專利名稱：一種溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)組分的制備技術(shù)，特別是一種溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的制備方法。
背景技術(shù)：
目前，蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)的研究受到了廣泛的關(guān)注。蛋白質(zhì)組學(xué)以細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動方式為研究對象，從更為深入的一個層次上去認(rèn)識生命活動的規(guī)律。研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能間的相互關(guān)系以及在不同生理、病理條件下蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，稱為功能蛋白組學(xué)(mctional proteomics)研究。功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究可以幫助我們認(rèn)識基因的功能，發(fā)掘與特定生理、病理條件相關(guān)的蛋白質(zhì)，構(gòu)建蛋白質(zhì)的功能網(wǎng)絡(luò)等。早期蛋白質(zhì)組學(xué)的研究范圍主要是指蛋白質(zhì)的表達(dá)模式(expressionprofile)，隨著學(xué)科的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究范圍也在不斷完善和擴充。具有重要功能的低豐度蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)翻譯后修飾、以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究都已越來越成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要部分。在目前功能基因尚不很清楚的情況下，發(fā)現(xiàn)功能蛋白有重要的意義。從組織和細(xì)胞中直接提取的蛋白質(zhì)，以人類細(xì)胞為例，種類高達(dá)上萬種，其中有高豐度蛋白質(zhì)和低豐度蛋白質(zhì)，高豐度蛋白質(zhì)與低豐度蛋白質(zhì)在濃度范圍上可以相差六個數(shù)量級甚至更高，樣品中低豐度蛋白質(zhì)含量太少，低于一般儀器的最低檢測限，造成低豐度蛋白質(zhì)難以檢測。但是，實際情況是，在生物體中承擔(dān)重要生命活動的蛋白質(zhì)往往都是低豐度蛋白質(zhì)，然而，低豐度蛋白質(zhì)極低的含量給后續(xù)的分析和檢測帶來困難，限制了人們對它們的研究和認(rèn)識，這一困難是目前已有的分離富集技術(shù)均無能為力的，要解決這個問題必須有新的思路。分子印跡技術(shù)，是制備對特定目標(biāo)分子(也稱模板分子、印跡分子)具有特異預(yù)定選擇性的高分子化合物——分子印跡聚合物的技術(shù)。分子印跡技術(shù)的原理模板分子與功能單體在合適的分散介質(zhì)中依靠相互作用力，形成可逆結(jié)合的復(fù)合物；再加入交聯(lián)劑，在光、熱、電場等作用以及引發(fā)劑和致孔劑輔助下形成既具有一定剛性又具有一定柔性的多孔三維立體功能材料，將模板分子有規(guī)律的包在其中；合成后，用一定方法把模板分子去除，即可獲得與模板分子互補的，有特異識別功能的三維孔穴，該孔穴可特異性識別模板分子。一般地，帶有多功能基團的小模板分子(相對分子質(zhì)量< 1000)能獲得親和性和特異性都較高的分子印跡聚合物。盡管目前分子印跡技術(shù)蓬勃發(fā)展，但是具有重要作用的功能蛋白質(zhì)印跡研究卻仍處于起步階段。磁性分離技術(shù)是依據(jù)物質(zhì)的磁性差異，在磁場作用力的驅(qū)動下，把磁性組分從非磁性組分混合物中分離出來的一種分離技術(shù)。由于生物體系中的絕大多數(shù)生物分子都是無磁性的，為了給欲分離的目標(biāo)生物分子賦予磁性，需要預(yù)先制備一種磁性載體顆粒作為運載工具，借助于磁性分離裝置，對目標(biāo)生物分子進(jìn)行負(fù)載、運載、卸載等分離操作，從而實現(xiàn)目標(biāo)生物分子的磁性分離過程。磁性分離載體可通過共聚、表面改性等化學(xué)反應(yīng)在粒子表面引入多種功能基團(-0H、-C00H、-CH0、-NH2等)，也可以通過共價鍵來結(jié)合酶、細(xì)胞、抗體等生物活性物質(zhì)；同時由于其具有磁性，可在外加磁場的作用下方便快速地分離和富集，這給目標(biāo)生物產(chǎn)品的分離帶來了革命性的發(fā)展，從而受到人們的廣泛關(guān)注和研究。溫敏性水凝膠的溫敏性是指凝膠能響應(yīng)溫度的變化而收縮或溶脹，且在最低臨界溶液溫度附近，體積往往發(fā)生很大的變化。N-異丙基丙烯酰胺的最低臨界溶液溫度在 32°C 34°C，接近于人體的體溫水平，是研究最多的一種溫敏性水凝膠。N-異丙基丙烯酰胺大分子鏈上同時具有親水性的酰胺基和疏水性的異丙基。當(dāng)溫度低于最低臨界溶液溫度時，其表現(xiàn)為以酰胺基為主的親水模式；當(dāng)溫度高于最低臨界溶液溫度時，其表現(xiàn)為以異丙基為主的疏水模式。通過調(diào)節(jié)溫度，可以實現(xiàn)對目標(biāo)物的有效分離和提純。迄今為止，溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的制備方法在國內(nèi)外鮮有報道，在理論上和方法上均屬于創(chuàng)新性研究。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對上述技術(shù)分析，提供一種溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的制備方法，該制備方法制備過程簡單、條件溫和、價格低廉、選擇性高，為復(fù)雜生物體系中高豐度蛋白質(zhì)組分的選擇性去除和富集提供了一種新的可行性方法。本發(fā)明的技術(shù)方案一種溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的制備方法，步驟如下
1)用水熱法合成粒徑為200nm的磁性納米球；2)通過凝膠-溶膠法在上述磁性納米球表面包覆一層厚度為20nm的硅層；3)將包硅的磁性納米球、功能單體、模板分子和交聯(lián)劑加入到Tris-HCl緩沖液中，得到反應(yīng)液；4)將上述反應(yīng)液在一定溫度下進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到聚合物；5)用洗脫液洗脫上述聚合物，即可制得溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球。所述水熱法合成磁性納米球的方法是，將1. 35g氯化鐵、3. 6g乙酸鈉和35mL乙二醇置于反應(yīng)釜中，200°C條件下反應(yīng)6h，固液用磁鐵分離后，將液體傾倒出來，固體產(chǎn)物用超純水洗滌至中性，真空干燥。所述凝膠-溶膠法在磁性納米球表面包覆硅層的方法是，將200mg磁性納米球、 80mL乙醇、30mL超純水、3mL氨水和2mL四乙氧基硅烷置于三口瓶中，常溫下反應(yīng)Mh，固液用磁鐵分離后，將液體傾倒出來，固體產(chǎn)物用超純水洗滌至中性，真空干燥。所述功能單體為N-異丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺和N-(3- 二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺的質(zhì)量比為3-10 1 1;交聯(lián)劑為N，N-亞甲基雙丙烯酰胺；模板分子為牛血清蛋白質(zhì)。所述包硅磁性納米球與Tris-HCl緩沖液的用量比為500mg/30mL。所述功能單體、模板分子和交聯(lián)劑在緩沖液中的重量百分比濃度分別為 26. 43%U1. 90%和 2. 14% 0所述聚合反應(yīng)的溫度為50°C，聚合時間為Mh。所述洗脫液為氯化鈉，其濃度為lmol/L，洗脫時間為4h。一種所述溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的應(yīng)用，用于復(fù)雜生物體系中高豐度蛋白質(zhì)組分的選擇性去除和富集。本發(fā)明的優(yōu)點是1)采用水熱法合成粒徑約為200nm的磁性納米球，粒徑均一，分散度高，超順磁性。作為載體，在外磁場作用下，可^內(nèi)實現(xiàn)固液快速分離，高效省時；2)采用凝膠-溶膠法使磁性納米球表面均勻包覆一層厚度約20nm的硅層，不僅可以使載體有很好的生物相容性，而且包硅磁性納米球表面的硅羥基有利于實現(xiàn)載體的進(jìn)一步接枝；幻采用表面分子印跡技術(shù)，使所得聚合物對特定的模板蛋白有專一的特定選擇性；4)引入了溫敏型功能單體一N-異丙基丙烯酰胺，使所得磁性蛋白質(zhì)印跡納米球可以通過溫度的改變來實現(xiàn)對特定蛋白質(zhì)的吸附和解吸；5)與現(xiàn)有的去除和富集牛血清蛋白質(zhì)的方法相比較，本發(fā)明材料成本低廉，合成過程簡便，僅需約5個小時就可以實現(xiàn)對實際樣品中牛血清蛋白質(zhì)的選擇性去除和富集。
圖1為采用水熱法合成粒徑為200nm的磁性納米球的透射電鏡圖。圖2為采用凝膠-溶膠法制得的硅層厚度為20nm的包硅磁性納米球的透射電鏡圖。圖3為表面分子印跡技術(shù)制得的溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的透射電鏡圖。
具體實施例方式一種溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的制備方法，包括如下步驟1)用水熱法合成粒徑為200nm的磁性納米球，方法是將1. 35g氯化鐵、3. 6g乙酸鈉和35mL乙二醇置于反應(yīng)釜中，200°C條件下反應(yīng)他，固液用磁鐵分離后，將液體傾倒出來，固體產(chǎn)物用超純水洗滌至中性，真空干燥，圖1為采用水熱法合成粒徑為200nm的磁性納米球的透射電鏡圖；幻通過凝膠-溶膠法在上述磁性納米球表面包覆一層厚度為20nm的硅層，方法是將200mg磁性納米球、80mL乙醇、30mL超純水、3mL氨水和2mL四乙氧基硅烷置于三口瓶中， 常溫下反應(yīng)Mh，固液用磁鐵分離后，將液體傾倒出來，固體產(chǎn)物用超純水洗滌至中性，真空干燥，圖2為采用凝膠-溶膠法制得的硅層厚度為20nm的包硅磁性納米球的透射電鏡圖；3)將500mg包硅磁性納米球置于三口燒瓶中，加入30mL Tris-HCl，再加入 200mgN-異丙基丙烯酰胺、5mg丙烯酰胺、17mgN-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺，18mg N， N-亞甲基雙丙烯酰胺和IOOmg牛血清蛋白質(zhì)，得到反應(yīng)液；4)將上述反應(yīng)液在50°C下，聚合Mh，得到聚合物；5)將上述聚合物用濃度為lmol/L為氯化鈉為洗脫液，洗脫4h，即得溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球，圖3為表面分子印跡技術(shù)制得的溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的透射電鏡圖。所制得的溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球，可應(yīng)用于復(fù)雜生物體系中高豐度蛋白質(zhì)組分的選擇性去除和富集。
權(quán)利要求
1.一種溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的制備方法，其特征在于步驟如下1)用水熱法合成粒徑為200nm的磁性納米球；2)通過凝膠-溶膠法在上述磁性納米球表面包覆一層厚度為20nm的硅層；3)將包硅的磁性納米球、功能單體、模板分子和交聯(lián)劑加入到Tris-HCl緩沖液中，得到反應(yīng)液；4)將上述反應(yīng)液在一定溫度下進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到聚合物；5)用洗脫液洗脫上述聚合物，即可制得溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的制備方法，其特征在于所述水熱法合成磁性納米球的方法是，將1. 35g氯化鐵、3. 6g乙酸鈉和35mL乙二醇置于反應(yīng)釜中，200°C條件下反應(yīng)6h，固液用磁鐵分離后，將液體傾倒出來，固體產(chǎn)物用超純水洗滌至中性，真空干燥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的制備方法，其特征在于所述凝膠-溶膠法在磁性納米球表面包覆硅層的方法是，將200mg磁性納米球、80mL乙醇、30mL 超純水、3mL氨水和2mL四乙氧基硅烷置于三口瓶中，常溫下反應(yīng)Mh，固液用磁鐵分離后， 將液體傾倒出來，固體產(chǎn)物用超純水洗滌至中性，真空干燥。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的制備方法，其特征在于所述功能單體為N-異丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺和N- (3- 二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺的質(zhì)量比為3-10 1 1;交聯(lián)劑為N，N-亞甲基雙丙烯酰胺；模板分子為牛血清蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的制備方法，其特征在于所述包硅磁性納米球與Tris-HCl緩沖液的用量比為500mg/30mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的制備方法，其特征在于所述功能單體、模板分子和交聯(lián)劑在緩沖液中的重量百分比濃度分別為26. 43%、11.90%和 2. 14%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的制備方法，其特征在于所述聚合反應(yīng)的溫度為50°C，聚合時間為Mh。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的制備方法，其特征在于所述洗脫液為氯化鈉，其濃度為lmol/L，洗脫時間為4h。
9.一種如權(quán)利要求1所述溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的應(yīng)用，其特征在于用于復(fù)雜生物體系中高豐度蛋白質(zhì)組分的選擇性去除和富集。
全文摘要
一種溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球的制備方法，用水熱法合成粒徑為200nm的磁性納米球；通過凝膠-溶膠法在上述磁性納米球表面包覆一層厚度為20nm的硅層；將包硅的磁性納米球、功能單體、模板分子和交聯(lián)劑加入到Tris-HCl緩沖液中，得到反應(yīng)液；將上述反應(yīng)液在一定溫度下進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到聚合物；用洗脫液洗脫上述聚合物，即可制得溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球。本發(fā)明的優(yōu)點是該溫敏型磁性蛋白質(zhì)印跡納米球?qū)⒎肿佑≯E的專一識別性、磁性納米球在外界磁場下迅速分離的特性和溫敏材料的溫度響應(yīng)性相結(jié)合，制備過程簡單、條件溫和、價格低廉，為復(fù)雜生物體系中高豐度蛋白質(zhì)組分的選擇性去除和富集提供了一種新的可行性方法。
文檔編號C08F220/54GK102532408SQ20111044335
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者何錫文, 張玉奎, 陳朗星, 高瑞霞 申請人:南開大學(xué)