專利名稱:殼聚糖衍生物及其制備方法與在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于源于天然且可生物降解的殼聚糖衍生物及其制備方法,以及其作為藥物載體在制備藥物中的應(yīng)用;具體為兩親性的殼聚糖衍生物及其制備方法,以及作為藥物納米載體,用于制備對難溶藥物有增溶作用的聚合物膠束。
背景技術(shù):
納米技術(shù)和可生物降解材料均是當(dāng)前發(fā)展藥物傳輸系統(tǒng)的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。聚合物膠束研究融合兩者的優(yōu)勢,即可生物降解,又可形成藥物納米載體。聚合物膠束與脂質(zhì)體、微球或微囊相比,聚合物膠束是由親水的殼和疏水的核組成,既具備形成親水膠體的藥用性能,又適合疏水藥物的增溶和包裹。而且,膠束粒徑小至納米級,其具有的由親水的殼和疏水的核組成特征使其可以達(dá)到體內(nèi)長循環(huán)、減少網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的吞噬的目的。聚合物可控制藥物釋放又可在體內(nèi)降解(M.Jones,J.Leroux,Eur JPharm Biopharm,1999,48(2)101-111.)目前對生物降解聚合物膠束的研究主要集中在合成高分子材料主要是兩親性A-B嵌段、A-B-A嵌段共聚物或接枝共聚物的結(jié)構(gòu)和膠束形成機(jī)理。A為親水性組分,B為疏水性組分。由于可供共聚A、B組分及可生物降解的組分較少,在選擇時存在較大困難,故疏水性組分通常局限在聚內(nèi)酯,如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)(S.A.Hagan,G.A.Coombes,M.C.Garnett,Langmuir.1996,122153-2161)或聚氨基酸如聚天冬氨酸、聚谷氨酸等(M.Yokoyama,M,Miyauchi,N.Yamada,J.Contro1.Rel.1990,11,269-2783);親水性組分則多為聚乙二醇(PEG)。然而,聚氨基酸作為疏水段可能導(dǎo)致免疫反應(yīng),且肽鍵很容易被體內(nèi)的酶斷裂,對控制釋藥速率不是理想的選擇。接枝共聚物主要是在親水性的鏈如PEG、聚丙烯酸側(cè)引入一些疏水基團(tuán)(J.Youngchang.Macromolecules.2000,33321-325)。膠束可通過化學(xué)偶聯(lián)連接藥物,而化學(xué)偶聯(lián)法在制備特定官能團(tuán)聚合物時困難較大,安全性較差。另外,無論嵌段共聚物或接枝共聚物的制備及表征均比較煩瑣,生產(chǎn)條件苛刻。
殼聚糖是可生物降解的天然來源的聚合物,具有良好的生物相容性,且來源廣泛,價格便宜。對于殼聚糖結(jié)構(gòu)改性的研究雖然很多,但是主要涉及親水性殼聚糖衍生物方面,例如O-,N-羧甲基殼聚糖(Marguerite R.,Pham L.D.,Claude G.et al.Int.J.Biol.Macromol.[J],1992,14122-128)、N-羧甲基殼聚糖(R.A.A.Muzzarelli,F(xiàn).Tanfani,M.Emanuelli,et al.Carbohydr.Res.1982,107199-214)、O-羧甲基殼聚糖(RiccardoA.A.Muzzarelli,Carbohydrate Polymer,1988,8(1),1-21)、N-磺酸化(K.R.Holme,A.S.Perlin.Carbohydr.Res.1997,302173-179)、N-季銨化(Zhishen J.,Dongfen S.,Weiliang X.Carbohydr.Res.2001,3331-6)等等。兩親性殼聚糖衍生物有2-羥基-3-(對壬基苯氧基)丙基-羧甲基殼聚糖(隋衛(wèi)平,陳國華,高先池等.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報,2001,22(1),133-135)等,但沒有作為藥用載體得到應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是用可生物降解的天然來源的殼聚糖作為原料,進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾,使其形成具有兩親性的聚合物分子,即一端含親水基、另一端含親脂基并且仍可在體內(nèi)進(jìn)行生物降解的聚合物,以適合用于藥物、與藥物組配或作為藥物載體,尤其是作為毒性小、不會產(chǎn)生溶血反應(yīng)的可靜脈注射給藥的藥物載體。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題還包括研究的兩親性質(zhì)的殼聚糖衍生物,不但要可用于難溶藥物的增溶和包裹,控制藥物釋放,而且可以在水中形成納米級膠束。由于由親水的殼和疏水的核組成的納米膠束,可以延長體內(nèi)循環(huán)、減少網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的吞噬,所以,最終提高治療效果。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題還包括可用作藥物載體的兩親性殼聚糖衍生物的制備方法,以及在制備藥物中的應(yīng)用。具體有可工業(yè)化應(yīng)用的制備方法;如何將研制的兩親性殼聚糖衍生物制備成適合藥用的膠束,以及如何將其制備成含有難溶藥物的膠束,尤其是毒性小、不會產(chǎn)生溶血反應(yīng)的含難溶藥物的聚合物膠束型藥物制劑。因?yàn)橹挥卸拘孕 ⒉粫a(chǎn)生溶血反應(yīng),才可以用于靜脈注射給藥。
為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明提供技術(shù)解決方案如下。
由下述通式表示的N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖 上述N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖,其特征在于優(yōu)選n=7;脫乙酰度為90~100%;N-辛基取代度為35~55%;磺酸基取代度為80~110%;其較好的脫乙酰度為95~98%;N-辛基取代度為45~50%;磺酸基取代度為90~100%。
前述N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖的制備方法,其特征在于用如下方法制備1)取殼聚糖加入甲醇或乙醇中,室溫攪拌,加入7~12C的長鏈烷基醛,反應(yīng)20~28小時后,加入KBH4水溶液,繼續(xù)攪拌8~12小時,生成N-長鏈烷基殼聚糖;2)取N-長鏈烷基殼聚糖加入DMF中攪拌8~12小時,再加入氯磺酸DMF液,在8~12℃和N2保護(hù)下反應(yīng)18~28h,制得N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖。
所述的制備方法,其較好的技術(shù)特征在于1)取殼聚糖加入甲醇中室溫攪拌,加入7~12C的長鏈烷基醛,反應(yīng)23~25小時后,加入KBH4水溶液,繼續(xù)攪拌10~11小時,生成N-長鏈烷基殼聚糖;2)取N-長鏈烷基殼聚糖加入DMF中攪拌9~10小時,再加入氯磺酸DMF液,在9~11℃和N2保護(hù)下反應(yīng)20~25h,制得N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖。
前述的制備方法,其特征在于生成N-長鏈烷基殼聚糖的反應(yīng)液用稀鹽酸液中和,用甲醇沉淀,過濾,干燥;生成N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖的反應(yīng)液,用NaOH液中和pH至7,過濾,濾液用透析袋(MWCO 10000)透析,冷凍干燥。
所述N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖的膠束制備方法,其特征在于將N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖與水按重量/體積比,以6~30∶1的比例溶解,其優(yōu)選比例為9~18∶1。
所述N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖的藥物組合物,其中含有治療有效量的難溶性藥物化合物和N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖。
一種含紫杉醇或環(huán)孢素A的藥物組合物,其特征在于基本上由治療有效量的紫杉醇或環(huán)孢素A與權(quán)利要求1~3之一所述N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖組成。
一種含紫杉醇或環(huán)孢素A的藥物組合物的制備方法,其特征在于將紫杉醇或環(huán)孢素A用藥學(xué)上可接受溶劑溶解后,與權(quán)利要求1~3之一所述N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖膠束混合后,經(jīng)室溫超聲處理,制得含治療有效量紫杉醇的粒徑為100~300nm的聚合物膠束。
N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖的合成路線圖解 本發(fā)明以殼聚糖為原料,m表示其聚合度。在殼聚糖的2-NH2接入疏水長鏈烷基(鏈長為7~12C),在6-OH進(jìn)行磺酸化(引入親水基),制得N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖,元素分析測得其脫乙酰度為90~100%;N-辛基取代度為35~55%;磺酸基取代度為80~110%;較好的乙酰度為95~100%;N-辛基取代度為45~50%;磺酸基取代度為90~100%。
為了獲得能夠形成聚合物膠束以及能夠包裹藥物尤其是難溶性藥物的聚合物膠束,除了考慮毒性、溶血反應(yīng)以外,必須篩選合適的能夠接入的疏水及親水性基團(tuán)。并不是所有只要形成親水親脂性的兩親性殼聚糖衍生物都適合作為藥物配體或藥物載體的,親水、親脂都有一個度,且親水、親脂基團(tuán)之間必須有一平衡,這平衡既與基團(tuán)親水、親脂程度有關(guān),亦與其所帶電荷有關(guān),還與其體積甚至立體結(jié)構(gòu)有關(guān)。
N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖的制備方法較詳細(xì)說明如下一、N-長鏈烷基-殼聚糖的制備(參見文獻(xiàn)Baba Y,Hirakawa H.Chem Lett 1992,10,1905-1908)取殼聚糖加入甲醇中室溫攪拌,加入8~12C的長鏈烷基醛,反應(yīng)20~28小時后,加入KBH4水溶液,繼續(xù)攪拌8~12小時,即生成N-長鏈烷基殼聚糖,反應(yīng)液用稀鹽酸液中和,用甲醇沉淀,過濾,濾渣即為N-長鏈烷基殼聚糖,干燥后,得到淺黃色粉末。
二、N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖的制備(參見文獻(xiàn)Hirano S,Tanaka Y,Hasegawa M,et al.Carbohydr.Res.1985,137,205-215)取N-長鏈烷基殼聚糖加入DMF中攪拌8~12小時,再加入氯磺酸DMF液,在8~12℃和N2保護(hù)下反應(yīng)18~28h,制得N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖。反應(yīng)液用NaOH液中和pH至7,過濾,濾液用透析袋(MWCO 10000)透析,以去除分子量小于10,000的小分子,冷凍干燥,得淺棕色N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖。
三、N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖膠束制備方法按每ml水中溶解6~30mg的N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖的比例,可以每ml水中溶解8~18mg的N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖,亦可以每ml水中溶解9~12mg的N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖,將制得的N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖溶于水中,制備成粒徑為100~300nm的N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖膠束。
四、N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖作為載體,制備含難溶藥物的藥物組合物N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖膠束形成后,將難溶性藥物如紫杉醇、環(huán)孢素A用適當(dāng)溶劑溶解,與N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖膠束混合,經(jīng)室溫超聲處理,制得粒徑為100~300nm的聚合物膠束。所謂適用溶劑,指藥學(xué)上使用的能溶解藥物的溶劑。
五、N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖作為載體制備的藥物組合物,對難溶藥物有增溶作用可使用N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖作為載體的難溶藥物有紫杉醇、環(huán)孢素AA、替尼泊甙、羥基喜樹堿、喜樹堿、長春酰胺、依托泊甙、尼莫地平、阿霉素、多西紫杉醇,燈盞花素、銀杏內(nèi)酯、水飛薊素、柔紅霉素、絲裂霉素、氨甲喋呤,尤其是對紫杉醇、環(huán)孢素AA、替尼泊甙、羥基喜樹堿、喜樹堿、長春酰胺、依托泊甙、尼莫地平、阿霉素、多西紫杉醇有增溶效果。
N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖膠束對難溶性藥物紫杉醇、環(huán)孢素A具有較好增溶作用,尤其是N-辛基-O-磺酸基殼聚糖對紫杉醇有明顯的增溶效果,當(dāng)其水溶液濃度為0.56%時,提高紫杉醇的溶解度達(dá)1.95~2.01mg/ml。
六、N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖作為載體較原料殼聚糖毒性低,且溶血反應(yīng)符合靜脈注射藥用輔料標(biāo)準(zhǔn)下述對于小鼠靜脈注射的急性毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明N-辛基-O-磺酸基殼聚糖急性毒性較原料殼聚糖有明顯降低。下述溶血實(shí)驗(yàn)表明N-辛基-O-磺酸基殼聚糖在用生理鹽水稀釋至適當(dāng)濃度,進(jìn)行靜脈注射給藥,不會引起機(jī)體的溶血反應(yīng)。
(一)載體急性毒性1.配制方法
載體靜脈注射溶液配置正確稱取N-辛基-O-磺酸基殼聚糖650mg,先用20ml生理鹽水將其溶解,然后加至26ml,得26ml濃度為25mg/ml的N-辛基-O-磺酸基殼聚糖注射溶液,以25mg/ml的藥液作為本次實(shí)驗(yàn)的最高濃度,并以1∶0.8的比例依此作遞減稀釋,配制20,16,12.8和10.24mg/ml共5個濃度的藥液,給藥體積為0.2ml/10g,單次iv給藥。將原料殼聚糖對照(400mg/kg),同上體積,單次iv給藥。
昆明種小白鼠,雌雄各半,18-22g,由東大醫(yī)學(xué)院動物中心提供,合格證為蘇動(質(zhì))97002。動物數(shù)N-辛基-O-磺酸基殼聚糖靜脈給藥組,10只/組,5個劑量組。原料殼聚糖對照1個劑量組。
(1).N-辛基-O-磺酸基殼聚糖靜脈給藥對小鼠的急性毒性小鼠50只,隨機(jī)分為5組,10只/組,受試前禁食12小時。根據(jù)預(yù)試,確定本次實(shí)驗(yàn)最高劑量為500mg/kg,并以1∶0.8的劑距依此遞減為400,320,256和204.8mg/kg共5個劑量組。
(2).殼聚糖原料對照400mg/kg,1個劑量組。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1).N-辛基-O-磺酸基殼聚糖靜脈給藥對小鼠的急性毒性較高劑量給藥后即進(jìn)入掙扎、昏迷,窒息而迅速死亡,中、低劑量給藥后多有短暫的呼吸抑制,呼吸困難、急促,部分小鼠最終也因肺部的病變死亡。死亡小鼠剖體檢查可見肺部不規(guī)則得出血性改變,稍晚死亡小鼠除肺部出血性改變外,部分可見肝臟脂肪樣變,余未見明顯異常。死亡原因可能系主要系肺部出血所致。本品小鼠靜脈給藥的死亡情況,LD50及95%可信限見表1,表2。
(2).殼聚糖原料對照400mg/kg,在給藥后8小時即全部死亡。
3.結(jié)論N-辛基-O-磺酸基殼聚糖小鼠靜脈注射的LD50及95%可信限分別為315.69(276.48~360.47)mg/kg。較原料殼聚糖有明顯降低。
表1、N-辛基-O-磺酸基殼聚糖小鼠靜脈注射的死亡記錄受試品劑量 動物每天動物死亡數(shù)(只)mg/kg 數(shù)(只) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14(天)500 10 4 6 0 0 0 0 0 0 0 00 000400 10 4 2 1 0 0 0 0 0 0 00 000320 10 0 2 0 1 1 0 0 0 0 00 000256 10 0 1 1 0 1 0 0 0 0 00 000204.8 10 0 0 1 0 0 0 0 0 0 00 000
表2、Bliss法計算A多糖小鼠靜脈注射的LD50及95%可信限受試品劑量 對數(shù)劑量動物數(shù) 死亡動物數(shù) 死亡率 機(jī)率單位 LD50值及95%可信限mg/kg (x) (只) (只) (%) (Y) (mg/kg)500 2.699 10 10 100 6.865400 2.602 10 770 5.513320 2.505 10 440 4.750 315.69256 2.408 10 330 4.486 (276.48~360.47)204.82.311 10 110 3.729(二)載體溶血試驗(yàn)1.試驗(yàn)方法常規(guī)制備2%的兔紅細(xì)胞懸液適量備用。進(jìn)行A,B,C三次溶血試驗(yàn),A,B,C三次試驗(yàn)內(nèi)容相同,但在A試驗(yàn)中N-辛基-O-磺酸基殼聚糖濃度為10mg/ml,C試驗(yàn)中載體濃度為1mg/ml(稀釋用0.9%生理鹽水),實(shí)驗(yàn)按表3數(shù)據(jù)進(jìn)行。
表3、載體10mg/ml,3mg/ml,1mg/ml三組溶液溶血試驗(yàn)試管編號1 2 3 45 62%紅細(xì)胞混懸液(ml)2.52.5 2.5 2.5 2.5 2.5生理鹽水(ml) 2.02.1 2.2 2.3 2.4 2.537℃恒溫半小時藥液(ml) 0.50.4 0.3 0.2 0.1 037℃恒溫4小時2000rpm,5min,540nm測定吸收度2.結(jié)果在N-辛基-O-磺酸基殼聚糖試驗(yàn)中,10mg/ml各管均可發(fā)生溶血反應(yīng),3mg/ml在第四、五管無明顯溶血,1mg/ml各管內(nèi)無溶血。
表4、載體10mg/ml,3mg/ml,1mg/ml三組溶液溶血試驗(yàn)結(jié)果
3.結(jié)論N-辛基-O-磺酸基殼聚糖在用生理鹽水稀釋至適當(dāng)濃度,進(jìn)行靜脈注射給藥,不會引起機(jī)體的溶血反應(yīng)。
綜上所述,本發(fā)明用可生物降解的天然來源的殼聚糖作為原料,進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾,使其形成具有兩親性的聚合物分子,即一端含親水基、另一端含親脂基并且仍可在體內(nèi)進(jìn)行生物降解的聚合物,適合用于藥物、與藥物組配或作為藥物載體,尤其是作為毒性小、不會產(chǎn)生溶血反應(yīng)的可靜脈注射給藥的藥物載體。
本發(fā)明研究的兩親性質(zhì)的殼聚糖衍生物,不但要可用于難溶藥物的增溶和包裹,控制藥物釋放,而且可以在水中形成納米級膠束。由于由親水的殼和疏水的核組成的納米膠束,可以延長體內(nèi)循環(huán)、減少網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的吞噬,所以,最終提高治療效果。
本發(fā)明研究了可用作藥物載體的兩親性殼聚糖衍生物的制備方法,以及在制備藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的兩親性殼聚糖衍生物,對難溶藥物有顯著增溶作用。本發(fā)明將研制的兩親性殼聚糖衍生物制備成適合藥用的膠束,并將其制備成含有難溶藥物的膠束,尤其是毒性小、不會產(chǎn)生溶血反應(yīng)的含難溶藥物的聚合物膠束型藥物制劑。
具體實(shí)施例方式
殼聚糖(南通雙林生物制品有限公司提供),脫乙酰度90%以上,粘均分子量60,000。
辛醛進(jìn)口試劑,F(xiàn)luka公司,含量>98%癸醛進(jìn)口試劑,F(xiàn)luka公司,含量>98%月桂醛進(jìn)口試劑,F(xiàn)luka公司,含量>98%硼氫化鉀上海申宇制藥原料廠,含量>99%氯磺酸上海亭新化工試劑廠,化學(xué)純透析袋(MWCO 10000)美國進(jìn)口。
其余試劑均為分析純和化學(xué)純。
儀器FTIR Nicolet Impact410型紅外光譜儀,KBr壓片;Bruker(AVACE)AV-300,AV-500核磁共振儀;Element Vario EL III元素分析儀。
實(shí)施例11、N-辛基殼聚糖的制備(參見文獻(xiàn)Baba Y,Hirakawa H.Chem Lett 1992,10,1905-1908)殼聚糖(1.0g)懸浮在50ml甲醇中室溫攪拌,加入辛醛(1.02g),繼續(xù)反應(yīng)24小時后,加入KBH4(0.5g)的5ml水溶液,繼續(xù)攪拌過夜,反應(yīng)液用2N的鹽酸溶液中和,用甲醇沉淀,過濾,濾渣用甲醇和水重復(fù)洗滌3次,用真空烘箱于60℃下干燥過夜,得淺黃色粉末N-辛基殼聚糖1.0g。
2、N-辛基-O-磺酸基殼聚糖的制備(參見文獻(xiàn)Hirano S,Tanaka Y,Hasegawa M,et al.Carbohydr.Res.1985,137,205-215)N-辛基殼聚糖(1.5g)懸浮在DMF(40ml)中機(jī)械攪拌過夜,氯磺酸(20ml),在0℃,N2保護(hù)和攪拌下,慢慢滴加至40ml DMF(N,N-二甲酰胺)中,滴加完畢,繼續(xù)攪拌1h。然后加入上述的N-辛基殼聚糖的DMF溶液,在100℃和N2保護(hù)下反應(yīng)24h。反應(yīng)液用20%NaOH中和pH至7,過濾,濾液用透析袋(MWCO 10000)在蒸餾水中透析四天,以去除分子量小于10,000的小分子,冷凍干燥,得淺棕色0.5g N-辛基-O-磺酸基殼聚糖。
FT-IR2957,2858,1467,1380,800cm-1(長鏈烷基),1260,1221 1002cm-1(O=S=O)1H-NMR(D2O)δ(ppm)3.0~3.2(m,2H)(-NH-CH2-(CH2)6-CH3);1.0~2.2(m,6H)(-NH-CH2-(CH2)6-CH3),0.81(tri,3H)(-NH-CH2-(CH2)6-CH3)。
13C-NMR(D2O)δ(ppm)13.5~13.7(-NH-CH2-(CH2)6-CH3);21.9~31.4(-NH-CH2-(CH2)6-CH3);4813(-NH-CH2-(CH2)6-CH3);55(C2),61.4(C6),66.8(C3),75.4(C5),76.4(C4),97(C1)。
元素分析測得脫乙酰化度為91.5%,N-辛基取代度為的取代度為50%,磺酸基的取代度為100%。[C6H8NO4(SO3H)1.6(H)0.815(C8H17)0.5(C2H3O)0.085·(H2O)1.7]nAnalC,31.88;N,3.54;H,5.77.FoundC,32.18;N,3.69;H,5.99。實(shí)施例21、N-癸基殼聚糖的制備用癸醛和殼聚糖反應(yīng),制備方法同N-辛基殼聚糖。2、N-癸基-O-磺酸基殼聚糖的制備用N-癸基殼聚糖和氯磺酸反應(yīng)制備,方法同N-辛基-O-磺酸基殼聚糖。FT-IR2950,2860,1462,1385,800cm-1(長鏈烷基),1260,1221 1002cm-1(O=S=O)。1H-NMR(D2O)δ(ppm)3.0~3.3(m,2H)(-NH-CH2-(CH2)8-CH3);1.0~2.5(m,8H)(-NH-CH2-(CH2)8-CH3),0.81(tri,3H)(-NH-CH2-(CH2)8-CH3)。
13C-NMR(D2O)δ(ppm)13.5~13.7(-NH-CH2-(CH2)8-CH3);22.3~34.2(-NH-CH2-(CH2)8-CH3);48.0(-NH-CH2-(CH2)8-CH3);55.3(C2),62.1(C6),65.9(C3),75.7(C5),77.1(C4),97.5(C1)。
元素分析測得脫乙?;葹?1.5%,N-癸基取代度為50%,磺酸基的取代度為100%。[C6H8NO4(SO3H)1.6(H)0.815(C10H21)0.5(C2H3O)0.085]nAnalC,36.96;N,3.86;H,5.88。FoundC,37.12;N,3.79;H,6.02。
實(shí)施例31、N-十二烷基-殼聚糖的制備用月桂醛和殼聚糖反應(yīng),制備方法同N-辛基殼聚糖。
2、N-十二烷基-O-磺酸基殼聚糖的制備用N-十二烷基殼聚糖和氯磺酸反應(yīng)制備,方法同N-辛基-O-磺酸基殼聚糖。
FT-IR2952,2865,1462,1385,810cm-1(長鏈烷基),1265,1221 1005cm-1(O=S=O)1H-NMR(D2O)δ(ppm)2.6.0~3.4(m,2H)(-NH-CH2-(CH2)10-CH3);0.8~3.3(m,6H)(-NH-CH2-(CH2)10-CH3),0.83(tri,3H)(-NH-CH2-(CH2)10-CH3)。
13C-NMR(D2O)δ(ppm)13.5~13.9(-NH-CH2-(CH2)10-CH3);22.1~33.5(-NH-CH2-(CH2)10-CH3);48.7(-NH-CH2-(CH2)10-CH3);55(C2),61.8(C6),67(C3),75.4(C5),76.9(C4)and97(C1)。
元素分析測得脫乙?;葹?1.5%,N-十二烷基的取代度為50%,磺酸基的取代度為100%。[C6H8NO4(SO3H)1.6(H)0.815(C12H25)0.5(C2H3O)0.085]nAnalC,38.77;N,3.71;H,6.20。FoundC,38.58;N,3.69;H,6.13。
實(shí)施例4N-辛基-O-磺酸基殼聚糖膠束的制備及膠束粒徑的測定(參見文獻(xiàn)Sung BL,Temo O,Kazunori K.J Pharm.Sci.1996,80(1)85-90)將N-辛基-O-磺酸基殼聚糖40mg溶解在7ml水中于50℃攪拌30min,然后室溫超聲30min后,用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments,Malvern,UK)在633nm,25℃,He-Ne激光測定膠束粒徑為100-300nm。
實(shí)施例51、包含紫杉醇的N-辛基-O-磺酸基殼聚糖膠束的制備
(1).透析法N-辛基-O-磺酸基殼聚糖40mg溶解在7ml水中于50℃攪拌30min。紫杉醇30mg溶解在1ml乙醇中。然后二者溶液混合,在室溫超聲30min后,用透析袋(MWCO 10000)在蒸餾水中室溫透析過夜,離心(3000rpm)5min,用0.22μm濾膜過濾,冷凍干燥。
(2).溶劑揮發(fā)法N-辛基-O-磺酸基殼聚糖40mg溶解在7ml水中于50℃攪拌30min,紫杉醇30mg溶解在1ml氯仿中。然后在室溫攪拌下將二者溶液混合,繼續(xù)攪拌過夜,使氯仿?lián)]發(fā),離心(3000rpm)5min,用0.22μm濾膜過濾,冷凍干燥。
(3).攪拌法N-辛基-O-磺酸基殼聚糖40mg溶解在7ml水中于50℃攪拌30min后,加入30mg紫杉醇,繼續(xù)室溫攪拌2小時,離心(3000rpm)5min,用0.22μm濾膜過濾,冷凍干燥。
2、N-辛基-O-磺酸基殼聚糖膠束中紫杉醇含量的測定(參見文獻(xiàn)張景京力、張志榮,羅恒。華西藥學(xué)雜志,2001,16(2),96-97)用HPLC(LC-6A,Shimadzu,Japan)流動相為甲醇∶乙睛∶水=30∶40∶32(v/v)。色譜柱為DiamohsilTMC18(250×4.6mm),柱子粒徑為5μm。流速為1.0ml/min,檢測波長為227nm(SPD-10A,UV detector,Shimadzu,Japan),柱溫為30℃。注射樣品體積為20μl。結(jié)果見表5。
實(shí)施例61、包含環(huán)孢素A的N-辛基-O-磺酸基殼聚糖膠束的制備(1).透析法N-辛基-O-磺酸基殼聚糖40mg溶解在7ml水中于50℃攪拌30min。環(huán)孢素A30mg溶解在1ml乙醇中。然后二者溶液混合,在室溫超聲30min后,用透析袋(MWCO 10000)在蒸餾水中室溫透析過夜,離心(3000rpm)5min,用0.22μm濾膜過濾,冷凍干燥。
(2).溶劑揮發(fā)法N-辛基-O-磺酸基殼聚糖40mg溶解在7ml水中于50℃攪拌30min,環(huán)孢素A30mg溶解在2ml氯仿中。然后在室溫攪拌下將二者溶液混合,繼續(xù)攪拌過夜,使氯仿?lián)]發(fā),離心(3000rpm)5min,用0.22μm濾膜過濾,冷凍干燥。
(3).攪拌法N-辛基-O-磺酸基殼聚糖40mg溶解在7ml水中于50℃攪拌30min后,加入30mg環(huán)孢素A,繼續(xù)室溫攪拌2小時,離心(3000rpm)5min,用0.22μm濾膜過濾,冷凍干燥。
2、N-辛基-O-磺酸基殼聚糖膠束中環(huán)孢素A含量的測定[參見文獻(xiàn)吳濤,郭健新,平其能等。藥學(xué)學(xué)報,2001,36(5),381-385]用HPLC(LC-6A,Shimadzu,Japan)流動相為甲醇∶乙醚∶水∶磷酸=350∶10∶140∶1(v/v)。色譜柱為Spherisorb C8(150×4.6mm),柱子粒徑為5μm。流速為1.2ml/min,檢測波長為210nm(SPD-10A,UV detector,Shimadzu,Japan),柱溫為70℃。注射樣品體積為20μl.。結(jié)果見表5。
表5不同膠束溶液中藥物含量
權(quán)利要求
1.由下述通式表示的N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖,其特征在于優(yōu)選n=7;脫乙酰度為90~100%;N-辛基取代度為35~55%;磺酸基取代度為80~110%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖,其特征在于脫乙酰度為95~98%;N-辛基取代度為45~50%;磺酸基取代度為90~100%。
4.權(quán)利要求1所述N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖的制備方法,其特征在于用如下方法制備1)取殼聚糖加入甲醇或乙醇中,室溫攪拌,加入7~12C的長鏈烷基醛,反應(yīng)20~28小時后,加入KBH4水溶液,繼續(xù)攪拌8~12小時,生成N-長鏈烷基殼聚糖;2)取N-長鏈烷基殼聚糖加入DMF中攪拌8~12小時,再加入氯磺酸DMF液,在8~12℃和N2保護(hù)下反應(yīng)18~28h,制得N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法,其特征在于1)取殼聚糖加入甲醇中室溫攪拌,加入7~12C的長鏈烷基醛,反應(yīng)23~25小時后,加入KBH4水溶液,繼續(xù)攪拌10~11小時,生成N-長鏈烷基殼聚糖;2)取N-長鏈烷基殼聚糖加入DMF中攪拌9~10小時,再加入氯磺酸DMF液,在9~11℃和N2保護(hù)下反應(yīng)20~25h,制得N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法,其特征在于生成N-長鏈烷基殼聚糖的反應(yīng)液用稀鹽酸液中和,用甲醇沉淀,過濾,干燥;生成N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖的反應(yīng)液,用NaOH液中和pH至7,過濾,濾液用透析袋(MWCO 10000)透析,冷凍干燥。
7.權(quán)利要求1所述N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖的膠束制備方法,其特征在于將N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖與水按重量/體積比,以6~30∶1的比例溶解,其優(yōu)選比例為9~18∶1。
8.含權(quán)利要求1~3之一所述N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖的藥物組合物,其中含有治療有效量的難溶性藥物化合物和N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖。
9.一種含紫杉醇或環(huán)孢素A的藥物組合物,其特征在于基本上由治療有效量的紫杉醇或環(huán)孢素A與權(quán)利要求1~3之一所述N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖組成。
10.一種含紫杉醇或環(huán)孢素A的藥物組合物的制備方法,其特征在于將紫杉醇或環(huán)孢素A用藥學(xué)上可接受溶劑溶解后,與權(quán)利要求1~3之一所述N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖膠束混合后,經(jīng)室溫超聲處理,制得含治療有效量紫杉醇的粒徑為100~300nm的聚合物膠束。
全文摘要
一種源于天然且可生物降解的N-長鏈烷基-O-磺酸基殼聚糖(I)及其制備方法,以及其作為毒性小、不會產(chǎn)生溶血反應(yīng)且對難溶藥物具增溶作用的納米載體,在制備靜脈注射藥物中的應(yīng)用;具體用于制備含難溶藥物如紫杉醇或環(huán)孢素A的聚合物膠束型藥物。
文檔編號C08B37/00GK1439655SQ0311298
公開日2003年9月3日 申請日期2003年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月14日
發(fā)明者平其能, 張燦, 張宏娟, 丁婭, 程耀 申請人:中國藥科大學(xué), 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司