專利名稱：螺旋藻多糖及其提取方法和在制備升白和抗癌藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及螺旋藻多糖，其提取方法以及在制備升白和抗癌藥物中的用途。
近幾十年來，國內(nèi)外對中藥材鈍頂螺旋藻進行了一系列的藥理和臨床研究，結(jié)果表明鈍頂螺旋藻具有升高白細胞、補血、提高機體免疫功能、調(diào)節(jié)血脂、抗癌、抗輻射損傷等多種藥理作用。
白細胞減少癥臨床頗為常見，它的發(fā)病原因很多，特別是在腫瘤病人的治療中，因術(shù)后體虛和放、化療對骨髓造血功能的毒性更為棘手，而當前中藥制劑的升白作用有待進一步提高，西藥又有一定的副反應。
雖然文獻報道了螺旋藻的升白作用，但并未單獨對螺旋藻多糖進行這方面的研究。本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，螺旋藻多糖具有顯著的升白細胞作用，其療效優(yōu)于升白安，尤其可用于放化療后的白細胞減少。而且，還具有顯著的抑制腫瘤的作用。
本發(fā)明的螺旋藻多糖提取物主要是在已知螺旋藻具有的藥理及臨床作用有效的基礎上，采用現(xiàn)代生物技術(shù)的理論和方法，從確有實效的單味螺旋藻提取有效部位而制成的具有較高水平的升白和抗腫瘤藥物。
用本發(fā)明方法制備的多糖提取物，多糖含量大于60％。質(zhì)量收率介于4.2～4.6％之間。
制備本發(fā)明的多糖提取物包括以下步驟A、多糖提取，采取稀堿溫浸提取法、水溶液溫浸提取法或鹽溶液溫浸提取法，優(yōu)選水溶液溫浸提取法；B、提取液調(diào)蛋白等電點，然后離心；C、離心液取上清液濃縮至一定濃度，采用乙醇沉淀，離心或過濾去除不溶物；D、上清液進行二次乙醇沉淀，再干燥，得螺旋藻多糖提取物。
關(guān)于多糖提取方法，可參閱張惟杰主編復合多糖生化研究技術(shù)，上?？茖W技術(shù)出版社，1987年。吳梧桐主編生物制藥工藝學，中國醫(yī)藥科技出版社，1993年，385頁。
其中提取一般用4-10倍，優(yōu)選約7-8倍量的提取液，在70-90℃，優(yōu)選約85℃的溫度下進行約7-10小時?？梢蕴崛?-3次。
蛋白等電點一般調(diào)至4-約6.5，優(yōu)選5.0左右。
離心速度通常在3000-7500轉(zhuǎn)/分之間，優(yōu)選約3600轉(zhuǎn)/分。
多糖的醇沉濃度在約50％～80％之間，優(yōu)選75％。
濃縮的倍數(shù)在2-6倍之間，優(yōu)選4倍。
多糖提取物優(yōu)選于60-70℃，優(yōu)選60℃，真空下(約0.090Mpa)干燥5-9h，優(yōu)選8h來進行干燥，如此可使多糖的含水量低于9％。但也可按普通方法進行干燥，但溫度不能太高。
本發(fā)明利用多糖溶于水的特點用熱水浸提，不僅可使多糖釋放、溶解，而且可縮短提取時間，防止腐敗并使蛋白變性。
根據(jù)蛋白在其等電點時溶解度最小的原理，提取液調(diào)pH5.0，沉淀提取液中大量雜蛋白，然后用離心的方法去除蛋白沉淀。
利用多糖難溶于高濃度乙醇的特點，用乙醇沉淀多糖；采用75％乙醇沉淀多糖同時還可以除去大量無機鹽、單糖、氨基酸和小分子量的多肽。
TLC及GC分析表明此多糖提取物中多糖主要由鼠李糖、巖藻糖、葡萄糖三種單糖組成。其摩爾比為(3.9∶1.4∶11.3)。分子量為3,390～2,907,623，該多糖主鏈以葡萄糖為主，各單糖存在多種聯(lián)結(jié)方式。通過顏色反應及紅外光譜分析證明，該多糖鏈上有糖醛酸基團及硫酸基團。含量測定參照中國藥典95版附錄IV分光光度法中比色法測定。
按照藥監(jiān)局新藥審批辦法要求研究了螺旋藻多糖提取物的初步穩(wěn)定性。在室溫下，對三個批號970710、970815、970912進行了0月、1月、2月、3月考察，考察項目為性狀、鑒別、水分、灰分、pH值、霉菌細菌總數(shù)及含量測定。各項指標均符合要求。結(jié)論螺旋藻多糖提取物在常溫下穩(wěn)定。
按《中藥藥效學研究指南》的要求進行螺旋藻多糖提取物主要藥效學試驗。試驗結(jié)果表明(1)螺旋藻多糖提取物15～60mg/kg/d，給藥12天呈劑量依賴性，使CTX所致小鼠骨髓DNA含量，有核細胞數(shù)和外周血白細胞數(shù)減少得以回升。作用優(yōu)于陽性藥升白安片的作用。
(2)螺旋藻多糖提取物12mg/kg/d預先給藥5天，并于照射第7天(骨髓抑制最明顯期)，總給藥26天，對60Co-γ射線導致的犬骨髓粒細胞系統(tǒng)有核細胞比率和外周血細胞數(shù)減少有明顯防治作用。
(3)螺旋藻多糖提取物對藥物性(CTX)和放射性60Co-γ射線骨髓造血功能損傷和抑制具有明顯的防治作用。
并進行毒性試驗，結(jié)果如下(1)小鼠急性毒性試驗螺旋藻多糖提取物水溶液以最高濃度、最大容積(大于5000mg/kg)給小鼠一次灌服和腹腔注射后，連續(xù)觀察7天，未見動物發(fā)生異常表現(xiàn)和死亡，其最大耐受量定為5000mg/kg。
(2)大鼠長期毒性試驗螺旋藻多糖提取物分別按240mg/kg、40mg/kg灌服，連續(xù)給藥90天及180天，給藥后，所有動物的一般狀況，血液常規(guī)、生化指標，主要臟器系數(shù)及組織形態(tài)學均未出現(xiàn)明顯異常變化。
(3)犬的長期毒性試驗螺旋藻多糖提取物分別按20mg/kg和200mg/kg喂飼犬，連續(xù)給藥6個月后，所有動物的一般狀況、心電圖、血液學及血液生化指標、病理組織學檢查均未出現(xiàn)明顯異常變化。
在500L搪玻璃罐內(nèi)加40kg 100目干燥藻粉和320L水，攪勻，夾套加熱至內(nèi)溫85℃，保溫提取8小時，提取過程中每0.5小時攪拌10分鐘以保持提取液均勻和各處溫度恒定。溫浸結(jié)束后冷卻到室溫，以4mol/L HCl和4mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH5.0，靜置1h待大量蛋白沉淀，SS-600離心機離心分離，離心殘渣采用初提條件再提取1次，離心棄去二次殘渣。清液合并后在500L薄膜濃縮設備中于70℃、0.085MPa真空度下減壓濃縮至原體積的四分之一，共得140L濃縮液(折算為d20從1.12g/ml升至1.28g/ml)。待溶液冷卻至室溫后，加392L 95％藥用乙醇使醇濃度為75％，靜置8小時以上，離心過濾，并以40L 95％藥用乙醇分兩次淋洗濾餅后濾干。沉淀(3.5kg)用15倍(52.5L)水溶解并過濾，濾液加入95％乙醇至乙醇濃度為75％沉淀多糖，靜置、過濾，用少量95％藥用乙醇洗滌沉淀。所得濕固體于60℃、0.090MPa真空度下干燥8h。質(zhì)量收率介于4.2～4.6％，即每1000g藻粉原料可得42～46g螺旋藻多糖提取物。以硫酸-苯酚法測定糖含量大于60％。
試驗一、多糖的質(zhì)量考察1、多糖的定性分析(1)稱取螺旋藻多糖提取物1g加50ml水，制成水溶液。取5ml于試管中加10％α-萘酚乙醇試液2-3滴，搖勻后沿管壁加濃硫酸0.5ml，于兩液界面間呈棕色環(huán)。
(2)另取上述糖溶液1ml于試管中加1ml 6％苯酚試液和5ml濃硫酸，搖勻，溶液呈棕黃色。
2、多糖含量測定取中試產(chǎn)品6個批號，分別精密稱定100mg，置己放有濾紙的小漏斗中，用95％熱乙醇(70℃)20ml洗滌，將殘留物及濾紙揮去乙醇后一并放入100ml錐形瓶中，加水40ml在電爐上加熱至微沸，攪拌溶解，再沿瓶壁加水30ml，沖下粘附其上的多糖，繼續(xù)加熱至微沸保持數(shù)分鐘，趁熱過濾至100ml量瓶中，用70℃水20ml分三次洗滌錐形瓶及濾紙，放冷后用水定容至刻度，從中吸取2.0ml加水稀釋至50ml，作為供試品溶液。另精密稱定101.2mg無水葡萄糖對照品溶于100ml量瓶中，加水至刻度，吸5.0ml再至100ml容量瓶中，定容至刻度。制備成每100ml含5.06mg葡萄糖的溶液作為對照品溶液。
精密吸取供試品溶液2.0ml；對照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml，對照品溶液不足2.0ml的加水至2.0ml；空白對照取水2.0ml代替葡萄糖溶液。分別加苯酚試液1.0ml，搖勻，再加濃硫酸5.0ml，搖勻，置冷水中冷卻5分鐘，再置沸水中加熱20分鐘，取出流水冷卻至室溫，按分光光度法(中華人民共和國藥典，1995年版一部附錄51頁)操作，在490nm處測定供試品和對照品的吸收度，以隨行的標準曲線計算含量，計算公式如下多糖含量％＝C×D×1/W×K×100其中C-由標準曲線計算得的樣品相當于葡萄糖的微克數(shù)，μgD-稀釋倍數(shù)W-樣品重量，μgK＝0.9，多糖系由n個單糖脫去n-1個H2O聚合而成，其質(zhì)量比約為1∶0.9。
葡萄糖標準曲線見表1。
表1葡萄糖標準曲線序號 1 2 3 4 5Cgluc，μg/ml 20.24 40.48 60.72 80.96 101.2A4900.117 0.230 0.352 0.470 0.598由表1中數(shù)據(jù)作線性回歸有C(μg/2ml)＝1.24+168A490，r＝0.9997六批中試產(chǎn)品中的多糖含量見表2。
表2樣品中多糖含量樣品編號 970710 970815 970912 991008 991020 991102稱重(mg) 101.7 98.7100.2 98.996.5102.4A4900.307 0.323 0.291 0.302 0.283 0.307含量(％) 64.970.362.565.763.264.4從表2可知6批產(chǎn)品的多糖含量均大于60％。試驗二、螺旋藻多糖提取物對環(huán)磷酰胺所致小鼠造血系統(tǒng)抑制的影響
1、對環(huán)磷酰胺(CTX)致外周血細胞減少的影響取小鼠60只，隨機分成6組。對照組每日灌胃SCMC(15ml/kg)，模型組同樣每日灌胃SCMC(15ml/kg)。在受試藥組中每日灌胃螺旋藻多糖提取物15mg、30mg或60mg/kg/d。陽性藥組用升白安片(無錫市第六制藥廠產(chǎn)品，批號960112)60mg/kg(SCMC混懸液)灌服。連續(xù)給藥12天。給藥第5天時，除對照組外，其余各組小鼠均給予腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)(上海第十二制藥廠，批號960501)100mg/kg，每日一次，連續(xù)3天，同時每天繼續(xù)給藥，于用藥第12天(總天數(shù))，從小鼠眼眶取血分別計數(shù)WBC、RBC并測定HB(表1)。結(jié)果表明環(huán)磷酰胺可使小鼠外周血白細胞(WBC)，紅細胞(RBC)和血紅蛋白(HB)明顯減少。螺旋藻多糖提取物15mg～60mg/kg/d給藥12天使降低的WBC升高15～60％，作用優(yōu)于陽性對照藥升白安片，對降低的RBC和HB無明顯升高作用。
2、對CTX致小鼠骨髓DNA含量和有核細胞數(shù)減少的影響取小鼠60只，分組給藥及模型方法同前。給藥第12天，取各組小鼠兩側(cè)股骨，分別進行骨髓DNA含量測定和有核細胞計數(shù)。
骨髓DNA含量測定取右側(cè)股骨，除凈軟組織。用0.005mol/LCaCl210ml將全部骨髓沖入離心管中。置4C冰箱30min，2500rpm離心15min。棄上清，將沉淀物加0.2mol/L HClO45ml充分混勻，90℃加熱15min，冷卻過濾，濾液用紫外分光光度計于260nm測定紫外吸收值(1OD260＝50μg/ml雙鏈DNA)，5ml最終濾液中DNA含量(每根股骨中DNA含量)＝OD值×50×5，單位μg/股骨。
骨髓有核細胞計數(shù)取左側(cè)股骨，用10ml 3％醋酸沖出骨髓細胞，在血細胞計數(shù)盤上計數(shù)四個大方格的細胞數(shù)，所得之數(shù)乘以2.5×104，即為一根股骨中的骨髓有核細胞數(shù)(注2.5×104表示稀釋倍數(shù)。四個大方格的體積為0.4mm3，10ml＝10000mm3，10000/0.4＝2.5×104)。
結(jié)果表明CTX可使小鼠骨髓DNA含量和有核細胞數(shù)明顯減少，呈現(xiàn)明顯的骨髓抑制作用。螺旋藻多糖提取物能使減少的骨髓DNA含量和有核細胞數(shù)得以回升，其療效優(yōu)于升白安片。
試驗三、螺旋藻多糖提取物對60Co-γ射線所致犬造血系統(tǒng)抑制的影響1、對60Co-γ射線所致犬外周血細胞減少的影響取雜種犬20只，隨機分為5組。常規(guī)飼養(yǎng)一周后進行實驗。給藥方式為將藥物干燥粉末夾在煮熟豬大腸段內(nèi)喂飼。正常對照組和60Co-γ照射組(模型組)僅喂給不夾藥物的豬腸。受試藥組用螺旋藻多糖提取物干燥粉末分別按3mg和12mg/kg夾入食物喂飼，陽性藥組喂飼升白安片(12mg/kg)。上述給藥每日一次，連續(xù)26天。給藥第5天用60Co-γ射線對屏蔽骨盆犬照射6.5Gy(劑量率為100倫/分)。具體方法為照射前用20×10×5(cm，長×寬×高)鉛磚7塊，平放于骨盆前2cm處，60Co-γ射線雙側(cè)照射(照射另一側(cè)時亦同法屏蔽骨盆)。動物無屏蔽處組織吸收劑量為6.5Gy。照射后繼續(xù)給藥。并分別于照射后第7、14和21天用注射器在前肢皮下頭靜脈處取血，分別計數(shù)WBC，RBC和測定HB，結(jié)果表明60Co-γ射線可使犬外周血WBC、RBC和HB降低，以照射后第7天最明顯。60Co-γ照射組(模型組)WBC下降62.5％，RBC下降26.4％，HB下降18.9％。螺旋藻多糖提取物12mg/kg使降低的WBC、RBC和HB分別升高39.5％、24％和20％。
2、對60Co-γ射線所致犬骨髓有核細胞減少的影響取犬20只，分組，給藥及模型方法同前。于照射后第7、14和21天分別于股骨下端后腘肌面，用16號骨髓穿刺針穿入骨髓腔并吸取骨髓液，推成數(shù)張骨髓片，瑞氏染色，在油鏡下檢查骨髓象。結(jié)果表明60Co-γ射線照射后7天骨髓象粒系和紅系呈明顯抑制狀態(tài)。螺旋藻多糖提取物12mg/kg能明顯升高降低的粒細胞系統(tǒng)有核細胞比率(升高250％，P＜0.01)，3mg/kg劑量組雖升高粒系31％，但差異不顯著。螺旋藻多糖提取物12mg/kg組亦能使降低的紅細胞系統(tǒng)有核細胞比率升高50％，但差異不顯著，結(jié)果見表3。
表3螺旋藻多糖提取物對60Co-γ射線所致犬骨髓造血細胞減少的影響(x±s)
注①有核細胞比率％＝有核細胞(個)/成熟紅細胞(個)×100％(每張骨髓片計數(shù)200個有核細胞)。
②與正常對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01③與60Co照射組比較ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01④有核細胞比率％＞10％即為正常骨髓象(或增年活躍骨髓象)結(jié)論螺旋藻多糖提取物(PSP)15～60mg/kg/d，給藥12天呈劑量依賴性使CTX所致小鼠骨髓DNA含量，有核細胞數(shù)和外周血白細胞數(shù)減少得以回升。作用優(yōu)于陽性藥升白安片的作用。
螺旋藻多糖提取物(PSP)12mg/kg/d預先給藥5天，并於照射第7天(骨髓抑制最明顯期)，總給藥26天，對60Co-γ射線導致的犬骨髓細胞系統(tǒng)有核細胞比率和外周血細胞數(shù)減少有明顯防治作用。
螺旋藻多糖提取物(PSP)對藥物性(CTX)和放射性(60Co-γ射線)骨髓造血功能損傷和抑制具有明顯的防治作用。
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權(quán)利要求
1.螺旋藻多糖提取物，特征在于采用以下步驟制備A、多糖提?。籅、提取液調(diào)蛋白等電點，然后離心；C、離心液取上清液濃縮至一定濃度，采用乙醇沉淀，離心或過濾去除不溶物；D、上清液進行二次乙醇沉淀，再干燥，得螺旋藻多糖提取物。
2.權(quán)利要求1的螺旋藻多糖提取物，其中多糖提取采用稀堿溫浸提取法、水溶液溫浸提取法或鹽溶液溫浸提取法進行。
3.權(quán)利要求1的螺旋藻多糖提取物，其中多糖提取采用水溶液溫浸提取法進行。
4.權(quán)利要求1的螺旋藻多糖提取物，其中所述提取用7-9倍量的提取液，在70-90℃的溫度下進行約7-10小時。
5.權(quán)利要求1的螺旋藻多糖提取物，其中所述蛋白等電點調(diào)至4-約6.5，優(yōu)選5.0左右。
6.權(quán)利要求1的螺旋藻多糖提取物，其中所述離心的速度在3000-7500轉(zhuǎn)/分之間。
7.權(quán)利要求1的螺旋藻多糖提取物，其中所述多糖的醇沉濃度為75％。
8.權(quán)利要求1的螺旋藻多糖提取物，其中所述濃縮的倍數(shù)在2-6倍之間。
9.權(quán)利要求1的螺旋藻多糖提取物，其中干燥于60-70℃、一定的真空度下進行5-9小時。
10.螺旋藻多糖在制備升白藥物中的用途。
11.螺旋藻多糖在制備治療腫瘤的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及螺旋藻多糖，提取方法和在制備升白和抗腫瘤藥物中的用途。其中制備方法包括以下步驟A、多糖提??；B、提取液調(diào)蛋白等電點，然后離心；C、離心液取上清液濃縮至一定濃度，采用乙醇沉淀，離心或過濾去除不溶物；D、上清液進行二次乙醇沉淀，再干燥，得螺旋藻多糖提取物。本發(fā)明的多糖提取物多糖含量在60％以上，對腫瘤放化療的骨髓造血功能損傷和抑制具有明顯的防治作用，尤其升白作用優(yōu)于升白安。
文檔編號C08B37/00GK1397567SQ0212589
公開日2003年2月19日 申請日期2002年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月1日
發(fā)明者殷鴻萍, 懷化 申請人:安徽古井集團九方制藥有限公司