(yàn)。C組說明用抗-6xHis抗體的Western印跡實(shí)驗(yàn)。圖13，A、B和C組說明通過[3+2]環(huán)加成標(biāo)記的蛋白質(zhì)。A組說明合成的染料標(biāo)記3-6。B組說明SOD和染料間的反應(yīng)。C組說明凝膠內(nèi)熒光掃描和Gelcode藍(lán)染色。圖14說明真核細(xì)胞，如在缺少尿嘧啶的SD培養(yǎng)基上，在圖11中所示1或2的存在或不存在下用合成酶突變體轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。圖15，A和B組說明在Y*位置含有疊氮(Az)(A組)或炔(Al)(B組)非天然氨基酸的胰蛋白酶肽VY*GSIK(SEQIDNO：87)的串聯(lián)質(zhì)譜分析，顯示它們的預(yù)計(jì)片段離子質(zhì)量。箭頭表明觀察到各肽的b(藍(lán))和y(紅)離子系列。圖16圖解說明將非天然氨基酸，如對(duì)-炔丙基氧基苯丙氨酸體內(nèi)摻入生長(zhǎng)多肽鏈中，以及通過該非天然氨基酸的[3+2]環(huán)加成反應(yīng)，與有機(jī)小分子生物共軛。圖17，A、B和C組說明用[3+2]環(huán)加成PEG化含有非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。A組說明炔丙基酰胺PEG在Cu(I)和磷酸鹽緩沖液(PB)存在下與含有疊氮基氨基酸的蛋白質(zhì)(例如，N3-SOD)的反應(yīng)。B組說明通過凝膠分析蛋白質(zhì)的PEG化。C組說明炔丙基酰胺PEG的合成。發(fā)明詳述在真核細(xì)胞中超越遺傳密碼強(qiáng)加的化學(xué)限制直接遺傳修飾蛋白結(jié)構(gòu)的能力，將提供強(qiáng)大的分子工具，以探測(cè)或操縱細(xì)胞過程。本發(fā)明提供了在真核細(xì)胞中能擴(kuò)展遺傳編碼的氨基酸數(shù)目的翻譯組件。這些包括tRNAs(例如，正交tRNAs(O-tRNAs))、氨酰基-tRNA合成酶(例如，正交合成酶(O-RS))、O-tRNA/O-RS對(duì)和非天然氨基酸。一般地，能夠有效表達(dá)并加工本發(fā)明的0-tRNA，它在真核細(xì)胞的翻譯中發(fā)揮功能，但不被宿主的氨酰基-tRNA合成酶顯著地氨?；ｍ憫?yīng)于選擇密碼子，本發(fā)明的O-tRNA將非天然氨基酸在mRNA翻譯期間輸送到生長(zhǎng)的多肽鏈上，該非天然氨基酸并不編碼普通的二十種氨基酸的任意一種。本發(fā)明的O-RS在真核細(xì)胞中優(yōu)選地氨酰化本發(fā)明具有非天然氨基酸的O-tRNA，但并不氨?；魏伟|(zhì)宿主的tRNA。而且，本發(fā)明氨?；?tRNA合成酶的特異性使其接受非天然氨基酸而拒絕任何內(nèi)源性氨基酸。包括例子O-RS或其部分氨基酸序列的多肽也是本發(fā)明的特征。此外，編碼翻譯組件。0-tRNA。O-RS及其部分的多核苷酸是本發(fā)明的特征。本發(fā)明也提供生產(chǎn)將非天然氨基酸用于真核細(xì)胞的所需翻譯組件，如O-RS和或正交對(duì)(正交tRNA和正交氨?；?tRNA合成酶)的方法，(以及由所述方法生產(chǎn)的翻譯組件)。例如，來自大腸桿菌的酪氨酰-tRNA合成酶/tRNACUA對(duì)是本發(fā)明的O-tRNA/O-RS對(duì)。此外，本發(fā)明也表征在一個(gè)真核細(xì)胞中選擇/篩選翻譯組件的方法，一旦選擇/篩選，就可以在不同真核細(xì)胞(沒有用于選擇/篩選的真核細(xì)胞)中使用那些組件。例如，生產(chǎn)用于真核細(xì)胞的翻譯組件的選擇/篩選方法可以在酵母，例如，釀酒酵母中進(jìn)行，然后可以將那些選擇組件用于另外的真核細(xì)胞，例如，另外的酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞等。本發(fā)明還提供了在真核細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，其中該蛋白含有非天然氨基酸。用本發(fā)明的翻譯組件生產(chǎn)該蛋白。本發(fā)明也提供包括非天然氨基酸的蛋白質(zhì)(和由本發(fā)明方法生產(chǎn)的蛋白)。感興趣的蛋白或多肽也可包括翻譯后修飾，例如，通過[3+2]環(huán)加成或親核-親電子反應(yīng)加入修飾，這不能通過原核細(xì)胞進(jìn)行，等。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明也包括用非天然氨基酸生產(chǎn)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的方法(和由所述方法生產(chǎn)的蛋白)。包括含有非天然氨基酸的蛋白的組合物也是本發(fā)明的特征。用非天然氨基酸生產(chǎn)蛋白或多肽的試劑盒也是本發(fā)明的特征。正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)為了將非天然氨基酸特異性參入到感興趣的蛋白或多肽中，在真核細(xì)胞中，改變合成酶的底物特異性以致只有所需的非天然氨基酸，而非任意普通的20種氨基酸加入tRNA。如果正交合成酶是混雜的，它將導(dǎo)致在靶位上混合有天然和非天然氨基酸的突變蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供了對(duì)于具體的非天然氨基酸具有修飾的底物特異性的生產(chǎn)正交氨?；?tRNA合成酶的組合物和方法。包括正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)的真核細(xì)胞是本發(fā)明的特征。O-RS在真核細(xì)胞中優(yōu)選地氨?；哂蟹翘烊话被岬恼籺RNA(O-tRNA)。在某些實(shí)施方式中，O-RS利用多于一個(gè)非天然氨基酸，例如，兩個(gè)或更多，三個(gè)或更多等。因此，本發(fā)明的O-RS可具有用不同的非天然氨基酸優(yōu)選地氨?；疧-tRNA的能力。通過選擇哪一個(gè)非天然氨基酸或非天然氨基酸的組合放入細(xì)胞和/或通過選擇放入細(xì)胞以摻入的不同量的非天然氨基酸提供了附加的對(duì)照水平。與天然氨基酸相比，本發(fā)明的O-RS對(duì)非天然氨基酸任選地具有一種或多種改進(jìn)或增強(qiáng)的酶性質(zhì)。這些性質(zhì)包括，例如，與天然產(chǎn)生的氨基酸如，20種已知普通氨基酸之一相比，對(duì)非天然氨基酸較高km、較低km、較高kcat、較低kcat、較低kcat/km、較高kcat/km等。任選地，O-RS可通過包括O-RS的多肽和/或通過編碼O-RS或其部分的多核苷酸提供給真核細(xì)胞。例如，如SEQIDNO.：3-35(例如，3-19、20-35或序列3-35的任何其它亞組)或其互補(bǔ)多核苷酸序列中任意一個(gè)所列多核苷酸序列編碼O-RS或其部分。在另一實(shí)施例中，O-RS包含如SEQIDNO.：36-63(例如，36-47、48-63或36-63的任意其它亞組)和/或86，或它們的保守變異的氨基酸序列。參見例如，本文表5、6和8以及實(shí)施例6用于示例O-RS分子的序列。O-RS也可包含與天然產(chǎn)生的酪氨酰氨?；?tRNA合成酶(TyrRS)(例如，SEQIDNO.：2中所列)的氨基酸序列例如，至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或甚至至少99.5%相同的氨基酸序列，包含A-E族的兩種或多種氨基酸。A族包括與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對(duì)應(yīng)位置上的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、或蘇氨酸；B族包括與大腸桿菌TyrRS的Asn126相對(duì)應(yīng)位置上的天冬氨酸；C族包括與大腸桿菌TyrRS的Asp182相對(duì)應(yīng)位置上的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸、天冬酰胺或甘氨酸；D族包括與大腸桿菌TyrRS的Phe183相對(duì)應(yīng)位置上的甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸、或酪氨酸；E族包括與大腸桿菌TyrRS的Leu186相對(duì)應(yīng)位置上的絲氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、或丙氨酸。這些族的任何亞組組合是本發(fā)明的特征。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，O-RS具有兩種或多種選自出現(xiàn)與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對(duì)應(yīng)位置上的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、或蘇氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Asp182相對(duì)應(yīng)位置上的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸或甘氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Phe183相對(duì)應(yīng)位置上的甲硫氨酸、或酪氨酸；和與大腸桿菌TyrRS的Leu186相對(duì)應(yīng)位置上的絲氨酸或丙氨酸的氨基酸。在另一實(shí)施方式中，O-RS包括兩種或多種選自與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對(duì)應(yīng)位置上的甘氨酸、絲氨酸或丙氨酸，與大腸桿菌TyrRS的Asn126相對(duì)應(yīng)位置上的天冬氨酸，與大腸桿菌TyrRS的Asp182相對(duì)應(yīng)位置上的天冬酰胺，與大腸桿菌TyrRS的Phe183相對(duì)應(yīng)位置上的丙氨酸或纈氨酸，和/或與大腸桿菌TyrRS的Leu186相對(duì)應(yīng)位置上的甲硫氨酸、纈氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸的氨基酸。也參見，例如，本文的表4、表6和表8。除了O-RS，本發(fā)明的真核細(xì)胞還可包括附加組分，例如，非天然氨基酸。真核細(xì)胞也包括正交tRNA(O-tRNA)(例如，來自非真核生物，如大腸桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和/或類似物)，其中O-tRNA識(shí)別選擇密碼子，并由O-RS優(yōu)選地氨?；哂蟹翘烊话被岬腛-tRNA。細(xì)胞中也可存在包含編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸，其中多核苷酸包含O-tRNA識(shí)別的選擇密碼子，或它們中一種或多種的組合。在一個(gè)方面，O-tRNA介導(dǎo)非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)中，其效率相當(dāng)于包含SEQIDNO.：65所列多核苷酸序列或由其加工而來的tRNA效率的例如、至少45%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或99%。在另一方面，O-tRNA包含SEQIDNO.：65和O-RS包含SEQIDNO.：36-63(例如，36-47、48-63或36-63的任何其它亞組)和/或86和/或它們的保守變異中任意一個(gè)所列多肽序列。也參見，例如，本文表5和實(shí)施例6中用于示例O-RS和O-tRNA分子的序列。在一個(gè)實(shí)施例中，真核細(xì)胞包含正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)、正交tRNA(O-tRNA)、非天然氨基酸和含有編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸，其中多核苷酸包含O-tRNA識(shí)別的選擇密碼子。O-RS在真核細(xì)胞中優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的正交tRNA(O-tRNA)，細(xì)胞在不存在非天然氨基酸的情況下生產(chǎn)感興趣多肽，其產(chǎn)率相當(dāng)于在非天然氨基酸存在下多肽產(chǎn)率的例如，小于30%、小于20%、小于15%、小于10%、小于5%、小于2.5%等。是本發(fā)明特征的生產(chǎn)O-RS的方法任選地包括從野生型合成酶的構(gòu)架產(chǎn)生突變合成酶庫(kù)，然后基于它們相對(duì)于普通的二十種氨基酸對(duì)非天然氨基酸的特異性選擇突變RS。為了分離所述合成酶，選擇方法是：(i)敏感的，因?yàn)閬碜允纵喌乃韬铣擅傅幕钚钥梢缘?，?shù)目??；(ii)“可調(diào)的”，因?yàn)樾枰诓煌倪x擇輪中改變選擇嚴(yán)格性；和(iii)通用的，以使這些方法可用于不同非天然氨基酸。生產(chǎn)在真核細(xì)胞中優(yōu)選地氨?；哂蟹翘烊话被岬恼籺RNA的正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)的方法一般包括應(yīng)用正選擇的組合，然后負(fù)選擇。在正選擇中，在陽性標(biāo)記的非必需位點(diǎn)引入選擇密碼子的抑制使真核細(xì)胞在正選擇壓力下存活。在非天然氨基酸存在下，存活細(xì)胞從而編碼將非天然氨基酸加入正交抑制型tRNA的活性合成酶。在負(fù)選擇中，在陰性標(biāo)記的非必需位點(diǎn)引入選擇密碼子的抑制除去具有天然氨基酸特異性的合成酶。正和負(fù)選擇中存活的細(xì)胞編碼僅(或至少優(yōu)選地)氨?；?加入)具有非天然氨基酸的正交抑制型tRNA的合成酶。例如，該方法包括：(a)進(jìn)行正選擇，在非天然氨基酸存在下，第一種類生物真核細(xì)胞的群體，其中真核細(xì)胞各包含：i)氨?；?tRNA合成酶(RS)文庫(kù)的一員，ii)正交tRNA(O-tRNA)，iii)編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸，和iv)編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸；其中在正選擇中存活的細(xì)胞包含在非天然氨基酸存在下氨?；籺RNA(O-tRNA)的活性RS；和(b)將在正選擇中存活的細(xì)胞在不存在非天然氨基酸的情況下進(jìn)行負(fù)選擇，以去除氨酰化具有天然氨基酸的O-tRNA的活性RS，從而提供優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的O-tRNA的O-RS。正選擇標(biāo)記可以是各種分子中的任意一種。在一個(gè)實(shí)施方式中，正選擇標(biāo)記是為生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)添加劑的產(chǎn)品，并在缺少營(yíng)養(yǎng)添加劑的培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸的例子包括但不限于，例如，基于補(bǔ)充細(xì)胞的氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷的報(bào)道基因、his3基因(例如，其中his3基因編碼咪唑甘油磷酸脫氫酶，通過3-氨基三唑(3-AT))、ura3基因、leu2基因、lys2基因、lacZ基因、adh基因等檢測(cè)。參見，例如，G.M.Kishore和D.M.Shah，(1988)，作為除草劑的氨基酸生物合成抑制劑(Aminoacidbiosynthesisinhibitorsasherbicides)，AnnualReviewofBiochemistry57：627-663。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過鄰-硝基苯基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(ONPG)的水解檢測(cè)lacZ產(chǎn)生。參見，例如，I.G.Serebriiskii和E.A.Golemis，(2000)，lacZ在研究基因功能中的用途：用于酵母雙雜交系統(tǒng)的β-半乳糖苷測(cè)定的評(píng)價(jià)（UsesoflacZtostudygenefunction:evaluationofbeta-galactosidaseassaysemployedintheyeasttwo-hybridsystem），AnalyticalBiochemistry285：1-15。附加的正選擇標(biāo)記包括，例如、熒光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)、YFP、EGFP、RFP、抗生素抗性基因產(chǎn)物(例如，氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT))、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白(例如，GAL4)等。編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸任選地包含選擇密碼子。可以將編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸可操作地連接到效應(yīng)元件上。也可存在編碼從效應(yīng)元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，并包含至少一個(gè)選擇密碼子的附加多核苷酸。通過非天然氨基酸氨?；腛-tRNA將非天然氨基酸摻入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白中導(dǎo)致編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸(例如，報(bào)道基因)的轉(zhuǎn)錄。例如，見圖1A。選擇密碼子任選地位于編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的DNA結(jié)合域的多核苷酸內(nèi)或基本上在其部分的附近。也可將編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸可操作地連接到效應(yīng)元件上，由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。參見，例如，A.J.DeMaggio等，(2000)，酵母分裂-雜交系統(tǒng)(Theyeastsplit-hybridsystem)，MethodEnzymol.328：128-137；H.M.Shih等，(1996)，陽性遺傳選擇破壞蛋白-蛋白相互作用：鑒定阻止與輔激活物CBP結(jié)合的CREB突變(Apositivegeneticselectionfordisruptingprotein-proteininteractions:identificationofCREBmutationsthatpreventassociationwiththecoactivatorCBP)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：13896-13901；M.Vidal,等，(1996)，用酵母反向雙雜交系統(tǒng)遺傳表征哺乳動(dòng)物蛋白-蛋白相互作用域(Geneticcharacterizationofamammalianprotein-proteininteractiondomainbyusingayeastreversetwo-hybridsystem)，[評(píng)論]，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：10321-10326；和M.Vidal,等，(1996)，用反向雙雜交和單雜交系統(tǒng)檢測(cè)蛋白-蛋白解離和DNA-蛋白相互作用(Reversetwo-hybridandone-hybridsystemstodetectdissociationofprotein-proteinandDNA-proteininteractions)，[評(píng)論]，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：10315-10320。通過天然氨基酸氨?；腛-tRNA將天然氨基酸摻入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白中導(dǎo)致負(fù)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄。負(fù)選擇標(biāo)記任選地包含選擇密碼子。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的正選擇標(biāo)記和/或負(fù)選擇標(biāo)記可包含至少兩個(gè)選擇密碼子，它們每個(gè)或兩個(gè)可含有至少兩種不同的選擇密碼子或至少兩種相同的選擇密碼子。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白是與核酸序列(例如，效應(yīng)元件)結(jié)合(直接或間接)并調(diào)節(jié)可操作地連接于效應(yīng)元件的序列的轉(zhuǎn)錄的分子。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白可以是轉(zhuǎn)錄激活蛋白(例如，GAL4、核激素受體、AP1、CREB、LEF/tcf家族成員、SMADs、VP16、SP1等)，轉(zhuǎn)錄抑制蛋白(例如，核激素受體、Groucho/tle家族、Engrailed家族等)或可根據(jù)環(huán)境具有兩種活性的蛋白(例如，LEF/tcf、同源框蛋白等)。效應(yīng)元件一般是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白可識(shí)別的核酸序列或與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白一致作用的附加劑。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白另一例子是轉(zhuǎn)錄激活蛋白，GAL4(參見例如，圖1A)。參見，例如，A.Laughon，等，(1984)，鑒定兩種通過釀酒酵母GAL4基因編碼的蛋白(IdentificationoftwoproteinsencodedbytheSaccharomycescerevisiaeGAL4gene)，Molecular&CellularBiology4：268-275；A.Laughon和R.F.Gesteland，(1984)，釀酒酵母GAL4基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)(PrimarystructureoftheSaccharomycescerevisiaeGAL4gene)，Molecular&CellularBiology4：260-267；L.Keegan，等，(1986)，從真核調(diào)節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)錄-激活功能分離DNA結(jié)合(SeparationofDNAbindingfromthetranscription-activatingfunctionofaeukaryoticregulatoryprotein)，Science231：699-704；和M.Ptashne，(1988)，真核轉(zhuǎn)錄激活蛋白是如何工作的(Howeukaryotictranscriptionalactivatorswork)，Nature335：683-689。這個(gè)881個(gè)氨基酸的蛋白的N-末端147氨基酸形成特異地結(jié)合DNA序列的DNA結(jié)合域(DBD)。參見，例如，M.Carey，等，(1989)，GAL4的氨基-末端片段與DNA結(jié)合為二聚體(Anamino-terminalfragmentofGAL4bindsDNAasadimer)，J.Mol.Biol.209：423-432；和E.Giniger，等，(1985)，GAL4，一種酵母陽性調(diào)節(jié)蛋白的特異性DNA結(jié)合(SpecificDNAbindingofGAL4,apositiveregulatoryproteinofyeast)，Cell40：767-774.該DBD通過間插蛋白序列連接到C-末端的113氨基酸激活域(AD)，當(dāng)該激活域與DNA結(jié)合時(shí)可以激活轉(zhuǎn)錄。參見，例如，J.Ma和M.Ptashne，(1987)，GAL4的缺失分析限定了兩種轉(zhuǎn)錄激活節(jié)段(DeletionanalysisofGAL4definestwotranscriptionalactivatingsegments)，Cell48：847-853：和J.Ma和M.Ptashne，(1987)，GAL80識(shí)別GAL4羧基-末端的30個(gè)氨基酸(Thecarboxy-terminal30aminoacidsofGAL4arerecognizedbyGAL80)，Cell50：137-142。通過將琥珀密碼子置于，例如，含有GAL4的N-末端DBD和它的C-末端AD的單個(gè)多肽的N-末端DBD，通過O-tRNA/O-RS對(duì)的琥珀抑制可以與通過GAL4的轉(zhuǎn)錄激活連接(圖1，A組)。GAL4激活的報(bào)道基因可以用于用基因進(jìn)行的正和負(fù)選擇(圖1，B組)。用于負(fù)選擇的培養(yǎng)基可以包含被負(fù)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)物質(zhì)的選擇劑或篩選劑。在本發(fā)明的一個(gè)方面，該可檢測(cè)物質(zhì)是有毒物質(zhì)。編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸可以是，例如，ura3基因。例如，可以將URA3報(bào)道基因置于含有GAL4DNA結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子的控制之下。例如，當(dāng)用選擇密碼子編碼GAL4的多核苷酸翻譯產(chǎn)生負(fù)選擇標(biāo)記時(shí)，GAL4激活URA3的轉(zhuǎn)錄。在含有5-氟乳清酸(5-FOA)的培養(yǎng)基上完成負(fù)選擇，ura3基因的基因產(chǎn)物可將5-氟乳清酸轉(zhuǎn)化成可檢測(cè)物質(zhì)(例如，殺死細(xì)胞的有毒物質(zhì))。參見，例如，J.D.Boeke,等，(1984)，在酵母中正選擇缺少乳清苷-5'-磷酸脫羧酶活性的突變體：5-氟乳清酸抗性(Apositiveselectionformutantslackingorotidine-5’-phosphatedecarboxylaseactivityinyeast:5-fluorooroticacidresistance)，Molecular&GeneralGenetics197：345-346)；M.Vidal,等，(1996)，用酵母反向雙雜交系統(tǒng)遺傳表征哺乳動(dòng)物蛋白-蛋白相互作用域(Geneticcharacterizationofamammalianprotein-proteininteractiondomainbyusingayeastreversetwo-hybridsystem)，[評(píng)論]，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：10321-10326；和M.Vidal,等，(1996)，用反向雙雜交和單雜交系統(tǒng)檢測(cè)蛋白-蛋白解離和DNA-蛋白相互作用(Reversetwo-hybridandone-hybridsystemstodetectdissociationofprotein-proteinandDNA-proteininteractions)，[評(píng)論]，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：10315-10320.也參見圖8C。如同正選擇標(biāo)記一樣，負(fù)選擇標(biāo)記也可以是各種分子的任意一種。在一個(gè)實(shí)施方式中，正選擇標(biāo)記和/或負(fù)選擇標(biāo)記是在合適的反應(yīng)物存在下發(fā)熒光或催化發(fā)光反應(yīng)的多肽。例如，負(fù)選擇標(biāo)記包括但不限于，例如，熒光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)、YFP、EGFP、RFP、抗生素抗性基因產(chǎn)物(例如、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT))、lacZ基因產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白等。在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)或通過發(fā)光檢測(cè)正選擇標(biāo)記和/或負(fù)選擇標(biāo)記。在另一實(shí)施例中，正選擇標(biāo)記和/或負(fù)選擇標(biāo)記包含基于親和力的篩選標(biāo)記。同一多核苷酸可編碼正選擇標(biāo)記和負(fù)選擇標(biāo)記。選擇/篩選嚴(yán)格性的附加水平也可用于本發(fā)明方法。該選擇或篩選嚴(yán)格性可以在生產(chǎn)O-RS方法的一或兩步上不同。這可包括，例如，改變編碼正和/或負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸中效應(yīng)元件的量，將數(shù)量不等的失活合成酶加入到步驟中的一步或兩步，改變使用的選擇/篩選劑的量等。也可以進(jìn)行附加輪的正和/或負(fù)選擇。選擇或篩選也可包括一種或多種正或負(fù)選擇或篩選，包括，例如，氨基酸通透性的改變、翻譯效率的改變、翻譯忠實(shí)性的改變等。一般地，一種或多種改變是基于包含或編碼用于生產(chǎn)蛋白的正交tRNA-tRNA合成酶對(duì)的組件的一種或多種多核苷酸中的突變。可以用模型富集研究從過量的失活合成酶中快速選擇活性合成酶?？梢赃M(jìn)行正和/或負(fù)模型選擇研究。例如，將含有可能的活性氨?；?tRNA合成酶的真核細(xì)胞與過量不同倍數(shù)的失活氨?；?tRNA合成酶混合。比率比較在非選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞之間進(jìn)行，例如，X-GAL覆蓋測(cè)定，和在選擇性培養(yǎng)基(例如，不存在組氨酸和/或尿嘧啶的情況下)中生長(zhǎng)并能夠存活的細(xì)胞中進(jìn)行，例如，X-GAL分析測(cè)定。對(duì)于負(fù)模型選擇，將可能的活性氨?；?tRNA合成酶與過量不同倍數(shù)的失活氨?；?tRNA合成酶混合，用負(fù)選擇物質(zhì)，例如，5-FO進(jìn)行選擇。一般地，RS文庫(kù)(例如，突變體RS文庫(kù))含有來自如來自非真核生物的至少一種氨?；?tRNA合成酶(RS)的RS。在一個(gè)實(shí)施方式中，RS文庫(kù)來自失活RS，例如，其中通過，例如在合成酶的活性位點(diǎn)、在合成酶的編輯機(jī)制位點(diǎn)、在不同位點(diǎn)通過結(jié)合合成酶的不同域等方式突變活性RS產(chǎn)生失活RS。例如，將RS的活性位點(diǎn)殘基突變?yōu)椋?，丙氨酸殘基。將編碼丙氨酸突變的RS的多核苷酸用作模板，以將丙氨酸殘基誘變?yōu)樗?0個(gè)氨基酸。選擇/篩選突變體RS文庫(kù)以生產(chǎn)O-RS。在另一實(shí)施方式中，失活RS包含氨基酸結(jié)合口袋，用一種或多種不同氨基酸取代一種或多種含有結(jié)合口袋的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施例中，取代的氨基酸用丙氨酸取代。任選地，將編碼丙氨酸突變的RS的多核苷酸用作模板，以將丙氨酸殘基誘變?yōu)樗?0個(gè)氨基酸，并進(jìn)行篩選/選擇。生產(chǎn)O-RS的方法還可包括用各種本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)生產(chǎn)RS文庫(kù)。例如，可通過位點(diǎn)特異性突變、隨機(jī)點(diǎn)突變、同源重組、DNA改組或其它遞歸誘變方法、嵌合構(gòu)建或它們的任意組合產(chǎn)生突變RS。例如，可以從兩種或多種其它，例如較小、變化較少的“亞文庫(kù)”產(chǎn)生突變體RS文庫(kù)。一旦合成酶進(jìn)行正和負(fù)選擇/篩選策略，就可進(jìn)一步誘變這些合成酶。例如，可以分離編碼O-RS的核酸；可從該核酸產(chǎn)生一組編碼突變的O-RS的多核苷酸(例如，通過隨機(jī)誘變，位點(diǎn)特異性誘變，重組或它們的任意組合)；和，可以重復(fù)進(jìn)行這些單獨(dú)步驟或這些步驟的組合，直到獲得優(yōu)選地氨?；哂蟹翘烊话被岬腛-tRNA的突變O-RS。在本發(fā)明的一個(gè)方面，這些步驟至少進(jìn)行兩次?？梢栽赪O2002/086075，題為“用于生產(chǎn)正交tRNA-氨?；鵷RNA合成酶對(duì)的方法和組合物”中找到生產(chǎn)O-RS的更多細(xì)節(jié)。也參見，Hamano-Takaku等，(2000)突變大腸桿菌酪氨酰-tRNA合成酶利用非天然氨基酸重氮酪氨酸比酪氨酸更有效(AmutantEscherichiacoliTyrosyl-tRNASynthetaseutilizestheUnnaturalAminoAcidAzatyrosineMoreEfficientlythanTyrosine)，JournalofBiologicalChemistry，275(51)：40324-40328；Kiga等(2002)，在真核翻譯中將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性摻入蛋白中的工程大腸桿菌酪氨酰-tRNA合成酶及其在麥胚無細(xì)胞體系中的應(yīng)用(AnengineeredEscherichiacolityrosyl-tRNAsynthetaseforsite-specificincorporationofanunnaturalaminoacidintoproteinsineukaryotictranslationanditsapplicationinawheatgermcellfreesystem)，PNAS99(15)：9715-9723；和Francklyn等，(2002)，氨?；?tRNA合成酶：變化的翻譯劇場(chǎng)中多才多藝的演員(Aminoacyl-tRNAsynthetases:Versatileplayersinthechangingtheateroftraslation)；RNA，8：1363-1372。正交tRNAs本發(fā)明提供了包括正交tRNA(O-tRNA)的真核細(xì)胞。該正交tRNA介導(dǎo)非天然氨基酸體內(nèi)摻入含有O-tRNA識(shí)別的選擇密碼子的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)中。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的O-tRNA介導(dǎo)非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)中，其效率相當(dāng)于含有SEQIDNO.：65所列多核苷酸序列或在該序列的細(xì)胞中加工的tRNA效率的例如，至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%或甚至90%或更高。參見本文的表5。本發(fā)明O-tRNA的例子是SEQIDNO.：65(參見本文的實(shí)施例6和表5)。SEQIDNO.：65是一個(gè)剪接/加工前的轉(zhuǎn)錄子，它在細(xì)胞中被任選地加工，例如，采用細(xì)胞的內(nèi)源性剪切和加工機(jī)器，修飾形成活性O(shè)-tRNA。一般地，群體所述的剪接前轉(zhuǎn)錄子在細(xì)胞中形成群體活性tRNA(活性tRNA可以是一種或多種活性形式)。本發(fā)明也包括O-tRNA的保守變異和它的細(xì)胞加工產(chǎn)物。例如，O-tRNA的保守變異包括功能類似SEQIDNO.：65的O-tRNA并維持tRNAL-型結(jié)構(gòu)如加工形式，但不具有相同序列(不同于野生型tRNA分子)的那些分子。一般地，本發(fā)明O-tRNA是可循環(huán)的O-tRNA，因?yàn)镺-tRNA可在體內(nèi)再氨酰化，響應(yīng)于選擇密碼子再介導(dǎo)非天然氨基酸摻入多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)中。tRNA在真核生物中而不在原核生物中的轉(zhuǎn)錄是通過RNA聚合酶III進(jìn)行的，該聚合酶對(duì)可在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的tRNA結(jié)構(gòu)基因的一級(jí)序列作出限制。此外，在真核細(xì)胞中，需要將tRNA從核中輸出到轉(zhuǎn)錄它們的地方即胞質(zhì)，以在翻譯中發(fā)揮作用。編碼本發(fā)明O-tRNA的核酸或它的互補(bǔ)多核苷酸也是本發(fā)明的特征。在本發(fā)明的一個(gè)方面，編碼本發(fā)明O-tRNA的核酸包括內(nèi)部啟動(dòng)子序列，例如，A框(例如，TRGCNNAGY)和B框(例如，GGTTCGANTCC，SEQIDNO：88)。本發(fā)明O-tRNA也可以是轉(zhuǎn)錄后修飾的。例如，在真核生物中tRNA基因的轉(zhuǎn)錄后修飾包括用RNA酶P和3'-核酸內(nèi)切酶分別去除5'-和3'-側(cè)翼序列。加入3'-CCA序列也是真核生物中tRNA基因的轉(zhuǎn)錄后修飾。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過將第一種類的真核細(xì)胞的群體進(jìn)行負(fù)選擇獲得O-tRNA，其中真核細(xì)胞含有tRNA文庫(kù)的一員。負(fù)選擇清除了含有被對(duì)真核細(xì)胞內(nèi)源性氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨?；膖RNA文庫(kù)的一員的細(xì)胞。這提供了與第一種類的真核細(xì)胞正交的tRNA庫(kù)。另外，在上述將非天然氨基酸摻入多肽中的方法或與其它方法結(jié)合中，可以使用反式翻譯系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括存在于大腸桿菌稱為tmRNA的分子。該RNA分子結(jié)構(gòu)上涉及丙氨酰tRNA，被丙氨酰合成酶氨酰化。tmRNA和tRNA之間的差異是反密碼子環(huán)被特殊的大序列代替。該序列允許核糖體用tmRNA內(nèi)編碼的開放閱讀框作為模板在被中止的序列上繼續(xù)翻譯。在本發(fā)明中，可以產(chǎn)生用正交合成酶優(yōu)選地氨?；⑤d有非天然氨基酸的正交tmRNA。通過借助該系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄基因，核糖體在特異性位點(diǎn)中止工作；將非天然氨基酸引入該位點(diǎn)，然后用正交tmRNA內(nèi)編碼的序列繼續(xù)翻譯。生產(chǎn)重組正交tRNA的其它方法可以在，例如，國(guó)際專利申請(qǐng)WO2002/086075,題為“用于生產(chǎn)正交tRNA-氨?；鵷RNA合成酶對(duì)的方法和組合物(MethodsandcompositionsfortheproductionoforthogonaltRNA-aminoacyltRNAsynthetasepairs)”中找到。也參見Forster等，(2003)通過翻譯從頭設(shè)計(jì)的遺傳密碼程序化擬肽合成酶(Programmingpeptidomimeticsynthetasesbytranslatinggeneticcodesdesigneddenovo)PNAS100(11)：6353-6357；和Feng等，(2003)，通過單氨基酸改變擴(kuò)展tRNA合成酶的tRNA識(shí)別(ExpandingtRNArecognitionofatRNAsynthetasebyasingleaminoacidchange)，PNAS100(10)：5676-5681。正交tRNA和正交氨?；?tRNA合成酶對(duì)正交對(duì)由O-tRNA，例如，抑制型tRNA、移碼tRNA等和O-RS組成。O-tRNA沒有被內(nèi)源性合成酶?；?，不能介導(dǎo)非天然氨基酸摻入含有O-tRNA體內(nèi)識(shí)別的選擇密碼子的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)中。在真核細(xì)胞中，O-RS識(shí)別O-tRNA并優(yōu)選地氨?；哂蟹翘烊话被岬腛-tRNA。本發(fā)明也包括生產(chǎn)正交對(duì)的方法以及由此方法生產(chǎn)的正交對(duì)，以及用于真核細(xì)胞的正交對(duì)組合物。在真核細(xì)胞中，多個(gè)正交tRNA/合成酶對(duì)的產(chǎn)生可以允許用不同密碼子同時(shí)摻入多個(gè)非天然氨基酸。在真核細(xì)胞中，可以通過用低效率跨種氨?；瘡牟煌镙斎雽?duì)，如無義抑制對(duì)，來生產(chǎn)正交O-tRNA/O-RS對(duì)。在真核細(xì)胞中，O-tRNA和O-RS有效地表達(dá)和加工，O-tRNA從核中有效地輸出至胞質(zhì)。例如，一個(gè)所述對(duì)是來自大腸桿菌的酪氨酰-tRNA合成酶/tRNACUA對(duì)(參見，例如，H.M.Goodman,等，(1968)，Nature217：1019-24；和D.G.Barker,等，(1982)，F(xiàn)EBSLetters150：419-23)。當(dāng)兩者都在釀酒酵母的胞質(zhì)中表達(dá)時(shí)，大腸桿菌酪氨酰-tRNA合成酶有效地氨?；潢P(guān)聯(lián)大腸桿菌tRNACUA，但不氨?；劸平湍竧RNA。參見，例如，H.Edwards和P.Schimmel，(1990)，Molecular&CellularBiology10：1633-41；和H.Edwards,等，(1991)，PNASUnitedStatesofAmerica88：1153-6。此外，大腸桿菌酪氨酰tRNACUA是釀酒酵母氨?；?tRNA合成酶的差底物(參見，例如，V.Trezeguet,等，(1991)，Molecular&CellularBiology11：2744-51)，但是在釀酒酵母的蛋白翻譯中有效發(fā)揮功能。參見，例如，H.Edwards和P.Schimmel，(1990)Molecular&CellularBiology10：1633-41；H.Edwards,等，(1991)，PNASUnitedStatesofAmerica88：1153-6；和V.Trezeguet,等，(1991)，Molecular&CellularBiology11：2744-51。而且，大腸桿菌TyrRS不具有校正連接到tRNA的非天然氨基酸的編輯機(jī)制。O-tRNA和O-RS可以是各種生物中天然產(chǎn)生的或可以是天然產(chǎn)生的tRNA和/或RS突變獲得的，它產(chǎn)生了tRNA文庫(kù)和/或RS文庫(kù)。參見本文中題為“來源和宿主”的部分。在各種實(shí)施方式中，O-tRNA和O-RS來自至少一種生物。在另一實(shí)施方式中，O-tRNA來自第一生物中天然產(chǎn)生或突變的天然產(chǎn)生tRNA，O-RS來自第二生物中天然產(chǎn)生或突變的天然產(chǎn)生RS。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一和第二非真核生物是相同的。另外，第一和第二非真核生物可以是不同的。參見本文中題為“正交氨?；?tRNA合成酶”和“O-tRNA”的部分中生產(chǎn)O-RS和0-tRNA的方法。也參見國(guó)際專利申請(qǐng)WO2002/086075,題為“生產(chǎn)正交tRNA-氨?；鵷RNA合成酶對(duì)的方法和組合物”(MethodsandcompositionsfortheproductionoforthogonaltRNA-aminoacyltRNAsynthetasepairs)。保真度、效率和產(chǎn)率保真度指將所需分子，例如，非天然氨基酸或氨基酸摻入生長(zhǎng)的多肽中所需位置的準(zhǔn)確度。本發(fā)明翻譯組件響應(yīng)于選擇密碼子，以高保真度將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)中。例如，用本發(fā)明的組件，將所需非天然氨基酸摻入生長(zhǎng)多肽鏈中所需位置的效率(例如，響應(yīng)于選擇密碼子)相當(dāng)于將不需要的特異性天然氨基酸摻入生長(zhǎng)多肽鏈中所需位置的效率的例如，大于75%、大于85%、大于95%或甚至大于99%或更高。效率也可指與相應(yīng)的對(duì)照相比，O-RS氨?；哂蟹翘烊话被岬腛-tRNA的程度?？梢酝ㄟ^本發(fā)明O-RS的效率對(duì)其進(jìn)行限定。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，將一個(gè)O-RS與另一O-RS相比。例如，本發(fā)明O-RS氨?；哂蟹翘烊话被岬腛-tRNA的效率相當(dāng)于具有SEQIDNO.：86或45所列氨基酸序列(或表5中另一特異性RS)的O-RS氨?；疧-tRNA效率的例如，至少40%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或甚至99%或更高。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的O-RS氨?；哂蟹翘烊话被岬腛-tRNA的效率比O-RS氨?；哂刑烊话被岬腛-tRNA的效率高至少10倍，至少20倍，至少30倍等。用本發(fā)明的翻譯組件，含有非天然氨基酸的感興趣多肽的產(chǎn)率是從多核苷酸缺少選擇密碼子的細(xì)胞中獲得天然產(chǎn)生的感興趣多肽的產(chǎn)率的例如，至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、50%或更高。在另一方面，細(xì)胞在不存在非天然氨基酸的情況下生產(chǎn)感興趣多肽的產(chǎn)率是在非天然氨基酸存在下生產(chǎn)多肽產(chǎn)率的例如，小于30%、小于20%、小于15%、小于10%、小于5%、小于2.5%等。來源和宿主生物本發(fā)明的正交翻譯組件一般來自非真核生物，用于真核細(xì)胞或翻譯系統(tǒng)。例如，正交O-tRNA可以來自非真核生物，例如，真細(xì)菌，如大腸桿菌、嗜熱棲熱菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等，或古細(xì)菌，如詹氏甲烷球菌、熱自養(yǎng)甲烷桿菌、鹽桿菌屬如沃氏富鹽菌和鹽桿菌種NRC-1、閃爍古生球菌、激烈火球菌、堀越氏火球菌、敏捷氣熱菌等，正交O-RS可來自非真核生物，例如，真細(xì)菌，如大腸桿菌、嗜熱棲熱菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等，或古細(xì)菌，如詹氏甲烷球菌、熱自養(yǎng)甲烷桿菌、鹽桿菌屬如沃氏富鹽菌和鹽桿菌種NRC-1、閃爍古生球菌、激烈火球菌、堀越氏火球菌、敏捷氣熱菌等。另外，也可使用真核來源，例如，植物、藻類、原生生物、真菌、酵母、動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物、昆蟲、節(jié)肢動(dòng)物等)等，例如，其中組件與感興趣的的細(xì)胞或翻譯系統(tǒng)正交，或?qū)⑺鼈冃揎?例如，突變)為與細(xì)胞或翻譯系統(tǒng)正交。O-tRNA/O-RS對(duì)的單獨(dú)組件可以來自相同生物或不同生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，O-tRNA/O-RS對(duì)來自相同生物。例如，O-tRNA/O-RS對(duì)可以來自大腸桿菌的酪氨酰-tRNA合成酶/tRNACUA對(duì)。另外，O-tRNA/O-RS對(duì)的O-tRNA和O-RS任選地來自不同生物。可以在真核細(xì)胞中選擇或篩選和/或使用正交O-tRNA、O-RS或O-tRNA/O-RS對(duì)，以用非天然氨基酸生產(chǎn)多肽。真核細(xì)胞可以來自各種來源的任意一種，例如，植物(例如，高等植物，如單子葉植物或雙子葉植物)、藻類、原生生物、真菌、酵母(例如，釀酒酵母)、動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物、昆蟲、節(jié)肢動(dòng)物等)等。具有本發(fā)明翻譯組件的真核細(xì)胞組合物也是本發(fā)明的特征。本發(fā)明也提供在一種類中有效篩選，以任選地用于該種類和/或第二種類(任選地，無附加選擇/篩選)。例如，在一種類，如容易操縱的種類(如酵母細(xì)胞等)中選擇或篩選O-tRNA/O-RS的組件，并引入第二真核生物，例如，植物(例如，高等植物，如單子葉植物或雙子葉植物)、藻類、原生生物、真菌、酵母、動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物、昆蟲、節(jié)肢動(dòng)物等)等，用于將非天然氨基酸體內(nèi)摻入第二種類中。例如，可以將釀酒酵母(S.cerevisiae)選作第一種真核生物，因?yàn)樗菃渭?xì)胞的，具有快速的世代時(shí)間，并且已相當(dāng)良好地鑒定了它的遺傳學(xué)特征。參見，例如，D.Burke,等，(2000)《酵母遺傳學(xué)方法》(MethodsinYeastGenetics)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY。而且，因?yàn)檎婧松锏姆g機(jī)器是高度保守的(參見，例如，(1996)《翻譯控制》(TranslationalControl)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY；Y.Kwok和J.T.Wong，(1980)，用氨酰基-tRNA合成酶作為系統(tǒng)發(fā)育探針確定紅皮鹽桿菌和真核生物之間的進(jìn)化關(guān)系(EvolutionaryrelationshipbetweenHalobacteriumcutirubrumandeukaryotesdeterminedbyuseofaminoacyl-tRNAsynthetasesasphylogeneticprobes)，CanadianJournalofBiochemistry58：213-218；和(2001)核糖體(TheRibosome)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY)，可以將發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母用于摻入非天然氨基酸的aaRS基因引入高等真核生物中，與關(guān)聯(lián)tRNA合作使用(參見，例如，K.Sakamoto,等，(2002)將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性摻入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)中(Site-specificincorporationofanunnaturalaminoacidintoproteinsinmammaliancells)，NucleicAcidsRes.30：4692-4699；和C.Kohrer,等，(2001)，將琥珀和赭石抑制型tRNAs輸入哺乳動(dòng)物細(xì)胞：將氨基酸類似物位點(diǎn)特異性地插入蛋白質(zhì)中的通用方法(ImportofamberandochresuppressortRNAsintomammaliancells:ageneralapproachtosite-specificinsertionofaminoacidanaloguesintoproteins)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：14310-14315)以摻入非天然氨基酸。在一個(gè)實(shí)施例中，本文所述的在第一種類中生產(chǎn)O-tRNA/O-RS的方法還包括將編碼O-tRNA的核酸和編碼O-RS的核酸引入第二種類(例如，哺乳動(dòng)物、昆蟲、真菌、藻類、植物等)真核細(xì)胞中。在另一實(shí)施例中，通過在真核細(xì)胞中優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的正交tRNA來生產(chǎn)正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)的方法包括：(a)在非天然氨基酸存在下對(duì)第一種類(例如，酵母等)真核細(xì)胞的群體進(jìn)行正選擇。各真核細(xì)胞包含：i)氨?；?tRNA合成酶(RS)文庫(kù)的一員，ii)正交tRNA(O-tRNA)，iii)編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸，和iv)編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸。在正選擇下存活的細(xì)胞包含在非天然氨基酸存在下氨?；籺RNA(O-tRNA)的活性RS。將在正選擇下存活的細(xì)胞在不存在非天然氨基酸的情況下進(jìn)行負(fù)選擇，以去除氨?；哂刑烊话被岬腛-tRNA的活性RS。這提供了優(yōu)選地氨?；哂蟹翘烊话被岬腛-tRNA的O-RS。將編碼O-tRNA的核酸和編碼O-RS的核酸(或O-tRNA和/或O-RS的組件)引入第二種類，例如，哺乳動(dòng)物、昆蟲、真菌、藻類、植物和/或類似物)的真核細(xì)胞。一般地，通過將第一種類真核細(xì)胞的群體進(jìn)行負(fù)選擇而獲得O-tRNA，其中真核細(xì)胞包含tRNA文庫(kù)的一員。負(fù)選擇清除了被對(duì)真核細(xì)胞內(nèi)源性氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨?；膖RNA文庫(kù)的一員的細(xì)胞，這提供了與第一種類和第二種類真核細(xì)胞正交的tRNA庫(kù)。選擇密碼子本發(fā)明的選擇密碼子擴(kuò)展了蛋白質(zhì)生物合成機(jī)器的遺傳密碼子構(gòu)架。例如，選擇密碼子包括，例如，唯一的三堿基密碼子，無義密碼子如終止密碼子，例如，琥珀密碼子(UAG)、乳白密碼子(UGA)，非天然密碼子，至少一個(gè)四堿基密碼子，罕用密碼子等?？梢詫⒃S多選擇密碼引入所需基因，例如，一個(gè)或多個(gè)、兩個(gè)或多個(gè)、多余三個(gè)等。一旦基因可以包括給定選擇密碼子的多個(gè)拷貝，就可以包括多個(gè)不同的選擇密碼子，或它們的任意組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，方法包括在真核細(xì)胞中用選擇密碼子中的終止密碼子體內(nèi)摻入非天然氨基酸。例如，生產(chǎn)了識(shí)別終止密碼子，如UAG的O-tRNA，O-RS用所需非天然氨基酸將O-tRNA氨?；Ｌ烊划a(chǎn)生的宿主的氨?；?tRNA合成酶并不識(shí)別該O-tRNA。可用常規(guī)的定位誘變?cè)诟信d趣多肽的感興趣的位點(diǎn)引入終止密碼子，例如，TAG。參見，例如，Sayers，J.R.,等(1988)，在基于硫代磷酸的寡核苷酸-定向誘變中的5',3'核酸外切酶(5',3'Exonucleaseinphosphorothioate-basedoligonucleotide-directedmutagenesis)，NucleicAcidsRes.791-802。當(dāng)O-RS、O-tRNA和編碼感興趣多肽的核酸在體內(nèi)結(jié)合時(shí)，響應(yīng)于UAG密碼子摻入非天然氨基酸，產(chǎn)生在指定位置含有非天然氨基酸的多肽。非天然氨基酸的體內(nèi)摻入可以在不顯著擾亂真核宿主細(xì)胞的情況下完成。例如，因?yàn)閁AG密碼子的抑制效率取決于O-tRNA，如琥珀抑制型tRNA和真核釋放因子(例如，eRF)(它結(jié)合到終止密碼子上并起始生長(zhǎng)肽從核糖體中釋放)之間的競(jìng)爭(zhēng)，所以可以通過，例如增加O-tRNA如抑制型tRNA的表達(dá)水平來調(diào)節(jié)抑制效率。選擇密碼子也包括擴(kuò)展密碼子，例如，四個(gè)或多個(gè)堿基的密碼子，如四、五、六或更多堿基密碼子。四堿基密碼子的例子包括，例如，AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五堿基密碼子的例子包括，例如，AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本發(fā)明的特征包括根據(jù)移碼抑制使用擴(kuò)展密碼子。四個(gè)或多個(gè)堿基密碼子可以插入，例如，相同蛋白的一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸中。例如，在具有反密碼子環(huán)，如至少8-10個(gè)核苷酸反密碼子環(huán)的突變0-tRNA，如特殊的移碼抑制型tRNA的存在下，可以將四個(gè)或多個(gè)堿基密碼子閱讀為單個(gè)氨基酸。在其它實(shí)施方式中，該反密碼子環(huán)可以解碼，例如，至少四堿基密碼子、至少五堿基密碼子、或至少六堿基密碼子或更多。因?yàn)橛?56種可能的四堿基密碼子，所以在同一細(xì)胞中可以用四個(gè)或多個(gè)堿基密碼子編碼多個(gè)非天然氨基酸。參見，Anderson等，(2002)探索密碼子和反密碼子大小的限度(ExploringtheLimitsofCodonandAnticodonSize)，ChemistryandBiology，9：237-244；Magliery，(2001)擴(kuò)展遺傳密碼：選擇四堿基密碼子的有效抑制劑并用大腸桿菌中的文庫(kù)方法鑒定“不穩(wěn)定的”四堿基密碼子(ExpandingtheGeneticCode:SelectionofEfficientSuppressorsofFour-baseCodonsandIdentificationof"Shifty"Four-baseCodonswithaLibraryApproachinEscherichiacoli)，J.Mol.Biol.307：755-769。例如，用體外生物合成方法四堿基密碼子已用于將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)中。參見，例如，Ma等，(1993)Biochemistry，32：7939；和Hohsaka等，(1999)J.Am.Chem.Soc.，121：34。將CGGG和AGGU用于通過兩種化學(xué)?；囊拼a抑制型tRNA將2-萘基丙氨酸和賴氨酸的NBD衍生物體外同時(shí)摻入鏈霉抗生物素蛋白中，參見，例如，Hohsaka等，(1999)J.Am.Chem.Soc.，121：12194。在體內(nèi)研究中，Moore等檢測(cè)了tRNALeu衍生物與NCUA反密碼子抑制UAGN密碼子(N可以是U、A、G或C)的能力，發(fā)現(xiàn)tRNALeu用UCUA反密碼子可以解碼四聯(lián)體UAGA，效率為13至26%，在0或-1框中解碼少。參見，Moore等，(2000)J.Mol.Biol.，298：195。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明可使用基于罕用密碼子或無義密碼子的擴(kuò)展密碼子，它們可以降低在其它不需要位點(diǎn)上的錯(cuò)義連讀和移碼抑制。對(duì)于一個(gè)給定系統(tǒng)來說，選擇密碼子也可包括天然三堿基密碼子之一，其中內(nèi)源性系統(tǒng)并不使用(或很少使用)天然堿基密碼子。例如，這包括缺少識(shí)別天然三堿基密碼子的tRNA的系統(tǒng)和/或三堿基密碼子是罕用密碼子的系統(tǒng)。選擇密碼子任選地包括非天然堿基對(duì)。這些非天然堿基對(duì)還擴(kuò)展了現(xiàn)有的遺傳字母表。一個(gè)額外堿基對(duì)可以使三聯(lián)體密碼子的數(shù)目從64增加到125。第三個(gè)堿基對(duì)的性質(zhì)包括穩(wěn)定和選擇性堿基配對(duì)、聚合酶以高保真度有效酶促摻入DNA，新生非天然堿基對(duì)合成后有效連續(xù)的引物延伸?？梢赃m用于方法和組合物的非天然堿基對(duì)的描述包括，例如，Hirao,等，(2002)用于將氨基酸類似物摻入蛋白質(zhì)中的非天然堿基對(duì)，NatureBiotechnology，20：177-182。其它相關(guān)出版物見以下所列。對(duì)于體內(nèi)使用，非天然核苷是膜可透過的，將其磷酸化形成相應(yīng)的三磷酸鹽。此外，增加的遺傳信息是穩(wěn)定的，且不會(huì)被細(xì)胞酶所破壞。之前Benner和其他人所做的努力利用了與典范的Watson-Crick對(duì)不同的氫鍵模式，其中最制得注意的例子是異-C：異-G對(duì)。參見，例如，Switzer等，(1989)J.Am.Chem.Soc.，111：8322；和Piccirilli等，(1990)Nature，343：33；Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.，4：602。通常，這些堿基與天然堿基有某種程度的錯(cuò)配，不能酶促?gòu)?fù)制。Kool和同事們證明堿基間的疏水堆積相互作用可以替換氫鍵，以驅(qū)使堿基對(duì)形成。參見，Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.，4：602；和Guckian和Kool，(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，36，2825。在開發(fā)滿足上面所有要求的非天然堿基對(duì)的努力中，Schultz、Romesberg和同事們系統(tǒng)地合成并研究了一系列非天然疏水堿基。發(fā)現(xiàn)PICS：PICS自身-對(duì)比天然堿基對(duì)更穩(wěn)定，大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段(KF)可將其有效摻入DNA。參見，例如，McMinn等，(1999)J.Am.Chem.Soc.，121：11586；和Ogawa等，(2000)J.Am.Chem.Soc.，122：3274。KF可以以足夠于生物功能的效率和選擇性合成3MN：3MN自身-對(duì)。參見，例如，Ogawa等，(2000)J.Am.Chem.Soc.，122：8803。然而，兩種堿基都作為鏈終止劑，用于進(jìn)一步復(fù)制。最近發(fā)現(xiàn)，突變DNA聚合酶可以用于復(fù)制PICS自身對(duì)。此外，可以復(fù)制7AI自身對(duì)。參見，例如，Tae等，(2001)J.Am.Chem.Soc.，123：7439。也開發(fā)了新的金屬堿基對(duì)Dipic：Py，在結(jié)合Cu(II)時(shí)形成穩(wěn)定對(duì)。參見，Meggers等，(2000)J.Am.Chem.Soc.，122：10714。因?yàn)閿U(kuò)展密碼子和非天然密碼子本質(zhì)上是與天然密碼子正交的，所以本發(fā)明方法可以利用該性質(zhì)為它們產(chǎn)生正交tRNA。翻譯旁路系統(tǒng)也可用于在所需多肽中摻入非天然氨基酸。在翻譯旁路系統(tǒng)中，將大序列插入基因中，但不翻譯成蛋白。該序列包含作為誘導(dǎo)核糖體跳過該序列并繼續(xù)進(jìn)行插入的下游翻譯的提示的結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸本文使用的非天然氨基酸指任何氨基酸、修飾氨基酸，或不是硒半胱氨酸和/或吡咯賴氨酸的氨基酸類似物，下面是20種遺傳編碼的α-氨基酸：丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，色氨酸，酪氨酸，纈氨酸。式I說明α-氨基酸的遺傳結(jié)構(gòu)：非天然氨基酸一般是任何具有式I的結(jié)構(gòu)，其中R基團(tuán)是除了20種天然氨基酸中使用的一種以外的任何取代基。參見例如，L.Stryer的《生物化學(xué)》，第三版，1988，F(xiàn)reemanandCompany，NewYork中二十種天然氨基酸的結(jié)構(gòu)。需要注意的是，本發(fā)明的非天然氨基酸可以是除上述二十種α-氨基酸外的天然產(chǎn)生的化合物。因?yàn)楸景l(fā)明的非天然氨基酸一般與側(cè)鏈中的天然氨基酸不同，非天然氨基酸與其它氨基酸，例如，天然或非天然氨基酸以天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中形成的相同方式形成酰胺鍵。然而，非天然氨基酸具有使其與天然氨基酸不同的側(cè)鏈基團(tuán)。例如，式I中的R任選地包括烷基-、芳基-、?；?、酮基-、疊氮基-、羥基-、肼、氰基-、鹵素-、酰肼、鏈烯基、炔基、醚、硫醇、硒-、磺?；?、硼酸、硼酸鹽、磷?；?、膦?；?、膦、雜環(huán)、烯酮、亞胺、醛、酯、硫代酸、羥胺、胺等，或它們的任意組合。其它感興趣的的非天然氨基酸包括但不限于，含有可光敏化的交聯(lián)劑的氨基酸、自旋標(biāo)記的氨基酸、熒光氨基酸、金屬結(jié)合氨基酸、含金屬的氨基酸、放射性氨基酸、具有新官能團(tuán)的氨基酸、與其他分子共價(jià)或非共價(jià)相互作用的氨基酸、光籠蔽和/或可光致異構(gòu)的氨基酸、含有生物素或生物素-類似物氨基酸、含酮氨基酸、含有聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、可化學(xué)切割或可光切割的氨基酸、與天然氨基酸相比具有延長(zhǎng)側(cè)鏈的氨基酸（例如，聚醚或長(zhǎng)鏈烴，如大于約5、大于約10個(gè)碳等）、含有碳-連接糖的氨基酸、具有氧化還原活性的氨基酸、含有氨基硫代酸的氨基酸和含有一種或多種有毒部分的氨基酸。在一些實(shí)施方式中，非天然氨基酸具有可光敏化的交聯(lián)劑，它用于，例如，將蛋白質(zhì)連接到固體支持物上。在一個(gè)實(shí)施方式中，非天然氨基酸具有附著于氨基酸側(cè)鏈的糖部分(例如，糖基化氨基酸)和/或其它碳水化合物修飾。除含有新側(cè)鏈的非天然氨基酸以外，非天然氨基酸也任選地包含修飾的骨架結(jié)構(gòu)，例如，式II和III的結(jié)構(gòu)所示：其中Z一般包括OH、NH2、SH、NH-R'或S-R'；X和Y可以相同或不同，它們一般包括S或O，R和R'是任選地相同或不同，它們一般選自上述針對(duì)具有式I的非天然氨基酸R基團(tuán)成分的相同列表以及氫。例如，本發(fā)明非天然氨基酸任選地包括在氨基或羧基上的取代，如式II和III所示。該類非天然氨基酸包括但不限于例如，具有與普通的二十種然氨基酸相應(yīng)的側(cè)鏈或非天然側(cè)鏈的α-羥酸、α-硫代酸α-氨基硫代羧酸酯。此外，在α-碳上的取代任選地包括L、D或α-α-雙取代氨基酸，如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其它結(jié)構(gòu)替代物包括環(huán)氨基酸，如脯氨酸類似物，以及3、4、6、7、8和9元環(huán)脯氨酸類似物，β和γ氨基酸，如取代的β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。例如，很多非天然氨基酸是基于天然氨基酸的，如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等。酪氨酸類似物包括對(duì)位取代的酪氨酸、鄰位取代的酪氨酸和間位取代的酪氨酸，其中取代的酪氨酸包括，例如，酮基(例如乙?；?、苯甲?；被?、肼、羥胺、硫醇基、羧基、異丙基、甲基、C6-C20直鏈或支鏈烴、飽和或不飽和烴、0-甲基、聚醚、硝基、炔基等。此外，也考慮到多取代芳環(huán)。本發(fā)明的谷氨酰胺類似物包括但不限于，α-羥基衍生物、γ-取代衍生物、環(huán)狀衍生物和酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。苯丙氨酸類似物的例子包括但不限于，對(duì)位取代的苯丙氨酸、鄰位取代的苯丙氨酸和間位取代的苯丙氨酸，其中取代基包括，例如，羥基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、疊氮基、碘、溴、酮基(例如乙?；?、苯甲?；⑷不?。非天然氨基酸的具體例子包括但不限于、對(duì)-乙?；?L-苯丙氨酸、對(duì)-炔丙基氧基苯丙氨酸、0-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙?；?GlcNAcβ-絲氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸、對(duì)-?；?L-苯丙氨酸、對(duì)-苯甲?；?L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦酰基絲氨酸、膦?；野彼?、對(duì)-碘代-苯丙氨酸、對(duì)-溴苯丙氨酸、對(duì)-氨基-L-苯丙氨酸和異丙基-L-苯丙氨酸等。非天然氨基酸結(jié)構(gòu)的例子見圖7，B組和圖11。例如，WO2002/085923題為“體內(nèi)摻入非天然氨基酸”的圖16、17、18、19、26和29中提供了其它結(jié)構(gòu)的各種非天然氨基酸。也可從Kiick等，(2002)通過Staudinger連接將疊氮化物摻入重組蛋白中用于化學(xué)選擇性修飾，PNAS99：19-24的圖1結(jié)構(gòu)2-5中參見其它甲硫氨酸類似物。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了包括非天然氨基酸(如對(duì)-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸)的組合物。也提供了各種含有對(duì)-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸和，如蛋白和/或細(xì)胞的組合物。在一個(gè)方面，包括對(duì)-(炔丙基氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的組合物還包括正交tRNA。非天然氨基酸可(如共價(jià))結(jié)合到正交tRNA上，例如，通過氨基-?；I共價(jià)結(jié)合到正交tRNA上，共價(jià)結(jié)合到正交tRNA的末端核糖的3'OH或2'OH上等。通過可以摻入蛋白的非天然氨基酸的化學(xué)部分提供了各種優(yōu)點(diǎn)和對(duì)蛋白的操縱。例如，酮官能團(tuán)的獨(dú)特反應(yīng)性允許用許多含肼或羥胺的試劑在體外和體內(nèi)進(jìn)行蛋白選擇性修飾。重原子非天然氨基酸，例如，可以用于取向X射線結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。用非天然氨基酸位點(diǎn)特異性引入重原子也在選擇重原子位置方面提供了選擇和靈活性。光敏非天然氨基酸(例如，具有二苯甲酮和芳基疊氮化物(例如，苯基疊氮化物)側(cè)鏈的氨基酸)，例如，允許蛋白在體內(nèi)和體外進(jìn)行有效的光交聯(lián)。光敏非天然氨基酸的例子包括但不限于，例如，對(duì)-疊氮基-苯丙氨酸和對(duì)-苯甲酰基-苯丙氨酸。然后，可以通過激發(fā)光敏基團(tuán)-提供暫時(shí)(和/或空間)對(duì)照，任意交聯(lián)具有光敏非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施例中，可以用同位素標(biāo)記的，例如甲基取代非天然氨基的甲基，在例如使用核磁共振和振動(dòng)光譜學(xué)中用作局部結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的探針。炔基或疊氮基官能團(tuán)，例如，允許通過[3+2]環(huán)加成反應(yīng)用分子選擇性修飾蛋白質(zhì)。非天然氨基酸的化學(xué)合成許多上面提供的非天然氨基酸都可以從，例如，Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee，WI，USA)購(gòu)得。如本文所提供的方法或各種出版物中所提供的方法或用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法任選地合成那些不能從市場(chǎng)上購(gòu)得的非天然氨基酸。有機(jī)合成技術(shù)參見，例如，F(xiàn)essendon和Fessendon的《有機(jī)化學(xué)》，(1982，第二版，WillardGrantPress，BostonMass.)；March的《高級(jí)有機(jī)化學(xué)》(第三版，1985，WileyandSons，NewYork)；和Carey和Sundberg的《高級(jí)有機(jī)化學(xué)》(第三版，A和B部分，1990，PlenumPress，NewYork)。描述非天然氨基酸合成的其它出版物包括，例如，WO2002/085923題為“體內(nèi)摻入非天然氨基酸”(InvivoincorporationofUnnaturalAminoAcids)；Matsoukas等，(1995)J.Med.Chem.，38,4660-4669；King，F(xiàn).E.&Kidd，D.A.A.(1949)從鄰苯二甲酸的中間體新合成谷氨酰胺和谷氨酸γ-二肽(ANewSynthesisofGlutamineandofγ-DipeptidesofGlutamicAcidfromPhthylatedIntermediates)，J.Chem.Soc.，3315-3319；Friedman，O.M.&Chatterrji，R.(1959)合成谷胺酰胺衍生物作為抗腫瘤劑的模式底物(SynthesisofDerivativesofGlutamineasModelSubstratesforAnti-TumorAgents)，J.Am.Chem.Soc.81,3750-3752；Craig，J.C.等(1988)7-氯-4[[4-(二乙氨基)-1-甲基丁基]氨基]喹啉(氯喹)的對(duì)映體的絕對(duì)構(gòu)型(AbsoluteConfigurationoftheEnantiomersof7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine))，J.Org.Chem.53,1167-1170；Azoulay，M.，Vilmont，M.&Frappier，F(xiàn).(1991)作為潛在抗瘧藥的谷胺酰胺類似物(GlutaminanaloguesasPotentialAntimalarials)，Eur.J.Med.Chem.26,201-5；Koskinen，A.M.P.&Rapoport，H.(1989)合成構(gòu)象受限的氨基酸類似物4-取代脯氨酸(Synthesisof4-SubstitutedProlinesasConformationallyConstrainedAminoAcidAnalogues)，J.Org.Chem.54，1859-1866；Christie，B.D.&Rapoport，H.(1985)從L-天冬酰胺合成光學(xué)純的2-哌啶酸(SynthesisofOpticallyPurePipecolatesfromL-Asparagine)。應(yīng)用于通過氨基酸脫羰和亞胺離子環(huán)化全合成(+)-阿撲長(zhǎng)春胺(ApplicationtotheTotalSynthesisof(+)-ApovincaminethroughAminoAcidDecarbonylationandIminiumIonCyclization)，J.Org.Chem.1989：1859-1866；Barton等，(1987)用自由基化學(xué)合成新α-氨基酸和衍生物：合成L-和D-α-氨基-己二酸、L-α-氨基庚二酸和合適的非飽和衍生物(SynthesisofNovelα-Amino-AcidsandDerivativesUsingRadicalChemistry:SynthesisofL-andD-α-Amino-AdipicAcids,L-α-aminopimelicAcidandAppropriateUnsaturatedDerivatives)，TetrahedronLett.43：4297-4308；和，Subasinghe等，(1992)使君子氨酸類似物：β-雜環(huán)2-氨基丙酸衍生物的合成及其在新使君子氨酸-敏化位點(diǎn)上的活性(Quisqualicacidanalogues:synthesisofbeta-heterocyclic2-aminopropanoicacidderivativesandtheiractivityatanovelquisqualate-sensitizedsite)，J.Med.Chem.35：4602-7。也參見2002年12月22日提交的代理人案卷編號(hào)P1001USOO的專利申請(qǐng)--題為“蛋白質(zhì)陣列(ProteinArrays)”。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了合成對(duì)-(炔丙基氧基)苯丙氨酸化合物的方法。方法包括，例如，(a)將N-叔-丁氧基羰基-酪氨酸和K2CO3懸浮在無水DMF中；(b)將炔丙基溴加入(a)的反應(yīng)混合物中，烷化羥基和羧基，產(chǎn)生保護(hù)的中間體化合物，該化合物具有結(jié)構(gòu)：和(c)將保護(hù)的中間體化合物與無水HCl在MeOH中混合，使胺部分去保護(hù)，從而合成對(duì)-(炔丙基氧基)苯丙氨酸化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法還包括(d)在NaOH和MeOH的水溶液中溶解對(duì)-(炔丙基氧基)苯丙氨酸HCl，室溫?cái)嚢瑁?e)將pH調(diào)整到pH7；和(f)沉淀對(duì)-(炔丙基氧基)苯丙氨酸化合物。參見例如，本文實(shí)施例4中炔丙基氧基苯丙氨酸的合成。非天然氨基酸的細(xì)胞攝取當(dāng)設(shè)計(jì)和選擇非天然氨基酸時(shí)，一般會(huì)考慮的一個(gè)問題是真核細(xì)胞對(duì)非天然氨基酸的攝取，例如，摻入蛋白。例如，α-氨基酸的高電荷密度提示這些化合物不大可能是細(xì)胞可透的。通過收集基于蛋白的運(yùn)輸系統(tǒng)將天然氨基酸攝入真核細(xì)胞?？梢酝瓿稍u(píng)價(jià)細(xì)胞攝取哪一種，如果有的話，非天然氨基酸的快速篩選。參見，例如，2002年12月22日提交的代理人案卷編號(hào)P1001USOO的申請(qǐng)，題為”蛋白質(zhì)陣列(ProteinArrays)”中的例如，毒性測(cè)定；和Liu，D.R.&Schultz，P.G.(1999)擴(kuò)展遺傳密碼有助于生物進(jìn)化的進(jìn)行，PNASUnitedStates96：4780-4785。雖然可以用各種測(cè)定容易地分析攝取，但是設(shè)計(jì)適合細(xì)胞攝取途徑的非天然氨基酸的替代途徑是提供體內(nèi)產(chǎn)生氨基酸的生物合成途徑。非天然氨基酸的生物合成細(xì)胞中已經(jīng)存在很多生物合成途徑，用于生產(chǎn)氨基酸和其它化合物。然而在自然界中，例如在真核細(xì)胞中，可能并不存在針對(duì)具體非天然氨基酸的生物合成方法，本發(fā)明提供了這種方法。例如，在宿主細(xì)胞中通過加入新酶或修飾已有的宿主細(xì)胞途徑任選地產(chǎn)生非天然氨基酸的生物合成途徑。附加新酶是任選地天然產(chǎn)生的酶或人工產(chǎn)生的酶。例如，對(duì)-氨基苯丙氨酸的生物合成(如WO2002/085923題為“體內(nèi)摻入非天然氨基酸”中的實(shí)施例所述)取決于加入來自其它生物的已知酶的組合?？梢酝ㄟ^用含有基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞將這些酶的基因引入真核細(xì)胞中。當(dāng)這些基因在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，它們提供了合成所需化合物的酶途徑。下面的實(shí)施例中提供了任選加入的酶類型的例子。附加酶的序列在，例如，Genbank中發(fā)現(xiàn)。也將人工產(chǎn)生的酶以相同方式任選地加入細(xì)胞。在該方式中，操縱細(xì)胞機(jī)器和細(xì)胞的資源以生產(chǎn)非天然氨基酸。對(duì)于生產(chǎn)用于生物合成途徑或用于發(fā)展已有途徑的新酶，可以使用各種方法。例如，將Maxygen，Inc開發(fā)的如，循環(huán)重組(可從萬維網(wǎng)的www.maxygen.com得到)，任選地用于開發(fā)新酶和途徑。參見，例如，Stemmer(1994),‘通過DNA改組在體外快速演化蛋白(RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling)，Nature370(4)：389-391；和，Stemmer，(1994)，通過隨機(jī)片段化和再組裝進(jìn)行DNA改組：用于分子演化的體外重組(DNAshufflingbyrandomfragmentationandreassembly:Invitrorecombinationformolecularevolution)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，91：10747-10751。類似地，將Genencor開發(fā)的(可從萬維網(wǎng)的genencor.com得到)DesignPathTM任選地用于代謝途徑工程，例如，設(shè)計(jì)在細(xì)胞中產(chǎn)生0-甲基-L-酪氨酸的途徑，該技術(shù)用新基因組合，例如通過功能基因組學(xué)鑒定，分子演化和設(shè)計(jì)重建了在宿主生物中的已有途徑。DiversaCorporation(可從萬維網(wǎng)diversa.com得到)也提供了快速篩選基因文庫(kù)和基因途徑的技術(shù)，例如，建立新途徑。一般地，用本發(fā)明設(shè)計(jì)的生物合成途徑生產(chǎn)非天然氨基酸是在足夠有效的蛋白生物合成的濃度下生產(chǎn)的，例如，天然細(xì)胞的量，但不至于達(dá)到影響其它氨基酸濃度或耗盡細(xì)胞資源的程度。以此方式體內(nèi)生產(chǎn)的典型濃度是約10mM至約0.05mM。一旦用含有用于生產(chǎn)具體途徑所需酶的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞并產(chǎn)生非天然氨基酸，就任選地用體內(nèi)選擇進(jìn)一步優(yōu)化非天然氨基酸的生產(chǎn)，用于核糖體蛋白合成和細(xì)胞生長(zhǎng)。具有非天然氨基酸的多肽具有至少一個(gè)非天然氨基酸的感興趣的蛋白或多肽是本發(fā)明的特征。本發(fā)明也包括具有至少一個(gè)用本發(fā)明組合物和方法生產(chǎn)的非天然氨基酸的多肽或蛋白。賦形劑(例如，藥學(xué)上可接受的賦形劑)也可與該蛋白一起存在。通過用至少一種非天然氨基酸在真核細(xì)胞中生產(chǎn)感興趣的蛋白或多肽，蛋白或多肽一般包括真核生物翻譯后修飾。在某些實(shí)施方式中，蛋白包括至少一個(gè)非天然氨基酸和至少一個(gè)由真核細(xì)胞體內(nèi)產(chǎn)生的翻譯后修飾，其中該翻譯后修飾不是由原核細(xì)胞產(chǎn)生的。例如，該翻譯后修飾包括，例如，乙酰化、?；?、脂質(zhì)-修飾、棕櫚?；?、棕櫚酸加成、磷酸化、糖脂-連接修飾、糖基化等。在一個(gè)方面，該翻譯后修飾包括將寡糖(例如，(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc))通過GlcNAc-天冬酰胺連接附著到天冬酰胺上。也參見，表7，該表列出了與真核生物蛋白(也可存在附加殘基，未顯示)N-連接的寡糖的一些例子。在另一方面，該翻譯后修飾包括將寡糖(例如，Gal-GaINAc，Gal-GlcNAc等)通過GalNAc-絲氨酸或GaINAc-蘇氨酸連接，或GlcNAc-絲氨酸或GlcNAc-蘇氨酸連接附著到絲氨酸或蘇氨酸上。表7：通過GlcNAc-連接的寡糖的例子在又一方面，該翻譯后修飾包括蛋白酶水解加工前體(例如，降鈣素前體、降鈣素基因-相關(guān)的肽前體、前甲狀旁腺激素原、前胰島素原、胰島素原、前阿片黑皮素原、阿片黑皮素原等)，組裝成多亞基蛋白質(zhì)或大分子組裝，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的另一位點(diǎn)(例如細(xì)胞器，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細(xì)胞核、溶酶體、過氧化物酶體、線粒體、葉綠體、液泡等，或通過分泌途徑)。在某些實(shí)施方式中，該蛋白包含分泌或定位序列、表位標(biāo)記、FLAG標(biāo)記、聚組氨酸標(biāo)記、GST融合等。非天然氨基酸的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它提供附加化學(xué)部分，可以用來加入附加分子。這些修飾可以在真核細(xì)胞中體內(nèi)生成，或體外生成。因此，在某些實(shí)施方式中，翻譯后修飾是通過非天然氨基酸的。例如，翻譯后修飾可以通過親核-親電子反應(yīng)。大部分現(xiàn)在用于選擇性修飾蛋白的反應(yīng)涉及親核和親電子反應(yīng)配偶體之間共價(jià)鍵形成，例如具有組氨酸或半胱氨酸側(cè)鏈α-鹵代酮的反應(yīng)。這些情況中的選擇性由蛋白中親核殘基的數(shù)量和可及性決定。在本發(fā)明蛋白質(zhì)中，可以用其它更具選擇性的反應(yīng)，如具有酰肼的非天然酮式-氨基酸或氨氧基化合物在體外和體內(nèi)的反應(yīng)。參見，例如，Cornish,等，(1996)Am.Chem.Soc.，118：8150-8151；Mahal,等，(1997)Science，276：1125-1128；Wang,等，(2001)Science292：498-500；Chin,等，(2002)Am.Chem.Soc.124：9026-9027；Chin,等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，99：11020-11024；Wang,等，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.，100：56-61；Zhang,等，(2003)Biochemistry，42：6735-6746；和Chin,等，(2003)Science，印刷中。這允許用許多試劑，包括熒光團(tuán)、交聯(lián)劑、糖衍生物和細(xì)胞毒性分子對(duì)基本上任何蛋白進(jìn)行選擇性標(biāo)記。也參見，2003年10月15日提交的題為“糖蛋白合成”(Glycoproteinsynthesis)的專利申請(qǐng)USSN10/686,944。例如，通過疊氮基氨基酸進(jìn)行的翻譯后修飾也可通過Staudinger連接(例如，用三芳基膦試劑)進(jìn)行。參見，例如，Kiick等，(2002)將疊氮化合物摻入重組蛋白中用于通過Staudinger連接進(jìn)行化學(xué)選擇性修飾(IncorporationofazidesintorecombinantproteinsforchemoselectivemodificationbytheStaudingerligtation)，PNAS99：19-24。本發(fā)明提供了選擇性修飾蛋白的另一高效方法，它包括響應(yīng)于選擇密碼子，將非天然氨基酸，例如，含有疊氮化物或炔基部分的非天然氨基酸(參見，例如，圖11的2和1)遺傳摻入蛋白質(zhì)中。然后可以通過，例如，Huisgen[3+2]環(huán)加成反應(yīng)(參見，例如，Padwa，A.《綜合有機(jī)合成》(ComprehensiveOrganicSynthesis)，第4卷，(1991)Trost，B.M.編，Pergamon，Oxford，第1069-1109頁；和Huisgen，R.《1.3-雙極還加成化學(xué)》(1,3-DipolarCycloadditionChemistry)，(1984)Padwa，A.編，Wiley，NewYork，第1-176頁)分別用例如，炔基或疊氮化物衍生物來修飾這些氨基酸側(cè)鏈。參見，例如，圖16。因?yàn)樵摲椒òōh(huán)加成而不是親核取代，所以可以以極高的選擇性來修飾蛋白質(zhì)。該反應(yīng)可以在室溫下、含水條件中以極好的區(qū)域選擇性(1,4>1,5)通過將催化量的Cu(I)鹽加入到反應(yīng)混合物中進(jìn)行。參見，例如，Tornoe,等，(2002)Org.Chem.67：3057-3064；和Rostovtsev,等，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.Eng.41：2596-2599?？梢允褂玫牧硪环椒ㄊ蔷哂兴陌腚装彼峄虻碾p砷化合物上的配體交換，參見，例如，Griffin,等，(1998)Science281：269-272。可以通過[3+2]環(huán)加成加入大批本發(fā)明蛋白的分子包括實(shí)際上任何具有疊氮基或炔基衍生物的分子。參見，例如，本文實(shí)施例3和5。這種分子包括但不限于，染料、熒光團(tuán)、交聯(lián)劑、糖衍生物、聚合物(例如，聚乙二醇的衍生物)、光交聯(lián)劑、細(xì)胞毒化合物、親和標(biāo)記、生物素的衍生物、樹脂、珠、第二個(gè)蛋白或多肽(或更多)、多核苷酸(例如，DNA、RNA等)、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物等。參見，例如，本文的圖13A和實(shí)施例3和5?？梢詫⑦@些分子分別加入到具有炔基的非天然氨基酸，如對(duì)-炔丙基氧基苯丙氨酸，或具有疊氮基的非天然氨基酸，如對(duì)-疊氮基-苯丙氨酸中。例如，參見圖13B和圖17A。在另一方面，本發(fā)明提供了包括這種分子的組合物和生產(chǎn)這些分子，例如，疊氮基染料(如化學(xué)結(jié)構(gòu)4和化學(xué)結(jié)構(gòu)6中所示)、炔基聚乙二醇(例如，化學(xué)結(jié)構(gòu)7中所示)的方法，其中n是例如，50和10,000、75和5,000、100和2,000、100和1,000等之間的整數(shù)。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，炔基聚乙二醇的分子量為，例如，約5,000至約100,000Da、約20,000至約50,000Da、約20,000至約10,000Da(例如，20,000Da)等。也提供了包含這些化合物，例如，與蛋白和細(xì)胞的各種組合物。在本發(fā)明的一個(gè)方面，含有疊氮基染料(例如，化學(xué)結(jié)構(gòu)4或化學(xué)結(jié)構(gòu)6)的蛋白還包括至少一種非天然氨基酸(例如，炔基氨基酸)，其中通過[3+2]環(huán)加成將疊氮基染料附著到非天然氨基酸上。在一個(gè)實(shí)施方式中，蛋白包括化學(xué)結(jié)構(gòu)7的炔基聚乙二醇。在另一實(shí)施方式中，該組合物還包括至少一種非天然氨基酸(例如，疊氮基氨基酸)，其中通過[3+2]環(huán)加成將炔基聚乙二醇附著到非天然氨基酸上。也提供了用于合成疊氮基染料的方法。例如，一種該方法包含：(a)提供含有磺酰鹵化物部分的染料化合物；(b)在3-疊氮基丙胺和三乙胺的存在下將染料化合物加熱到室，將3-疊氮基丙胺的胺部分與染料化合物的鹵化物位置偶聯(lián)，從而合成疊氮基染料。在一個(gè)例子實(shí)施方式中，該染料化合物包括丹磺酰氯，該疊氮基染料包括化學(xué)結(jié)構(gòu)4的組合物。在一個(gè)方面，該方法還包括從反應(yīng)混合物中純化疊氮基染料。參見，例如，本文實(shí)施例5。在另一實(shí)施例中，合成疊氮基染料的方法包括(a)提供含胺的染料化合物；(b)在合適的溶劑中將含胺的染料化合物與碳二亞胺和4-(3-疊氮基丙基氨甲?；?-丁酸混合，將該酸的羰基與染料化合物的胺部分偶聯(lián)，從而合成疊氮基染料。在一個(gè)實(shí)施方式中，碳二亞胺包括1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)。在一個(gè)方面，含胺的染料包括熒光胺，合適溶劑包括吡啶。例如，含胺的染料任選地包括熒光胺，疊氮基染料任選地包括化學(xué)結(jié)構(gòu)6的組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法還包括(c)沉淀疊氮基染料；(d)用HCl洗滌沉淀；(e)在EtOAc中溶解洗滌的沉淀；和(f)在己烷中沉淀疊氮基染料。參見，例如，本文實(shí)施例5。也提供了合成炔丙基酰胺聚乙二醇的方法。例如，該方法包括將炔丙基胺與聚乙二醇(PEG)-羥基琥珀酰亞胺酯在有機(jī)溶劑(例如，CH2Cl2)中室溫下反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)結(jié)構(gòu)7的炔丙基酰胺聚乙二醇。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法還包括用乙酸乙酯沉淀炔丙基酰胺聚乙二醇。在一個(gè)方面，該方法還包括在甲醇中再結(jié)晶炔丙基酰胺聚乙二醇；和真空下干燥產(chǎn)物。參見，例如，本文的實(shí)施例5。本發(fā)明的真核細(xì)胞提供了合成包含大有用量的非天然氨基酸的蛋白的能力。在一個(gè)方面，該組合物任選地包括，例如，至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克或更多含有非天然氨基酸的蛋白，或用體內(nèi)蛋白生產(chǎn)方法可獲得的量(本文詳細(xì)提供了重組蛋白生產(chǎn)和純化)。在另一方面，該蛋白任選地以存在于組合物中，即在例如，細(xì)胞裂解物、緩沖液、藥物緩沖液或其它懸浮液(例如，體積為，例如，從約1納升至約100升)中的濃度為例如，每升至少10微克蛋白、每升至少50微克蛋白、每升至少75微克蛋白、每升至少100微克蛋白、每升至少200微克蛋白、每升至少250微克蛋白、每升至少500微克蛋白、每升至少1毫克蛋白或每升至少10毫克蛋白或更多。在真核細(xì)胞中包括至少一種非天然氨基酸的蛋白的大量生產(chǎn)(例如，比用其它方法，例如，體外翻譯一般性可能量更大)是本發(fā)明的特征。可以完成非天然氨基酸的摻入以，例如，修改蛋白結(jié)構(gòu)和/或功能中的變化，例如，改變大小、酸度、親核性、氫鍵合、疏水性、蛋白酶靶位點(diǎn)的可及性，靶向一個(gè)部分(例如，蛋白陣列)等。包括非天然氨基酸的蛋白可具有增加的或甚至新的催化或物理性質(zhì)。例如，通過蛋白中包括非天然氨基酸任選地修飾了下面的性質(zhì)：毒性、生物分布、結(jié)構(gòu)性質(zhì)、光譜性質(zhì)、化學(xué)和/或光化學(xué)性質(zhì)、催化能力、半衰期(例如、血清半衰期)、與其它分子反應(yīng)的能力、例如、共價(jià)或非共價(jià)等。含有包括至少一種非天然氨基酸的蛋白的組合物可用于，例如，新治療、診斷、催化酶、工業(yè)酶、結(jié)合蛋白(例如，抗體)和例如，蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究。參見，例如，Dougherty，(2000)非天然氨基酸用作蛋白結(jié)構(gòu)和功能的探針(UnnaturalAminoAcidsasProbesofProteinStructureandFunction)，CurrentOpinioninChemicalBiology，4：645-652。在本發(fā)明的一個(gè)方面，組合物包括至少一種具有至少一個(gè)，例如，至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)、至少九個(gè)或至少十個(gè)或更多的非天然氨基酸的蛋白。非天然氨基酸可以是相同或不同的，例如，在蛋白中可以有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多不同位點(diǎn)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多不同非天然氨基酸。在另一方面，組合物包括蛋白中存在的至少一種，但少于全部的具體氨基酸被非天然氨基酸取代的蛋白。對(duì)于給定的具有多于一個(gè)非天然氨基酸的蛋白來說，非天然氨基酸可以是相同或不同的(例如，該蛋白可包括兩種或多種不同類型的非天然氨基酸，或可包括兩種相同的非天然氨基酸)。對(duì)于給定的具有多于兩個(gè)非天然氨基酸的蛋白來說，非天然氨基酸可以是相同、不同或同種的多個(gè)非天然氨基酸與至少一種不同的非天然氨基酸的組合。從本質(zhì)上說，可以用本文的組合物和方法生產(chǎn)任何包括非天然氨基酸(和任意相應(yīng)的編碼核酸，例如，該核酸包括一種或多種選擇密碼子)的蛋白(或其部分)。沒有對(duì)幾十萬的已知蛋白進(jìn)行鑒定的嘗試，這些蛋白中任意一個(gè)都可被修飾為包括一種或多種非天然氨基酸，例如，通過修改任何可用的突變方法在相關(guān)翻譯系統(tǒng)中包括一種或多種合適的選擇密碼子。已知蛋白的普通序列庫(kù)包括GenBankEMBL、DDBJ和NCBI。通過搜索因特網(wǎng)可容易地識(shí)別其它庫(kù)。一般地，蛋白與任意可用蛋白(例如，治療蛋白、診斷蛋白、工業(yè)酶或它們的一部分等)，例如，至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%或更多相同，它們包含一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸?？梢孕揎棸ㄒ环N或多種非天然氨基酸的治療、診斷和其它蛋白的例子包括但不限于，例如，α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗體(抗體的進(jìn)一步詳述見下)、載脂蛋白、脫輔蛋白質(zhì)、心鈉素、心房鈉尿多肽、心房肽、C-X-C趨化因子(例如，T39765，NAP-2，ENA-78，Gro-a，Gro-b，Gro-c，IP-10，GCP-2，NAP-4，SDF-1，PF4，MIG)、降鈣素、CC趨化因子(例如，單核細(xì)胞趨化蛋白-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-2、單核細(xì)胞趨化蛋白-3、單核細(xì)胞炎癥蛋白-1α、單核細(xì)胞炎癥蛋白-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262)、CD40配體、C-kit配體、膠原、集落刺激因子(CSF)、補(bǔ)體因子5α、補(bǔ)體抑制劑、補(bǔ)體受體1、細(xì)胞因子、(例如，上皮嗜中性粒細(xì)胞激活肽-78、GROα/MGSA、GROβ、GROγ、MIP-lα、MIP-1δ、MCP-1)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、促紅細(xì)胞生成素(“EPO”，代表通過摻入一種或多種非天然氨基酸進(jìn)行修飾的優(yōu)選靶)、剝脫性毒素A和B、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、纖維蛋白原、纖連蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺素、生長(zhǎng)因子、Hedgehog蛋白(例如，Sonic，Indian，Desert)、血紅蛋白、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白、胰島素、胰島素-樣生長(zhǎng)因子(IGF)、干擾素(例如，IFN-α、IFN-β、IFN-Y)、白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12等)、角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、乳鐵蛋白、白血病抑制因子、熒光素酶、Neurturin、嗜中性粒細(xì)胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素(例如，人生長(zhǎng)激素)、多效營(yíng)養(yǎng)因子、蛋白A、蛋白G、熱源性外毒素A、B和C、松弛素、腎素、SCF、可溶性補(bǔ)體受體I、可溶性I-CAM1、可溶性白介素受體(IL-1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15)、可溶性TNF受體、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、促生長(zhǎng)素抑制素、促生長(zhǎng)素、鏈激酶、超抗原即葡萄球菌腸毒素(SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE)、超氧化物歧化酶(SOD)、中毒性休克綜合征毒素(TSST-1)、胸腺素α1、組織纖溶酶原激活物、腫瘤壞死因子β(TNFβ)、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、腫瘤壞死因子-α(TNFα)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGEF)、尿激酶和許多其它物質(zhì)。一類可用本文描述的用于體內(nèi)摻入非天然氨基酸的組合物和方法制成的蛋白包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑或其部分。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑的例子包括調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、調(diào)節(jié)等的基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。在原核生物、病毒和真核生物包括真菌、植物、酵母、昆蟲和動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑，這提供了大量的治療靶。應(yīng)理解表達(dá)和轉(zhuǎn)錄激活物通過很多機(jī)制，例如，通過與受體結(jié)合、刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)、與啟動(dòng)子和增強(qiáng)子結(jié)合、與結(jié)合到啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的蛋白結(jié)合、解旋DNA、剪接前mRNA、聚腺苷化RNA和降解RNA來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。例如，真核細(xì)胞中的GAL4蛋白或其部分的組合物也是本發(fā)明的特征。一般地，GAL4蛋白或其部分含有至少一個(gè)非天然氨基酸。也參見本文中題為“正交氨酰基-tRNA合成酶”的部分。一類本發(fā)明的蛋白(例如，具有一種或多種非天然氨基酸的蛋白)包括表達(dá)激活物，如細(xì)胞因子、炎癥分子、生長(zhǎng)因子、它們的受體和癌基因產(chǎn)物，例如，白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-8等)、干擾素、FGF、IGF-I、IGF-II、FGF、PDGF、TNF、TGF-α、TGF-β、EGF、KGF、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-1、ICAM-1/LFA-1和透明質(zhì)酸苷/CD44；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和相應(yīng)的癌基因產(chǎn)物，例如，Mos、Ras、Raf和Met；以及轉(zhuǎn)錄激活物和抑制物，例如，p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel和甾類激素受體如雌激素、孕酮、睪酮、醛固酮、LDL受體配體和皮質(zhì)酮受體。本發(fā)明也提供了具有至少一個(gè)非天然氨基酸的酶(例如，工業(yè)酶)或其部分。酶的例子包括但不限于，例如，酰胺酶、氨基酸消旋酶、?；?、脫鹵素酶、加雙氧酶、二芳基丙烷過氧化物酶、差向異構(gòu)酶、環(huán)氧化物水解酶、酯酶、異構(gòu)酶、激酶、葡萄糖異構(gòu)酶、糖苷酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、鹵素過氧化物酶、單加氧酶(如p450)、脂肪酶、木質(zhì)素過氧化物酶、腈水合酶、腈水解酶、蛋白酶、磷酸酶、枯草桿菌蛋白酶、轉(zhuǎn)氨酶和核酸酶。很多這些蛋白可從市場(chǎng)上購(gòu)得(參見，例如，SigmaBioSciences2002目錄和價(jià)格表)，相應(yīng)的蛋白序列和基因一般還有它們的很多變體是熟知的(參見，例如，Genbank)?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明通過插入一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸對(duì)它們中的任一進(jìn)行修飾，例如，根據(jù)一種或多種治療、診斷或感興趣的的酶性質(zhì)改變蛋白。治療相關(guān)性質(zhì)的例子包括血清半衰期、儲(chǔ)存半衰期、穩(wěn)定性、免疫原性、治療活性，可檢測(cè)性(例如，在非天然氨基酸中包括報(bào)道基團(tuán)(例如，標(biāo)記或標(biāo)記結(jié)合位點(diǎn)))、LD50的降低或其它副作用、通過消化道進(jìn)入身體的能力(例如口服利用度)等。診斷性質(zhì)的例子包括儲(chǔ)存半衰期、穩(wěn)定性、診斷活性，可檢測(cè)性等。相關(guān)酶性質(zhì)的例子包括儲(chǔ)存半衰期、穩(wěn)定性、酶活性、生產(chǎn)能力等。也可以修飾各種其它蛋白，以包括本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸。例如，本發(fā)明可包括例如，在來自感染性真菌，例如，曲霉，假絲酵母種；細(xì)菌，具體是作為病原菌模型的大腸桿菌，和醫(yī)學(xué)上重要的細(xì)菌如葡萄球菌屬(例如，金黃色(葡萄球菌))或鏈球菌屬(例如，肺炎(鏈球菌))；原生動(dòng)物如孢子蟲綱(例如瘧原蟲)、根足蟲類(例如內(nèi)變形蟲屬)和鞭毛蟲類(錐蟲屬、利什曼蟲屬、毛滴蟲屬、賈第蟲屬等)；病毒如(+)RNA病毒(例子包括痘病毒，如牛痘病毒；細(xì)小核糖核酸病毒，例如脊髓灰質(zhì)炎病毒；被膜病毒，例如風(fēng)疹病毒；黃病毒，例如HCV；和冠狀病毒)，(-)RNA病毒(例如，彈狀病毒，例如VSV；副粘病毒，例如RSV；正粘病毒，例如流感病毒；布尼亞病毒和沙粒病毒)，dsDNA病毒(例如呼腸弧病毒)，RNA至DNA病毒，即逆轉(zhuǎn)錄病毒，如HIV和HTLV，以及某些DNA至RNA病毒，如乙肝病毒的蛋白中，用非天然氨基酸在一種或多種疫苗蛋白中取代一個(gè)或多個(gè)天然氨基酸。農(nóng)業(yè)相關(guān)蛋白，如昆蟲抗性蛋白(例如，Cry蛋白)、淀粉和脂質(zhì)生產(chǎn)酶、植物和昆蟲毒素、毒素抗性蛋白、真菌毒素解毒蛋白、植物生長(zhǎng)酶(例如，核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶“RUBISCO”)、脂肪氧合酶(LOX)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶也是非天然氨基酸修飾的合適靶。本發(fā)明也提供在真核細(xì)胞中生產(chǎn)至少一種含有至少一個(gè)非天然氨基酸的蛋白的方法(和該方法生產(chǎn)的蛋白)。例如，方法包括：在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有核酸的真核細(xì)胞，該核酸包含至少一個(gè)選擇密碼子并編碼該蛋白。該真核細(xì)胞也包含：在細(xì)胞中起作用并識(shí)別選擇密碼子的正交tRNA(O-tRNA)；和優(yōu)選地氨?；哂蟹翘烊话被岬腛-tRNA的正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)和含有非天然氨基酸的培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法還包括將非天然氨基酸摻入該蛋白中，其中非天然氨基酸包含第一活性基團(tuán)；然后將該蛋白與含有第二活性基團(tuán)的分子(例如，染料、聚合物如聚乙二醇的衍生物、光交聯(lián)劑、細(xì)胞毒化合物、親和標(biāo)記、生物素的衍生物、樹脂、第二個(gè)蛋白或多肽、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸(例如，DNA、RNA等)等)接觸。第一活性基團(tuán)與第二活性基團(tuán)反應(yīng)，使該分子通過[3+2]環(huán)加成附著到非天然氨基酸上。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一活性基團(tuán)是炔基或疊氮基部分，第二活性基團(tuán)是疊氮基或炔基部分。例如，第一活性基團(tuán)是炔基部分(例如，在非天然氨基酸對(duì)-炔丙基氧基苯丙氨酸)，第二活性基團(tuán)是疊氮基部分。在另一實(shí)施例中，第一活性基團(tuán)是疊氮基部分(例如，在非天然氨基酸對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸)，第二活性基團(tuán)是炔基部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，O-RS氨?；哂蟹翘烊话被岬腛-tRNA的效率相當(dāng)于具有例如，SEQIDNO.：86或45中所列氨基酸序列的O-RS的效率的至少50%。在另一實(shí)施方式中，O-tRNA包含SEQIDNO.：65或64，加工而來或由編碼的，或它們的互補(bǔ)多核苷酸序列。在又一實(shí)施方式中，O-RS包含SEQIDNO.：36-63(例如，36-47、48-63或36-63的任意其它亞組)和/或86中任意一個(gè)所列的氨基酸。該編碼蛋白可包括，例如，治療蛋白、診斷蛋白、工業(yè)酶或它們的一部分。任選地，通過非天然氨基酸進(jìn)一步修飾該方法生產(chǎn)的蛋白。例如，通過至少一個(gè)翻譯后修飾在體內(nèi)任選地修飾該方法生產(chǎn)的蛋白。也提供了生產(chǎn)篩選或選擇轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的方法(和用這種方法生產(chǎn)的篩選或選擇轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白)。例如，方法包括：選擇第一個(gè)多核苷酸序列，其中的多核苷酸序列編碼核酸結(jié)合域；并將第一個(gè)多核苷酸序列突變以包括至少一個(gè)選擇密碼子。這提供篩選或選擇多核苷酸序列。該方法也包括：選擇第二個(gè)多核苷酸序列，其中第二個(gè)多核苷酸序列編碼轉(zhuǎn)錄激活域；提供含有可操作地連接于第二個(gè)多核苷酸序列的篩選或選擇多核苷酸序列的構(gòu)建物；和將該構(gòu)建物、非天然氨基酸、正交tRNA合成酶(O-RS)和正交tRNA(O-tRNA)引入細(xì)胞。響應(yīng)于篩選或選擇多核苷酸序列中的選擇密碼子，O-RS憑借這些組件優(yōu)選地氨?；哂蟹翘烊话被岬腛-tRNA，O-tRNA識(shí)別選擇密碼子并將非天然氨基酸摻入核酸結(jié)合域中，從而提供篩選或選擇轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。在某些實(shí)施方式中，本方法中感興趣的蛋白或多肽(或其部分)和/或本發(fā)明組合物由核酸編碼。一般地，該核酸包含至少一個(gè)選擇密碼子、至少兩個(gè)選擇密碼子、至少三個(gè)選擇密碼子、至少四個(gè)選擇密碼子、至少五個(gè)選擇密碼子、至少六個(gè)選擇密碼子、至少七個(gè)選擇密碼子、至少八個(gè)選擇密碼子、至少九個(gè)選擇密碼子、十個(gè)或更多選擇密碼子?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法以及本文描述的“誘變和其它分子生物學(xué)技術(shù)”誘變編碼感興趣的蛋白或多肽的基因，以包括，例如，一個(gè)或多個(gè)用于摻入非天然氨基酸的選擇密碼子。例如，將用于感興趣的蛋白的核酸突變，以包括一個(gè)或多個(gè)選擇密碼子，提供一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸的插入。本發(fā)明包括任意所述變體，例如，突變體，任意蛋白的形式，例如，包括至少一個(gè)非天然氨基酸。類似地，本發(fā)明也包括相應(yīng)的核酸，即任何具有一個(gè)或多個(gè)選擇密碼子的核酸，該核酸編碼一種或多種非天然氨基酸。在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了組合物(和本發(fā)明方法生產(chǎn)的組合物)，包括Thr44、GAL4的Arg110TAG突變體，其中GAL4蛋白包括至少一個(gè)非天然氨基酸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包括人超氧化物歧化酶(hSOD)的Trp33TAG突變體的組合物，其中hSOD蛋白包括至少一個(gè)非天然氨基。純化含有非天然氨基酸的重組蛋白可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和使用的標(biāo)準(zhǔn)步驟純化本發(fā)明的蛋白，例如，含有非天然氨基酸的蛋白，含有非天然氨基酸的蛋白的抗體等，達(dá)到部分或基本同質(zhì)性。因此，可以通過本領(lǐng)域熟知的許多方法中任意一種回收并純化本發(fā)明多肽，包括，例如，硫酸銨或乙醇沉淀、酸或堿抽提、柱層析、親和柱層析、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、羥基磷灰石層析、凝集素層析、凝膠電泳等。在生成正確折疊的成熟蛋白中可以按需使用蛋白再折疊步驟。在最后需要高純度的純化步驟中，可以使用高效液相層析(HPLC)、親和層析或其他合適方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，將抗非天然氨基酸(或含有非天然氨基酸的蛋白)的抗體用作純化試劑，例如，用于基于親和力的蛋白純化，該蛋白含有一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸。一旦純化，按需達(dá)到部分同質(zhì)性或同質(zhì)性，則將多肽任選地用作，例如測(cè)定組件、治療劑或用作生產(chǎn)抗體的免疫原。除了本文中引用的其它參考文獻(xiàn)外，各種純化/蛋白折疊方法都是本領(lǐng)域熟知的，這些方法包括，例如，R.Scopes，《蛋白純化》(ProteinPurification)，Springer-Verlag，N.Y.(1982)；Deutscher，《酶學(xué)方法》(MethodsinEnzymology)第182卷：“蛋白純化指南”(GuidetoProteinPurification)，AcademicPress，Inc.N.Y.(1990)；Sandana(1997)《蛋白的生物分離》(BioseparationofProteins)，AcademicPress，Inc.；Bollag等(1996)《蛋白方法》(ProteinMethods)第2版，Wiley-Liss，NY；Walker(1996)《蛋白操作程序手冊(cè)》(TheProteinProtocolsHandbook)HumanaPress，NJ，Harris和Angal(1990)《蛋白純化應(yīng)用：實(shí)用方法》(ProteinPurificationApplications：APracticalApproach)Oxford的IRLPress，Oxford，England；Harris和Angal《蛋白純化方法：實(shí)用方法》(ProteinPurificationMethods：APracticalApproach)Oxford的IRLPress，Oxford，England；Scopes(1993)《蛋白純化：原理和實(shí)踐》(ProteinPurification：PrinciplesandPractice)第3版SpringerVerlag，NY；Janson和Ryden(1998)《蛋白純化：原理、高分辨率方法和應(yīng)用》(ProteinPurification：Principles,HighResolutionMethodsandApplications)，第二版，Wiley-VCH，NY；和Walker(1998)《CD-ROM上的蛋白操作程序》(ProteinProtocolsonCD-ROM)HumanaPress，NJ；和其中引用的參考文獻(xiàn)中所列方法。在真核細(xì)胞中用非天然氨基酸生產(chǎn)感興趣的蛋白或多肽的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是該蛋白或多肽一般以它們的原始構(gòu)象折疊。然而，在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，合成、表達(dá)和/或純化后，蛋白可具有與相關(guān)多肽所需構(gòu)象不同的構(gòu)象。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)蛋白任選地變性，然后復(fù)性。這是通過例如，將侶伴蛋白加入感興趣的蛋白或多肽和/或通過在離液劑如鹽酸胍中使蛋白溶解等完成的。通常，偶而需要將表達(dá)多肽變性并還原，然后使多肽再折疊成優(yōu)選構(gòu)象。例如，可以將胍、尿素、DTT、DTE和/或侶伴蛋白加入感興趣的的翻譯產(chǎn)物。還原、變性和復(fù)性蛋白的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見上述參考文獻(xiàn)，以及Debinski,等(1993)J.Biol.Chem.，268：14065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconjug.Chem.，4：581-585；和Buchner,等，(1992)Anal.Biochem.，205：263-270)。例如，Debinski,等描述了在胍-DTE中變性和還原內(nèi)含體蛋白。該蛋白可以在含有，例如氧化谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化還原緩沖液中再折疊。再折疊試劑可以流動(dòng)或移動(dòng)至與一種或多種多肽或其它表達(dá)產(chǎn)物接觸，反之亦然。抗體在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明分子，例如合成酶、tRNA和包含非天然氨基酸的蛋白的抗體。將本發(fā)明分子的抗體用作純化試劑，例如，用于純化本發(fā)明分子。此外，抗體可用作指示實(shí)際來指示合成酶、tRNA或包含非天然氨基酸的蛋白的存在，例如，以追蹤分子的存在或定位(例如，體內(nèi)或原位)。本發(fā)明的抗體可以是包含一個(gè)或多個(gè)基本或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段編碼多肽的蛋白。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和υ恒定區(qū)基因，以及無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分類為κ或λ。重鏈歸類為γ、υ、α、δ或ε，它們分別依次定義免疫球蛋白類型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。一種典型的免疫球蛋白(如抗體)的結(jié)構(gòu)單位包含四聚體。各四聚體由兩個(gè)相同的多肽鏈對(duì)組成，各對(duì)有一條“輕鏈”(約25kD)和一條“重鏈”(約50-70kD)。各鏈的N末端確定約100-110或更多氨基酸的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。術(shù)語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指這些輕鏈和重鏈。抗體以完整的免疫球蛋白或用不同肽酶消化產(chǎn)生許多良好表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)中的二硫連接下面消化抗體，產(chǎn)生F(ab')2，F(xiàn)ab的二聚體，其本身是由二硫鍵連接于VH-CH1的輕鏈?？稍跍睾蜅l件下還原F(ab')2以打斷鉸鏈區(qū)中的二硫連接，從而將F(ab')2二聚體轉(zhuǎn)化為Fab'單體。Fab'單體實(shí)質(zhì)上是具有部分鉸鏈區(qū)的Fab(對(duì)其它抗體片段的更詳細(xì)描述參見，《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(FundermentalImmunology)，第四版，W.E.Paul編，RavenPress，N.Y.(1999))。雖然根據(jù)完整抗體的消化定義了不同抗體片段，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，也可用化學(xué)方法或通過重組DNA的方法從頭合成所述Fab'片段等。因此，本文中所用術(shù)語抗體，也任選地包括通過全抗體修飾或用重組DNA方法從頭合成所產(chǎn)生的抗體片段。抗體包括單鏈抗體,包括單鏈Fv(sFv或scFv)抗體，其中由可變重鏈和可變輕鏈連接在一起(直接或經(jīng)由肽接頭)形成連續(xù)的多肽。本發(fā)明抗體可以是，例如，多克隆、單克隆、嵌和、人源化、單鏈、Fab片段、由Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段等。通常，本發(fā)明抗體在各種分子生物或藥學(xué)方法中用作常用試劑和治療試劑中是有價(jià)值的。生產(chǎn)多克隆和單克隆抗體的方法是可用的，可以應(yīng)用于生產(chǎn)本發(fā)明抗體。許多基礎(chǔ)教科書描述了標(biāo)準(zhǔn)的抗體生產(chǎn)方法，包括，例如，Borrebaeck(編)(1995)《抗體工程》(AntibodyEngineering)，第二版，F(xiàn)reemanandCompany，NY(Borrebaeck)；McCafferty等(1996)《抗體工程,實(shí)用方法》(AntibodyEngineering，APracticalApproach)OxfordPress的IRL，Oxford，England(McCafferty),和Paul(1995)《抗體工程方案》(AntibodyEngineeringProtocols)Humanapress，Towata，NJ(Paul)；Paul(編)，(1999)《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(FundamentalImmunology)，第五版RavenPress，N.Y.；Coligan(1991)《新編免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(CurrentProtocolsinImmunology)Wiley/Greene，NY；Harlow和Lane(1989)《抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Antibodies:ALaboratoryManual)ColdHarborPress，NY；Stites等(編)《基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)》(BasicandClinicalImmunology)(第四版)LangeMedicalPublications，LosAltos，CA，和其中引用的參考文獻(xiàn)；Goding(1986)《單克隆抗體：原理和實(shí)踐》(MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice)(第二版)AcademicPress，NewYork，NY；以及Kohler和Milstein(1975)Nature256:495-497。已經(jīng)開發(fā)了用于不依賴于如向動(dòng)物注射抗原的抗體制備的各種重組技術(shù)，它們可以用于本

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
中。例如，可能在噬菌體或類似載體中產(chǎn)生并選擇重組抗體文庫(kù)。參見，例如，Winter等(1994)通過噬菌體展示技術(shù)生產(chǎn)抗體(MakingAntibodiesbyPhageDisplayTechnology)，Annu.Rev.Immunol.12：433-455及其引用作綜述的參考文獻(xiàn)。也參見，Griffiths和Duncan(1998)通過噬菌體展示選擇抗體的策略(Strategiesforselectionofantibodiesbyphagedisplay)，CurrOpinBiotechnol9：102-108；Hoogenboom等(1998)抗體噬菌體展示技術(shù)及其應(yīng)用(Antibodyphagedisplaytechnologyanditsapplications)，Immunotechnology4：1-20；Gram等(1992)從幼稚的組合免疫球蛋白文庫(kù)中體外選擇和親和成熟抗體(invitroselectionandaffinitymaturationofantibodiesfromanaivecombinatorialimmunoglobulinlibrary)PNAS89：3576-3580；Huse等(1989)Science246:1275-1281；和Ward等(1989)Nature341：544-546。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體文庫(kù)可包含V基因的所有組成成分(如，從淋巴細(xì)胞群中收集或體外組裝)，將其克隆，用于在絲狀噬菌體的表面展示相關(guān)重鏈和輕鏈可變域。通過與抗原結(jié)合選擇噬菌體。由感染噬菌體的細(xì)菌表達(dá)可溶性抗體，例如通過誘變來改良該抗體。參見，如Balint和Larrick(1993)通過簡(jiǎn)約誘變進(jìn)行的抗體工程(AntibodyEngineeringbyParsimoniousMutagenesis)Gene137：109-118；Stemmer等(1993)通過酶反向PCR從蛋白接頭文庫(kù)制備活性單鏈Fv抗體的選擇(SelectionofanActiveSingleChainFvAntibodyFromaProteinLinkerLibraryPreparedbyEnzymaticInversePCR)Biotechniques14(2)：256-65；Crameri等(1996)通過DNA改組構(gòu)建并發(fā)展抗體-噬菌體文庫(kù)(Constructionandevolutionofantibody-phagelibrariesbyDNAshuffling)NatureMedicine2：100-103；和Crameri和Stemmer(1995)組合的多盒式誘變建立了突變型和野生型盒的所有變換(Combinatorialmultiplecassettemutagenesiscreatesallthepermutationsofmutantandwildtypecassettes)BioTechniques18：194-195。用于克隆和表達(dá)重組抗體噬菌體系統(tǒng)的試劑盒也是已知的和可用的，例如，產(chǎn)自Amersham-PharmaciaBiotechnology(Uppsala，Sweden)的“重組噬菌體抗體系統(tǒng)，小鼠ScFv模塊”(recombinantphageantibodysystem，mouseScFvmodule)。噬菌體抗體文庫(kù)也用于通過鏈改組生產(chǎn)高親和人源抗體(參見，例如，Marks等(1992)旁路免疫：通過鏈改組構(gòu)建高親和人抗體(By-PassingImmunization:BuildingHighAffinityHumanAntibodiesbyChainShuffling)Biotechniques10：779-782。也公認(rèn)的是，可通過許多商業(yè)服務(wù)的任何一個(gè)制備抗體(如BethylLaboratories(Montgomery，TX)、Anawa(Switzerland)、Eurogentec(比利時(shí)和在美國(guó)賓夕法尼亞州費(fèi)城等)和許多其它公司。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明“人源化“抗體是有用的，如，抗體用于治療性給藥時(shí)。人源化抗體的使用趨于減少對(duì)治療抗體的不需要的免疫反應(yīng)的發(fā)生率(如，當(dāng)患者是人時(shí))。上述抗體參考文獻(xiàn)描述了人源化策略。除了人源化抗體外，人抗體也是本發(fā)明的特征。人抗體由特征性的人免疫球蛋白序列組成。人抗體可通過各種方法生產(chǎn)(參見，例如，Larrick等，美國(guó)專利5,001,065作以綜述)。通過三體雜交瘤(trioma)技術(shù)生產(chǎn)人抗體的一般方法由Ostberg等，(1983)，Hybridoma2：361-367，Ostberg，美國(guó)專利4,634,664，和Engelman等，美國(guó)專利4,634,666描述。已知在純化和檢測(cè)蛋白中使用抗體的各種方法，這些方法可以應(yīng)用于檢測(cè)和純化如本文所述含有非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。通常，抗體對(duì)酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)、Western印跡、免疫化學(xué)、親和層析法、SPR和很多其他方法是有用的試劑。上述參考文獻(xiàn)提供如何進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)、Western印跡、表面胞質(zhì)團(tuán)共振(SPR)等的細(xì)節(jié)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明抗體本身包括非天然氨基酸，提供了具有感興趣的性質(zhì)的抗體(例如改進(jìn)的半衰期、穩(wěn)定性、毒性等)。亦參見，本文中題為“具有非天然氨基酸的多肽”部分?？贵w占目前臨床試驗(yàn)中所有化合物的接近50%(Wittrup，(1999)噬菌體展示Tibtech17：423-424，抗體普遍用作診斷試劑。因此，用非天然氨基酸修飾抗體的能力為修飾這些有價(jià)值的試劑提供了重要的工具。例如，Mab在診斷領(lǐng)域有很多應(yīng)用。從簡(jiǎn)單的斑點(diǎn)試驗(yàn)到涉及面更廣的測(cè)定方法如來自DuPontMerckCo.的放射性標(biāo)記的NR-LU-10Mab，它用于腫瘤成像(Rusch等(1993)NR-LU-10單克隆抗體掃描。計(jì)算斷層顯像評(píng)價(jià)非小細(xì)胞肺癌的有用新手段(NR-LU-10monoclonalantibodyscanning.Ahelpfulnewadjuncttocomputedtomographyinevaluatingnon-small-celllungcancer)，JThoracCardiovascSurg106：200-4)。如上所述，Mab是ELISA、Westerm印跡、免疫化學(xué)、親和層析法等的中心試劑。可以修飾任何所述診斷抗體，包括一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸，改變，例如Ab對(duì)靶的特異性或親合力，或例如，通過在非天然氨基酸中包括可檢測(cè)標(biāo)記(如光譜、熒光、發(fā)光等)改變一種或多種可檢測(cè)的性質(zhì)。一類有價(jià)值的抗體試劑是治療抗體。例如，抗體可以是腫瘤特異性的Mab，它能夠通過靶向腫瘤細(xì)胞，通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)或補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解(CML)抑制腫瘤生長(zhǎng)(這些通用型Ab有時(shí)稱為”魔彈”)。一個(gè)例子是利妥昔(Rituxan)，一種抗CD20Mab，用于治療非霍其金氏淋巴瘤(Scott(1998)利妥昔：一種治療非霍其金氏淋巴瘤的新單克隆抗體(Rituximab:anewtherapeuticmonoclonalantibodyfornon-Hodgkin'slymphom)，CancerPract6：195-7)。第二個(gè)例子涉及干擾腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵組分的抗體。賀賽汀(herceptin)是一種抗HER-2單克隆抗體，用于治療轉(zhuǎn)移型乳腺癌，并提供具有此種作用機(jī)制的抗體的例子(Baselga等，(1998)重組人源化抗HER2抗體(賀賽汀)增強(qiáng)紫杉醇和阿霉素對(duì)過表達(dá)HER2/neu的人乳腺癌異種移植瘤的抗腫瘤活性(Recombinanthumanizedanti-HER2antibody(Herceptin)enhancestheantitumoractivityofpaclitaxelanddoxorubicinagainstHER2/neuoverexpressinghumanbreastcancerxenografts)[排錯(cuò)出版于CancerRes(1999)59(8)：2020]，CancerRes58:2825-31)。第三個(gè)例子涉及直接將細(xì)胞毒化合物(毒素、放射性核素等)輸送至腫瘤或其他感興趣的部位的抗體。例如，一種應(yīng)用Mab是CYT-356，90Y連接的抗體，它直接將放射靶向前列腺腫瘤細(xì)胞(Deb等(1996)用90Y-CYT-356單克隆抗體治療激素耐治的前列腺癌(Treatmentofhormone-refractoryprostatecancerwith90Y-CYT-356monoclonalantibody)ClinCancerRes2:1289-97。第四個(gè)應(yīng)用是抗體導(dǎo)向的酶前藥療法，其中共定位至腫瘤的酶在腫瘤附近激活全身給予的前藥。例如，開發(fā)了連接于羧肽酶A的抗Ep-CAM1抗體，用于治療結(jié)直腸癌(Wolfe等，(1999)用人羧肽酶A1的T268G突變體的進(jìn)行的抗體導(dǎo)向的酶前藥療法：前藥氨甲蝶呤和胸苷酸抑制劑GW1031和GW1843的體內(nèi)外研究(Antibody-directedenzymeprodrugtherapywiththeT268GmutantofhumancarboxypeptidaseAl:invitroandinvivostudieswithprodrugsofmethotrexateandthethymidylatesynthaseinhibitorsGW1031andGW1843)，BioconjugChem10：38-48)。將其它Ab(如拮抗劑)設(shè)計(jì)為特異性抑制正常細(xì)胞功能，以獲得療效。一個(gè)例子是OrthocloneOKT3，一種由JohnsonandJohnson提供的抗CD3Mab，用于降低器官移植的急性排斥反應(yīng)(Strate等(1990)OrthocloneOKT3作為一線治療用于腎臟同種異體移植的急性排斥反應(yīng)(OrthocloneOKT3asfirst-linetherapyinacuterenalallograftrejection)，TransplantProc22：219-20。另一類抗體制品為激動(dòng)劑。將這些單克隆抗體設(shè)計(jì)為特異性增強(qiáng)正常細(xì)胞功能，以獲得療效。例如，用于精神病治療的基于單抗的乙酰膽堿受體激動(dòng)劑正在開發(fā)之中(Xie等(1997)通過鑒定激動(dòng)劑ScFv直接證明MuSK參與乙酰膽堿受體簇集(DirectdemonstrationofMuSKinvolvementinacetylcholinereceptorclusteringthroughidentificationofagonistScFv)，Nat.Biotechnol.15：768-71?？蓪⑦@些抗體中任意一種修飾成包含一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸，以增強(qiáng)一種或多種治療性質(zhì)(特異性、親和力、血清半衰期等)。另一類抗體產(chǎn)品提供了新功能。這組中主要抗體是催化抗體，如工程改造以模擬酶催化能力的Ig序列(Wentworth和Janda(1998)催化抗體(Catalyticantibodies)CurrOpinChemBiol2：138-44)。例如，一項(xiàng)有趣的應(yīng)用是在體內(nèi)用催化抗體mAb-15A10水解可卡因以治療成癮(Mets等(1998)一種抗可卡因的催化抗體防止可卡因在大鼠中加強(qiáng)和毒性效應(yīng)(Acatalyticantibodyagainstcocainepreventscocaine'sreinforcingandtoxiceffectsinrats)，ProcNatlAcadSciUSA95：10176-81)。也可修飾催化抗體，使其包含一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸，以改進(jìn)一種或多種感興趣的的性質(zhì)。通過免疫反應(yīng)性定義多肽因?yàn)楸景l(fā)明多肽提供了各種新多肽序列(如本文翻譯系統(tǒng)中合成蛋白的情況下包含非天然的氨基酸，或如在本文新合成酶的情況下，標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的新序列)，這些多肽也提供了能夠被例如免疫測(cè)定所識(shí)別的新結(jié)構(gòu)特性。抗體或特異性結(jié)合本文發(fā)明多肽的抗體的產(chǎn)生，以及抗體或抗血清結(jié)合的多肽，均為本發(fā)明的特征。例如，本發(fā)明包括與抗體或抗血清特異性結(jié)合的合成酶蛋白或它們與抗體或抗血清特異地免疫反應(yīng)，產(chǎn)生包含選自(SEQIDNO:36-63(例如，36-47、48-63或36-63的任何其它亞組)和/或86)中一個(gè)或多個(gè)的氨基酸序列的免疫原。為了減少與其他同源物的交叉反應(yīng)性，用可用的對(duì)照合成酶同源物，例如野生型大腸桿菌酪氨酰合成酶(TyrRS)(如，SEQIDNO.2)消減抗體或抗血清。在一種典型形式中，免疫測(cè)定使用多克隆抗血清，該抗血清通過抗一種或多種多肽產(chǎn)生，所述多肽包含對(duì)應(yīng)于SEQIDNO：36-63(如36-47、48-63或36-63的任意其它亞組)和/或86，或它們的實(shí)質(zhì)性亞序列(如，提供至少是全長(zhǎng)序列的約30%)中一個(gè)或多個(gè)的一個(gè)或多個(gè)序列。這組來自SEQIDNO:36-63和86的潛在多肽免疫原在下文中統(tǒng)稱為”免疫原性多肽”。任選地選擇所得的抗血清，以與對(duì)照合成酶同源物具有低交叉反應(yīng)性，在多克隆抗血清用于免疫測(cè)定前，例如，通過用一種或多種合成酶同源物免疫吸附去除任何這種交叉反應(yīng)性。為了生產(chǎn)用于免疫測(cè)定的抗血清，如本文所述生產(chǎn)并純化一種或多種免疫原性多肽。例如，可以在重組細(xì)胞中生產(chǎn)重組蛋白。用與標(biāo)準(zhǔn)佐劑，如弗氏佐劑結(jié)合的免疫原性蛋白和標(biāo)準(zhǔn)小鼠免疫方案免疫(有關(guān)可用于確定特異性免疫反應(yīng)的抗體產(chǎn)生、免疫測(cè)定形式和條件的標(biāo)準(zhǔn)描述參見，例如，Harlow和Lane(1988)《抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Antibodies,ALaboratoryManual)，ColdSpringHarborPublications，NewYork。本文也描述了抗體的附加參考和討論，本文可應(yīng)用于通過免疫反應(yīng)性定義/檢測(cè)多肽生產(chǎn)抗體)近交品系的小鼠(因?yàn)樾∈蟮膶?shí)際遺傳一致性，結(jié)果更可重復(fù)，所以本測(cè)定使用這種小鼠)?；蛘?，將來自本文公開序列的異種或多種合成或重組多肽共軛到載體蛋白，并用作免疫原。在免疫測(cè)定中，收集多克隆抗血清，并滴定抗免疫原性多肽，例如，用固體支持物上固定的一種或多種免疫原性蛋白進(jìn)行固相免疫測(cè)定。選擇、集中并用對(duì)照合成酶多肽消減滴度為106或更大的多克隆抗血清，以產(chǎn)生消減的、集中的、滴定的多克隆抗血清。測(cè)試消減的、集中的、滴定的多克隆抗血清在比較免疫測(cè)定中與對(duì)照同源物的交叉反應(yīng)。在這個(gè)比較測(cè)定中，為消減的、集中的、滴定的多克隆抗血清測(cè)定差別結(jié)合條件，使滴定的多克隆抗血清結(jié)合到免疫原性合成酶的信噪比與結(jié)合到對(duì)照合成酶同源物相比高至少約5-10倍。也就是說，通過加入非特異性的競(jìng)爭(zhēng)劑如清蛋白或脫脂奶粉，和/或通過調(diào)節(jié)鹽條件、溫度，和/或其他方面來調(diào)節(jié)結(jié)合/洗滌反應(yīng)的嚴(yán)格性。在后續(xù)測(cè)定中將這些結(jié)合/洗滌條件用以確定測(cè)試多肽(相比免疫原性多肽和/或?qū)φ斩嚯牡亩嚯?是否被集中的、消減的多克隆抗血清特異性結(jié)合。具體地，測(cè)試多肽在差別結(jié)合條件下顯示，比對(duì)照合成酶同源物的信噪比至少高2-5倍，并且與免疫原性多肽相比其信噪比至少是約1/2，與已知合成酶相比，該測(cè)試多肽與免疫原性多肽共有基本結(jié)構(gòu)相似性，因此是本發(fā)明的多肽。在另一實(shí)施例中，將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合式的免疫測(cè)定用于測(cè)試多肽的檢測(cè)。例如，如上所述，通過用對(duì)照多肽免疫吸附從集中的抗血清混合物中去除交叉反應(yīng)抗體。然后，將免疫原性多肽固定在與消減的集中的抗血清接觸的固體支持物上。加入受試蛋白，以測(cè)定競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合集中的消減的抗血清。與固定蛋白相比，受試蛋白與集中的消減的抗血清競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的能力，與加入測(cè)定以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合免疫原性多肽的能力(免疫原性多肽與固定的免疫原性多肽有效競(jìng)爭(zhēng)，以結(jié)合集中的多克隆抗血清)相當(dāng)。用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算方法計(jì)算受試蛋白交叉反應(yīng)性百分?jǐn)?shù)。在平行測(cè)定中，通過與免疫原性多肽競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗血清的能力比較，任選地測(cè)定對(duì)照蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合集中的消減的抗血清的能力。再次用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算方法計(jì)算對(duì)照多肽的交叉反應(yīng)百分?jǐn)?shù)。當(dāng)測(cè)試多肽的交叉反應(yīng)性百分?jǐn)?shù)比對(duì)照多肽高至少5-10倍時(shí)，或測(cè)試多肽的結(jié)合大約在免疫原性多肽的結(jié)合范圍內(nèi)時(shí)，一般認(rèn)為測(cè)試多肽特異地結(jié)合集中的消減的抗血清。通常，免疫吸附的和集中的抗血清可用于本文描述的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合免疫測(cè)定，以比較任何測(cè)試多肽與免疫原性和/或?qū)φ斩嚯?。為了進(jìn)行此比較，在寬濃度范圍中測(cè)定各免疫原性、測(cè)試和對(duì)照多肽，各多肽的量需要能夠抑制消減抗血清與，例如固定對(duì)照的50%結(jié)合，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定測(cè)試或免疫原性蛋白。如果競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中測(cè)試多肽結(jié)合的所需量少于所需免疫原性多肽的量的兩倍，一般認(rèn)為測(cè)試多肽與產(chǎn)生的抗免疫原性蛋白的抗體特異地結(jié)合，提供的量是對(duì)照多肽的至少約5-10倍。作為特異性的附加測(cè)定，用免疫原性多肽(而非對(duì)照多肽)任選地完全免疫吸附集中的抗血清，直到幾乎沒有或所得的免疫原性多肽消減的集中的抗血清與用于免疫吸附的免疫原性多肽的不結(jié)合可被探測(cè)到。然后，測(cè)試完全免疫吸附的抗血清與測(cè)試多肽的反應(yīng)性。如果幾乎沒有或沒有觀察到反應(yīng)性(即，觀察到完全吸附的抗血清與免疫原性多肽的結(jié)合信噪比不高于2倍)，那么由免疫原性蛋白得到的抗血清特異地結(jié)合測(cè)試多肽。藥物組合物任選地將本發(fā)明中的多肽或蛋白(如合成酶、包含一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸的蛋白)用于治療性用途，如與合適的藥物載體結(jié)合。這種組合物，例如，包含治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。所述載體或賦形劑包括但不限于，鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和/或它們的組合。使劑型適應(yīng)給藥方式。通常，蛋白給藥方式是本領(lǐng)域公知的，可以應(yīng)用于本發(fā)明多肽的給藥。在一種或多種體外和/或體內(nèi)疾病的動(dòng)物模型中任選地測(cè)試包含一種或多種本發(fā)明多肽的治療組合物，根據(jù)本領(lǐng)域中公知的方法確證效能、組織代謝和估計(jì)劑量。具體地，最初可通過活性、穩(wěn)定性或本文中非天然氨基酸到天然氨基酸同源物的其它合適測(cè)量方法(如，修飾以包括一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸的EPO與天然氨基酸EPO相比)，即在一個(gè)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中確定劑量。給藥是通過通常用于引入分子使之最終與血液或組織細(xì)胞接觸的任意途徑進(jìn)行的。任選地用一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，以任意合適方式給予本發(fā)明的非天然氨基酸多肽。本發(fā)明內(nèi)容中給予病人所述多肽的合適方法是可用的，并且，雖然可用多于一種途徑給予具體組合物，但具體途徑可經(jīng)常提供比另一途徑更快速和更有效的作用或反應(yīng)。通過給予的具體組合物，以及用于給予該組合物的具體方法部分決定藥學(xué)上可接受的載體。因此，本發(fā)明藥物組合物有各種合適的劑型?？梢酝ㄟ^許多途徑，包括但不限于：經(jīng)口、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌內(nèi)、透皮、皮下、局部、舌下或直腸方式給予多肽組合物。也可通過脂質(zhì)體給予非天然氨基酸多肽組合物。這種給藥途徑和合適劑型通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。也可將非天然氨基酸多肽單獨(dú)或與其他合適成分聯(lián)合制成氣霧劑(即它們可“霧化”)以通過吸入給藥?？蓪忪F劑置入加壓的可接受壓縮氣體，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮?dú)獾?。適合胃腸道外給藥的劑型，例如關(guān)節(jié)內(nèi)(在關(guān)節(jié)中)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)和皮下途徑包括可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使劑型與計(jì)劃中的受者血液等滲的溶質(zhì)的水性和非水性等滲無菌注射液，和可包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑的水相和非水相無菌懸液。包裝核酸的劑型可以單位劑量或多劑量密封容器，如安瓿瓶和小瓶的形式呈現(xiàn)。胃腸道外給藥和靜脈內(nèi)給藥是優(yōu)選的給藥方式。具體地，已用于天然氨基酸同源物治療(如，一般用于EPO、GCSF、GMCSF、IFN、白介素、抗體和/或任何藥學(xué)輸送的蛋白)的給藥途徑，與當(dāng)前使用的劑型一起為包括本發(fā)明非天然氨基酸的蛋白提供優(yōu)選的給藥途徑和劑型(如當(dāng)前治療蛋白的加入聚乙二醇的變體等)。在本發(fā)明內(nèi)容中，隨時(shí)間推移，給予病人的劑量足以對(duì)病人產(chǎn)生有益的治療反應(yīng)，或例如，根據(jù)本申請(qǐng)，抑制病原體感染，或其他合適的活性。劑量由具體的組合物/劑型效能和所用非天然氨基酸多肽的活性、穩(wěn)定性或血清半衰期，病人病情，以及所治療病人的體重或體表面積確定。劑量的大小也由具體病人中存在、性質(zhì)以及伴隨給予具體組合物/劑型的任何不良副作用的程度等決定。在確定治療或預(yù)防疾病(如癌癥、遺傳病、糖尿病、艾滋病等)中施用有效量的組合物/劑型，醫(yī)生評(píng)價(jià)循環(huán)血漿濃度、劑型毒性、疾病進(jìn)展和/或相關(guān)部位抗非天然氨基酸多肽抗體的產(chǎn)生。給予如70千克病人的劑量一般在與當(dāng)前使用的治療蛋白劑量相當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，并根據(jù)相關(guān)組合物的活性或血清半衰期改變作出調(diào)整。本發(fā)明組合物/劑型可以通過任何已知的常規(guī)療法，包括抗體給藥，疫苗給藥，細(xì)胞毒劑、天然氨基酸多肽、核酸、核酸類似物、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑等的給藥來補(bǔ)充治療病癥。對(duì)于給藥，以相關(guān)劑型的LD-50和/或?qū)Ψ翘烊话被嵩诓煌瑵舛认氯魏胃弊饔玫挠^察確定的速率給予本發(fā)明劑型，例如根據(jù)病人體重和總體健康狀況。可通過單劑量和均分劑量完成給藥。如果進(jìn)行輸注某劑型的病人發(fā)生發(fā)熱、寒戰(zhàn)或肌肉疼痛，那么他/她應(yīng)接受合適劑量的阿司匹林、布洛芬、對(duì)乙酰氨基酚或其他疼痛/發(fā)熱控制藥物。對(duì)于經(jīng)歷輸注反應(yīng)，如發(fā)熱、肌肉疼痛和寒戰(zhàn)的病人，應(yīng)在輸注前30分鐘預(yù)先給予阿司匹林、對(duì)乙酰氨基酚或如苯海拉明。產(chǎn)生不對(duì)解熱藥和抗組胺藥迅速反應(yīng)的更嚴(yán)重寒戰(zhàn)和肌肉疼痛，則使用杜冷丁。根據(jù)反應(yīng)的嚴(yán)重程度，減慢或中斷治療。核酸和多肽序列及變體如上下文所述，本發(fā)明提供了核酸多核苷酸序列和多肽氨基酸序列，如0-tRNA和O-RS，和，如包含所述序列的組合物和方法。本文中公開了所述序列的例子，如0-tRNA和O-RS(參見表5，如除了SEQIDNO.:1和2外的SEQIDNO.3-65、86)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本發(fā)明并不局限于本文公開的序列，例如，實(shí)施例和表5。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本發(fā)明也提供了許多相關(guān)和甚至不相關(guān)的具有本文所述功能的序列，如編碼O-tRNA或O-RS。本發(fā)明也提供多肽(O-RS)和多核苷酸，如O-tRNA，編碼O-RS或其部分(如合成酶的活性位點(diǎn))的多核苷酸，用于構(gòu)建氨酰基tRNA合成酶突變體的寡核苷酸等。例如，本發(fā)明的多肽包括包含SEQIDNO.:36-63(如36-47、48-63或36-63的任何其它亞組)和/或86中任一所列的氨基酸序列的多肽，包含由SEQIDNO.:3-35(如3-19、20-35或3-35的任何其它亞組)中任一所列的多核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽，和與對(duì)多肽的特異性抗體特異地免疫反應(yīng)的多肽，該多肽包含SEQIDNO.：36-63，和/或86中任一個(gè)所列氨基酸序列的多肽或包含SEQIDNO.：3-35(例如，3-19,20-35，或序列3-35的任何其它亞組)中所列任一個(gè)多核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多肽也包括與天然產(chǎn)生的酪氨酰氨?；?tRNA合成酶(TyrRS)(例如，SEQIDNO.：2)具有至少90%相同氨基酸序列的多肽，和包含A-E族中兩種或多種氨基酸的多肽。例如，A族包括與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對(duì)應(yīng)位置上的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸或蘇氨酸。B族包括與大腸桿菌TyrRS的Asn126相對(duì)應(yīng)位置上的天冬氨酸；C族包括與大腸桿菌TyrRS的Asp182相對(duì)應(yīng)位置上的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸、天冬酰胺或甘氨酸；D族包括與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對(duì)應(yīng)位置上的甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸或酪氨酸；E族包括與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對(duì)應(yīng)位置上的絲氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸或丙氨酸。任何這些族組合的亞組也是本發(fā)明的特征。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，O-RS具有兩種或多種選自與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對(duì)應(yīng)位置上出現(xiàn)的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、或蘇氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Asp182相對(duì)應(yīng)位置上的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸、或甘氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對(duì)應(yīng)位置上的甲硫氨酸、或酪氨酸；和與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對(duì)應(yīng)位置上的絲氨酸、或丙氨酸的氨基酸。在另一實(shí)施方式中，O-RS包括兩種或多種選自與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對(duì)應(yīng)位置上的甘氨酸、絲氨酸、或丙氨酸，與大腸桿菌TyrRS的Asnl26相對(duì)應(yīng)位置上的天冬氨酸，與大腸桿菌TyrRS的Aspl82相對(duì)應(yīng)位置上的天冬酰胺，與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對(duì)應(yīng)位置上的丙氨酸或纈氨酸和/或和與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對(duì)應(yīng)位置上的甲硫氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、或蘇氨酸。類似地，本發(fā)明多肽也包括含有SEQIDNO.：36-63(例如，36-47、48-63或36-63的任意其它亞組)和/或86中至少20個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽，和如上述A-E族中的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。也參見本文表4、6和/或表8。本發(fā)明多肽也包括包含任一上述多肽的保守變異的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物包括本發(fā)明多肽和賦形劑(例如，緩沖液、水、藥學(xué)上可接受的賦形劑等)。本發(fā)明也提供與本發(fā)明多肽特異地免疫反應(yīng)的抗體或抗血清。本發(fā)明也提供多核苷酸。本發(fā)明多核苷酸包括編碼本發(fā)明感興趣的蛋白或多肽或包括一個(gè)或多個(gè)選擇密碼子，或二者的多核苷酸。例如，本發(fā)明的多核苷酸包括，例如，含有SEQIDNO.：3-35(例如，3-19、20-35或序列3-35的任意其它亞組)、64-85中任意一個(gè)所列核苷酸序列的多核苷酸；與該多核苷酸序列互補(bǔ)或編碼該多核苷酸序列的多核苷酸；和/或編碼含有SEQIDNO.：36-63和/或86中任意一個(gè)所列氨基酸序列或其保守變異的多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸也包括編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。類似地，在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與上述多核苷酸雜交的核酸超過基本上全長(zhǎng)的核酸是本發(fā)明的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸也包括編碼多肽的多核苷酸，該多肽包含與天然產(chǎn)生的酪氨酰氨?；?tRNA合成酶(TyrRS)(例如，SEQIDNO.：2)至少90%相同的氨基酸序列，和包含A-E族(上述)中所述的兩個(gè)或多個(gè)突變。與上述多核苷酸和/或含有任一上述多核苷酸的保守變異的多核苷酸至少70%(或至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%或更多)相同的多核苷酸也包括在本發(fā)明的多核苷酸中。也參見本文的表4、表6和/或表8。在某些實(shí)施方式中，載體(例如，質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等)包含本發(fā)明的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，載體是表達(dá)載體。在另一實(shí)施方式中，表達(dá)載體包括可操作地連接于一種或多種本發(fā)明的多核苷酸的啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方式中，細(xì)胞含有包括本發(fā)明的多核苷酸的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員也將理解，本發(fā)明包括公開序列的很多變體。例如，本發(fā)明包括產(chǎn)生功能相同序列的公開序列的保守變體。認(rèn)為本發(fā)明包括與至少一種公開序列雜交的核酸多核苷酸序列的變體。本文公開序列的獨(dú)特亞序列，如通過例如，標(biāo)準(zhǔn)序列對(duì)比技術(shù)確定的亞序列也包括在本發(fā)明中。保守變異由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并，”沉默取代”(即不導(dǎo)致編碼多肽改變的核酸序列中的取代)是每個(gè)編碼氨基酸的核酸序列的暗指特征。類似地，用性質(zhì)高度相似的不同氨基酸取代氨基酸序列的一種或幾種氨基酸中的”保守氨基酸取代”，也容易地鑒定為與公開構(gòu)建物高度相似。各公開序列的這種保守變異是本發(fā)明的特征。具體核苷酸序列的”保守變異”指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或該核酸并不將氨基酸序列編碼成基本相同的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在編碼序列中改變、加入或去除單個(gè)氨基酸或小百分比(一般小于5%，更一般小于4%、2%或1%)的氨基酸進(jìn)行的單獨(dú)取代、缺失或加入是”保守的修飾變異”，其中改變導(dǎo)致氨基酸的缺失、氨基酸的加入或用化學(xué)上相似的氨基酸取代氨基酸。因此，本發(fā)明所列多肽序列的”保守變異”包括用相同保守取代基的保守選擇氨基酸以小百分比，一般小于5%，更一般小于2%或1%取代多肽序列氨基酸。最后，加入并不改變核酸分子編碼活性的序列，如非功能序列的加入，是基本核酸的保守變異。提供功能類似的氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域公知的。下面列出了包含互相”保守取代”的天然氨基酸的例子組。保守取代組1丙氨酸(A)絲氨酸(S)蘇氨酸(T)2天冬氨酸(D)谷氨酸(E)3天冬酰胺(N)谷胺酰胺(Q)4精氨酸(R)賴氨酸(K)5異亮氨酸(I)亮氨酸(L)甲硫氨酸(M)纈氨酸(V)6苯丙氨酸(F)酪氨酸(Y)色氨酸(W)核酸雜交可以用比較雜交鑒定本發(fā)明核酸，包括本發(fā)明核酸的保守變異，該比較雜交法是區(qū)別本發(fā)明核酸的優(yōu)選方法。此外，在高、超高和超超高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNO：3-35(例如，3-19、20-35或序列3-35的任意其它亞組)、64-85代表的核酸雜交的靶核酸是本發(fā)明的特征。與給定核酸序列相比，所述核酸的例子包括具有一個(gè)或幾個(gè)沉默或保守核酸取代的核酸。當(dāng)測(cè)試核酸與探針的雜交至少相當(dāng)于完美匹配的互補(bǔ)靶的1/2，即信噪比至少相當(dāng)于探針與靶在下述條件下雜交信噪比的1/2時(shí)，認(rèn)為測(cè)試核酸與探針核酸特異性雜交，在所述條件下，完美匹配探針與完美匹配互補(bǔ)靶結(jié)合的信噪比比雜交到任意不匹配靶核酸時(shí)觀察到的信噪比至少高約5-10倍。當(dāng)核酸一般在溶液中結(jié)合時(shí)，它們“雜交”。核酸因?yàn)楦鞣N良好表征的物理-化學(xué)力，如氫鍵、溶劑排斥、堿基堆積等雜交。在Tijssen(1993)《生物化學(xué)和分子生物學(xué)中的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)--用核酸探針雜交》(LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicAcidProbes)第2章第I部分，“雜交原理和核酸探針測(cè)定的策略概要”(Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays)(Elsevier，NewYork)，和Ausubel(上述)中發(fā)現(xiàn)了核酸雜交的廣泛指南。Hames和Higgins(1995)《基因探針1》(GeneProbes1)IRLPressatOxfordUniversityPress，Oxford，England，(Hames和Higgins1)以及Hames和Higgins(1995)《基因探針2》(GeneProbes2)IRLPressatOxfordUniversityPress，Oxford，England(Hames和Higgins2)提供了合成、標(biāo)記、檢測(cè)和定量DNA和RNA，包括寡核苷酸的細(xì)節(jié)。在Southern或Northern印跡中用于具有多于100個(gè)互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸在濾膜上雜交的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的例子是在含有1毫克肝素的50%福爾馬林中42℃雜交過夜。嚴(yán)謹(jǐn)洗滌條件的例子是0.2xSSC在65℃下洗滌15分鐘(SSC緩沖液的描述參見，Sambrook，上述)。高嚴(yán)謹(jǐn)洗滌之前是低嚴(yán)謹(jǐn)洗滌，以去除背景探針信號(hào)。低嚴(yán)謹(jǐn)洗滌的例子是2xSSC在40℃下洗滌15分鐘。通常具體雜交測(cè)定中，信噪比比不相關(guān)探針中觀察到的高5倍(或更高)表明檢測(cè)到了特異性雜交。核酸雜交實(shí)驗(yàn)，如Southern和Northern雜交的內(nèi)容中“嚴(yán)謹(jǐn)雜交洗滌條件”是序列依賴性的，而且在不同環(huán)境參數(shù)下是不同的。在Tijssen(1993)(上述)和Hames和Higgins，1和2中發(fā)現(xiàn)了核酸雜交的廣泛指南?？梢匀菀椎亟?jīng)驗(yàn)性確定任何測(cè)試核酸的嚴(yán)謹(jǐn)雜交和洗滌條件。例如，在確定高嚴(yán)謹(jǐn)雜交和洗滌條件時(shí)，逐漸增加雜交和洗滌條件(例如，通過提高溫度、降低鹽濃度、提高去垢劑濃度和/或提高有機(jī)溶劑，如雜交或洗滌中的福爾馬林的濃度)，直到負(fù)荷一組選擇標(biāo)準(zhǔn)。例如，雜交和洗滌條件逐漸增加，直到探針與完美配對(duì)互補(bǔ)靶結(jié)合的信噪比比探針與不匹配靶雜交時(shí)所觀察到的信噪比至少高約5倍。選擇“非常嚴(yán)謹(jǐn)”條件，以等于具體探針的熱熔點(diǎn)(Tm)。Tm是50%測(cè)試序列與完美匹配探針雜交的溫度(在限定的離子強(qiáng)度和pH下)。為本發(fā)明目的，通常將“高嚴(yán)謹(jǐn)”雜交和洗滌條件選擇為低于具體序列在限定的離子強(qiáng)度和pH下的Tm約5℃?！俺邍?yán)謹(jǐn)”雜交和洗滌條件是增加了雜交和洗滌條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，直到探針與完美匹配互補(bǔ)靶核酸的結(jié)合信噪比是與任意不匹配靶核酸雜交中所觀察到的信噪比至少高10倍的條件。在這種條件下與探針雜交的靶核酸，其信噪比是完美匹配互補(bǔ)靶核酸的至少1/2，認(rèn)為在超高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與探針結(jié)合。類似地，甚至可以通過逐漸增加相關(guān)雜交測(cè)定的雜交和/或洗滌條件確定更高水平的嚴(yán)謹(jǐn)性。例如，在那些條件中，增加了雜交和洗滌條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，直到探針和完美匹配互補(bǔ)靶核酸結(jié)合的信噪比是與任意不匹配靶核酸雜交中所觀察到的信噪比至少高lO倍、20倍、50倍、100倍或500倍或更高。與探針在所述條件下雜交的靶核酸，其信噪比是完美匹配互補(bǔ)靶核酸的至少1/2，認(rèn)為在超超高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與探針結(jié)合。如果它們編碼的多肽基本相同，那么在嚴(yán)謹(jǐn)條件下不互相雜交的核酸仍是基本相同的。這發(fā)生在，例如，用遺傳密碼允許的最大密碼子簡(jiǎn)并產(chǎn)生核酸的拷貝時(shí)。獨(dú)特的亞序列在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了核酸，該核酸包含選自本文公開的0-tRNA和O-RS序列的核酸中獨(dú)特的亞序列。與任何已知O-tRNA或O-RS核酸序列相對(duì)應(yīng)的核酸相比，該獨(dú)特的亞序列是獨(dú)特的?？梢杂茫?，設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)的BLAST進(jìn)行對(duì)比。任何獨(dú)特亞序列都是有用的，例如，作為探針鑒定本發(fā)明核酸。類似地，本發(fā)明包括多肽，該多肽包含選自本文公開的O-RS序列的多肽中獨(dú)特的亞序列。這里，與任何已知多肽序列相對(duì)應(yīng)的多肽相比，獨(dú)特的亞序列是獨(dú)特的。本發(fā)明也提供在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與獨(dú)特的編碼寡核苷酸雜交的靶核酸，該寡核苷酸編碼選自O(shè)-RS序列的多肽中獨(dú)特的亞序列，其中與任意對(duì)照多肽(例如，從其例如，通過突變獲得本發(fā)明合成酶的親代序列)相對(duì)應(yīng)的多肽相比，獨(dú)特的亞序列是獨(dú)特的。如上所述地確定獨(dú)特的序列。序列比較，同一性和同源性當(dāng)采用，如下述序列比較算法之一(或本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的其它算法)或通過視覺檢查測(cè)量以比較和對(duì)比最大一致性時(shí)，在兩種或多種核酸或多肽序列內(nèi)容中的術(shù)語“相同”或“同一性”百分?jǐn)?shù)指兩種或多種相同或具有特定的氨基酸殘基或核苷酸相同百分?jǐn)?shù)的序列或亞序列。當(dāng)用序列比較算法或通過視覺檢查測(cè)量以比較和對(duì)比最大一致性時(shí)，在兩種核酸或多肽(例如，編碼O-tRNA或O-RS的DNA，或O-RS的氨基酸序列)內(nèi)容中的術(shù)語“基本相同”指兩種或多種具有至少約60%，優(yōu)選80%，最優(yōu)選90-95%核苷酸或氨基酸殘基同一性的序列或亞序列。在沒有參考實(shí)際祖先的情況下，一般認(rèn)為“基本相同”的序列是“同源”的。優(yōu)選地，在長(zhǎng)度至少約50個(gè)殘基的序列區(qū)域上，更優(yōu)選在至少約100個(gè)殘基的區(qū)域上存在“基本同一性”，最優(yōu)選地，在至少約150個(gè)殘基，或待比較的兩個(gè)全長(zhǎng)序列上存在“基本同一性”。對(duì)于序列比較和同源性確定來說，一般將一個(gè)序列用作參比序列，將測(cè)試序列序列與它作比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試和參比序列輸入計(jì)算機(jī)，如果需要的話指定亞序列坐標(biāo)，指定序列算法程序參數(shù)。然后該序列比較算法根據(jù)指定的程序參數(shù)，計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參比序列的序列同一性百分?jǐn)?shù)?？梢酝ㄟ^，例如，Smith和Waterman的局部同源算法，Adv.Appl.Math.2：482(1981)，Needleman和Wunsch的同源對(duì)比算法，J.Mol.Biol.48：443(1970)，Pearson和Lipman的搜索相似性方法，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85：2444(1988)，這些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(GeneticsComputerGroup)，575ScienceDr.，Madison，WI)或視覺檢查(通常參見，Ausubel等，下述)為比較進(jìn)行最優(yōu)化的序列對(duì)比。一個(gè)適合于確定序列同一性百分?jǐn)?shù)和序列相似性的算法例子是BLAST算法，Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中描述了這種算法?？赏ㄟ^國(guó)家生物技術(shù)信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開地得到進(jìn)行BLAST分析的軟件。該算法包括，首先通過鑒定查詢序列中長(zhǎng)度W的短字鑒定高分的序列對(duì)(HSP)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字對(duì)比時(shí)，查詢序列匹配或滿足一些正評(píng)價(jià)的閾值分?jǐn)?shù)T。T稱為鄰近字分?jǐn)?shù)閾值(Altschul等，上述)。這些起始鄰近字命中(wordhits)用作起始搜索尋找含有它們的更長(zhǎng)HSP的種子。然后字命中在沿各序列的兩個(gè)方向上延伸，以盡量增加累積對(duì)比分?jǐn)?shù)。對(duì)于核苷酸序列，用參數(shù)M(匹配殘基對(duì)的獎(jiǎng)勵(lì)分?jǐn)?shù)；總是>0)和N(錯(cuò)配殘基的懲罰分?jǐn)?shù)；總是<0)計(jì)算累積分?jǐn)?shù)。對(duì)于氨基酸序列，用計(jì)分矩陣計(jì)算累積分?jǐn)?shù)。當(dāng)：累積對(duì)比分?jǐn)?shù)通過來自其最大獲得值的參數(shù)X下降時(shí)；由于一種或多種負(fù)得分殘基對(duì)比使累積分?jǐn)?shù)達(dá)到零或零以下；或達(dá)到各序列的末端時(shí)，停止延伸各方向上的字命中。BLAST算法參數(shù)W、T和X確定對(duì)比的靈敏性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的默認(rèn)設(shè)置為字長(zhǎng)(W)11、期望值(E)10、截?cái)嘀?00、M=5、N=-4和兩條鏈的比較。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默認(rèn)設(shè)置為字長(zhǎng)(W)3、期望值(E)10和BLOSUM62計(jì)分矩陣(參見Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915)。除了計(jì)算序列同一性百分?jǐn)?shù)之外，BLAST算法也對(duì)兩種序列之間的相似性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(參見，例如，Karlin&Altschul，Proc.Nat'1.Acad.Sci.USA90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一種測(cè)量相似性的方法是最小總和概率(P(N))，它提供了概率說明，這種概率下兩種核苷酸或氨基酸序列之間偶然發(fā)生匹配。例如，如果在測(cè)試核酸和參比核酸的比較中最小總和概率小于約0.1、更優(yōu)選小于約0.01、最優(yōu)選小于約0.001，則認(rèn)為核酸與參比序列相似。誘變和其他分子生物學(xué)技術(shù)描述分子生物學(xué)技術(shù)的普通教科書包括Berger和Kimmel，分子克隆技術(shù)指南，《酶學(xué)方法》第152卷(GuidetoMolecularCloningTechniques，MethodsinEnzymology)AcademicPress，Inc.，SanDiego，CA(Berger)；Sambrook等，《分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(MolecularCloning-ALaboratoryManual)(第二版)，第1-3卷，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork，1989(“Sambrook”)和《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，F(xiàn).M.Ausubel等編，CurrentProtocols，它是GreenePublishingAssociates，Inc.和JohnWiley&Sons，Inc.的合資公司，(1999年起增補(bǔ))(“Ausubel”))。這些教科書描述了誘變、載體的用途、啟動(dòng)子和很多其它與，如基因產(chǎn)生相關(guān)的主題，包括用于生產(chǎn)包括非天然氨基酸、正交tRNA、正交合成酶和它們的對(duì)在內(nèi)的蛋白的選擇密碼子。本發(fā)明使用各種類型的誘變，例如，以產(chǎn)生tRNA文庫(kù)，以產(chǎn)生合成酶文庫(kù)，以將編碼非天然氨基酸的選擇密碼子插入感興趣的蛋白或多肽。它們包括但不限于定位誘變、隨機(jī)點(diǎn)誘變，同源重組、DNA改組或其它遞歸誘變方法，嵌合構(gòu)建，用含有尿嘧啶模板的誘變，寡核苷酸-導(dǎo)向的誘變，硫代磷酸-修飾的DNA誘變，用缺口雙鏈體DNA誘變等，或它們的任意組合。其它合適的方法包括點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)、用修復(fù)缺陷型宿主株誘變、限制性選擇和限制性純化、缺失誘變、通過全基因合成誘變、雙鏈斷裂修復(fù)等。本發(fā)明也包括例如，包括嵌合構(gòu)建物的誘變。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以根據(jù)天然產(chǎn)生分子或改變的或突變的天然產(chǎn)生分子的已知信息指導(dǎo)誘變，例如，序列，序列比較、物理性質(zhì)、晶體結(jié)構(gòu)等。本文的上述內(nèi)容和例子描述了這些步驟。在下面的出版物和引用參考文獻(xiàn)中可以找到附加信息：Ling等，DNA誘變方法：概要(ApproachestoDNAmutagenesis：anoverview)，AnalBiochem.254(2)：157-178(1997)；Dale等，用硫代磷酸法進(jìn)行寡核苷酸-導(dǎo)向的隨機(jī)誘變(Oligonucleotide-directedrandommutagenesisusingthephosphorothioatemethod)，MethodsMol.Biol.57：369-374(1996)；Smith，體外誘變(Invitromutagenesis)，Ann.Rev.Genet.19：423-462(1985)；Botstein&Shortle，體外誘變的策略和應(yīng)用(Strategiesandapplicationsofinvitromutagenesis)，Science229：1193-1201(1985)；Carter，定位誘變(Site-directedmutagenesis)，Biochem.J.237：1-7(1986)；Kunkel，寡核苷酸導(dǎo)向的誘變效率(Theefficiencyofoligonucleotidedirectedmutagenesis)，刊于《核酸和分子生物學(xué)》(Acids&MolecularBiology)(Eckstein，F(xiàn).和Lilley，D.M.J.編，SpringerVerlag，Berlin))(1987)；Kunkel，無需表型選擇的快速和有效的定位誘變(Rapidandefficientsite-specificmutagenesiswithoutphenotypicselection)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492(1985)；Kunkel等，無需表型選擇的快速和有效的定位誘變(Rapidandefficientsite-specificmutagenesiswithoutphenotypicselection)，MethodsinEnzymol.154,367-382(1987)；Bass等，具有新DNA-結(jié)合特異性的突變Trp抑制物(MutantTrprepressorswithnewDNA-bindingspecificities)，Science242：240-245(1988)；MethodsinEnzymo.100：468-500(1983)；MethodsinEnzymol.154：329-350(1987)；Zoller&Smith，用來自Ml3的載體進(jìn)行寡核苷酸-導(dǎo)向的誘變：在任意DNA片段中產(chǎn)生點(diǎn)突變的有效和通用方法(Oligonucleotide-directedmutagenesisusingMl3-derivedvectors:anefficientandgeneralprocedurefortheproductionofpointmutationsinanyDNAfragment)，NucleicAcidsRes.10：6487-6500(1982)；Zoller&Smith，克隆到M13載體中DNA片段的寡核苷酸-導(dǎo)向的誘變(Oligonucleotide-directedmutagenesisofDNAfragmentsclonedintoM13vectors)，MethodsinEnzymol.100：468-500(1983)；Zoller&Smith，寡核苷酸-導(dǎo)向的誘變：使用兩種寡核苷酸引物和單鏈DNA模板的簡(jiǎn)單方法(Oligonucleotide-directedmutagenesis:asimplemethodusingtwooligonucleotideprimersandasingle-strandedDNAtemplate)，MethodsinEnzymol.154：329-350(1987)；Taylor等，硫代磷酸修飾的DNA在限制性酶反應(yīng)制備缺口DNA中的用途(Theuseofphosphorothioate-modifiedDNAinrestrictionenzymereactionstopreparenickedDNA)，Nucl.AcidsRes.13：8749-8764(1985)；Taylor等，用硫代磷酸修飾的DNA高頻率快速產(chǎn)生寡核苷酸-導(dǎo)向的突變(Therapidgenerationofoligonucleotide-directedmutationsathighfrequencyusingphosphorothioate-modifiedDNA)，Nucl.AcidsRes.13：8765-8787(1985)；Nakamaye&Eckstein，硫代磷酸基團(tuán)抑制限制性核酸內(nèi)切酶NciI切割及其在寡核苷酸-導(dǎo)向的誘變中的應(yīng)用(InhibitionofrestrictionendonucleaseNciIcleavagebyphosphorothioategroupsanditsapplicationtooligonucleotide-directedmutagenesis)，Nucl.AcidsRes.14：9679-9698(1986)；Sayers等，在基于硫代磷酸的寡核苷酸-導(dǎo)向的誘變中的Y-T核酸外切酶(Y-TExonucleasesinphosphorothioate-basedoligonucleotide-directedmutagenesis)，Nucl.AcidsRes.16：791-802(1988)；Sayers等，通過在溴乙錠的存在下與限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)鏈特異性切割含有硫代磷酸的DNA(Strandspecificcleavageofphosphorothioate-containingDNAbyreactionwithrestrictionendonucleasesinthepresenceofethidiumbromide)，(1988)Nucl.AcidsRes.16：803-814；Kramer等，構(gòu)建寡核苷酸-導(dǎo)向的突變的缺口雙鏈體DNA方法(ThegappedduplexDNAapproachtooligonucleotide-directedmutationconstruction)，Nucl.AcidsRes.12：9441-9456(1984)；Kramer&Fritz通過缺口雙鏈體DNA寡核苷酸-導(dǎo)向的構(gòu)建突變(Oligonucleotide-directedconstructionofmutationsviagappedduplexDNA)，MethodsinEnzymol.154：350-367(1987)；Kramer等，用于寡核苷酸-導(dǎo)向的構(gòu)建突變的缺口雙鏈體DNA方法中改進(jìn)的酶促體外反應(yīng)(ImprovedenzymaticinvitroreactionsinthegappedduplexDNAapproachtooligonucleotide-directedconstructionofmutations)，Nucl.AcidsRes.16：7207(1988)；Fritz等，寡核苷酸-導(dǎo)向的構(gòu)建突變：無需酶促體外反應(yīng)的缺口雙鏈體DNA方法(Oligonucleotide-directedconstructionofmutations:agappedduplexDNAprocedurewithoutezymaticreactionsinvitro)，Nucl.AcidsRes.16：6987-6999(1988)；Kramer等，點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)(PointMismatchRepair)，Cell38：879-887(1984)；Carter等，用M13載體改進(jìn)的寡核苷酸定位誘變(Improvedoligonucleotidesite-directedmutagenesisusingM13vectors)，Nucl.AcidsRes.13：4431-4443(1985)；Carter，用M13載體改進(jìn)的寡核苷酸-導(dǎo)向的誘變(Improvedoligonucleotide-directedmutagenesisusingM13vectors)，MethodsinEnzymol.154：382-403(1987)；Eghtedarzadeh&Henikoff，寡核苷酸用于產(chǎn)生大缺失(Useofoligonucleotidestogeneratelargedeletions)，Nucl.AcidsRes.14：5115(1986)；Wells等，在穩(wěn)定枯草桿菌蛋白酶的過渡態(tài)中氫鍵形成的重要性(Importanceofhydrogen-bondformationinstabilizingthetransitionstateofsubtilisin)，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A317：415-423(1986)；Nambiar等，編碼核糖核酸酶S蛋白的基因全合成和克隆(TotalsynthesisandcloningofagenecodingfortheribonucleaseSprotein)，Science223：1299-1301(1984)；Sakamar和Khorana，牛桿菌外節(jié)段鳥嘌呤核苷酸-結(jié)合蛋白(轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白)的α-亞基的基因全合成和表達(dá)(Totalsynthesisandexpressionofagenefortheα-subunitofbovinerodoutersegmentguaninenucleotide-bindingprotein(transducin))，Nucl.AcidsRes.14：6361-6372(1988)；Wells等，盒式誘變：在限定位點(diǎn)產(chǎn)生多突變的有效方法(Cassettemutagenesis:anefficientmethodforgenerationofmultiplemutationsatdefinedsites)，Gene34：315-323(1985)；等，通過微量的‘鳥槍法’基因合成進(jìn)行寡核苷酸-導(dǎo)向的誘變(Oligonucleotide-directedmutagenesisbymicroscale'shot-gun'genesynthesis)，Nucl.AcidsRes.13：3305-3316(1985)；Mandecki，大腸桿菌質(zhì)粒中寡核苷酸-導(dǎo)向的雙鏈斷裂修復(fù)：定位誘變方法(Oligonucleotide-directeddouble-strandbreakrepairinplasmidsofEscherichiacoli:amethodforsite-specificmutagenesis)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：7177-7181(1986)；Arnold，用于不平常環(huán)境的蛋白工程(Proteinengineeringforunusualenvironments)，CurrentOpinioninBiotechnology4：450-455(1993)；Sieber等，NatureBiotechnology，19：456-460(2001).W.P.C.Stemmer，Nature370，389-91(1994)；和I.A.Lorimer，I.Pastan，NucleicAcidsRes.23,3067-8(1995)。上述很多方法的其它詳情可參見MethodsinEnzymology第154卷，它也描述了有用的措施，以解決各種誘變方法中出現(xiàn)的故障問題。本發(fā)明也涉及真核宿主細(xì)胞和生物，用于通過正交tRNA/RS對(duì)體內(nèi)摻入非天然氨基酸。用本發(fā)明的多核苷酸或包括本發(fā)明的多核苷酸的構(gòu)建物，例如本發(fā)明載體，可以是，如克隆載體或表達(dá)載體遺傳改造的(例如，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)宿主細(xì)胞。載體可以是，如質(zhì)粒、細(xì)菌、病毒、裸露的多核苷酸或共軛多核苷酸的形式。通過標(biāo)準(zhǔn)方法，包括電穿孔(From等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82,5824(1985))、病毒載體感染、在小珠或顆粒的基質(zhì)內(nèi)或表面上通過具有核酸的小顆粒高速?gòu)椀罎B透(Klein等，Nature327，70-73(1987))將載體引入細(xì)胞和/或微生物?？梢栽跒檫m用于，如篩選步驟、激活啟動(dòng)子或選擇轉(zhuǎn)化株的活性而修改的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)改造的宿主細(xì)胞?？梢詫⑦@些細(xì)胞任選地培養(yǎng)成轉(zhuǎn)基因生物。其它用于，例如細(xì)胞分離和培養(yǎng)(如后續(xù)核酸分離)的有用參考文獻(xiàn)包括Freshney(1994)《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，基本技術(shù)手冊(cè)》(CultureofAnimalCells，aManualofBasicTechnique)，第三版，Wiley-Liss，NewYork及其引用的參考文獻(xiàn)；Payne等(1992)《在液體系統(tǒng)中培養(yǎng)植物細(xì)胞和組織》(PlantCellandTissueCultureinLiquidSystems)JohnWiley&Sons，Inc.NewYork，NY；Gamborg和Phillips(編)(1995)《植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)》(PlantCell，TissueandOrganCulture)；《基本方法施普林格實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(FundamentalMethodsSpringerLabManual)，Springer-Verlag(BerlinHeidelbergNewYork)和Atlas和Parks(編)《微生物培養(yǎng)基手冊(cè)》(TheHandbookofMicrobiologicalMedia)(1993)CRCPress，BocaRaton，F(xiàn)L。將靶核酸引入細(xì)胞的幾種公知方法是可用的，其中任何一個(gè)均可用于本發(fā)明。這些方法包括：將含有DNA的細(xì)菌原生質(zhì)體與受體細(xì)胞融合、電穿孔、拋射體轟擊和用病毒載體感染(下面進(jìn)一步討論)等?？蓪⒓?xì)菌細(xì)胞用于擴(kuò)增含有本發(fā)明DNA構(gòu)建物的質(zhì)粒的數(shù)目。細(xì)菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期，可通過本領(lǐng)域已知的各種方法分離細(xì)菌中的質(zhì)粒(參見，例如，Sambrook)。此外，可從市場(chǎng)購(gòu)得很多用于從細(xì)菌中純化質(zhì)粒的試劑盒(參見，例如，PharmaciaBiotech的EasyPrepTM、FlexiPrepTM；Stratagene的StrataCleanTM；和Qiagen的QIAprepTM)。然后進(jìn)一步操縱分離和純化的質(zhì)粒，以生產(chǎn)其它質(zhì)粒，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞或摻入相關(guān)載體以感染生物體。典型載體包含用于調(diào)節(jié)具體靶核酸表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列，和啟動(dòng)子。載體任選地包含含有至少一個(gè)獨(dú)立終止子序列、允許該盒在真核生物或原核生物或二者中復(fù)制的序列(如穿梭載體)和用于原核和真核系統(tǒng)的選擇標(biāo)記的普通表達(dá)盒。載體適合于在原核生物、真核生物或優(yōu)選二者中復(fù)制和整合。參見，Giliman&Smith，Gene8：81(1979)；Roberts，等，Nature，328：731(1987)；Schneider，B.，等，ProteinExpr.Purif.6435：10(1995)；Ausubel，Sambrook，Berger(上述)。例如ATCC，如《ATCC細(xì)菌和噬菌體目錄》(TheATCCCatalogueofBacteriaandBacteriophage)(1992)Gherna等(編)ATCC出版，提供了用于克隆的細(xì)菌和噬菌體目錄。用于測(cè)序、克隆和分子生物學(xué)其它方面的附加基本方法和基礎(chǔ)理論考慮也參見Watson等(1992)《重組DNA》(RecombinantDNA)第二版ScientificAmericanBooks，NY。此外，實(shí)質(zhì)上可從各種商業(yè)來源中任意一家定制或規(guī)范訂購(gòu)任意核酸(實(shí)際上任意貼商標(biāo)的核酸，無論標(biāo)準(zhǔn)或非標(biāo)準(zhǔn))，如MidlandCertifiedReagentCompany(Midland，TXmcrc.com)、TheGreatAmericanGeneCompany(Ramona，CA可登錄萬維網(wǎng)genco.com)、ExpressGenInc.(Chicago，IL，可登錄萬維網(wǎng)expressgen.com)、OperonTechnologiesInc.(Alameda，CA)和很多其它公司。試劑盒試劑盒也是本發(fā)明特征。例如，提供了在細(xì)胞中生產(chǎn)含有至少一個(gè)非天然氨基酸的蛋白的試劑盒，其中該試劑盒包括含有編碼O-tRNA的多核苷酸序列和/或O-tRNA，和/或編碼O-RS的多核苷酸序列和/或O-RS的容器。在一個(gè)實(shí)施方式中，該試劑盒還包括至少一種非天然氨基酸。在另一實(shí)施方式中，該試劑盒還包含生產(chǎn)蛋白的說明材料。實(shí)施例提供下面的實(shí)施例是為了說明，而非限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以在不背離本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍的情況下改變各種非重要的參數(shù)。實(shí)施例1：在真核細(xì)胞中摻入非天然氨基酸的氨?；?tRNA合成酶的生產(chǎn)方法和組合物擴(kuò)展真核生物遺傳密碼以包括具有新的物理、化學(xué)或生物性質(zhì)的非天然氨基酸，為在這些細(xì)胞中分析和控制蛋白功能提供有力工具。為此目的，描述了在釀酒酵母(S.cerevisiae)中用于分離響應(yīng)于琥珀密碼子以高保真度將非天然氨基酸摻入蛋白中的氨?；?tRNA合成酶。該方法基于通過在GAL4的DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域之間抑制琥珀密碼子，激活GAL4反應(yīng)性報(bào)道基因HIS3、URA3或LacZ。描述了用于正選擇活性大腸桿菌酪氨酰-tRNA合成酶(EcTyrRS)變體的GAL4報(bào)道基因的最優(yōu)化。也開發(fā)了用URA3報(bào)道基因進(jìn)行失活EcTyrRS變體的負(fù)選擇，該報(bào)道基因使用加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基作為‘有毒等位基因’的小分子(5-氟乳清酸(5-FOA))。重要的是，可以在單細(xì)胞上以一定范圍的嚴(yán)格性進(jìn)行正和負(fù)選擇。這可有助于從大的突變體合成酶文庫(kù)中分離一定范圍的氨?；?tRNA合成酶(aaRS)活性。模型選擇證明了該方法用于分離所需aaRS表型的功效。最近，將非天然氨基酸加入大腸桿菌(E.coli)的遺傳密碼中提供了在體外和體內(nèi)分析和操縱蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的有效的新手段。以與普通的二十種氨基酸相匹敵的效率和保真度，將具有光親和標(biāo)記、重原子、酮和烯烴基的氨基酸和生色團(tuán)摻入大腸桿菌中的蛋白質(zhì)中。參見，例如，Chin,等，(2002)，將光交聯(lián)劑加入到大腸桿菌的遺傳密碼中(AdditionofaPhotocrosslinkertotheGeneticCodeofEscherichiacoli)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：11020-11024；Chin和Schultz，(2002)，體內(nèi)用非天然氨基酸誘變進(jìn)行光交聯(lián)(InvivoPhotocrosslinkingwithUnnaturalAminoAcidMutagenesis)，ChemBioChem11：1135-1137；Chin等，(2002)，將對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸加入大腸桿菌的遺傳密碼中(Additionofp-Azido-L-phenylalaninetotheGeneticcodeofEscherichiacoli)，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027；Zhang等，(2002)，將鏈烯選擇性摻入大腸桿菌中的蛋白(TheselectiveincorporationofalkenesintoproteinsinEscherichiacoli)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.41：2840-2842；以及Wang和Schultz，(2002)，擴(kuò)展遺傳密碼(ExpandingtheGeneticCode)，Chem.Comm.1-10。以前，已經(jīng)通過顯微注射化學(xué)錯(cuò)?；氖葻崴哪はxtRNA(例如，M.E.Saks,等(1996)，用于通過無義抑制將非天然氨基酸體內(nèi)摻入蛋白質(zhì)的工程四膜蟲tRNAGln(AnengineeredTetrahymenatRNAGlnforinvivoincorporationofunnaturalaminoacidsintoproteinsbynonsensesuppression)，J.Biol.Chem.271：23169-23175)和相關(guān)mRNA，將非天然氨基酸引入爪蟾卵母細(xì)胞中的煙堿性乙酰膽堿受體中(例如，M.W.Nowak,等(1998)，將非天然氨基酸體內(nèi)摻入爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的離子通道中(InvivoincorporationofunnaturalaminoacidsintoionchannelsinXenopusoocyteexpressionsystem)，MethodEnzymol.293：504-529)。這允許了通過引入含有具獨(dú)特物理或化學(xué)性質(zhì)的側(cè)鏈的氨基酸對(duì)卵母細(xì)胞中的受體進(jìn)行詳細(xì)的生物物理學(xué)研究。參見，例如，D.A.Dougherty(2000)，作為蛋白結(jié)構(gòu)和功能探針的非天然氨基酸(Unnaturalaminoacidsasprobesofproteinstructureandfunction)，Curr.Opin.Chem.Biol.4：645-652。不幸的是，該方法僅限于可以進(jìn)行顯微注射的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，因?yàn)閠RNA在體外被化學(xué)?；?，不能被再酰化，所以蛋白產(chǎn)率非常低。這反過來使測(cè)定蛋白功能的靈敏技術(shù)成為必需。在真核細(xì)胞中響應(yīng)于琥珀密碼子，將非天然氨基酸遺傳摻入蛋白質(zhì)中引起了大家的興趣。也參見，H.J.Drabkin等，(1996)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的琥珀抑制取決于大腸桿菌氨?；?tRNA合成酶基因的表達(dá)(AmbersuppressioninmammaliancellsdependentuponexpressionofanEscherichiacoliaminoacyl-tRNAsynthetasegene)，Molecular&CellularBiology16：907-913；A.K.Kowal,等，(2001)，第二十一個(gè)氨?；?tRNA合成酶-抑制型tRNA對(duì)在真核生物和真細(xì)菌中將氨基酸類似物位點(diǎn)特異性摻入蛋白中的可能用途(Twenty-firstaminoacyl-tRNAsynthetase-suppressortRNApairsforpossibleuseinsite-specificincorporationofaminoacidanaloguesintoproteinsineukaryotesandineubacteria)，[評(píng)論]，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：2268-2273；和K.Sakamoto,等，(2002)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性摻入蛋白質(zhì)中(Site-specificincorporationofanunnaturalaminoacidintoproteinsinmammaliancells)，NucleicAcidsRes.30：4692-4699。這將具有顯著的技術(shù)和實(shí)踐優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)閠RNA的關(guān)聯(lián)合成酶將對(duì)其進(jìn)行再?；?導(dǎo)致產(chǎn)生大量突變蛋白。而且，遺傳編碼的氨?；?tRNA合成酶和tRNA原則上是可遺傳的，允許非天然氨基酸通過很多代細(xì)胞分裂摻入蛋白中，而沒有指數(shù)稀釋。已經(jīng)描述了將新氨基酸加入到大腸桿菌的遺傳密碼中的必需步驟(參見，例如，D.R.Liu和P.G.Schultz，(1999)，具有擴(kuò)展遺傳密碼的生物進(jìn)化的進(jìn)展(Progresstowardtheevolutionofanorganismwithanexpandedgeneticcode)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：4780-4785；類似原理可用于擴(kuò)展真核生物的遺傳密碼。第一步，鑒定正交氨?；?tRNA合成酶(aaRS)/tRNACUA對(duì)。該對(duì)需要與宿主細(xì)胞翻譯機(jī)器一起作用，但是aaRS不應(yīng)該使任何內(nèi)源性tRNAs具有氨基酸，tRNACUA不應(yīng)該被任何內(nèi)源性合成酶氨?；⒁?，例如，D.R.Liu，等，設(shè)計(jì)用于在體內(nèi)將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性摻入蛋白質(zhì)中的tRNA和氨?；?tRNA合成酶(EngineeringatRNAandaminoacyl-tRNAsynthetaseforthesite-specificincorporationofunnaturalaminoacidsintoproteinsinvivo)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：10092-10097。第二步，從突變體aaRS文庫(kù)中選擇那些能夠僅用非天然氨基酸的aaRS/tRNA對(duì)。在大腸桿菌中，利用MjTyrRS的變體選擇非天然氨基酸是通過采用兩步‘雙篩’選擇進(jìn)行的。參見，例如，D.R.Liu和P.G.Schultz，(1999)，具有擴(kuò)展遺傳密碼的生物進(jìn)化的進(jìn)展(Progresstowardtheevolutionofanorganismwithanexpandedgeneticcode)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：4780-4785。在真核細(xì)胞中使用修飾的選擇方法。將釀酒酵母(S.cerevisiae)選作真核宿主生物，因?yàn)樗菃渭?xì)胞，具有快速的世代時(shí)間，并且已相當(dāng)良好地表征了遺傳學(xué)特征。參見，例如，D.Burke,等，(2000)《酵母遺傳學(xué)方法》(MethodsinYeastGenetics)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY。而且，因?yàn)檎婧松锏姆g機(jī)器是高度保守的(參見，例如，(1996)《翻譯控制》(TranslationalControl)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY；Y.Kwok和J.T.Wong，(1980)，用氨?；?tRNA合成酶作為系統(tǒng)發(fā)育探針確定紅皮鹽桿菌和真核生物之間的進(jìn)化關(guān)系(EvolutionaryrelationshipbetweenHalobacteriumcutirubrumandeukaryotesdeterminedbyuseofaminoacyl-tRNAsynthetasesasphylogeneticprobes)，CanadianJournalofBiochemistry58：213-218；和(2001)《核糖體》(TheRibosome)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY)，很可能，發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母用于摻入非天然氨基酸的aaRS基因可被‘切割和粘貼’到高級(jí)真核生物中，與關(guān)聯(lián)tRNAs合作使用(參見，例如，K.Sakamoto,等，(2002)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性摻入蛋白質(zhì)中(Site-specificincorporationofanunnaturalaminoacidintoproteinsinmammaliancells)，NucleicAcidsRes.30：4692-4699；和C.Kohrer，等，(2001)，將琥珀和赭石抑制型tRNAs輸入哺乳動(dòng)物細(xì)胞：將氨基酸類似物位點(diǎn)特異性插入蛋白質(zhì)中的通用方法(ImportofamberandochresuppressortRNAsintomammaliancells:ageneralapproachtosite-specificinsertionofaminoacidanaloguesintoproteins)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：14310-14315)以摻入非天然氨基酸。因此，釀酒酵母遺傳密碼的擴(kuò)展是擴(kuò)展復(fù)雜多細(xì)胞真核生物的遺傳密碼的途徑。參見，例如，M.Buvoli,等，(2000)，在細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠中通過多聚體化的抑制型tRNA基因抑制無義突變(SuppressionofnonsensemutationsincellcultureandmicebymultimerizedsuppressortRNAgenes)，Molecular&CellularBiology20：3116-3124。來源于以前用于擴(kuò)展大腸桿菌遺傳密碼的詹氏甲烷球菌TyrRS(MjTyrRS)/tRNA(參見例如，L.Wang和P.G.Schultz，(2002)，擴(kuò)展遺傳密碼(ExpandingtheGeneticCode)，Chem.Comm.1-10)的酪氨酰對(duì)在真核生物中不是正交的(例如，P.Fechter,等，(2001)，詹氏甲烷球菌和釀酒酵母tRNA(Tyr)中的主要酪氨酸決定子是保守的但表達(dá)不同(MajortyrosineidentitydeterninantsinMethanococcusjannaschiiandSaccharomycescerevisiaetRNA(Tyr)areconservedbutexpresseddifferently)，Eur.J.Biochem.268：761-767)，需要新的正交對(duì)以擴(kuò)展真核生物遺傳密碼。Schimmel和同事們指出，在釀酒酵母中，大腸桿菌酪氨酰-tRNA合成酶(EcTyrRS)/tRNACUA對(duì)抑制琥珀密碼子；以及在酵母細(xì)胞溶膠中，內(nèi)源性氨酰基tRNA合成酶不載有大腸桿菌tRNACUA(圖2)。也參見，例如，H.Edwards，等，(1991)，大腸桿菌酪氨酸轉(zhuǎn)移RNA在釀酒酵母中是亮氨酸-特異性轉(zhuǎn)移RNA(AnEscherichiacolityrosinetransferRNAisaleucine-specifictransferRNAintheyeastSaccharomycescerevisiae)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：1153-1156；以及H.Edwards和P.Schimmel(1990)，細(xì)菌氨?；?tRNA合成酶選擇性識(shí)別釀酒酵母中的細(xì)菌琥珀抑制子(AbacterialambersuppressorinSaccharomycescerevisiaeisselectivelyrecognizedbyabacterialaminoacyl-tRNAsynthetase)，Molecular&CellularBiology10：1633-1641。此外，EcTyrRS已顯示并不在體外載有酵母tRNA。參見，例如，Y.Kwok和J.T.Wong，(1980)，用氨酰基-tRNA合成酶作為系統(tǒng)發(fā)育探針確定紅皮鹽桿菌和真核生物之間的進(jìn)化關(guān)系(EvolutionaryrelationshipbetweenHalobacteriumcutirubrumandeukaryotesdeterminedbyuseofaminoacyl-tRNAsynthetasesasphylogeneticprobes)，CanadianJournalofBiochemistry58：213-218；B.P.Doctor，等，(1966)，酵母和大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA的種特異性的研究(StudiesonthespeciesspecificityofyeastandE.colityrosinetRNAs)，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.31：543-548；和K.Wakasugi,等，(1998)，進(jìn)化中的遺傳密碼：將種特異性氨?；c肽移植物交換(Geneticcodeinevolution:switchingspecies-specificaminoacylationwithapeptidetransplant)，EMBOJournal17：297-305。因此，EcTyrRS/tRNACUA對(duì)是釀酒酵母以及高級(jí)真核生物中正交對(duì)的候選物(例如，A.K.Kowal,等，(2001)，第二十一個(gè)氨?；?tRNA合成酶-抑制型tRNA對(duì)在真核生物和真細(xì)菌中將氨基酸類似物位點(diǎn)特異性摻入蛋白中的可能用途(Twenty-firstaminoacyl-tRNAsynthetase-suppressortRNApairsforpossibleuseinsite-specificincorporationofaminoacidanaloguesintoproteinsineukaryotesandineubacteria)，[評(píng)論]，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(2001)2268-2273)。為了擴(kuò)展大腸桿菌中EcTyrRS的底物特異性，Nishimura和同事們篩選了易出錯(cuò)的PCR產(chǎn)生的EcTyrRS突變體文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)了具有改進(jìn)的摻入3-氮酪氨酸能力的突變體。參見，例如，F(xiàn).Hamano-Takaku,等，(2000)，突變大腸桿菌酪氨酰tRNA合成酶利用非天然氨基酸氮酪氨酸比利用酪氨酸更有效率(AmutantEscherichiacolityrosyltRNAsynthetaseutilizestheunnaturalaminoacidazatyrosinemoreefficientlythantyrosine)，J.Biol.Chem.275：40324-40328。然而，該氨基酸摻入整個(gè)大腸桿菌蛋白質(zhì)組中，產(chǎn)生的酶仍然優(yōu)選酪氨酸作為底物。Yokoyama和同事們?cè)邴溑叻g系統(tǒng)中篩選了一小部分設(shè)計(jì)的EcTyrRS活性位點(diǎn)變體，發(fā)現(xiàn)了利用3-碘化酪氨酸比利用酪氨酸更有效率的EcTyrRS變體。參見，D.Kiga,等，(2002)，在真核翻譯中將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性摻入蛋白中的工程大腸桿菌酪氨酰-tRNA合成酶及其在麥胚無細(xì)胞體系中的應(yīng)用(AnengineeredEscherichiacolityrosyl-tRNAsynthetaseforsite-specificincorporationofanunnaturalaminoacidintoproteinsineukaryotictranslationanditsapplicationinawheatgermcell-freesystem)，Proc.Natl.Sci.U.S.A.99：9715-9720。與我們?cè)诖竽c桿菌中開發(fā)的酶相反(例如，J.W.Chin,等，(2002)，將光交聯(lián)劑加入到大腸桿菌的遺傳密碼中(AdditionofaPhotocrosslinkertotheGeneticCodeofEscherichiacoli)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.99：11020-11024；J.W.Chin,等，(2002)，將對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸加入大腸桿菌的遺傳密碼中(Additionofp-Azido-L-phenylalaninetotheGeneticcodeofEscherichiacoli)，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027；L.Wang,等，(2001)，擴(kuò)展大腸桿菌的遺傳密碼(ExpandingtheGeneticCodeofEscherichiacoli)，Science292：498-500；和L.Wang,等，(2002)，將L-3-(2-萘基)丙氨酸加入大腸桿菌的遺傳密碼中(AddingL-3-(2-naphthyl)alaninetothegeneticcodeofE-coli)，J.Am.Chem.Soc.124：1836-1837)，該酶在沒有非天然氨基酸的情況下仍然摻入酪氨酸。參見，例如，D.Kiga等，(2002)，在真核翻譯中將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性摻入蛋白中的工程大腸桿菌酪氨酰-tRNA合成酶及其在麥胚無細(xì)胞體系中的應(yīng)用(AnengineeredEscherichiacolityrosyl-tRNAsynthetaseforsite-specificincorporationofanunnaturalaminoacidintoproteinsineukaryotictranslationanditsapplicationinawheatgermcellfreesystem)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：9715-9720。最近，Yokoyama和同事們也證明在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中該EcTyrRS突變體與來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的tRNACUA一起作用以抑制琥珀密碼子。參見，K.Sakamoto,等，(2002)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性摻入蛋白中，NucleicAcidsRes.30：4692-4699。要求任何加入真核遺傳密碼的氨基酸以類似于普通的二十種氨基酸的保真度摻入。為了完成這個(gè)目的，用通常體內(nèi)選擇方法以發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母中起作用響應(yīng)于琥珀密碼子TAG，摻入非天然氨基酸而非普通氨基酸的EcTyrRS/tRNACUA變體。選擇的主要優(yōu)點(diǎn)是可以從108EcTyrRS活性位點(diǎn)變體文庫(kù)中迅速選擇并富集選擇性摻入非天然氨基酸的酶，這比體外篩選的多樣性多6-7個(gè)數(shù)量級(jí)。參見，例如，D.Kiga,等，(2002)，在真核翻譯中將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性摻入蛋白中的工程大腸桿菌酪氨酰-tRNA合成酶及其在麥胚無細(xì)胞體系中的應(yīng)用(AnengineeredEscherichiacolityrosyl-tRNAsynthetaseforsite-specificincorporationofanunnaturalaminoacidintoproteinsineukaryotictranslationanditsapplicationinawheatgermcell-freesystem)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：9715-9720。這種多樣性的增加大大增加了分離EcTyrRS變體的可能性，變體用于以非常高的保真度摻入各種不同的有用功能。參見，例如，L.Wang和P.G.Schultz，(2002)，擴(kuò)展遺傳密碼(ExpandingtheGeneticCode)，Chem.Comm.1-10。為了延伸釀酒酵母的選擇方法，使用了轉(zhuǎn)錄激活蛋白、GAL4(參見圖1)。參見，例如，A.Laughon,等，(1984)，鑒定兩種通過釀酒酵母GAL4基因編碼的蛋白(IdentificationoftwoproteinsencodedbytheSaccharomycescerevisiaeGAL4gene)，Molecular&CellularBiology4：268-275；A.Laughon和R.F.Gesteland，(1984)，釀酒酵母GAL4基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)(PrimarystructureoftheSaccharomycescerevisiaeGAL4gene)，Molecular&CellularBiology4：260-267；L.Keegan,等，(1986)，從真核調(diào)節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)錄-激活功能中分離DNA結(jié)合(SeparationofDNAbindingfromthetranscription-activatingfunctionofaeukaryoticregulatoryprotein)，Science231：699-704；和M.Ptashne，(1988)，真核轉(zhuǎn)錄激活物是如何工作的(Howeukaryotictranscriptionalactivatorswork)，Nature335：683-689。該881個(gè)氨基酸的蛋白N-末端147個(gè)氨基酸形成DNA結(jié)合域(DBD)，它與DNA序列特異地結(jié)合。參見，例如，M.Carey,等，(1989)，GAL4的氨基-末端片段與DNA結(jié)合成二聚體(Anamino-terminalfragmentofGAL4bindsDNAasadimer)，J.Mol.Biol.209：423-432；和E.Giniger,等，(1985)，GAL4，一種酵母陽性調(diào)節(jié)蛋白的特異性DNA結(jié)合(SpecificDNAbindingofGAL4,apositiveregulatoryproteinofyeast)，Cell40：767-774。由間插蛋白序列將DBD連接到C-末端113個(gè)氨基酸的激活域(AD)，當(dāng)該激活域與DNA結(jié)合時(shí)可激活轉(zhuǎn)錄。參見，例如，J.Ma和M.Ptashne，(1987)，GAL4的缺失分析限定了兩種轉(zhuǎn)錄激活節(jié)段(DeletionanalysisofGAL4definestwotranscriptionalactivatingsegments)，Cell48：847-853：和J.Ma和M.Ptashne，(1987)，GAL80識(shí)別GAL4羧基-末端的30個(gè)氨基酸(Thecarboxy-terminal30aminoacidsofGAL4arerecognizedbyGAL80)，Cell50：137-142。我們想像，通過將琥珀密碼子置于含有GAL4的N-末端DBD和它的C-末端AD的單個(gè)多肽的N-末端DBD處，通過EcTyrRS/tRNACUA對(duì)的琥珀抑制可以與通過GAL4的轉(zhuǎn)錄激活連接(圖1，A組)。通過選擇合適的GAL4激活的報(bào)道基因，正和負(fù)選擇都可以用該基因進(jìn)行(圖1，B組)。雖然很多基于補(bǔ)充細(xì)胞的氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型報(bào)道基因可以用于正選擇(如URA3，LEU2，HISS，LYS2)，但HISS基因是吸引人的報(bào)道基因，因?yàn)榭梢酝ㄟ^加入3-氨基三唑(3-AT)以劑量依賴方式調(diào)節(jié)它編碼的蛋白的活性(咪唑甘油磷酸脫氫酶)。參見，例如，G.M.Kishore和D.M.Shah，(1988)，作為除草劑的氨基酸生物合成抑制劑(Aminoacidbiosynthesisinhibitorsasherbicides)，AnnualReviewofBiochemistry57：627-663。在釀酒酵母中，較少基因已用于負(fù)選擇。已經(jīng)成功使用的幾種負(fù)選擇策略之一(參見，例如，A.J.DeMaggio,等，(2000)，酵母分裂-雜交系統(tǒng)(Theyeastsplit-hybridsystem)，MethodEnzymol.328：128-137；H.M.Shih,等，(1996)，陽性遺傳選擇破壞蛋白-蛋白相互作用：鑒定阻止與輔激活物CBP結(jié)合的CREB突變(Apositivegeneticselectionfordisruptingprotein-proteininteractions:identificationofCREBmutations,thatpreventassociationwiththecoactivatorCBP)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：13896-13901；M.Vidal,等，(1996)，用酵母反向雙雜交系統(tǒng)遺傳表征哺乳動(dòng)物蛋白-蛋白相互作用域的遺傳特征(Geneticcharacterizationofamammalianprotein-proteininteractiondomainbyusingayeastreversetwo-hybridsystem)，[評(píng)論]，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：10321-10326；和M.Vidal,等，(1996)，反向雙雜交和單雜交系統(tǒng)檢測(cè)蛋白-蛋白解離和DNA-蛋白相互作用(Reversetwo-hybridandone-hybridsystemstodetectdissociationofprotein-proteinandDNA-proteininteractions)，[評(píng)論]，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：10315-10320)是在Vidal和同事們開發(fā)的‘反向雙雜交’系統(tǒng)中描述的URA3/5-氟乳清酸(5-FOA)負(fù)選擇(例如，J.D.Boeke,等，(1984)，在酵母中正選擇缺少乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶活性的突變體：5-氟乳清酸抗性(Apositiveselectionformutantslackingorotidine-5’-phosphatedecarboxylaseactivityinyeast:5-fluorooroticacidresistance)，Molecular&GeneralGenetics197：345-346)系統(tǒng)。參見，M.Vidal,等，(1996)，用酵母反向雙雜交系統(tǒng)遺傳表征哺乳動(dòng)物蛋白-蛋白相互作用域(Geneticcharacterizationofamammalianprotein-proteininteractiondomainbyusingayeastreversetwo-hybridsystem)，[評(píng)論]，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：10321-10326；和M.Vidal,等，(1996)，反向雙雜交和單雜交系統(tǒng)檢測(cè)蛋白-蛋白解離和DNA-蛋白相互作用(Reversetwo-hybridandone-hybridsystemstodetectdissociationofprotein-proteinandDNA-proteininteractions)，[評(píng)論]，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.93：10315-10320)。在反向雙雜交系統(tǒng)中，將基因組整合的URA3報(bào)道基因置于嚴(yán)密控制的啟動(dòng)子下，該啟動(dòng)子含有GAL4DNA結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)相互作用的兩種蛋白與GAL4DBD和GAL4AD產(chǎn)生融合時(shí)，它們就重建了GAL4的活性，并激活URA3的轉(zhuǎn)錄。在5-FOA存在下，URA3基因產(chǎn)物將5-FOA轉(zhuǎn)化成有毒產(chǎn)物，殺死細(xì)胞。參見，J.D.Boeke，等，上述。將該選擇用于選擇破壞蛋白-蛋白相互作用的蛋白和選擇破壞蛋白-蛋白相互作用的突變。也描述了用于篩選蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制劑的變體。參見，例如，J.Huang和S.L.Schreiber，(1997)用于在納米滴中選擇蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制劑的酵母遺傳體系(Ayeastgeneticsystemforselectingsmallmoleculeinhibitorsofprotein-proteininteractionsinnanodroplets)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：13396-13401.在全長(zhǎng)GAL4中琥珀密碼子的合適選擇允許用HIS3或URA3GAL4激活的報(bào)道基因有效正選擇活性EcTyrRS變體，以在酵母細(xì)胞中補(bǔ)充組氨酸或尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型。而且，URA3報(bào)道基因可以用于在5-FOA存在下負(fù)選擇失活EcTyrRS變體。此外，可以將使用lacZ的比色測(cè)定用于讀出酵母細(xì)胞中氨酰基-tRNA合成酶活性。結(jié)果和討論在構(gòu)建的ADH1啟動(dòng)子的控制下表達(dá)EcTyrRS基因，從相同的高拷貝酵母質(zhì)粒(pEcTyrRStRNACUA，圖1，C組)中表達(dá)tRNACUA基因。在pEcTyrRStRNACUA和低拷貝報(bào)道基因的共轉(zhuǎn)化時(shí)，該報(bào)道基因在嵌入MaV203的GAL4構(gòu)建物的DNA結(jié)合域和激活域之間含有單琥珀突變，細(xì)胞在缺少組氨酸和含有10-20mM3-AT的選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(圖2)。當(dāng)MaV203細(xì)胞轉(zhuǎn)染了相同的GAL4構(gòu)建物和失活合成酶突變體(A5)或缺少EctRNA基因的構(gòu)建物時(shí)，在10mM3-AT上沒有觀察到生長(zhǎng)(圖2)。這些實(shí)驗(yàn)確定EcTyrRS可以從ADH1啟動(dòng)子開始以功能形式構(gòu)成地表達(dá)，在MaV203中有最小的內(nèi)源性琥珀抑制，和在該系統(tǒng)中酵母合成酶幾乎沒有載有EctRNACUA。參見，例如，H.Edwards，等，(1991)，大腸桿菌酪氨酸轉(zhuǎn)移RNA在釀酒酵母中是亮氨酸-特異性轉(zhuǎn)移RNA(AnEscherichiacolityrosinetransferRNAisaleucine-specifictransferRNAintheyeastSaccharomycescerevisiae)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：1153-1156；以及H.Edwards和P.Schimmel，(1990)，細(xì)菌氨?；?tRNA合成酶選擇性識(shí)別釀酒酵母中的細(xì)菌琥珀抑制子(AbacterialambersuppressorinSaccharomycescerevisiaeisselectivelyrecognizedbyabacterialaminoacyl-tRNAsynthetase)，Molecular&CellularBiology10：1633-1641。因?yàn)镋cTyrRS不載有釀酒酵母tRNA(例如，Y.Kwok和J.T.Wong，(1980)，用氨?；?tRNA合成酶作為系統(tǒng)發(fā)育探針確定紅皮鹽桿菌和真核生物之間的進(jìn)化關(guān)系(EvolutionaryrelationshipbetweenHalobacteriumcutirubrumandeukaryotesdeterminedbyuseofaminoacyl-tRNAsynthetasesasphylogeneticprobes)，CanadianJournalofBiochemistry58：213-218；B.P.Doctor，等，(1966)，酵母和大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA的種特異性的研究(StudiesonthespeciesspecificityofyeastandE.colityrosinetRNAs)，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.31：543-548；和K.Wakasugi,等，(1998)，進(jìn)化中的遺傳密碼：將種特異性氨?；c肽移植物交換(Geneticcodeinevolution:switchingspecies-specificaminoacylationwithapeptidetransplant)，EMBOJournal17：297-305)，這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)EcTyrRS/EctRNACUA在釀酒酵母中是正交對(duì)。雖然第一代GAL4嵌合體能夠激活弱HIS3報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄，但是它不能在MaV203中激活URA3報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄足以在大于20mM的3-AT濃度上或在-URA平板上明顯生長(zhǎng)(圖2)。為了選擇EcTyrRS的目的，制成了變體第二代GAL4構(gòu)建物。該GAL4報(bào)道基因被設(shè)計(jì)得更有活性，具有更大的動(dòng)態(tài)范圍，避免了回復(fù)體聚集。為了提高GAL4報(bào)道基因的活性，在強(qiáng)ADH1啟動(dòng)子的控制下使用全長(zhǎng)GAL4(它的轉(zhuǎn)錄激活活性是DBD-AD融合體的兩倍(參見，例如，J.Ma和M.Ptashne，(1987)，GAL4的缺失分析限定了兩種轉(zhuǎn)錄激活節(jié)段(DeletionanalysisofGAL4definestwotranscriptionalactivatingsegments)，Cell48：847-853)，并使用了高拷貝的2-微米質(zhì)粒(拷貝數(shù)是起始GAL4嵌合體的著絲粒質(zhì)粒的10-30倍)。質(zhì)粒拷貝數(shù)和它編碼的蛋白活性的增加應(yīng)該延伸了報(bào)道基因的動(dòng)態(tài)范圍。琥珀突變是靶向編碼氨基酸殘基2和147的GAL4基因區(qū)域(圖3)。該區(qū)域足夠序列特異性DNA結(jié)合(參見，例如，M.Carey,等，(1989)，GAL4的氨基-末端片段與DNA結(jié)合成二聚體(Anamino-terminalfragmentofGAL4bindsDNAasadimer)，J.Mol.Biol.209：423-432)，位于GAL4基因中第一隱蔽激活域的5'側(cè)(參見，例如，J.Ma和M.Ptashne，(1987)GAL4的缺失分析限定了兩種轉(zhuǎn)錄激活節(jié)段(DeletionanalysisofGAL4definestwotranscriptionalactivatingsegments)，Cell48：847-853)，Cell48：847-853)，以使不預(yù)計(jì)在琥珀抑制不存在的情況下產(chǎn)生的截短產(chǎn)物能激活轉(zhuǎn)錄。氨基酸密碼子的選擇誘變由以前對(duì)GAL4的飽和誘變選擇指導(dǎo)(參見，例如，M.Johnston和J.Dover，(1988)，釀酒酵母GAL4-編碼的轉(zhuǎn)錄激活蛋白的突變分析(MutationalanalysisoftheGAL4-encodedtranscriptionalactivatorproteinofSaccharomycescerevisiae)，Genetics120：63-74)，以及GAL4的N-末端DNA結(jié)合域的X射線結(jié)構(gòu)(參見，例如，R.Marmorstein,等，(1992)，通過GAL4進(jìn)行DNA識(shí)別：蛋白-DNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)(DNArecognitionbyGAL4:structureofaprotein-DNAcomplex)，[評(píng)論]，Nature356：408-414；和J.D.Baleja,等，(1992)，釀酒酵母Cd2-GAL4的DNA-結(jié)合域的溶液結(jié)構(gòu)(SolutionstructureoftheDNA-bindingdomainofCd2-GAL4fromS.cerevisiae)，[評(píng)論]，Nature356：450-453)和它的二聚化區(qū)域的NMR結(jié)構(gòu)。參見，例如，P.Hidalgo，等，(2001)，通過GAL11P募集轉(zhuǎn)錄機(jī)器：GAL4二聚化域的結(jié)構(gòu)和相互作用(RecruitmentofthetranscriptionalmachinerythroughGAL11P:structureandinteractionsoftheGAL4dimerizationdomain)，Genes&Development15：1007-1020。將全長(zhǎng)GAL4克隆到基于小pUC的載體中，以通過定位誘變迅速構(gòu)建10個(gè)單琥珀突變體(在氨基酸L3、I13、T44、F68、R110、V114、T121、I127、S131、T145的密碼子處)。然后，在全長(zhǎng)ADH1啟動(dòng)子的控制下將GAL4和產(chǎn)生的琥珀突變體亞克隆到2-微米的酵母載體中，以建立pGADGAL4和一系列稱為pGADGAL4(xxTAG)的琥珀突變體(圖1，C組)，其中xx指GAL4基因中的突變?yōu)殓昝艽a子的氨基酸密碼子。用EcTyrRS/tRNACUA或A5/tRNACUA將各GAL4突變體共轉(zhuǎn)化到MaV203細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化為亮氨酸和色氨酸原養(yǎng)型(protrophy)。pGADGAL4本身以非常低的效率轉(zhuǎn)化(<GAL4琥珀突變體的10-3倍)，在如此高拷貝下對(duì)MaV203細(xì)胞可能有毒；用GAL4的琥珀突變體沒有觀察到如此效果。在活性或死亡合成酶的存在下，在-URA平板和0.1%5-FOA平板上測(cè)定GAL4報(bào)道基因的表型(圖3，A組)。在野生型或失活EcTyrRS存在下，五個(gè)GAL4突變體(L3TAG、I13TAG、T44TAG、F68TAG、S131TAG)在-URA平板上生長(zhǎng)，不能在0.1%5-FOA上生長(zhǎng)。在這些琥珀突變體中，內(nèi)源性抑制明顯足夠?qū)cTyrRS/tRNACUA介導(dǎo)的抑制推進(jìn)到MaV203中URA3報(bào)道基因的動(dòng)態(tài)范圍以外。五個(gè)GAL4單琥珀突變體(R110TAG，V114TAG，T121TAG，I127TAG，T145TAG)在沒有尿嘧啶和存在EcTyrRS/tRNACUA的情況下生長(zhǎng)(但不是A5/tRNACUA)，在5-FOA上顯示了反向表型。這些突變體顯示了EcTyrRS依賴性表型，屬于MaV203中URA3報(bào)道基因的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)。用GAL4的R110TAG突變體觀察到在-URA和0.1%5-FOA上最潔凈的EcTyrRS依賴性表型。當(dāng)與A5共轉(zhuǎn)化時(shí)，該突變體在X-GAL測(cè)定中顯示一些藍(lán)色。為了進(jìn)一步改進(jìn)動(dòng)態(tài)范圍，使一系列六個(gè)GAL4的雙琥珀突變體含有R110TAG(圖3，B組)，(L3TAG、R110TAG；I13TAG、R110TAG；T44TAG、R110TAG；R110TAG、T121TAG；R110TAG、I127TAG；R110TAG、T145TAG)。這些雙突變體中的四個(gè)(I13TAG、R110TAG；R110TAG、T121TAG；R110TAG、I127TAG和T145TAG、R110TAG)不能在沒有尿嘧啶的條件下生長(zhǎng)，而能夠在0.1%5-FOA上生長(zhǎng)。這些雙突變體具有平板測(cè)定的動(dòng)態(tài)范圍以外的活性。雙突變體中的兩個(gè)(L3TAG、R110TAG和T44TAG、R110TAG)能夠在存在野生型EcTyrRS/tRNACUA而非A5/tRNACUA的條件下在-URA平板上生長(zhǎng)；這些突變體在5-FOA上也顯示預(yù)期的交互表型。選擇pGADGAL4(T44TAG、R110TAG)，這兩個(gè)GAL4突變體中更有活性的進(jìn)行更詳細(xì)的表征(圖4)。含有pGADGAL4(T44TAG、R110TAG)/pEcTyrRS-tRNACUA的MaV203在X-GAL上是藍(lán)色的，但是相應(yīng)的含有pA5/tRNACUA的株則不是。類似地，含有pGADGAL4(T44TAG，R110TAG)/pEcTyrRS/tRNACUA的MaV203在具有濃度高達(dá)75mM的3-AT的平板和-URA平板上茁壯生長(zhǎng)，但是相應(yīng)的含有pA5/tRNACUA的株不能在10mM3AT或沒有尿嘧啶的情況下生長(zhǎng)?？傊?，pGADGAL4的EcTyrRS依賴性表型(T44TAG，R110TAG)可以跨越MaV203中URA3，HIS3和lacZ報(bào)道基因的動(dòng)態(tài)范圍。感興趣的是確定GAL4突變體的活性，其中T44或R110被除了酪氨酸的氨基酸取代，因?yàn)樵诓桓淖僄AL4活性的情況下取代不同氨基酸的能力可能在選擇可以將非天然氨基酸摻入蛋白的突變氨?；?tRNA合成酶中有用。參見，例如，M.Pasternak,等，(2000)，用于衍生具有擴(kuò)展遺傳密碼的生物的新正交抑制tRNA/氨?；?tRNA合成酶對(duì)(AneworthogonalsuppressortRNA/aminoacyl-tRNAsynthetasepairforevolvinganorganismwithanexpandedgeneticcode)，HelveticaChemicaActa83：2277。將GAL4中殘基T44的一系列五個(gè)突變體(T44Y，T44W，T44F，T44D，T44K)構(gòu)建到pGADGAL4(R110TAG)中，因?yàn)閜GADGAL4本身是有毒的。將GAL4中R110位的類似系列的突變體(R110Y，R110W，R110F，R110D，R110K)構(gòu)建到pGADGAL4(T44TAG)中。這些突變體與我們?cè)趽饺氲鞍字懈信d趣的大疏水氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)怯衅畹模舶瑤д姾珊拓?fù)電荷的殘基，作為允許的嚴(yán)格測(cè)試。用pEcTyrRS/tRNACUA將各突變體共轉(zhuǎn)化到MaV203細(xì)胞中，用鄰-硝基苯基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(ONPG)水解在leu+trp+分離物中測(cè)定lacZ產(chǎn)生(圖5)。在所有情況中，細(xì)胞間活性差異小于3倍，該細(xì)胞含有取代了T44或R110的不同氨基酸的GAL4。這種最小的可變性證明了這些位點(diǎn)允許在不改變GAL4的轉(zhuǎn)錄活性的情況下進(jìn)行氨基酸取代。正如由選擇性平板上測(cè)定的單琥珀突變體活性所料，在GAL4(R110TAG)背景中制成的T44突變體導(dǎo)致ONPG的水解比在GAL4(T44TAG)背景中制成的R110突變體更慢。進(jìn)行模型富集研究以檢測(cè)該系統(tǒng)從大過量的失活合成酶中選擇活性合成酶的能力(表1，表2，圖6)。該選擇模仿了在非天然氨基酸存在下從變體文庫(kù)中選擇活性合成酶的能力。將含有GAL4(T44、R110)和EcTyrRS/tRNACUA的MaV203細(xì)胞與由OD660確定過量10至106倍的GAL4(T44TAG，R110TAG)和A5/tRNACUA，以及當(dāng)鋪板于非選擇性-leu，-trp培養(yǎng)基上通過X-Gal覆蓋測(cè)定變藍(lán)的菌落部分混合。選擇那些能夠在50mM3-AT或在沒有尿嘧啶的情況下存活的細(xì)胞。在3-AT或-URA上存活的細(xì)胞在X-Gal測(cè)定中藍(lán)色和白色的比例，與不存在選擇下的相同比例比較，清楚地證明正選擇可以從死合成酶中富集活性合成酶(表1)，系數(shù)>105。在起始比例大于1：105的情況下，測(cè)定準(zhǔn)確富集一般是不可能的，因?yàn)榭梢苑奖愕匿伆宥鴽]有顯著細(xì)胞間串話導(dǎo)致不可靠表型的細(xì)胞是不多于106個(gè)細(xì)胞。表1.模型正選擇功能性EcTyrRS。a)通過OD660測(cè)定b)在X-Gal上表2.模型負(fù)選擇無功能EcTyrRS(A5)。a)通過OD660測(cè)定b)在X-Gal上在非天然氨基酸存在下進(jìn)行正選擇后，選擇的細(xì)胞將含有能夠使用天然氨基酸和能夠使用加入的非天然氨基酸的合成酶。為分離僅能夠使用非天然氨基酸的合成酶，必須從選擇的克隆中除去編碼使用天然氨基酸的合成酶的細(xì)胞。這可以用負(fù)選擇完成，負(fù)選擇中，非天然氨基酸被保留，而那些與天然氨基酸一起發(fā)揮作用的合成酶被去除。以與模型正選擇類似的方式進(jìn)行模型負(fù)選擇。將EcTyrRS/tRNACUA與過量10至105倍的A5/tRNACUA混合，在0.1%5-FOA上進(jìn)行選擇。將在0.1%5-FOA存活細(xì)胞在X-GAL測(cè)定中是白色和藍(lán)色的比例，與非選擇性條件下的相同比例進(jìn)行比較(參見表2)，清楚的是負(fù)選擇可以從活性合成酶中富集死合成酶，系數(shù)至少0.6x104。在起始比例大于1：104的情況下，測(cè)定準(zhǔn)確富集一般是不可能的，因?yàn)榭梢苑奖愕匿伆宥鴽]有顯著細(xì)胞間串話導(dǎo)致不可靠表型的細(xì)胞是不多于105個(gè)細(xì)胞。開發(fā)了一種通用方法，進(jìn)行識(shí)別非天然氨基酸的aaRS正選擇和識(shí)別天然氨基酸的aaRS負(fù)選擇。通過改變選擇的嚴(yán)格性，可以分離各種合成酶活性。將該方法應(yīng)用于用EcTyrRS變體的模型選擇中顯示在單輪正選擇中富集大于105，在單輪負(fù)選擇中大于0.6x104。這些發(fā)現(xiàn)提示該方法可以提供快速到達(dá)正交氨酰基-tRNA合成酶，其功能是將具有各種側(cè)鏈的非天然氨基酸位點(diǎn)特異地?fù)饺脶劸平湍傅牡鞍字?。而且，釀酒酵母中產(chǎn)生的酶可以用于高等真核生物。材料和方法載體構(gòu)建用引物tRNA5'：GGGGGGACCGGTGGGGGGACCGGTAAGCTTCCCGATAAGGGAGCAGGCCAGTAAAAAGCATTACCCCGTGGTGGGTTCCCGA(SEQIDNO：89)和tRNA3'：GGCGGCGCTAGCAAGCTTCCCGATAAGGGAGCAGGCCAGTAAAAAGGGAAGTTCAGGGACTTTTGAAAAAAATGGTGGTGGGGGAAGGAT(SEQIDNO：90)從pESCSU3URA中PCR擴(kuò)增tRNACUA基因。這個(gè)以及其它所有PCR反應(yīng)都用Roche的ExpandPCR試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商說明書進(jìn)行。限制性核酸內(nèi)切酶NheI和AgeI消化后，將該tRNA基因插入2微米載體pESCTrp(Stratagene)中的相同位點(diǎn)之間，產(chǎn)生ptRNACUA。用引物PADHf：IGGGGGGACCGGTIGGGGGGACCGGTCGGGATCGAAGAAATGATGGTAAATGAAATAGGAAATCAAGG(SEQIDNO：91)和pADHR：GGGGGGGAATTCAGTTGATTGTATGCTTGGTATAGCTTGAAATATTGTGCAGAAAAAGAAAC(SEQIDNO：92)從pDBLeu(Invitrogen)中PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)ADH1啟動(dòng)子，用AgeI和EcoRI消化。用引物pESCTrp1：TCATAACGAGAATTCCGGGATCGAAGAAATGATGGTAAATGAAATAGGAAATCTCATAACGAGAATTCATGGCAAGCAGTAACTTG(SEQIDNO：93)和pESCTrp2：TTACTACGTGCGGCCGCATGGCAAGCAGTAACTTGTTACTACGTGCGGCCGCTTATTTCCAGCAAATCAGAC(SEQIDNO：94)擴(kuò)增EcTyrRS。用EcoRI和NotI消化EcTyrRSPCR產(chǎn)物。然后用AgeI和NotI消化ptRNACUA。將這三個(gè)DNA三連接產(chǎn)生pEcTyrRS-tRNACUA。用寡核苷酸F37Afwd：CCGATCGCGCTCGCTTGCGGCTTCGATC(SEQIDNO：95)、N126Afwd：ATCGCGGCGAACGCCTATGACTGGTTC(SEQIDNO：96)、182、183、186A、GTTGCAGGGTTATGCCGCCGCCTGTGCGAACAAACAGTAC(SEQIDNO：97)和它們的反向補(bǔ)體，以及側(cè)翼的寡核苷酸4783：GCCGCTTTGCTATCAAGTATAAATAG(SEQIDNO：98)、3256：CAAGCCGACAACCTTGATTGG(SEQIDNO：99)和作為模板的pEcTyrRS-tRNACUA進(jìn)行重疊PCR，建立具有氨基酸殘基(活性位點(diǎn)中37、126、182、183和186位突變?yōu)楸彼?的質(zhì)粒pA5-tRNACUA。用EcoRI和NotI消化PCR產(chǎn)物，連接到用相同酶消化時(shí)釋放的pEcTyrRS-tRNACUA的大片段中。為構(gòu)建第一代DB-AD報(bào)道者，用正向引物pADfwd：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACGCCAATTTTAATCAAAGTGGGAATATTGC(SEQIDNO：100)或pADfwd(TAG)GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAGGCCAATTTTAATCAAAGTGGGAATATTGC(SEQIDNO：101)和ADrev：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTACTCTTTTTTTGGGTTTGGTGGGGTATC(SEQIDNO：102)從pGADT7(Clontech)中PCR擴(kuò)增GAL4DNA結(jié)合域。用Clonase步驟，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書將這些PCR產(chǎn)物克隆到載體pDEST3-2(invitrogen)中，產(chǎn)生pDB-AD和pDB-(TAG)-AD。為構(gòu)建PGADGAL4和變體，用引物ADH1428-1429AAGCTATACCAAGCATACAATC(SEQIDNO：103)和GAL4C：ACAAGGCCTTGCTAGCTTACTCTTTTTTTGGGTTTGGTGGGGTATCTTC(SEQIDNO：104)從pCL1(Clontech)中PCR擴(kuò)增GAL4基因。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書將該片段克隆到載體pCR2.1TOPO(Invitrogen)中。用HindIII消化含有GAL4基因的克隆(pCR2.1TOPOGAL4)，將2.7kbGAL4片段凝膠純化并連接到用HindIII消化的pGADT7的大片段中，用小牛腸磷酸酶處理，凝膠純化。根據(jù)生產(chǎn)商說明書進(jìn)行Quikchange反應(yīng)(Stratagene)，用列在補(bǔ)充信息中的引物將GAL4基因的變體建立在pCR2.1上。以與野生型GAL4基因相同的方式將GAL4突變體克隆到pGADT7中。所有最終構(gòu)建物都經(jīng)過DNA測(cè)序確認(rèn)。酵母培養(yǎng)基和操作釀酒酵母株MaV203(Invitrogen)是MATα；leu2-3，112；trp1109；his3Δ200；ade2-101；cyh2R；cyh1R；GAL4Δ；gal80Δ；GAL1::lacZ；HIS3UASGAL1::HIS3@LYS2；SPALlOUASGALl::URA3。酵母培養(yǎng)基購(gòu)自Clontech，5-FOA和X-GAL購(gòu)自Invitrogen，3-AT購(gòu)自BIO101。YPER(酵母蛋白抽提試劑)和ONPG購(gòu)自PierceChemicals。通過PEG/醋酸鋰法(參見，例如，D.Burke,等，(2000)《酵母遺傳學(xué)方法》(MethodsinYeastGenetics)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，在合適的合成完全撤除成分培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。為了在MaV203上測(cè)試各種質(zhì)粒組合給予的表型，將來自各轉(zhuǎn)化的合成完全撤除成分平板的酵母菌落重懸于15微升無菌水中，然后在感興趣的選擇性培養(yǎng)基上劃線。各表型至少用五個(gè)獨(dú)立菌落確認(rèn)。通過凝膠覆蓋法進(jìn)行X-GAL測(cè)定。參見，I.G.Serebriiskii和E.A.Golemis，(2000)，lacZ在研究基因功能中的用途：用于酵母雙雜交系統(tǒng)的β-半乳糖苷測(cè)定的評(píng)價(jià)(UsesoflacZtostudygenefunction:evaluationofbeta-galactosidaseassaysemployedintheyeasttwo-hybridsystem)，AnalyticalBiochemistry285：1-15。簡(jiǎn)要說，在瓊脂平板上通過加入幾次純氯仿裂解菌落或細(xì)胞小塊。氯仿蒸發(fā)后，將含有0.25克/升XGAL的1%瓊脂糖和含有0.1MNa2P04的緩沖液加于平板表面。瓊脂糖一凝固，就將平板置于37℃孵育12小時(shí)。通過將單菌落接種到含有1毫升SD-leu、-trp的96孔板中，并在30℃振蕩孵育進(jìn)行ONPG測(cè)定。在96孔微量滴定板中平行記錄100微升細(xì)胞以及幾個(gè)細(xì)胞稀釋液的OD660。將細(xì)胞(100微升)與100微升YPER:ONPG(1xPBS、50%v/vYPER、20mMMgCl2、0.25%v/vβ-巰基乙醇和3mMONPG)混合，在37℃振蕩孵育。在顯色時(shí)，離心沉淀細(xì)胞，將上清轉(zhuǎn)移到潔凈的96孔微量滴定板(Nunclon，目錄號(hào)167008)，記錄A420。所有數(shù)據(jù)表示至少4個(gè)獨(dú)立克隆試驗(yàn)的平均值，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)差。用等式：β-半乳糖苷酶單位=1000.A420/(V.t.OD660)計(jì)算ONPG水解，其中V是以微升表示的細(xì)胞體積，t是以分鐘表示的孵育時(shí)間。參見，例如，I.G.Serebriiskii和E.A.Golemis，(2000)，lacZ在研究基因功能中的用途：用于酵母雙雜交系統(tǒng)的β-半乳糖苷測(cè)定的評(píng)價(jià)(UsesoflacZtostudygenefunction:evaluationofbeta-galactosidaseassaysemployedintheyeasttwo-hybridsystem)，AnalyticalBiochemistry285：1-15。一個(gè)β-半乳糖苷酶單位相當(dāng)于每細(xì)胞每分鐘水解1微摩爾ONPG。參見，Serebriiskii和Golemis，上述。在SPECTRAmaxl90板閱讀器上進(jìn)行分光光度讀數(shù)。模型選擇正選擇：將兩個(gè)過夜培養(yǎng)物培養(yǎng)在SD-Leu、-Trp中。一個(gè)包含載有pEcTyrRS-tRNACUA/pGADGAL4(T44、R110TAG)的MaV203，另一個(gè)載有pA5-tRNASU3/pGADGAL4(T44、R110TAG)。離心收集這些細(xì)胞，通過渦旋重懸于0.9%NaCl。然后將這兩個(gè)細(xì)胞溶液稀釋到相同的OD660。將載有pEcTyrRS-tRNACUA/pGADGAL4(T44、R110TAG)的MaV203連續(xù)稀釋為7個(gè)數(shù)量級(jí)，然后將各溶液與未稀釋的載有pA5-tRNACUA/pGADGAL4(T44、R110TAG)的MaV2031:1體積：體積混合，以提供確定比例的含有活性和失活酪氨酰-tRNA合成酶的細(xì)胞。對(duì)各比列稀釋液進(jìn)行第二次連續(xù)稀釋，其中細(xì)胞數(shù)量減少，但保持載有pEcTyrRS-tRNACUA/pGADGAL4(T44、R110TAG)和pA5-tRNACUA/pGADGAL4(T44。R110TAG)的細(xì)胞比例。將這些稀釋液鋪平板于SD-Leu、-trp、SD-Leu、-Trp、-URA和SD-Leu、-Trp、-His+50mM3-AT。60小時(shí)后，用EagleEyeCCD相機(jī)(Stratagene)對(duì)各平板上的菌落計(jì)數(shù)，用X-GALβ-半乳糖苷酶測(cè)定確認(rèn)存活細(xì)胞的表型。分離來自幾個(gè)單獨(dú)藍(lán)色或白色菌落的細(xì)胞并在SD-leu、-trp中培養(yǎng)至飽和，用標(biāo)準(zhǔn)方法分離質(zhì)粒DNA。用DNA測(cè)序確認(rèn)EcTyrRS變體的身份。負(fù)選擇：以與正選擇類似的方式進(jìn)行模型負(fù)選擇，除了將載有pA5-tRNACUA/pGADGAL4(T44、R110TAG)的MaV203連續(xù)稀釋并與固定密度的載有pEcTyrRS-tRNACUA/pGADGAL4(T44、R110TAG)的MaV203混合。將細(xì)胞鋪平板于SD-leu、-trp+0.1%5-FOA，48小時(shí)后計(jì)算菌落數(shù)量，平板處理如上所述。下面的寡核苷酸(表3)與它們的反向補(bǔ)體聯(lián)用，以通過Quikchange誘變構(gòu)建定位突變體。突變位置用粗體文字表示。表3：用于構(gòu)建定位突變體的寡核苷酸。琥珀突變體寡核苷酸序列L3TAG5'-ATGAAGTAGCTGTCTTCTATCGAACAAGCATGCG-3'(SEQIDNO：66)I13TAG5'-CGAACAAGCATGCGATTAGTGCCGACTTAAAAAG-3'(SEQIDNO：67)T44TAG5'-CGCTACTCTCCCAAATAGAAAAGGTCTCCGCTG-3'(SEQIDNO：68)F68TAG5'-CTGGAACAGCTATAGCTACTGATTTTTCCTCG-3'(SEQIDNO：69)R110TAG5'-GCCGTCACAGATTAGTTGGCTTCAGTGGAGACTG-3'(SEQDNO：70)V114TAG5'-GATTGGCTTCATAGGAGACTGATATGCTCTAAC-3'(SEQIDNO：71)T121TAG5'-GCCTCTATAGTTGAGACAGCATAGAATAATGCG-3'(SEQIDNO：72)I127TAG5'-GAGACAGCATAGATAGAGTGCGACATCATCATCGG-3'(SEQIDNO：73)S131TAG5'-GAATAAGTGCGACATAGTCATCGGAAGAGAGTAGTAG-3'(SEQIDNO：74)T145TAG5'-GGTCAAAGACAGTTGTAGGTATCGATTGACTCGGC-3'(SEQIDNO：75)允許位點(diǎn)突變體寡核苷酸序列T44F5'-CGCTACTCTCCCCAAATTTAAAAGGTCTCCGCTG-3'(SEQIDNO：76)T44Y5'-CGCTACTCTCCCCAAATATAAAAGGTCTCCGCTG-3'(SEQIDNO：77)T44W5'-CGCTACTCTCCCCAAATGGAAAAGGTCTCCGCTG-3'(SEQIDNO：78)T44D5'-CGCTACTCTCCCCAAAGATAAAAGGTCTCCGCTG-3'(SEQIDNO：79)T44K5'-CGCTACTCTCCCCAAAAAAAAAAGGTCTCCGCTG-3'(SEQIDNO：80)R110F5'-GCCGTCACAGATTTTTTGGCTTCAGTGGAGACTG-3'(SEQIDNO：81)R110Y5'-GCCGTCACAGATTATTTGGCTTCAGTGGAGACTG-3'(SEQIDNO：82)R110W5'-GCCGTCACAGATTGGTTGGCTTCAGTGGAGACTG-3'(SEQIDNO：83)R110D5'-GCCGTCACAGATGATTTGGCTTCAGTGGAGACTG-3'(SEQIDNO：84)R110K5'-GCCGTCACAGATAAATTGGCTTCAGTGGAGACTG-3'(SEQIDNO：85)實(shí)施例2：擴(kuò)展的真核生物遺傳密碼描述了將非天然氨基酸加入到釀酒酵母遺傳密碼中的通常和快速的途徑。響應(yīng)于無義密碼子TAG，將五個(gè)氨基酸以高保真度有效摻入蛋白質(zhì)中。這些氨基酸的側(cè)鏈含有酮基，可以在體外或體內(nèi)用廣范圍的化學(xué)探針和試劑將其獨(dú)特地修飾；含有重原子的氨基酸用于結(jié)構(gòu)研究；以及光交聯(lián)劑用于蛋白質(zhì)相互作用的細(xì)胞研究。該方法不僅去除遺傳密碼對(duì)我們?cè)诮湍钢胁倏v蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的強(qiáng)加的限制，它提供了系統(tǒng)性擴(kuò)展多細(xì)胞真核生物的遺傳密碼的途徑。雖然化學(xué)家已經(jīng)開發(fā)了合成和操縱小分子結(jié)構(gòu)的有效方法和策略(參見，例如，E.J.Corey和X.-M.Cheng，《化學(xué)合成的邏輯》(TheLogicofChemicalSynthesis)(Wiley-Interscience，NewYork，1995))，但是合理控制蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的能力仍處于萌芽狀態(tài)。雖然在很多情況下已經(jīng)可能在整個(gè)蛋白質(zhì)組中競(jìng)爭(zhēng)性摻入與普通氨基酸接近的結(jié)構(gòu)類似物，但是誘變方法限于普通的20個(gè)氨基酸構(gòu)件。參見，例如，K.Kirshenbaum,等，(2002)，ChemBioChem3：235-7；和V.Doring等，(2001)，Science292：501-4。全合成(參見，例如，B.Merrifield，(1986)，Science232：341-7(1986))和半合成方法(參見，例如，D.Y.Jackson等，(1994)Science266：243-7；和P.E.Dawson和S.B.Kent，(2000)，AnnualReviewofBiochemistry69：923-60，已經(jīng)使合成肽和小蛋白成為可能，但對(duì)于超過10千道爾頓(kDa)的蛋白，其用途受到更多限制。包括化學(xué)酰化的正交tRNA的生物合成方法(參見，例如，D.Mendel,等，(1995)，AnnualReviewofBiophysicsandBiomolecularStructure24：435-462；和V.W.Cornish,等(1995年3月31日)，AngewandteChemie-InternationalEditioninEnglish34：621-633已經(jīng)允許在體外(參見，例如，J.A.Ellman,等，(1992)，Science255：197-200)或在顯微注射的細(xì)胞中(參見，例如，D.A.Dougherty，(2000)，CurrentOpinioninChemicalBiology4：645-52)將非天然氨基酸摻入較大的蛋白質(zhì)中。然而，化學(xué)酰化的化學(xué)計(jì)量特性嚴(yán)重限制了可以產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量。因此，盡管作出了很大努力，但是在整個(gè)進(jìn)化中，二十個(gè)遺傳編碼的氨基酸(除吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸(參見，例如，A.Bock等，(1991)，MolecularMicrobiology5：515-20；和G.Srinivasan,等，(2002)，Science296：1459-62)以外)已經(jīng)限制蛋白、可能是整個(gè)生物的性質(zhì)。為了克服該限制，將新組件加入到原核生物大腸桿菌(E.coli)的蛋白質(zhì)生物合成機(jī)器中(例如，L.Wang，等，(2001)，Science292：498-500)，這使體內(nèi)遺傳編碼非天然氨基酸成為可能。響應(yīng)于琥珀密碼子TAG，將一些具有新化學(xué)、物理或生物學(xué)性質(zhì)的新氨基酸有效和選擇性地?fù)饺氲鞍踪|(zhì)中。參見，例如，J.W.Chin等，(2002)，JournaloftheAmericanChemicalSociety124：9026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz，(2002)，ChemBioChem11：1135-1137；J.W.Chin,等，(2002)，PNASUnitedStatesofAmerica99：11020-11024：和L.Wang和P.G.Schultz，(2002)，Chem.Comm.，1：1-10。然而，因?yàn)榉g機(jī)器在原核生物和真核生物間并不是非常保守的，加入大腸桿菌的生物合成機(jī)器的組件通常不能用于在真核細(xì)胞中將非天然氨基酸位點(diǎn)特異地?fù)饺氲鞍踪|(zhì)中，以研究或操縱細(xì)胞過程。因此，建立在真核細(xì)胞中會(huì)擴(kuò)展遺傳編碼的氨基酸數(shù)目的翻譯組件。選擇釀酒酵母作為起始真核宿主生物，因?yàn)樗怯杏玫哪Ｊ秸婧松?，容易進(jìn)行遺傳操縱(參見，例如，D.Burke,等，(2000)，《酵母遺傳學(xué)方法》(MethodsinYeastGenetics)(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY)，它的翻譯機(jī)器與高等真核生物的翻譯機(jī)器高度同源(參見，例如，T.R.Hughes，(2002)，F(xiàn)unct.Integr.Genomics2:199-211)。新構(gòu)件加入釀酒酵母遺傳密碼需要不與酵母翻譯機(jī)器的任何組件交叉反應(yīng)的獨(dú)特的密碼子、tRNA和氨?；?tRNA合成酶(‘a(chǎn)aRS’)(參見，例如，Noren等，(1989)Science244：182；Furter(1998)ProteinSci.7：419；和Liu等，(1999)PNASUSA96:4780)。一個(gè)候選正交對(duì)是來自大腸桿菌的琥珀抑制酪氨酰-tRNA合成酶-tRNACUA對(duì)(參見，例如，H.M.Goodman,等，(1968)，Nature217：1019-24；和D.G.Barker,等，(1982)，F(xiàn)EBSLetters150：419-23)。當(dāng)大腸桿菌酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)和大腸桿菌tRNACUA在釀酒酵母中遺傳編碼但不氨?；劸平湍赴|(zhì)tRNA時(shí)，大腸桿菌酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)有效氨酰化大腸桿菌tRNACUA。參見，例如，H.Edwards和P.Schimmel，(1990)，Molecular&CellularBiology10：1633-41；和H.Edwards,等，(1991)，PNASUnitedStatesofAmerica88：1153-6。此外，對(duì)于釀酒酵母氨?；?tRNA合成酶來說，大腸桿菌酪氨酰tRNACUA是差的底物(參見，例如，V.Trezeguet,等，(1991)，Molecular&CellularBiology11：2744-51)，但是它在釀酒酵母中加工，從核輸出到胞質(zhì)(參見，例如，S.L.Wolin和A.G.Matera，(1999)Gene&Development13：1-10)并有效作用于蛋白翻譯。參見，例如，H.Edwards和P.Schimmel，(1990)Molecular&CellularBiology10：1633-41；H.Edwards,等，(1991)，PNASUnitedStatesofAmerica88：1153-6；和V.Trezeguet,等，(1991)，Molecular&CellularBiology11：2744-51。而且，大腸桿菌TyrRS不具有編輯機(jī)制，因此不應(yīng)該校正與tRNA連接的非天然氨基酸。為了改變正交TyrRS的氨基酸特異性以使它用所需非天然氨基酸和沒有任何內(nèi)源性氨基酸氨?；痶RNACUA，產(chǎn)生TyrRS突變體的一個(gè)大文庫(kù)，并進(jìn)行遺傳選擇。根據(jù)來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的同源TyrRS的晶體結(jié)構(gòu)(參見，例如，P.Brick,等，(1989)，JournalofMolecularBiology208：83)，將位于結(jié)合酪氨酸芳環(huán)的對(duì)位內(nèi)的大腸桿菌TyrRS活性位點(diǎn)中的五個(gè)殘基(嗜熱脂肪芽孢桿菌，圖7，A組)突變。例如，為建立突變體EcTyrRS文庫(kù)，將五個(gè)靶向突變的位置首先轉(zhuǎn)化為丙氨酸密碼子以產(chǎn)生A5RS基因。這在基因中兩個(gè)質(zhì)粒之間獨(dú)特的PstI位點(diǎn)上分開?；旧细鶕?jù)本領(lǐng)域已知技術(shù)(參見，例如，Stemmer等，(1993)Biotechniques14：256-265)的描述建立該文庫(kù)。一個(gè)質(zhì)粒含有A5RS基因的5'半，另一質(zhì)粒含有A5RS基因的3'半。通過用擴(kuò)增整個(gè)質(zhì)粒的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR，對(duì)各片斷進(jìn)行誘變。摻入的引物含有NNK(N=A+G+T+C，K=G+T)和BsaI限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。用BsaI消化，連接產(chǎn)生的兩種環(huán)形質(zhì)粒，各含有EcTyrRS基因一半的突變拷貝。然后用PstI消化這兩種質(zhì)粒，并通過連接組裝成單一質(zhì)粒，導(dǎo)致全長(zhǎng)突變基因的組裝。將突變EcTyrRS基因從該質(zhì)粒中切下并連接入pA5RS/tRNACUA中的EcoRI和NotI位點(diǎn)之間。用PEG-醋酸鋰法將該文庫(kù)轉(zhuǎn)化到釀酒酵母Mav203：pGADGAL4(2TAG)中，產(chǎn)生～108個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化子。用該文庫(kù)轉(zhuǎn)化釀酒酵母的選擇株[MaV203：pGADGAL4(2TAG)(參見，例如，M.Vidal,等，(1996)，PNASUnitedStatesofAmerica93：10321-6；M.Vidal，等，(1996)，PNASUnitedStatesofAmerica93：10315-201和Chin等，(2003)Chem.Biol.10：511)]以提供108個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化子，在1mM非天然氨基酸的存在下生長(zhǎng)(圖8，C組)。在轉(zhuǎn)錄激活物GAL4中抑制兩種允許琥珀密碼子導(dǎo)致全長(zhǎng)GAL4的產(chǎn)生和GAL4-反應(yīng)性HIS3、URA3和lacZ報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄激活(圖8，A組)。例如，允許密碼子是用于Gal4的T44和R110。HIS3和URA3在缺少尿嘧啶(-ura)或含有20mM3-氨基三唑(參見，例如，G.M.Kishore和D.M.Shah，(1988)，AnnualReviewofBiochemistry57,627-63)(3-AT，His3蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑)以及缺少組氨酸(-his)的培養(yǎng)基中的表達(dá)允許正選擇表達(dá)活性aaRS-tRNACUA對(duì)的克隆。如果突變TyrRS載上具有氨基酸非tRNACUA，那么細(xì)胞能夠生物合成組氨酸和尿嘧啶，且存活。在沒有3-AT和非天然氨基酸的情況下擴(kuò)增存活細(xì)胞，從選擇性摻入非天然氨基酸的細(xì)胞中去除全長(zhǎng)GAL4。為去除響應(yīng)于琥珀密碼子摻入內(nèi)源性氨基酸的克隆，將細(xì)胞培養(yǎng)于含有0.1%5-氟乳清酸(5-FOA)而缺少非天然氨基酸的培養(yǎng)基上。作為用天然氨基酸抑制GAL4琥珀突變的結(jié)果，表達(dá)URA3的那些細(xì)胞將5-FOA轉(zhuǎn)化為有毒產(chǎn)物，殺死細(xì)胞。參見，例如，J.D.Boeke，等，(1984)，Molecular&GeneralGenetics197：345-6。在非天然氨基酸存在下擴(kuò)增存活克隆，再應(yīng)用于正選擇。LacZ報(bào)道基因允許用比色方法區(qū)別活性和失活合成酶-tRNA對(duì)(圖8，B組)。通過使用該方法，將五個(gè)具有不同空間和電子性質(zhì)的新氨基酸(圖7，B組)獨(dú)立地加入釀酒酵母的遺傳密碼中。這些氨基酸包括對(duì)-乙?；?L-苯丙氨酸(1)、對(duì)-苯甲?；?L-苯丙氨酸(2)、對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸(3)、氧-甲基-L-酪氨酸(4)和對(duì)-碘代-L-苯丙氨酸(5)(在圖7，B組中以數(shù)字表示)。對(duì)-乙?；?L-苯丙氨酸的酮官能團(tuán)的獨(dú)特反應(yīng)性允許用一系列含肼或羥胺的試劑在體外和體內(nèi)進(jìn)行蛋白的選擇性修飾(參見，例如，V.W.Cornish,等，(1996年8月28日)，JournaloftheAmericanChemicalSociety118：8150-8151；和Zhang，Smith，Wang，Brock，Schultz，準(zhǔn)備中)?？梢宰C明，對(duì)-碘代-L-苯丙氨酸的重原子可用于定相X射線結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(用多波長(zhǎng)不規(guī)則衍射)。對(duì)-苯甲酰基-L-苯丙氨酸和對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸的二苯甲酮和疊氮苯側(cè)鏈允許蛋白在體內(nèi)和體外有效的光交聯(lián)(參見例如，Chin等，(2002)J.Am.Chem.Soc.，124：9026；Chin和Schultz，(2002)Chem.Bio.Chem.11：1135；和Chin等，(2002)PNAS，USA99:11020)?？捎猛凰貥?biāo)記的甲基容易地取代氧-甲基-L-酪氨酸的甲基，在使用核磁共振和振動(dòng)光譜學(xué)中用作局部結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的探針。三輪選擇(正-負(fù)-正)后，分離幾個(gè)菌落，它們?cè)?ura或在20mM3-AT-his培養(yǎng)基上的存活嚴(yán)格依賴于選擇的非天然氨基酸的加入。參見，圖8，D組。相同克隆僅在存在1mM非天然氨基酸的x-gal上是藍(lán)色的。這些實(shí)驗(yàn)證明觀察的表型由演化的氨?；?tRNA合成酶-tRNACUA對(duì)和它們的關(guān)聯(lián)氨基酸的組合產(chǎn)生(參見，表4)。例如，為選擇突變體合成酶，將細(xì)胞(～109)在液體SD-leu、-trp+1mM氨基酸中培養(yǎng)4小時(shí)。然后離心收集細(xì)胞，重懸于0.9%NaCl，鋪平板于SD-leu、-trp、-his+20mM3-AT、+1mM非天然氨基酸或SD-leu、-trp、-ura、+1mM非天然氨基酸上。30℃48至60小時(shí)后，從板上刮下細(xì)胞，移入液體SD-leu、-trp中，在30℃培養(yǎng)15小時(shí)。離心收集細(xì)胞，重懸于0.9%NaCI，鋪平板于SD-leu、-trp+0.1%5-FOA。30℃48小時(shí)后，將細(xì)胞刮下，移至液體SD-leu、-trp+1mM非天然氨基酸中，培養(yǎng)15小時(shí)。然后離心收集細(xì)胞，重懸于0.9%NaCl，鋪平板于SD-leu、-trp、-his+20mM3-AT、+1mM非天然氨基酸或SD-leu，-trp,-ura，+1mM非天然氨基酸上。為篩選選擇細(xì)胞的表型，將來自各選擇的菌落(192)轉(zhuǎn)移到含有0.5毫升SD-leu、-trp的96孔板的孔中，在30℃培養(yǎng)24小時(shí)。向每孔加入甘油(50%v/v；0.5毫升)，存在或沒有1mM非天然氨基酸的情況下，將細(xì)胞復(fù)制鋪板于瓊脂(SD-leu、-trp；SD-leu、-trp、-his、+20mM3-AT；SD-leu、-trp、-ura)上。用瓊脂糖覆蓋法在SD-leu、-trp平板上進(jìn)行X-Gal測(cè)定。為了進(jìn)一步證明觀察的表型是由于正交突變體TyrRS/tRNA對(duì)位點(diǎn)特異性摻入非天然氨基酸，產(chǎn)生并表征含有各非天然氨基酸的人超氧化物歧化酶1(hSOD)的突變體(參見，例如，H.E.Parge,等，(1992)，PNASUnitedStatesofAmerica89：6109-13)。例如，用PS356(ATCC)作為模板，通過重疊PCR進(jìn)行加入編碼C-末端六組氨酸標(biāo)記的DNA和將人超氧化物歧化酶基因中的Trp33密碼子突變?yōu)殓昝艽a子。將hSOD(Trp33TAG)HIS在來自pYES2.1(Invitrogen，Carlsbad，CAUSA)的GAL1啟動(dòng)子和CYC1終止子之間克隆。用pYES2.1hSOD(Trp33TAG)HIS將pECTyrRS-tRNACUA衍生質(zhì)粒上的突變體合成酶和tRNA基因共轉(zhuǎn)化到InvSc株(Invitrogen)中。對(duì)于蛋白表達(dá)，將細(xì)胞培養(yǎng)于SD-trp,-ura+棉子糖中，通過加入半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)使OD660達(dá)到0.5。通過Ni-NTA層析(Qiagen，Valencia，CA，USA)純化HSOD突變體。從33位上含有琥珀密碼子的基因生產(chǎn)六-組氨酸-標(biāo)記的hSOD嚴(yán)格依賴于對(duì)-乙?；鵓heRS-1-tRNACUA和1mM對(duì)-乙酰基-L-苯丙氨酸(密度測(cè)定<0.1%，在沒有任何一個(gè)組件的情況下)(參見圖9)。純化含有全長(zhǎng)hSOD的對(duì)-乙酰基-L-苯丙氨酸(例如，通過Ni-NTA親和層析)，產(chǎn)率為50納克/毫升，與從含有大腸桿菌TyrRStRNACUA的細(xì)胞中純化的產(chǎn)率相差不大。為了比較，在相同條件下，野生型hSODHIS的純化產(chǎn)率為250納克/毫升。圖9說明遺傳編碼非天然氨基酸的hSOD(33TAG)HIS在釀酒酵母中的蛋白表達(dá)(如圖7B組所示，在圖9中以它們?cè)趫D7B組中的編號(hào)表示)。圖9的上部說明從存在(+)和沒有(-)非天然氨基酸情況下的酵母中純化的hSOD的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，非天然氨基酸以數(shù)字表示，與圖7B組中用考馬斯藍(lán)染色的非天然氨基酸相一致。細(xì)胞含有為所示氨基酸選擇的突變體合成酶-tRNA對(duì)。圖9的中部說明用抗hSOD抗體探測(cè)的Western印跡。圖9的下部說明用抗C-末端His6標(biāo)記的抗體探測(cè)的Western印跡。通過將突變蛋白的胰蛋白酶消化物進(jìn)行液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜分析確定摻入氨基酸的身份。例如，用膠體考馬斯染色使質(zhì)譜蛋白條帶顯色。將與野生型和突變型SOD相對(duì)應(yīng)的凝膠條帶從聚丙烯酰胺凝膠上切下，切成1.5毫米的立方體，還原并烷化，然后進(jìn)行基本如上所述的胰蛋白酶水解。參見，例如，A.Shevchenko，等，(1996)，AnalyticalChemistry68，850-858。通過納米流反相HPLC/μESI/MS與LCQ離子阱質(zhì)譜儀分析含有非天然氨基酸的胰蛋白酶肽。在裝有納米噴霧HPLC(Agilent1100系列)的FinniganLCQDeca離子阱質(zhì)譜儀(ThermoFinnigan)上進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析。參見，例如，圖10，A-H組。用離子阱質(zhì)譜儀分離并片段化前體離子，它與帶單電荷或雙電荷離子的含有非天然氨基酸(標(biāo)為Y*)的肽Val-Y*-Gly-Ser-Ile-Lys(SEQIDNO：87)對(duì)應(yīng)。片段離子質(zhì)量可以是明確指定的，確認(rèn)了對(duì)-乙?；?L-苯丙氨酸的位點(diǎn)特異性摻入(參見，圖10，A組)。沒有觀察到酪氨酸或其它氨基酸代替對(duì)-乙酰基-L-苯丙氨酸，從肽譜的信噪比獲得最小99.8%的摻入純度。當(dāng)對(duì)-苯甲酰基PheRS-1、對(duì)-疊氮基PheRS-1、氧-meTyrRS-1或?qū)?碘代PheRS-1用于將對(duì)-苯甲?；?L-苯丙氨酸、對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸、氧-甲基-L-賴氨酸或?qū)?碘代-L-苯丙氨酸摻入hSOD中時(shí)(參見，圖9和圖10，A-H組)，觀察到類似的蛋白表達(dá)保真度和效率。在實(shí)驗(yàn)的樣品制備中，對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸被還原成對(duì)-氨基-L-苯丙氨酸，在質(zhì)譜中觀察到了后者。該還原并不通過含有對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸的純化SOD的化學(xué)衍生在體內(nèi)發(fā)生。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，制備在33位含有色氨酸、酪氨酸和亮氨酸的六-組氨酸-標(biāo)記的hSOD，進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定(參見圖10，F(xiàn)、G和H組)。含有氨基酸33的離子在這些樣品的質(zhì)譜中清晰可見。將5個(gè)非天然氨基酸獨(dú)立地加入釀酒酵母的遺傳密碼證明了我們方法的通用性，提示它可應(yīng)用于其它非天然氨基酸，包括自旋標(biāo)記的、金屬結(jié)合的或可光異構(gòu)的氨基酸。該方法可產(chǎn)生具有新的或提高性質(zhì)的蛋白，以及在酵母中易于控制蛋白功能。而且，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，大腸桿菌酪氨酰-tRNA合成酶與嗜熱脂肪芽孢桿菌tRNACUA形成正交對(duì)。參見，例如，Sakamoto等，(2002)NucleicAcidsRes.30：4692。因此人們可以使用在酵母中開發(fā)的氨?；?tRNA合成酶將非天然氨基酸加到高等真核生物的遺傳密碼中。表4.選擇的氨?；?TRNA合成酶的序列a這些克隆也含有Asp165Gly突變實(shí)施例3：將具有新反應(yīng)性的氨基酸加到真核生物的遺傳密碼中證明了一個(gè)基于[3+2]環(huán)加成與蛋白生物共軛的方法，該方法是位點(diǎn)特異性，快速，可靠和可逆的。非常需要在生理?xiàng)l件下以高度選擇方式修飾蛋白的化學(xué)反應(yīng)。參見，例如，Lemineux和Bertozzi，(1996)TIBTECH，16：506-513。目前用于蛋白選擇性修飾的大部分反應(yīng)都包括親核和親電子反應(yīng)配偶之間形成共價(jià)鍵，例如α-鹵代酮與組氨酸或半胱氨酸側(cè)鏈的反應(yīng)。在這些情況下，選擇性由蛋白中親核殘基的數(shù)量和可及性決定。在合成或半合成蛋白的情況下，可以使用其它更具選擇性的反應(yīng)，如非天然酮式-氨基酸與酰肼或氨氧基化合物的反應(yīng)。參見，例如，Cornish,等，(1996)Am.Chem.Soc.，118：8150-8151；和Mahal,等，(1997)Science，276：1125-1128。最近，在細(xì)菌和酵母中用具有改變氨基酸特異性的正交tRNA-合成酶對(duì)已可能遺傳編碼非天然氨基酸(參見，例如，Wang,等，(2001)Science292：498-500；Chin,等，(2002)Am.Chem.Soc.124：9026-9027；和Chin,等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，99：11020-11024)，包括含有酮的氨基酸(參見，例如，Wang,等，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.，100：56-61；Zhang,等，(2003)Biochemistry，42：6735-6746；和Chin,等，(2003)Science，印刷中)。該方法已使得用包括熒光團(tuán)、交聯(lián)劑和細(xì)胞毒分子在內(nèi)的大量試劑選擇性標(biāo)記基本上任何蛋白質(zhì)成為可能。描述了用于蛋白選擇性修飾的一種高效方法，它包括響應(yīng)于，例如，琥珀無義密碼子TAG，將含有疊氮化物或乙炔的非天然氨基酸遺傳摻入蛋白質(zhì)中。然后可以分別用炔基(乙炔)或疊氮化物衍生物通過Huisgen[3+2]環(huán)加成反應(yīng)(參見，例如，Padwa，A.《綜合有機(jī)合成》(ComprehensiveOrganicSynthesis)，第4卷，(1991)Trost，B.M.編，Pergamon，Oxford，第1069-1109頁；和Huisgen，《R.1.3-雙極環(huán)加成化學(xué)》(1，3-DipolarCycloadditionChemistry)，(1984)Padwa，A.編，Wiley，NewYork，第1-176頁)修飾這些氨基酸側(cè)鏈。因?yàn)樵摲椒òōh(huán)加成而非親核取代，所以可以以極高的選擇性來修飾蛋白質(zhì)(可以使用的另一方法具有四半胱氨酸基序的雙砷化合物上的配體交換，參見，例如，Griffin,等，(1998)Science281：269-272)。該反應(yīng)可以在室溫下、含水條件下以極好的區(qū)域選擇性(1,4>1,5)通過將催化量的Cu(I)鹽加入到反應(yīng)混合物中進(jìn)行。參見，例如，Tornoe,等，(2002)Org.Chem.67：3057-3064；和Rostovtsev，等，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.41：2596-2599。實(shí)際上，F(xiàn)inn和同事們已經(jīng)證明此疊氮化物-炔[3+2]環(huán)加成可以在完整的豇豆花葉病毒表面上進(jìn)行。參見，例如，Wang，等，(2003)J.Am.Chem.Soc.，125：3192-3193。另一最近實(shí)施例將疊氮基親電子引入蛋白，和隨后的[3+2]環(huán)加成，參見，例如，Speers,等，(2003)J.Am.Chem.Soc.，125：4686-4687。為了將炔基(乙炔)或疊氮化物官能團(tuán)選擇性引入真核蛋白的獨(dú)特位點(diǎn)，在酵母中產(chǎn)生演化的正交TyrRS/tRNACUA對(duì)，它遺傳編碼乙炔和疊氮基氨基酸，分別如圖11的1和2所示?？梢栽诤罄m(xù)的還加成反應(yīng)中，在生理?xiàng)l件下用熒光團(tuán)有效并選擇地標(biāo)記所得的蛋白。之前，在酵母中證明大腸桿菌酪氨酰tRNA-tRNA合成酶對(duì)是正交的，即，tRNA或合成酶均不與內(nèi)源性酵母tRNA或合成酶交叉反應(yīng)。參見，例如，Chin,等，(2003)Chem.Biol.，10：511-519。該正交tRNA-合成酶對(duì)已經(jīng)用于響應(yīng)于TAG密碼子，將許多非天然氨基酸選擇和有效地?fù)饺虢湍钢?例如，Chin,等，(2003)Science，印刷中)。為了改變大腸桿菌酪氨酰-tRNA合成酶的氨基酸特異性，以接受圖11的氨基酸1或2，通過隨機(jī)化Tyr37、Asn126、Asp182、Phe183和Leu186的密碼子產(chǎn)生～107突變體的文庫(kù)。根據(jù)來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的同源合成酶的晶體結(jié)構(gòu)選擇這五個(gè)殘基。為獲得具體氨基酸用作底物的合成酶，使用了一種選擇方案，其中將轉(zhuǎn)錄激活物GAL4的基因的Thr44和Arg110的密碼子轉(zhuǎn)化為琥珀無義密碼子(TAG)。參見，例如，Chin,等，(2003)Chem.Biol.，10：511-519。在MaV203：pGADGAL4(2TAG)酵母株中抑制這些琥珀密碼子導(dǎo)致產(chǎn)生全長(zhǎng)GAL4(參見，例如，Keegan，等，(1986)Science，231：699-704；和Ptashne，(1988)Nature，335：683-689)，它反過來驅(qū)動(dòng)HIS3和URA3報(bào)道基因的表達(dá)。后一個(gè)基因產(chǎn)物補(bǔ)充組氨酸和尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷，允許在圖11中1或2的存在下選擇載有活性合成酶突變體的克隆。通過在缺乏圖11中1或2卻含有5-氟乳清酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)去除裝載內(nèi)源性氨基酸的合成酶，URA3將5-氟乳清酸轉(zhuǎn)化為有毒產(chǎn)物。通過對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行三輪選擇(正、負(fù)、正)，我們鑒定了選擇性針對(duì)圖11的1(pPR-EcRS1-5)和針對(duì)圖11的2(pAZ-EcRS1-6)的合成酶，如表8所示。所有合成酶都顯示了強(qiáng)的高序列相似性，包括保守的Asn126，這提示該殘基具有重要的功能作用。令人驚訝的是，合成酶pPR-EcRS-2和pAZ-EcRS-6，衍生以分別結(jié)合圖11的1和2，會(huì)聚成相同序列(Tyr37→Thr37、Asn126→Asn126、Asp182→Ser182和Phe183→Ala183、Leu186→Leu186)。結(jié)合酪氨酸的酚羥基與Tyr37和Asp182之間的氫鍵由于分別突變成Thr和Ser而被破壞。Phe183轉(zhuǎn)化為Ala，可能為容納非天然氨基酸提供更多空間。為證實(shí)該合成酶(和其它合成酶)接受氨基酸作為底物的能力，將載有合成酶質(zhì)粒的選擇株培養(yǎng)于缺乏尿嘧啶(從缺乏組氨酸的培養(yǎng)基中獲得了相同結(jié)果)但補(bǔ)充有圖11的1或2的培養(yǎng)基上。生長(zhǎng)結(jié)果揭示五個(gè)炔合成酶中的四個(gè)能夠?qū)煞N非天然氨基酸加到其tRNA上。疊氮基合成酶似乎更具選擇性，因?yàn)橹挥衟AZ-EcRS-6(與pPR-EcRS-2相同)能夠用圖11的1和2氨?；鋞RNA。沒有圖11中1或2的情況下未檢測(cè)到生長(zhǎng)的事實(shí)提示，合成酶并不接受20種普通氨基酸中任意一種作為底物。參見圖14。對(duì)于所有其它使用pPR-EcRS-2(pAZ-EcRS-6)的實(shí)驗(yàn)，允許人們簡(jiǎn)單地通過將圖11中1或2加入含有表達(dá)株的培養(yǎng)基來控制將哪個(gè)非天然氨基酸摻入。對(duì)于蛋白質(zhì)生產(chǎn)，將融合了C-末端6xHis標(biāo)記的人超氧化物歧化酶-1(SOD)的允許殘基Trp33的密碼子突變?yōu)門AG。例如，將人超氧化物歧化酶(Trp33TAG)HIS在pYES2.1(Invitrogen，Carlsbad，CAUSA)的GAL1啟動(dòng)子和CYC1終止子之間克隆。用pYES2.1SOD(Trp33TAG)HIS將pECTyrRS-tRNACUA衍生質(zhì)粒上的突變體合成酶和tRNA基因共轉(zhuǎn)化到InvSc株(Invitrogen)中。對(duì)于蛋白質(zhì)表達(dá)，將細(xì)胞培養(yǎng)于SD-tr、-ura+棉子糖上，通過加入半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)使OD660達(dá)到0.5。在存在或沒有圖11中1mM1或2的情況下表達(dá)蛋白，通過Ni-NTA層析(Qiagen，Valencia，CA，USA)純化。SDS-PAGE和Western印跡分析揭示非天然氨基酸依賴性蛋白表達(dá)，與沒有圖11中1或2情況下的蛋白表達(dá)相比，密度測(cè)定確定其保真度>99%。參見圖12。為進(jìn)一步確認(rèn)摻入氨基酸的身份，將胰蛋白酶消化物進(jìn)行液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜分析。例如，用鎳親和柱純化野生型和突變型hSOD，用膠體考馬斯染色使蛋白條帶顯色。將與野生型和突變型SOD相對(duì)應(yīng)的凝膠條帶從聚丙烯酰胺凝膠上切下，切成1.5毫米的立方體，還原并烷化，然后進(jìn)行基本如上所述的胰蛋白酶水解。參見，例如，Shevchenko，A等，(1996)Anal.Chem.68：850-858。通過納米流反相HPLC/μESI/MS與LCQ離子阱質(zhì)譜儀分析含有非天然氨基酸的胰蛋白酶肽。參見，圖15，A和B組。在裝有納米噴霧HPLC(Agilent1100系列)的FinniganLCQDeca離子阱質(zhì)譜儀(ThermoFinnigan)上進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析。用離子阱質(zhì)譜儀分離并片段化前體離子，它與帶單電荷或雙電荷的含有非天然氨基酸(標(biāo)為Y*)的肽VY*GSIK(SEQIDNO：87)前體離子對(duì)應(yīng)。片段離子質(zhì)量可以是明確指定的，確認(rèn)了各非天然氨基酸的位點(diǎn)特異性摻入。LCMS/MS并未表明在此位置摻入任何天然氨基酸。所有突變體肽的信噪比>1000，這提示摻入的保真度優(yōu)于99.8%。參見，圖15，A和B組。為證明可以通過疊氮-炔[3+2]環(huán)加成反應(yīng)將小有機(jī)分子共軛至蛋白質(zhì)，合成圖13中A組所示的染料3-6，它們含有乙炔基或疊氮基并具有丹磺?；驘晒馑?zé)晒鈭F(tuán)(參見本文的實(shí)施例5)。環(huán)加成本身用0.01mM蛋白在pH8的磷酸鹽緩沖液(PB)中，在圖13A組中所示2mM3-6、1mMCuS04和～1毫克銅線的存在下，37℃反應(yīng)4小時(shí)(參見圖13，B組)進(jìn)行的。例如，向45微升蛋白的PB緩沖液(pH=8)中加入1微升CuS04(在H20中50mM)、2微升染料(在EtOH中50mM)、2微升三(1-苯甲基-1H-[1,2,3]三唑-4-基甲基)胺(在DMSO中50mM)和銅線。室溫或或37℃下4小時(shí)或4℃過夜后，加入450微升H20，將混合物離心通過透析膜(10kDa截?cái)?。用2x500微升通過離心洗滌上清后，溶液體積為50毫升。通過SDS-PAGE分析20毫升的樣品?？梢酝ㄟ^在H20/MeOH/AcOH(5:5:1)中浸泡過夜從凝膠中去除偶爾剩余的染料。將三(羧乙基)膦用作還原劑通常導(dǎo)致標(biāo)記效率更低。與較早的觀察(例如，Wang，Q.等，(2003)J.Am.Chem.Soc.125：3192-3193)不同，存在或沒有三(三唑基)胺配體并不實(shí)質(zhì)性影響反應(yīng)的結(jié)果。透析后，用SDS-PAGE分析標(biāo)記蛋白，在圖13A組中所示3-4丹磺酰染料(λex=337納米，λem=506納米)的情況下用光密度計(jì)或在圖13A組中所示5-6熒光素染料(λex=483納米，λem=516納米)的情況下用感光成像儀在凝膠內(nèi)成像。參見，例如，Blake，(2001)Curr.Opin.Pharmacol.，1：533-539；Wouters,等，(2001)TrendsinCellBiology11：203-211；和Zacharias,等，(2000)Curr.Opin.Neurobiol.，10：416-421。通過LCMS/MS分析胰蛋白酶消化物表征標(biāo)記蛋白，顯示了熒光團(tuán)的位點(diǎn)特異性附著，轉(zhuǎn)化率平均為75%(例如，通過比較用圖13，A組中所示5或6標(biāo)記的SOD的A280/A495值確定)。圖13，A組中所示3和炔蛋白或圖13，A組中所示4和疊氮基蛋白之間沒有可觀察的反應(yīng)的事實(shí)確證了此生物共軛的選擇性。表8進(jìn)化形成的合成酶為1選擇的pPR-EcRS和為2選擇的pAZEcRS(如圖11所示)實(shí)施例4：炔氨基酸的合成在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了炔基氨基酸。式IV說明了炔氨基酸的一個(gè)結(jié)構(gòu)的例子：炔氨基酸一般是具有式IV的任意結(jié)構(gòu)，其中R1是二十種天然氨基酸之一使用的取代基，R2是炔基取代基。例如，圖11中1說明對(duì)-炔丙基氧基苯丙氨酸的結(jié)構(gòu)?？梢院铣蓪?duì)-炔丙基氧基苯丙氨酸，例如，如下所述。在這個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)-炔丙基氧基苯丙氨酸的合成可以在起始于市售N-Boc-酪氨酸的三個(gè)步驟中完成。例如，將N-叔-丁氧基羰基-酪氨酸(2克，7毫摩爾，1當(dāng)量)和K2C03(3克，21毫摩爾，3當(dāng)量)懸浮于無水DMF(15毫升)。將炔丙基溴(2.1毫升，21毫摩爾，3當(dāng)量，80%甲苯溶液)緩慢加入，室溫下攪拌反應(yīng)混合物18小時(shí)。加入水(75毫升和Et20(50毫升)，分層，用Et20(2x50毫升)提取水相。干燥(MgS04)混合的有機(jī)層，減壓去除溶劑。獲得黃色油狀產(chǎn)物(2.3克，91%)，無需進(jìn)一步純化就用于下一步驟。以下面的化學(xué)結(jié)構(gòu)8說明Boc-保護(hù)的產(chǎn)物：2-叔-丁氧基羰基氨基-3-[4-(丙-2-炔基氧基)苯基]-丙酸炔丙基酯在0℃下，小心地將乙酰氯(7毫升)加入甲醇(60毫升)中，以產(chǎn)生5M無水HCl的甲醇溶液。加入前一步驟的產(chǎn)物(2克，5.6毫摩爾)，攪拌反應(yīng)物4小時(shí)，此時(shí)允許加熱到環(huán)境溫度。減壓去除揮發(fā)性物質(zhì)后，獲得淡黃色固體(1.6克，98%)(參見化學(xué)結(jié)構(gòu)9)，將它直接用于下一步驟。2-氨基-3-[4-(丙-2-炔基氧基)苯基]-丙酸炔丙基酯將來自前一步驟的炔丙基酯(1.6克，5.5毫摩爾)溶解于2NNaOH(14毫升)和MeOH(10毫升)的含水混合物中。室溫下攪拌1.5小時(shí)后，通過加入濃HCI將pH調(diào)整到7。加入水(20毫升)，將混合物置于4℃過夜。過濾沉淀，用冰冷的H20洗滌，真空干燥，產(chǎn)生1.23克(90%)圖11中的1(2-氨基-3-苯基丙酸(1)(也稱為對(duì)-炔丙基氧基苯丙氨酸)，白色固體。1HNMR(400MHz，D20)(如D20中的鉀鹽)δ7.20(d，J=8.8Hz，2H)，6.99(d，J=8.8Hz，2H)，4.75(s，2H)，3.50(dd，J=5.6,7.2Hz，1H)，2.95(dd，J=5.6,13.6Hz，1H)，2.82(dd，J=7.2，13.6Hz，1H)；13CNMR(100MHz，D20)δ181.3,164.9,155.6，131.4，130.7，115.3，57.3，56.1，39.3；HRMS(CI)m/z220.0969[C12H13NO3(M+1)需要220.0968]。實(shí)施例5：通過[3+2]環(huán)加成將分子加入到具有非天然氨基酸的蛋白中在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將含有非天然氨基酸的蛋白質(zhì)與附加取代分子偶聯(lián)的方法和相關(guān)組合物。例如，可以通過[3+2]環(huán)加成將附加取代基加入非天然氨基酸。參見，例如，圖16。例如，可根據(jù)下面公開的[3+2]環(huán)加成反應(yīng)的條件將所需分子的[3+2]環(huán)加成(例如，包括第二活性基團(tuán)，如炔三鍵或疊氮基)到具有非天然氨基酸的蛋白(例如，具有第一活性基團(tuán)，如疊氮基或三鍵)中。例如，將包含非天然氨基酸的蛋白的PB緩沖液(pH=8)加入CuS04、所需分子和銅線中?；旌衔锓跤?例如，室溫或37℃下約4小時(shí)，或4℃過夜)，加入H2O，通過透析膜過濾混合物。可以通過，例如凝膠分析來分析加入樣品。所述分子的例子包括但不限于，例如，具有三鍵或疊氮基的分子，如具有圖13，A組的式3、4、5和6等結(jié)構(gòu)的分子。而且，可以將三鍵或疊氮基摻入其它感興趣的分子，例如聚合物(如聚(乙二醇)和衍生物)、交聯(lián)劑、附加染料、光交聯(lián)劑、細(xì)胞毒化合物、親和標(biāo)記、生物素、糖、樹脂、珠、第二種蛋白或多肽、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸(例如DNA、RNA等)等的結(jié)構(gòu)中，然后也可用于[3+2]環(huán)加成。在本發(fā)明的一個(gè)方面，可以如下所述合成具有圖13，A組的式3、4、5或6的分子。例如，通過在0℃下將炔丙基胺(250微升，3.71毫摩爾，3當(dāng)量)加入丹磺酰氯(500毫克，1.85毫摩爾，1當(dāng)量)和三乙胺(258微升，1.85毫摩爾，1當(dāng)量)的CH2Cl2(10毫升)溶液合成圖13，A組的3中和下面的化學(xué)結(jié)構(gòu)3中所顯示的炔染料。攪拌1小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加熱到室溫，再攪拌1小時(shí)。真空去除揮發(fā)物，通過硅膠層析(Et20/己烷=1:1)純化粗產(chǎn)物，產(chǎn)生黃色固體的圖13，A組的3(418毫克，78%)。分析數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中報(bào)道的相同。參見，例如，Bolletta，F(xiàn)等，(1996)Organometallics15：2415-17。化學(xué)結(jié)構(gòu)3中顯示了本發(fā)明中可使用的炔染料的結(jié)構(gòu)的例子：通過在0℃下將3-疊氮基丙胺(例如，如Carboni，B等，(1993)J.Org.Chem.58：3736-3741中所述)(371毫克，3.71毫摩爾，3當(dāng)量)加入丹磺酰氯(500毫克，1.85毫摩爾，1當(dāng)量)和三乙胺(258微升，1.85毫摩爾，1當(dāng)量)的CH2Cl2(10毫升)溶液合成圖13，A組的4中和下面的化學(xué)結(jié)構(gòu)4中所顯示的疊氮基染料。攪拌1小時(shí)后，將反應(yīng)混合物加熱到室溫，再攪拌1小時(shí)。真空去除揮發(fā)物，通過硅膠層析(Et20/己烷=1:1)純化粗產(chǎn)物，產(chǎn)生黃色油狀的圖13，A組的4(548毫克，89%)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.55(d，J=8.4Hz，1H)，8.29(d，J=8.8Hz，1H)，8.23(dd，J=1.2，7.2Hz，1H)，7.56-7.49(comp，2H)，7.18(d，J=7.6Hz，1H)，5.24(brs，1H)，3.21(t，J=6.4Hz，2H)，2.95(dt，J=6.4Hz，2H)，2.89(s，6H)，1.62(quin，J=6.4Hz，2H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ134.3，130.4，129.7，129.4，128.4，123.3，118.8，115.3，48.6，45.4，40.6，28.7(在13CNMR譜中并非所有的季碳原子信號(hào)都可見)；HRMS(CI)m/z334.1336[C15H20N5O2S(M+1)需要334.1332]?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)4中顯示了疊氮基染料的結(jié)構(gòu)的例子：通過在室溫下將EDCI(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)(83毫克，0.43毫摩爾，1當(dāng)量)加入熒光素胺(150毫克，0.43毫摩爾，1當(dāng)量)和10-十一碳一炔酸(79毫克，0.43毫摩爾，1當(dāng)量)的吡啶(2毫升)溶液合成圖13，A組的5中和下面的化學(xué)結(jié)構(gòu)5中所顯示的炔染料。將懸液攪拌過夜，將反應(yīng)混合物傾入H20(15毫升)中。通過加入濃HCl將該溶液酸化(pH<2)。攪拌1小時(shí)后，過濾掉沉淀，用H2O(5毫升)洗滌，溶解于少量的EtOAc。己烷的加入導(dǎo)致圖13，A組的5以橙色晶體析出，收集并在真空下干燥(138毫克，63%)。分析數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中報(bào)道的相同。參見，例如，Crisp，G.T.和Gore，J.(1997)Tetrahedron53：1505-1522?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)5中顯示了炔染料的結(jié)構(gòu)的例子：通過在室溫下將EDCI(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)(83毫克，0.43毫摩爾，1當(dāng)量)加入熒光素胺(150毫克，0.43毫摩爾，1當(dāng)量)和4-(3-疊氮基丙基氨基甲酰基)-丁酸(例如，通過3-疊氮基丙胺與戊二酸酐的反應(yīng)合成)(92毫克，0.43毫摩爾，1當(dāng)量)的吡啶(2毫升)溶液合成圖13，A組的6中和下面的化學(xué)結(jié)構(gòu)6中所顯示的疊氮基染料。將懸液攪拌過夜，將反應(yīng)混合物傾入H20(15毫升)中。通過加入濃HCl將該溶液酸化(pH<2)。攪拌1小時(shí)后，過濾掉沉淀，用1NHC1(3x3毫升)洗滌，溶解于少量的EtOAc。己烷的加入導(dǎo)致圖13，A組的6以橙色晶體析出，收集并在真空下干燥(200毫克，86%)。1HNMR(400MHz，CD30D)δ8.65(s，1H)，8.15(d，J=8.4Hz，1H)，7.61-7.51(comp，2H)，7.40(d，J=8.4Hz，1H)，7.35(brs，2H)，7.22-7.14(comp，2H)，6.85-6.56(comp，3H)，3.40-3.24(comp，4H)，2.54(t，J=7.2Hz，2H)，2.39-2.30(comp，2H)，2.10-1.99(comp，2H)，1.82-1.72(comp，2H)；13CNMR(100MHz，CD30D)δ175.7,174.4,172.4,167.9,160.8，143.0，134.3，132.9，131.8，129.6，124.4，123.3，121.1，118.5，103.5，50.2，38.0，37.2，36.2，29.8，22.9(在13CNMR譜中并非所有的季碳原子信號(hào)都可見)；HRMS(CI)m/z544.1835[C28H25N507(M+1)需要544.1827]。化學(xué)結(jié)構(gòu)6中顯示了疊氮基染料的結(jié)構(gòu)的例子：在一個(gè)實(shí)施方式中，也可以將PEG分子加入到具有非天然氨基酸，例如疊氮基氨基酸或炔丙基氨基酸的蛋白質(zhì)中。例如，可以通過[3+2]環(huán)加成將炔丙基酰胺PEG(如圖17，A組中所示)加入到具有疊氮基氨基酸的蛋白質(zhì)中。參見例如，圖17，A組。圖17，B組說明了具有加入的PEG取代基的蛋白質(zhì)的凝膠分析。在本發(fā)明的一個(gè)方面，可如下所述合成炔丙基酰胺PEG(如圖17，A組中所示)。例如，將炔丙基胺(30微升)的CH2Cl2(1毫升)溶液加入20kDaPEG-羥基琥珀酰亞胺酯(120毫克，購(gòu)自Nektar)中。室溫下攪拌反應(yīng)4小時(shí)。然后加入Et20(10毫升)，過濾掉沉淀，通過加入Et20(10毫升)從MeOH(1毫升)中二次再結(jié)晶。將產(chǎn)物在真空下干燥，產(chǎn)生白色固體(105毫克，產(chǎn)率88%)。參見，例如，圖17，C組。實(shí)施例6：示例性O(shè)-RS和0-tRNA示例性O(shè)-tRNA包含SEQIDNO.：65(參見，表5)。O-RS例子包括SEQIDNOs.：36-63、86(參見，表5)。編碼O-RS或其部分(如活性位點(diǎn))的多核苷酸包括SEQIDNOs.：3-35。此外，表6中說明了示例性O(shè)-RS的氨基酸改變。表6:進(jìn)化形成的EcTyrRS變體a這些克隆也含有Asp165Gly突變可以理解，本文描述的實(shí)施例和實(shí)施方式僅作為示例性目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)λ鼈冞M(jìn)行各種的修改或改變，而仍然包括在本申請(qǐng)的范圍和精神以及所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。雖然為闡明和理解已經(jīng)在一些細(xì)節(jié)方面詳述了前述發(fā)明，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，能夠通過閱讀本公開作出各種形式和細(xì)節(jié)上的改變，而并不背離本發(fā)明的范圍。例如，本文描述的所有技術(shù)和裝置都可以用于不同組合。本申請(qǐng)中引用的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)和/或其它文件均為所有目的以相同程度整體引入本文作為參考，似乎各單獨(dú)出版物、專利、專利申請(qǐng)和/或其它文件為所有目的單獨(dú)引入作為參考。表5a這些克隆也含有Asp165Gly突變。