專利名稱：胍基化聚乙烯醇轉(zhuǎn)基因非病毒載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因載體及其制備方法，更具體地說(shuō)，涉及一種改性聚乙烯醇轉(zhuǎn)基因載體及其制備方法。
背景技術(shù)：
基因治療是指將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^(guò)一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正、補(bǔ)償基因的缺陷或異常，從而達(dá)到治療目的的方法。通過(guò)基因治療可以使某些通過(guò)其他手段無(wú)法治愈的疾病得到有效地治療甚至預(yù)防?；蚬こ滩《咀钤绫挥米骰蜉d體。早期研究證明了病毒載體的高效率，然而，其副作用也十分的明顯。人們認(rèn)識(shí)到病毒載體可能通過(guò)插入誘變引發(fā)癌癥，因?yàn)榛螂S機(jī)嵌入寄主染色體可能會(huì)擾亂重要的正常的基因的表達(dá)。此外，基因載體本身也會(huì)引發(fā)免疫響應(yīng)從而產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。這些為題促使了人們對(duì)于更加安全的低病原性和致免疫性的非病毒基因載體的研究，這些研究包括脂質(zhì)體載體，無(wú)機(jī)材料和基于高分子材料的非病毒載體。除了更加安全之外，這些非病毒載體具有更加豐富的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)來(lái)提供多樣化的功能。然而非病毒載體普遍有著轉(zhuǎn)染效率低的缺點(diǎn)。陽(yáng)尚子聞聚物作為非病毒載體的一部分，它除了存在非病毒載體的特點(diǎn)(低毒性，低免疫原性和低致癌性)以外，還有自身的優(yōu)勢(shì)，即易制備和攜帶目的基因能力高，這些更加有利于其作為轉(zhuǎn)基因載體的應(yīng)用。常見(jiàn)的陽(yáng)離子高聚物能夠通過(guò)強(qiáng)靜電作用有效縮合DNA，形成較穩(wěn)定的聚電解質(zhì)復(fù)合物(PECs)。這些PECs易于細(xì)胞內(nèi)化，從內(nèi)涵體中逃逸，并能有效保護(hù)DNA免受DNA酶的降解。但是陽(yáng)離子高聚物作為基因載體應(yīng)用時(shí)，仍呈現(xiàn)出了一些問(wèn)題，例如生物相容性差、有毒性、以及轉(zhuǎn)染效率低等。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種胍基化聚乙烯醇非病毒基因載體及制備方法和應(yīng)用。該共聚物具有轉(zhuǎn)基因的能力，實(shí)現(xiàn)對(duì)于DNA的運(yùn)輸和表達(dá)。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，合成條件溫和。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)胍基化聚乙烯醇非病毒基因載體，以聚乙烯醇為主鏈，具體結(jié)構(gòu)如下所示
權(quán)利要求
1.胍基化聚乙烯醇轉(zhuǎn)基因非病毒載體，其特征在于，以聚乙烯醇為主鏈，具體結(jié)構(gòu)如下所示
2.一種制備胍基化聚乙烯醇轉(zhuǎn)基因非病毒載體的方法，其特征在于，按照下述步驟進(jìn)行首先，即步驟(1)，將聚乙烯醇和對(duì)甲苯磺酰氯進(jìn)行反應(yīng)得到聚乙烯對(duì)甲苯磺酸酯；其次，即步驟(2)，將聚乙烯對(duì)甲苯磺酸酯和過(guò)量的乙二胺反應(yīng)，以得到乙二胺修飾的聚乙烯醇； 然后，即步驟(3)，將乙二胺修飾聚乙烯醇和IH-吡唑-I-甲咪鹽酸鹽放入容器中，加入蒸餾水進(jìn)行溶解，室溫下進(jìn)行反應(yīng)，得到胍基化聚乙烯醇非病毒基因載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種制備胍基化聚乙烯醇轉(zhuǎn)基因非病毒載體的方法，其特征在于，所述步驟(I)具體來(lái)說(shuō)，向容器中加入聚乙烯醇和吡啶，85°C下預(yù)反應(yīng)兩小時(shí)，再向該燒瓶中加入雙倍體積的吡啶，反應(yīng)體系降溫至5°C左右；冷卻后，再向容器中加入I. 5倍體積的對(duì)甲苯磺酰氯，溶液變?yōu)榈S色；反應(yīng)體系在5 10°C下反應(yīng)24h ;結(jié)束后，向反應(yīng)瓶中加入等體積丙酮，使得非均相反應(yīng)體系中的不溶物充分溶解，將溶液加入約10倍體積的蒸餾水中產(chǎn)生白色沉淀，減壓抽濾，棄掉液體；重復(fù)這一步驟，將濾得固體再次溶于丙酮并在水中沉淀，減壓抽濾得到產(chǎn)物并進(jìn)行真空干燥，即得到聚乙烯對(duì)甲苯磺酸酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種制備胍基化聚乙烯醇轉(zhuǎn)基因非病毒載體的方法，其特征在于，所述步驟(2)具體來(lái)說(shuō)，將得到的聚乙烯對(duì)甲苯磺酸酯加入容器中，加入二甲基亞砜使其溶解，并加入過(guò)量的乙二胺，在70°C下反應(yīng)48h;冷卻后，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，將反應(yīng)液在去離子水中透析3天(透析袋截留分子量3500Da)，每8h換一次水，冷凍干燥，得到乙二胺修飾的聚乙烯醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種制備胍基化聚乙烯醇轉(zhuǎn)基因非病毒載體的方法，其特征在于，所述步驟(3)具體來(lái)說(shuō)，將乙二胺修飾聚乙烯醇和IH-吡唑-I-甲咪鹽酸鹽放入容器中，加入蒸餾水進(jìn)行溶解，20-25度反應(yīng)24h，再將反應(yīng)液在去離子水中透析3天(透析袋截留分子量3500Da)，每8h換一次水，冷凍干燥，得到胍基化程度不同的胍基化聚乙烯醇非病毒基因載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種制備胍基化聚乙烯醇轉(zhuǎn)基因非病毒載體的方法，其特征在于，在完成步驟(2)后，可對(duì)乙二胺修飾的聚乙烯醇進(jìn)行核磁氫譜測(cè)試，通過(guò)測(cè)試結(jié)果確定乙二胺的接枝率，并根據(jù)氨基摩爾量加入不同量的IH-吡唑-I-甲咪鹽酸鹽進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)而得到不同胍基化程度不同的胍基化聚乙烯醇非病毒基因載體。
7.如權(quán)利要求I所述的胍基化聚乙烯醇轉(zhuǎn)基因非病毒載體在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種胍基化聚乙烯醇轉(zhuǎn)基因非病毒載體及制備方法和應(yīng)用。它是通過(guò)對(duì)甲苯磺酰氯活化聚乙烯醇得到聚乙烯對(duì)甲苯磺酸酯，再通過(guò)乙二胺引入氨基，最后再對(duì)氨基進(jìn)行胍基化，其制備方法簡(jiǎn)便，條件溫和。本發(fā)明提供的胍基化聚乙烯醇轉(zhuǎn)基因非病毒載體可用作基因載體，轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低，是一種有效的非病毒基因載體。
文檔編號(hào)C08F8/30GK102718903SQ20121014298
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月9日
發(fā)明者劉文廣, 劉璐, 楊建海 申請(qǐng)人:天津大學(xué)