專利名稱：一種b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的純化方法。
背景技術(shù)：
在Hib疫苗制備的過程中，莢膜多糖的制備是關(guān)鍵的步驟。在我國多采用和流行性腦膜炎球菌以及傷寒Vi多糖提取相似的工藝來提取莢膜多糖。此工藝采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)與酸性多糖形成季胺絡(luò)合物從而沉淀多糖。但是CTAB對核酸、蛋白質(zhì)也有不同程度的沉淀作用，因此要獲得純度較高的莢膜多糖，必須進(jìn)一步去除沉淀的核酸和蛋白質(zhì)。常規(guī)的去除蛋白質(zhì)的方法是用苯酚抽提去除蛋白質(zhì)。但是該工藝的缺點是會產(chǎn)生大量的廢棄苯酚，苯酚是一種強腐蝕性的高毒性物質(zhì)，對環(huán)境有嚴(yán)重危害，對水體和大氣可造成污染。苯酚對皮膚、粘膜有強烈的腐蝕作用，可抑制中樞神經(jīng)或損害肝、腎功能。人吸入高濃度苯酚氣體可致頭痛、頭暈、乏力、視物模糊、肺水腫等。因此，對去除蛋白質(zhì)的工藝進(jìn)行改進(jìn)是有實際意義的。羥基磷灰石是磷酸鈣的一種形式，具有獨特的選擇性和分辨率，經(jīng)常能夠分離一些其他技術(shù)無法區(qū)分的生物分子。羥基磷灰石填料廣泛用于核酸、蛋白、病毒以及其他大分子的分離純化。當(dāng)前還沒有將羥基磷灰石用于b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的純化的工藝。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的即在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的純化方法，該方法不使用苯酚來進(jìn)行莢膜多糖的純化，減輕了對環(huán)境的危害和對人體的損害，并且得到的Hib莢膜多糖純度可達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的純化方法，包括以下步驟A.裝填一根羥基磷灰石層析柱，用20mM磷酸鹽緩沖液平衡2個柱體積直至基線平穩(wěn)；B.將b型流感嗜血桿菌(Hib)莢膜多糖粗糖溶解于20mM磷酸鹽緩沖液，將得到的Hib莢膜多糖粗糖溶液上樣于層析柱上；C.使用20mM磷酸鹽緩沖液洗2個柱體積，收集流穿峰；D.用高鹽緩沖液洗脫結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，再生層析柱；E.將收集的流穿峰用G-25葡萄糖凝膠柱進(jìn)行緩沖液置換，流動相為無熱原的注射用水，收集含Hib莢膜多糖的洗脫峰，最終得到Hib莢膜多糖精糖原液。在上述步驟中，Hib莢膜多糖粗糖是通過對Hib樣本進(jìn)行處理得到的沉淀物。在上述步驟中，20mM磷酸鹽緩沖液的pH值為6. 9。在步驟B中，將50 150mgHib莢膜多糖粗糖溶解于50ml 20mM磷酸鹽緩沖液。在步驟D中，高鹽緩沖液為pH值為6. 9，由20mM磷酸鹽緩沖液和0. 2M氯化鈉組成的液體。
本發(fā)明的優(yōu)點在于，采用羥基磷灰石進(jìn)行莢膜多糖的純化，避免了使用苯酚對環(huán)境和人體帶來的危害，并且得到的Hib莢膜多糖純度可達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，本發(fā)明的保護范圍不限于以下所述。一種b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的純化方法，包括以下步驟A.裝填一根羥基磷灰石層析柱，用20mM磷酸鹽緩沖液平衡2個柱體積直至基線平穩(wěn)；B.將b型流感嗜血桿菌(Hib)莢膜多糖粗糖溶解于20mM磷酸鹽緩沖液，將得到的Hib莢膜多糖粗糖溶液上樣于層析柱上；C.使用20mM磷酸鹽緩沖液洗2個柱體積，收集流穿峰；D.用高鹽緩沖液洗脫結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，再生層析柱；E.將收集的流穿峰用G-25葡萄糖凝膠柱進(jìn)行緩沖液置換，流動相為無熱原的注射用水，收集含Hib莢膜多糖的洗脫峰，最終得到Hib莢膜多糖精糖原液。在上述步驟中，Hib莢膜多糖粗糖是通過對Hib樣本進(jìn)行處理得到的沉淀物。在上述步驟中，20mM磷酸鹽緩沖液的pH值為6. 9。在步驟B中，將50 150mgHib莢膜多糖粗糖溶解于50ml 20mM磷酸鹽緩沖液。在步驟D中，高鹽緩沖液為PH值為6. 9，由20mM磷酸鹽緩沖液和0. 2M氯化鈉組成的液體。Hib莢膜多糖粗糖制取方法如下參照文獻(xiàn)公開的方法(Anderson，1977.INFCTION AND IMMUNITY. Vol 15. No. 2,P472 477)進(jìn)行Hib的培養(yǎng)。培養(yǎng)基采用CY培養(yǎng)基，1升培養(yǎng)基含IOg酸水解酪蛋白，5g酵母提取物，5g葡萄糖，Img氯化血紅素，Img輔酶I，0. IM PB，培養(yǎng)基的pH值為7. 6。培養(yǎng)溫度為37°C，振蕩速度為220rpm，待菌種濃度OD66tl為0. 5后接種至發(fā)酵罐繼續(xù)培養(yǎng)，維持培養(yǎng)溫度37°C，攪拌速度150rpm，培養(yǎng)8 IOh后加入濃度為0.5% (ν/ν)的甲醛殺菌，收獲時菌液濃度OD66tl > 4. O0殺菌后的培養(yǎng)液采用IOOOOrpm離心30min沉淀菌體，收集上清液。將CTAB加入上清液中，CTAB與上清液的重量體積比(w/v)為1 1000，室溫攪拌lh，得到的混合液IOOOOrpm離心30min后收集CTAB與Hib莢膜多糖的復(fù)合物沉淀。沉淀用0. 5 IM氯化鈉溶液溶解，室溫攪拌2小時，使Hib莢膜多糖與CTAB解離。加入4°C預(yù)冷的無水乙醇至乙醇終濃度為25% (ν/ν)，4°C攪拌過夜。IOOOOrpm離心30min，收集上清液，上清液中繼續(xù)加入無水乙醇至乙醇終濃度為75% (v/v)，4°C攪拌過夜，IOOOOrpm離心30min，收集沉淀。沉淀用無水乙醇和丙酮各洗滌兩次，最終得到的沉淀即為Hib莢膜多糖粗糖。實施例一預(yù)先裝填一根羥基磷灰石層析柱(5cmX 20cm)，用20mM PB緩沖液(pH6. 9)平衡柱子2個柱體積直至OD2tl6nm基線平穩(wěn)。然后將50mg Hib莢膜多糖粗糖溶解于50ml 20mM PB緩沖液(PH6. 9)，上樣于層析柱上。上樣完成后先用緩沖液A(20mM PB緩沖液，pH6.9)洗2個柱體積，收集流穿峰。然后用緩沖液B(20mM PB緩沖液，0. 2M氯化鈉，pH6.9)洗脫結(jié)合在層析柱上的的蛋白質(zhì)，再生層析柱。
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預(yù)先裝填一根G-25葡萄糖凝膠柱(5cmX 20cm)，用無熱原的注射用水平衡層析柱直至0D206nm基線平穩(wěn)。然后將收集的流穿峰上樣于G-25葡萄糖凝膠柱上。用無熱原的注射用水作為流動相洗脫，收集含Hib莢膜多糖的洗脫峰，最終得到Hib莢膜多糖精糖原液，并取樣檢測。各項檢定指標(biāo)如下
蛋白含量5.02 mg/g
核酸含量6.55 mg/g
核糖含量394.52 mg/g
磷含量76.38 mg/g
內(nèi)毒素含量 <12.5 EU/μ g。實施例二 預(yù)先裝填一根羥基磷灰石層析柱(5cmX 20cm)，用20mM PB緩沖液(pH6. 9)平衡柱子2個柱體積直至0D206nm基線平穩(wěn)。然后將IOOmg Hib莢膜多糖粗糖溶解于50ml 20mMPB緩沖液(pH6. 9)，上樣于層析柱上。上樣完成后先用緩沖液A(20mM PB緩沖液，pH6. 9)洗2個柱體積，收集流穿峰。然后用緩沖液B(20mM PB緩沖液，0. 2M氯化鈉，pH6. 9)洗脫結(jié)合在層析柱上的的蛋白質(zhì)，再生層析柱。預(yù)先裝填一根G-25葡萄糖凝膠柱(5cmX 20cm)，用無熱原的注射用水平衡層析柱直至0D206nm基線平穩(wěn)。然后將收集的流穿峰上樣于G-25葡萄糖凝膠柱上。用無熱原的注射用水作為流動相洗脫，收集含Hib莢膜多糖的洗脫峰，最終得到Hib莢膜多糖精糖原液，并取樣檢測。各項檢定指標(biāo)如下
蛋白含量
核酸含量核糖含量磷含量內(nèi)毒素含量實施例三預(yù)先裝填一根羥基磷灰石層析柱(5cmX 20cm)，用20mM PB緩沖液(pH6. 9)平衡柱子2個柱體積直至0D206nm基線平穩(wěn)。然后將IOOmg Hib莢膜多糖粗糖溶解于50ml 20mMPB緩沖液(pH6. 9)，上樣于層析柱上。上樣完成后先用緩沖液A(20mM PB緩沖液，pH6. 9)洗2個柱體積，收集流穿峰。然后用緩沖液B(20mM PB緩沖液，0. 2M氯化鈉，pH6. 9)洗脫結(jié)合在層析柱上的的蛋白質(zhì)，再生層析柱。預(yù)先裝填一根G-25葡萄糖凝膠柱(5cmX 20cm)，用無熱原的注射用水平衡層析柱直至0D206nm基線平穩(wěn)。然后將收集的流穿峰上樣于G-25葡萄糖凝膠柱上。用無熱原的注
4.64 mg/g
6.33 mg/g391.19 mg/g71.03 mg/g<12.5 EU/μ go射用水作為流動相洗脫，收集含Hib莢膜多糖的洗脫峰，最終得到Hib莢膜多糖精糖原液，并取樣檢測。各項檢定指標(biāo)如下
蛋白含量5.86 mg/g
核酸含量5.51 mg/g
核糖含量411.91 mg/g
磷含量82.47 mg/g
內(nèi)毒素含量 <12.5 EU/μ g。通過本發(fā)明制備的Hib莢膜多糖各項檢定指標(biāo)與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的比較
行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量核酸含量核糖含量磷含量內(nèi)毒素含量<10mg/g<10mg/g320 410mg/g68 90mg/g<50EU/ μ g實施例一5.026.55394.5276.38<12.5實施例二4.646.33391.1971.03<12.5實施例三5.865.51411.9182.47<12.5 從上表中可以看出，本發(fā)明制備的Hib莢膜多糖的蛋白含量、核酸含量、核糖含量、磷含量和內(nèi)毒素含量均達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，且制備過程中完全不使用苯酚，杜絕了因使用苯酚對環(huán)境和人體帶來的危害。
權(quán)利要求
1.一種b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的純化方法，其特征在于，包括以下步驟A.裝填一根羥基磷灰石層析柱，用20mM磷酸鹽緩沖液平衡2個柱體積直至基線平穩(wěn)；B.將5(Tl50mgb型流感嗜血桿菌(Hib)莢膜多糖粗糖溶解于50ml 20mM磷酸鹽緩沖液，將得到的Hib莢膜多糖粗糖溶液上樣于層析柱上；C.使用20mM磷酸鹽緩沖液洗2個柱體積，收集流穿峰；D.用高鹽緩沖液洗脫結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，再生層析柱；E.將收集的流穿峰用G-25葡萄糖凝膠柱進(jìn)行緩沖液置換，流動相為無熱原的注射用水，收集含Hib莢膜多糖的洗脫峰，最終得到Hib莢膜多糖精糖原液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的純化方法，其特征在于，所述Hib莢膜多糖粗糖是通過對Hib樣本進(jìn)行處理得到的沉淀物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的純化方法，其特征在于，所述20mM磷酸鹽緩沖液的pH值為6. 9。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的純化方法，其特征在于， 所述高鹽緩沖液為由20mM磷酸鹽緩沖液和0. 2M氯化鈉組成的混合液體，混合液體pH值為 6. 9。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的純化方法，本方法使用羥基磷灰石進(jìn)行Hib莢膜多糖的純化，過程如下將Hib莢膜多糖粗糖溶解于20mm磷酸鹽緩沖液，將得到的Hib莢膜多糖粗糖溶液上樣于羥基磷灰石層析柱；使用20mm磷酸鹽緩沖液洗2個柱體積，收集流穿峰；用高鹽緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)，將收集的流穿峰用G-25葡萄糖凝膠柱進(jìn)行緩沖液置換，最終得到Hib莢膜多糖精糖原液。本發(fā)明的優(yōu)點在于采用羥基磷灰石進(jìn)行莢膜多糖的純化，避免了使用苯酚對環(huán)境和人體帶來的危害，并且得到的Hib莢膜多糖純度可達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。
文檔編號C08B37/00GK102558382SQ20121003724
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月17日
發(fā)明者伍長華, 關(guān)曉峰, 吳強, 羅力心 申請人:成都?xì)W林生物科技股份有限公司