專利名稱：Hib莢膜多糖純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及莢膜多糖純化技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種Hib莢膜多糖純化工藝。
背景技術(shù)：
b 型流感嗜血桿菌 Hib (Hamephilus influenzae type b, Hib)是引起 3 月齡至5周歲嬰幼兒腦膜炎、敗血癥和肺炎等傳染病的主要致病菌之一，而且75%以上的Hib感染發(fā)生在2歲以下嬰幼兒，侵襲性b型流感嗜血桿菌通常引起肺炎、蜂窩組織炎、化膿性關(guān)節(jié)炎和菌血癥，發(fā)病率高，致死率高。WHO統(tǒng)計(jì)顯示，每年Hib在全球可引起至少300萬(wàn)嚴(yán)重病例和大約38. 6萬(wàn)死亡病例。接種疫苗是預(yù)防絕大多數(shù)Hib嚴(yán)重病例的唯一公共衛(wèi)生措施。全球各區(qū)域已經(jīng)有90多個(gè)國(guó)家將Hib疫苗納入兒童常規(guī)免疫規(guī)劃。但是在低收入國(guó)家，僅有小部分兒童能享受Hib疫苗接種服務(wù)。Hib莢膜多糖(polyribosylribitol phosphate, PRP)的提取純化，是生產(chǎn)結(jié)合疫苗關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，很多因素影響Hib的培養(yǎng)、PRP產(chǎn)生和提取純化。本研究通過(guò)研究提取純化PRP多糖，為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)Hib多糖結(jié)合疫苗奠定基礎(chǔ)。b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的主要成分是多聚核糖基核糖醇磷酸鹽(PRP)。PRP具有抗原性，能在人體中誘發(fā)保護(hù)性免疫力。PRP是一種非胸腺依賴性抗原，雖然可以產(chǎn)生較弱的IgM型抗體，但不產(chǎn)生免疫記憶。18個(gè)月齡以下的嬰兒，其B淋巴細(xì)胞尚未成熟到足以產(chǎn)生自我保護(hù)能力，為了獲得免疫反應(yīng)，PRP必須結(jié)合到一種載體蛋白上，使得多糖成為胸腺依賴性抗原。這樣就可激活T輔助淋巴細(xì)胞輔助B細(xì)胞產(chǎn)生特異性IgG抗體。當(dāng)重復(fù)注射疫苗時(shí)，可產(chǎn)生明顯的免疫增強(qiáng)效果，標(biāo)志著免疫記憶反應(yīng)的建立。常規(guī)的去除蛋白質(zhì)的方法是將Hib粗制多糖溶解于飽和中性醋酸鈉溶液中，然后用冷酚溶液抽提，根據(jù)粗制多糖中含有的蛋白的情況，此步驟通常需要重復(fù)數(shù)次。該工藝的缺點(diǎn)是會(huì)使用大量的苯酚，苯酚是一種強(qiáng)腐蝕性的高毒性物質(zhì)，對(duì)人的皮膚和粘膜有強(qiáng)烈的腐蝕作用，可抑制中樞神經(jīng)或損害肝、腎功能。皮膚接觸可致灼傷。同時(shí)，該工藝會(huì)產(chǎn)生大量的廢棄苯酚，對(duì)水體和大氣可造成污染，對(duì)環(huán)境有嚴(yán)重危害。在Hib疫苗制備的過(guò)程中，莢膜多糖的制備是關(guān)鍵的步驟。在我國(guó)多采用和流行性腦膜炎球菌以及傷寒Vi多糖提取相似的工藝來(lái)提取Hib莢膜多糖。此工藝采用超濾透析去除核酸、蛋白質(zhì)，進(jìn)一步采用色譜分離可以大大提高純度，但粗多搪的蛋白和核酸含量較高時(shí)，也會(huì)影響色譜純化效果效果。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種安全有效、減輕對(duì)人體和環(huán)境危害的Hib莢膜多糖純化工藝，解決現(xiàn)有的Hib制備工藝中核酸、蛋白不易去除的問(wèn)題。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)Hib莢膜多糖純化工藝，它包括以下步驟a、在發(fā)酵液中加入終濃度為O. 8%的甲醛溶液，4°C攪拌過(guò)夜，15000 20000rpm離心30 60min去除菌體，收集上清液；b、離心上清液用O. 22um的中空纖維膜過(guò)濾，收集透過(guò)液；C、透過(guò)液通過(guò)選用100KD膜包的Millipore Pellicon超濾裝置,進(jìn)行超濾濃縮，用PBS緩沖液反復(fù)清洗濃縮液，直至濃縮液280和260下的吸光度達(dá)到恒定，收集濃縮洗滌液；d、向濃縮洗滌液中加入95%乙醇至終濃度為20% 25%，搖勻后4°C過(guò)夜；e、6000 8000rpm離心15 30min棄除沉淀，向上清液內(nèi)補(bǔ)加95%乙醇至70%終濃度，搖勻后，4°C下6000 8000rpm離心40 50min,收集上清液；f、向上清液中加入95%乙醇至80% 85%終濃度，混勻后，4°C靜置3 4h ; g、靜置后的溶液6000 8000rpm離心15 30min收集沉淀，沉淀用水溶解，沉淀水溶液6000 8000rpm離心15 30min去除不溶物質(zhì)；h、上清液用12 14KD透析膜對(duì)水透析，即得粗提PRP透析液；i、粗提PRP透析液,6000 8000rpm離心15 30min收集上清,上清用O. 45um濾膜過(guò)濾，濾液依次通過(guò)AKTA explorer,CL 4B層析柱，收集Kd彡O. 5的目的峰，即得Hib莢膜多糖純化樣品。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
I、本發(fā)明解決了現(xiàn)有的Hib制備工藝中核酸、蛋白不易去除的困難。2、本發(fā)明避免使用十六烷基三甲基溴化銨沉淀復(fù)合多糖以及苯酚抽提蛋白過(guò)程中對(duì)人體健康和環(huán)境造成的危害。3、本發(fā)明降低了處理難度，提高了處理質(zhì)量，且處理穩(wěn)定性好，使得人工純化的Hib多糖在連續(xù)的生產(chǎn)批次內(nèi)各個(gè)指標(biāo)都能符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，且產(chǎn)生的雜質(zhì)殘留量少又易去除。
4、本發(fā)明大大提高了純化PRP的純度，純化樣品檢測(cè)合格，免疫雙擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗原性良好，為進(jìn)一步制備Hib PRP多糖蛋白結(jié)合疫苗奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述實(shí)施例I :Hib莢膜多糖純化工藝，它包括以下步驟a、在發(fā)酵液中加入終濃度為O. 8%的甲醛溶液，4°C攪拌過(guò)夜，20000rpm離心30min
去除菌體，收集上清液；b、離心上清液用O. 22um的中空纖維膜過(guò)濾，收集透過(guò)液；C、透過(guò)液通過(guò)選用100KD膜包的Millipore Pellicon超濾裝置,進(jìn)行超濾濃縮，用PBS緩沖液反復(fù)清洗濃縮液，直至濃縮液280和260下的吸光度達(dá)到恒定，收集濃縮洗滌液；d、向濃縮洗滌液中加入95%乙醇至終濃度為20%，搖勻后4°C過(guò)夜；e、6000rpm離心30min棄除沉淀，向上清液內(nèi)補(bǔ)加95%乙醇至70%終濃度,搖勻后，4°C下6000rpm離心50min,收集上清液；f、向上清液中加入95%乙醇至83%終濃度，混勻后，4°C靜置3h ；
g、靜置后的溶液SOOOrpm離心15min收集沉淀，沉淀用水溶解，沉淀水溶液8000rpm離心15min去除不溶物質(zhì)；h、上清液用13KD透析膜對(duì)水透析，即得粗提PRP透析液；i、粗提PRP透析液,8000rpm離心15min收集上清,上清用O. 45um濾膜過(guò)濾,濾液依次通過(guò)AKTAexplorerXL 4B層析柱，收集Kd彡O. 5的目的峰，即得Hib莢膜多糖純化樣
品O本實(shí)施例得到的樣品的檢測(cè)結(jié)果如下取樣并按中國(guó)藥典方法檢測(cè)核糖含量、蛋白含量、核酸含量、磷含量，本實(shí)施例制備的3批Hib莢膜多糖純化樣品進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果如表I所示。
實(shí)施例2 Hib莢膜多糖純化工藝，它包括以下步驟a、在發(fā)酵液中加入終濃度為O. 8%的甲醛溶液，4°C攪拌過(guò)夜，15000rpm離心50min
去除菌體，收集上清液；b、離心上清液用O. 22um的中空纖維膜過(guò)濾，收集透過(guò)液；C、透過(guò)液通過(guò)選用100KD膜包的Millipore Pellicon超濾裝置,進(jìn)行超濾濃縮，用PBS緩沖液反復(fù)清洗濃縮液，直至濃縮液280和260下的吸光度達(dá)到恒定，收集濃縮洗滌液；d、向濃縮洗滌液中加入95%乙醇至終濃度為22%，搖勻后4°C過(guò)夜； e、7000rpm離心20min棄除沉淀，向上清液內(nèi)補(bǔ)加95%乙醇至70%終濃度，搖勻后，4°C下7000rpm離心40min,收集上清液；f、向上清液中加入95%乙醇至80%終濃度，混勻后，4°C靜置3. 5h ；g、靜置后的溶液7000rpm離心20min收集沉淀，沉淀用水溶解，沉淀水溶液7000rpm離心20min去除不溶物質(zhì)；h、上清液用12KD透析膜對(duì)水透析，即得粗提PRP透析液；i、粗提PRP透析液,7000rpm離心20min收集上清,上清用O. 45um濾膜過(guò)濾,濾液依次通過(guò)AKTAexplorerXL 4B層析柱，收集Kd彡O. 5的目的峰，即得Hib莢膜多糖純化樣
品O本實(shí)施例得到的樣品的檢測(cè)結(jié)果如下取樣并按中國(guó)藥典方法檢測(cè)核糖含量、蛋白含量、核酸含量、磷含量，本實(shí)施例制備的3批Hib莢膜多糖純化樣品進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果如表I所示。實(shí)施例3 Hib莢膜多糖純化工藝，它包括以下步驟a、在發(fā)酵液中加入終濃度為O. 8%的甲醛溶液，4°C攪拌過(guò)夜，18000rpm離心60min
去除菌體，收集上清液；b、離心上清液用O. 22um的中空纖維膜過(guò)濾，收集透過(guò)液；C、透過(guò)液通過(guò)選用100KD膜包的Millipore Pellicon超濾裝置,進(jìn)行超濾濃縮，用PBS緩沖液反復(fù)清洗濃縮液，直至濃縮液280和260下的吸光度達(dá)到恒定，收集濃縮洗滌液；d、向濃縮洗滌液中加入95%乙醇至終濃度為25%，搖勻后4°C過(guò)夜；
e、8000rpm離心15min棄除沉淀，向上清液內(nèi)補(bǔ)加95%乙醇至70%終濃度,搖勻后，4°C下8000rpm離心45min,收集上清液；f、向上清液中加入95%乙醇至85%終濃度，混勻后，4°C靜置4h ；g、靜置后的溶液6000rpm離心30min收集沉淀，沉淀用水溶解，沉淀水溶液6000rpm離心30min去除不溶物質(zhì)；h、上清液用14KD透析膜對(duì)水透析，即得粗提PRP透析液；i、粗提PRP透析液,6000rpm離心30min收集上清,上清用O. 45um濾膜過(guò)濾,濾液依次通過(guò)AKTA explorer, CL 4B層析柱，收集Kd彡O. 5的目的峰，即得Hib莢膜多糖純化樣品。
本實(shí)施例得到的樣品的檢測(cè)結(jié)果如下取樣并按中國(guó)藥典方法檢測(cè)核糖含量、蛋白含量、核酸含量、磷含量，本實(shí)施例制備的3批Hib莢膜多糖純化樣品進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果如表I所示。表I實(shí)施例樣品的核糖、蛋白、核酸、磷含量檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1. Hib莢膜多糖純化工藝，其特征在于它包括以下步驟 a、在發(fā)酵液中加入終濃度為0.8%的甲醛溶液，4°C攪拌過(guò)夜，15000 20000rpm離心30 60 min去除菌體，收集上清液； b、離心上清液用0.22um的中空纖維膜過(guò)濾，收集透過(guò)液； C、透過(guò)液通過(guò)選用100KD膜包的Millipore Pellicon超濾裝置，進(jìn)行超濾濃縮,用PBS緩沖液反復(fù)清洗濃縮液，直至濃縮液280和260下的吸光度達(dá)到恒定，收集濃縮洗滌液； d、向濃縮洗滌液中加入95%こ醇至終濃度為20% 25%，搖勻后4°C過(guò)夜； e、6000 8000rpm離心15 30min棄除沉淀，向上清液內(nèi)補(bǔ)加95%こ醇至70%終濃度，搖勻后，4°C下6000 8000rpm離心40 50min,收集上清液； f>向上清液中加入95%こ醇至80% 85%終濃度，混勻后，4°C靜置3 4h ; g、靜置后的溶液6000 8000rpm離心15 30min收集沉淀，沉淀用水溶解，沉淀水溶液6000 8000rpm離心15 30min去除不溶物質(zhì)； h、上清液用12 14KD透析膜對(duì)水透析，即得粗提PRP透析液； i、粗提PRP透析液，6000 8000rpm離心15 30min收集上清,上清用0.45um濾膜過(guò)濾，濾液依次通過(guò)AKTA explorer,CL-4B層析柱，收集Kd彡0. 5的目的峰，即得Hib莢膜多糖純化樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了Hib莢膜多糖純化工藝，包括以下步驟a、加入甲醛溶液，4℃攪拌過(guò)夜，離心，收集上清液；b、中空纖維過(guò)濾；c、超濾濃縮，用PBS清洗濃縮液；d、加入乙醇，過(guò)夜；e、離心，向上清液補(bǔ)加乙醇，離心，收集上清液；f、加入乙醇，靜置；g、離心，收集沉淀，沉淀用水溶解，離心，去除不溶物質(zhì)；h、用透析膜對(duì)水透析；i、離心，濾膜過(guò)濾，依次通過(guò)AKTAexplorer、CL-4B層析柱，收集Kd≤0.5的目的峰。本發(fā)明的有益效果是解決了現(xiàn)有的Hib制備工藝中核酸、蛋白不易去除的困難，避免了對(duì)人體健康和環(huán)境造成的危害，降低了處理難度，提高了處理質(zhì)量，且處理穩(wěn)定性好。
文檔編號(hào)C08B37/00GK102731670SQ20121022240
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月29日
發(fā)明者伍長(zhǎng)華, 關(guān)曉峰, 吳強(qiáng), 樊紹文, 羅力心, 陳庚 申請(qǐng)人:成都?xì)W林生物科技股份有限公司