專利名稱：聚合物多肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及聚合物多肽的制備方法，尤其涉及一種制備醋酸格拉替雷的方法。
背景技術(shù)：
醋酸格拉替雷,英文名為Glatiramer acetate,是一種合成的肽類化合物，是由Teva和Marion公司合作研制的多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis, MS)治療藥物，商品名 Copaxone ⑧。醋酸格拉替雷分子式為 C25H45N5O13,是由 L-Alanine, L-Lysine, L-Glutamic,L-Tyrosine四種氨基酸組成的多聚物，四種氨基酸的摩爾比為0. 427:0. 338:0. 141:0. 095，平均分子量為 4. 7 IlKDa,結(jié)構(gòu)式為(Ala, Lys, Glu, Tyr) x XCH3COOH 或(C3H7NO2 .C6H14N2O2 C5H9NO4 C9H11NO3) X XC2H4O2 ) 藥理研究表明醋酸格拉替雷與免疫系統(tǒng)內(nèi)的調(diào)控因子結(jié)合并進(jìn)入中樞神經(jīng)，透過一連串的免疫作用扭轉(zhuǎn)多發(fā)性硬化癥患者其自體免疫進(jìn)程；亦即刺激「有害」或前發(fā)炎性的T細(xì)胞轉(zhuǎn)換為「有益的」或抗發(fā)炎的T細(xì)胞。醋酸格拉替雷可直接作用於神經(jīng)細(xì)胞損傷部位并直接減少發(fā)炎情形。這些效益都有助於減少多發(fā)性硬化癥患者其復(fù)發(fā)率，以及有效降低其進(jìn)一步的損傷。許多研究與臨床經(jīng)驗證實醋酸格拉替雷能大幅度地減低多發(fā)性硬化癥患者的復(fù)發(fā)率，防止神經(jīng)進(jìn)一步的損傷與惡化，改善失能的病況，減少腦部損傷。而且醋酸格拉替雷的副作用發(fā)生率少，有助于提升患者的耐受性。在其它長期使用的療效研究里(6年至最長12年不等)，醋酸格拉替雷亦證實能持續(xù)地延緩患者其神經(jīng)學(xué)上病程的惡化或者讓患者維持穩(wěn)定的病況，減少腦內(nèi)損傷并防止神經(jīng)元大量遭受破壞終至喪失功能的惡化情形。所以說醋酸格拉替雷具有很高的藥用價值和廣闊的市場前景。制備醋酸格拉替雷的方法最早在Euro. J. Immune. 1，242 (1971, Tietelbaum etal)和美國專利US 3，849，550中有描述。其中描述的方法均以丙氨酸、I _三氟乙?；嚢彼?、Y-芐基谷氨酸、酪氨酸的羧基內(nèi)酸酐為原料，在二氧六環(huán)中用二乙胺作為引發(fā)劑引發(fā)聚合，得到帶有保護(hù)基的聚合物。聚合物用溴化氫醋酸溶液脫芐基，得到三氟乙?；窭胬?。三氟乙?；窭胬子眠哙に芤好摮阴；詈笸ㄟ^純化得到醋酸格拉替雷。后續(xù)的專利 US 5, 800, 808 (1998), US 6, 054, 430 (2000), US 6, 048, 898 (2000), US
6,342, 476 (2002) ,US 6，362，161 (2002)，US 6，620，847 (2003)，US 6，939，539 (2005)，US
7,199, 098(2007), US 10, 014, 477 以及 WO 00/05250，W009/016653 均按照該方法進(jìn)行制備，得到平均分子量為5000-9000Da的多肽聚合物。其中US 5, 800, 808 (1998)，US6, 054, 430 (2000), US 6, 048, 898 (2000), US 6, 342, 476 (2002), US 6,362，161 (2002), US
6,620, 847(2003), US 6，939，539 (2005)，US 7，199，098 (2007)，US 10, 014, 477 以及 WO00/05250在制備三氟乙?；窭胬椎倪^程中，均采用33%溴化氫醋酸溶液20-28°C下反應(yīng)10-50h。W009/016653對該步驟做了修改，反應(yīng)時間改為l_5h，溫度改為35_45°C。這兩種方法都采用高濃度的溴化氫醋酸溶液，在去保護(hù)的過程中對肽鏈的切斷作用十分明顯，因此不利于對產(chǎn)品分子量的控制。WO 2004/043995和US 2006/0172542用Z或帶有取代基的Z保護(hù)Lys，芐酯或帶有取代基的芐酯保護(hù)Glu，聚合之后在冰醋酸溶液中用催化劑催化氫化，直接得到聚合物的醋酸鹽，然后進(jìn)行純化。該方法的優(yōu)點是合成步驟少，與采用HBr/HOAc溶液去保護(hù)相比，在去保護(hù)過程中不切斷肽鏈，對分子量不產(chǎn)生影響。然而，上述制備方法工藝復(fù)雜、醋酸格拉替雷收率低，不適合醋酸格拉替雷的產(chǎn)業(yè)
化生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種對醋酸格拉替雷分子 量影響小、收率高的制備醋酸格拉替雷的方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種制備醋酸格拉替雷的方法，包括以下步驟I)以丙氨酸、I-三氟乙?；嚢彼?、Y-芐基谷氨酸、酪氨酸的羧基內(nèi)酸酐為原料，在二氧六環(huán)中用二乙胺作為引發(fā)劑引發(fā)聚合，得到帶有保護(hù)基的聚合物；2)取步驟I)所得帶有保護(hù)基的聚合物在18_30°C下與20-25%溴化氫醋酸溶液進(jìn)行脫芐基反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液倒入冰水中析出固體；3)取步驟2)所得固體用乙醚洗滌，過濾后收集固體；4)向步驟3)所得固體中加入哌啶水溶液脫除三氟乙?；玫礁窭胬状之a(chǎn)品溶液，純化制得醋酸格拉替雷。本發(fā)明所述制備醋酸格拉替雷的方法采用丙氨酸、I-三氟乙?；嚢彼?、Y-芐基谷氨酸、酪氨酸的羧基內(nèi)酸酐為原料，在二氧六環(huán)中用二乙胺作為引發(fā)劑引發(fā)聚合，得到帶有保護(hù)基的聚合物。帶有保護(hù)基的聚合物用20-25%的溴化氫醋酸溶液反應(yīng)脫芐基，得到三氟乙酰基格拉替雷。然后用三氟乙?；窭胬子靡颐严礈斐シ磻?yīng)產(chǎn)生的芐溴。之后用哌啶水溶液脫除三氟乙?；窭胬椎娜阴；玫礁窭胬?，純化凍干得到醋酸格拉替雷。優(yōu)選的，步驟I)所述丙氨酸、I-三氟乙?；嚢彼?、Y-芐基谷氨酸與酪氨酸的羧基內(nèi)酸酐的摩爾比為0. 9:0. 7:0. 3:0. 2。本發(fā)明所述制備醋酸格拉替雷的方法在步驟I)中羧基內(nèi)酸酐的聚合由二乙胺引發(fā)，同時反應(yīng)體系中痕量水分也會對反應(yīng)產(chǎn)生影響。由二乙胺引發(fā)得到的肽鏈較長，而由水引發(fā)得到的肽鏈則較短。因此反應(yīng)體系中的水分對聚合物的分子量分布有很大的影響，得到的聚合物分子量往往很難均一。本發(fā)明步驟2)通過在18-30°C下，采用20-25%溴化氫醋酸溶液脫除芐基，同時還會切斷肽鏈。本發(fā)明采用溴化氫醋酸溶液濃度低，對產(chǎn)品分子量的控制更加容易，從而調(diào)節(jié)產(chǎn)品分子量，穩(wěn)定得到分子量分布在5000-9000Da的產(chǎn)品。優(yōu)選的，步驟2)所述脫芐基反應(yīng)的反應(yīng)時間為20 25h。更優(yōu)選為23h本發(fā)明所述制備醋酸格拉替雷的方法在步驟3)中，用乙醚洗滌步驟2)所得三氟乙?；窭胬坠腆w，以除去脫芐基產(chǎn)生的芐溴，提高反應(yīng)的收率。同時乙醚沸點較低，可以快速去除三氟乙?；窭胬讟悠分械乃?，既減少殘余的水分對聚合物的分子量的影響，又有利于縮短干燥時間。
優(yōu)選的，所述乙醚洗滌為加入乙醚洗滌三次，每次攪拌25min。本發(fā)明所述制備方法步驟4)利用哌啶水溶液脫除三氟乙酰基格拉替雷的三氟乙?；玫礁窭胬状之a(chǎn)品溶液，然后經(jīng)純化制得醋酸格拉替雷。優(yōu)選的，所述純化為超濾、透析或凝膠過濾。在某一些具體實施方式
中，所述超濾為用格拉替雷粗產(chǎn)品溶液截留量為2KDa超濾膜純化至溶液pH值為5. 0-6. 5后凍干。在某一些具體實施方式
中，所述透析為將格拉替雷粗產(chǎn)品溶液置于截留量為5KDa透析袋中，用0. 3v/v%乙酸溶液透析至pH值為5. 0-6. 56. 0后凍干。在另一些具體實施方式
中，所述凝膠過濾為格拉替雷粗產(chǎn)品溶液用SEPHADEX G25或SEPHADEX G50凝膠柱，以0. 01-2. OM醋酸銨水溶液為流動相過濾，收集分子量為7_8KDa的組分，濃縮后凍干。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述制備方法操作簡單、對醋酸格拉替雷分子量影響小，醋酸格拉替雷收率高，適合于醋酸格拉替雷大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，并且制得的醋酸格拉替雷純度高、雜質(zhì)含量低，具有可觀的經(jīng)濟實用價值和廣泛的應(yīng)用前景。
圖I示實施例5醋酸格拉替雷凝膠過濾層析圖譜，其中醋酸格拉替雷產(chǎn)品平均分子量為7409 ；圖2示實施例5醋酸格拉替雷質(zhì)譜圖，其中橫坐標(biāo)為質(zhì)核比(m/z)，縱坐標(biāo)為相對離子豐度(％)，其中右上角插圖為質(zhì)荷比為1500 5000相對離子豐度。
具體實施例方式本發(fā)明實施例公開了聚合物多肽的制備方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實施例I :帶有保護(hù)基聚合物的制備在5L三口圓底燒瓶中加入丙氨酸羧基內(nèi)酸酐103. 5g (0.9mol)、三氟乙酰基賴氨酸羧基內(nèi)酸酐187. 6g (0. 70mol)、Y -節(jié)基谷氨酸羧基內(nèi)酸酐78. 9g (0. 3mol)、酪氨酸羧基內(nèi)酸酐41. 4g (0.20mol)和3L 二氧六環(huán)，攪拌溶解。再加入0. 01% 二乙胺引發(fā)聚合反應(yīng)，室溫攪拌24h后倒入30L水中淬滅反應(yīng)，固體用IOL水洗滌后過濾，干燥得白色固體313. 9g，收率為 76. 3%。實施例2 :三氟乙酰基格拉替雷制備在50mL圓底燒瓶中加入3g實施例I制得的帶保護(hù)基聚合物，加入30mL25%溴化氫醋酸溶液，在25°C攪拌23h,反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入300mL冰水中析出固體,過濾后收集固體用水洗滌(300mL)后過濾抽干。收集固體加入50mL乙醚洗滌三次，每次攪拌25min，過濾后干燥，得到白色固體2. 2g,收率為73. 3%。
實施例3 :三氟乙酰基格拉替雷的制備在5L圓底燒瓶中加入300g實施例I制得的帶保護(hù)基聚合物，加入3000mL 20-25%溴化氫醋酸溶液，在25°C攪拌23h,反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入30L冰水中析出固體,過濾后收集固體用30L水洗滌后過濾抽干。收集固體加入5L乙醚洗滌三次，每次攪拌25min，樣品過濾后干燥，得到白色固體216. 9g,收率為72. 3%。實施例4 :格拉替雷粗品溶液的制備在20L反應(yīng)釜中加入200g實施例3制得的三氟乙?；窭胬?，加入15L IM哌啶水溶液，在室溫下攪拌24h過濾，收集濾液得到淺黃色水溶液，即為格拉替雷粗產(chǎn)品溶液。實施例5 :凝膠過濾純化
取實施例4制得的格拉替雷粗品溶液，用600 X 26mm SEPHADEX G50凝膠柱凝膠過濾，流動相為0. IM醋酸銨水溶液，流速5mL/min，上樣量30mL，紫外檢測器進(jìn)行監(jiān)測，收集分子量為7-8KDa的組分，濃縮凍干后得到類白色的醋酸格拉替雷固體160mg。凝膠過濾層析圖譜圖1，質(zhì)譜結(jié)果檢測見圖2。 實施例6 凝膠過濾純化取實施例4制得的格拉替雷粗品溶液，用600 X 26mm SEPHADEX G25凝膠柱凝膠過濾，流動相為0. IM醋酸銨水溶液，流速5mL/min，上樣量30mL，紫外檢測器進(jìn)行監(jiān)測，收集分子量為7-8KDa的組分，濃縮凍干后得到類白色的醋酸格拉替雷固體150mg。質(zhì)譜結(jié)果與實施例5相似。實施例7 :透析純化取20mL實施例4制得的格拉替雷粗品溶液于截留量為5000Da的透析袋中，用
0.3%H0Ac溶液透析至pH值為6. 0，凍干得到180mg醋酸格拉替雷。質(zhì)譜結(jié)果與實施例5相似。實施例8 :超濾純化取500mL取實施例4制得的格拉替雷粗品溶液，用截留量為2KDa切向流超濾膜包進(jìn)行超濾純化，超濾純化至PH值為6. 0，凍干得到3. 9g醋酸格拉替雷。質(zhì)譜結(jié)果與實施例5相似。以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種制備醋酸格拉替雷的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)以丙氨酸、I-三氟乙酰基賴氨酸、Y-芐基谷氨酸、酪氨酸的羧基內(nèi)酸酐為原料，在二氧六環(huán)中用二乙胺作為引發(fā)劑引發(fā)聚合，得到帶有保護(hù)基的聚合物； 2)取步驟I)所得帶有保護(hù)基的聚合物在18-30°C下與20-25%溴化氫醋酸溶液進(jìn)行脫芐基反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液倒入冰水中析出固體； 3)取步驟2)所得固體用乙醚洗滌，過濾后收集固體； 4)向步驟3)所得固體中加入哌啶水溶液脫除三氟乙?；玫礁窭胬状之a(chǎn)品溶液，純化制得醋酸格拉替雷。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，步驟I)所述丙氨酸、I-三氟乙?；嚢彼帷-芐基谷氨酸與酪氨酸的羧基內(nèi)酸酐的摩爾比為0.9:0. 7:0. 3:0. 2。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，步驟2)所述脫芐基反應(yīng)的反應(yīng)時間為20 25h。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，步驟3)所述乙醚洗滌為加入乙醚洗滌三次，每次攪拌25min。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，步驟4)所述純化為超濾、透析或凝膠過濾。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述超濾為用格拉替雷粗產(chǎn)品溶液截留量為2KDa超濾膜純化至溶液pH值為5. 0-6. 5后凍干。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述透析為將格拉替雷粗產(chǎn)品溶液置于截留量為5KDa透析袋中，用0. 3v/v%乙酸溶液透析至pH值為5. 0-6. 56. 0后凍干。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述凝膠過濾為格拉替雷粗產(chǎn)品溶液用SEPHADEX G25或SEPHADEX G50凝膠柱，以0. 01-2. OM醋酸銨水溶液為流動相過濾，收集分子量為7-8KDa的組分，濃縮后凍干。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種聚合物多肽的制備方法，公開了一種制備醋酸格拉替雷的方法。本發(fā)明所述制備方法以丙氨酸、ξ-三氟乙?；嚢彼?、γ-芐基谷氨酸、酪氨酸的羧基內(nèi)酸酐為原料，在二氧六環(huán)中用二乙胺作為引發(fā)劑引發(fā)聚合，得到帶有保護(hù)基的聚合物，所得帶有保護(hù)基的聚合物在18-30℃下與20-25%溴化氫醋酸溶液進(jìn)行脫芐基反應(yīng)，反應(yīng)液倒入冰水中析出固體，所得固體用乙醚洗滌，過濾后收集固體，加入哌啶水溶液脫除三氟乙酰基得到格拉替雷粗產(chǎn)品溶液，純化制得醋酸格拉替雷。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述制備方法操作簡單、對醋酸格拉替雷分子量影響小，醋酸格拉替雷收率高，適合于醋酸格拉替雷大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C08G69/48GK102718963SQ20121020316
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月19日
發(fā)明者劉飛, 曾國良, 袁建成, 馬亞平 申請人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司