用于治療骨疾病和病癥的針對rank-l的氨基酸序列以及包括其的多肽的制作方法

用于治療骨疾病和病癥的針對rank-l的氨基酸序列以及包括其的多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及針對RANK-L的氨基酸序列，以及包括一個或多個所述氨基酸序列或基本上由其組成的化合物或構(gòu)建體、且特別是蛋白和多肽。本發(fā)明還涉及編碼所述氨基酸序列和多肽的核酸，用于制備所述氨基酸序列和多肽的方法；表達或能夠表達所述氨基酸序列或多肽的宿主細胞；包括所述氨基酸序列、多肽、核酸和/或宿主細胞的組合物、且特別是藥物組合物；和所述氨基酸序列或多肽、核酸、宿主細胞和/或組合物的應(yīng)用，特別是預(yù)防、治療或診斷目的的應(yīng)用。
【專利說明】用于治療骨疾病和病癥的針對RANK-L的氨基酸序列以及 包括其的多肽
[0001] 本申請是國際申請?zhí)朠CT/EP2008/056383，國際申請日2008年5月23日，中國申 請?zhí)?00880100072. 6,發(fā)明名稱為"用于治療骨疾病和病癥的針對RANK-L的氨基酸序列以 及包括其的多肽"的分案申請。
[0002] 本發(fā)明涉及針對（如本文所定義）核因子κ B配體的受體激活劑（RANK-L，還稱為 腫瘤壞死因子相關(guān)的、激活-誘導(dǎo)的細胞因子（TRANCE)，破骨細胞分化因子（0DF)，護骨蛋 白（osteoprotegerin)配體（0PG-L)或腫瘤壞死因子超家族成員ll(TNFSFll))的氨基酸 序列，以及包括一個或多個所述氨基酸序列或基本上由其組成的化合物或構(gòu)建體、且特別 是蛋白和多肽（在本發(fā)明還分別稱為"本發(fā)明的氨基酸序列"，"本發(fā)明的化合物"，和"本發(fā) 明的多肽"）。
[0003] 本發(fā)明還涉及編碼所述氨基酸序列和多肽的核酸（在本發(fā)明還稱為"本發(fā)明的核 酸"或"本發(fā)明的核苷酸序列；涉及制備所述氨基酸序列和多肽的方法；涉及表達或能夠 表達所述氨基酸序列或多肽的宿主細胞；涉及包括所述氨基酸序列、多肽、核酸和/或宿主 細胞的組合物特別是藥物組合物，并且涉及所述氨基酸序列或多肽、核酸、宿主細胞和/或 組合物的應(yīng)用，特別是用于預(yù)防、治療或診斷目的如本發(fā)明所提及的預(yù)防、治療或診斷目的 的應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明的其它方面、實施方案、優(yōu)點和應(yīng)用將從本發(fā)明的進一步描述中變得清楚。
[0005] 骨的重塑（更新）是這樣的過程，即通過該過程不斷地吸收（去除）和形成（替 換）成人骨骼。骨的重塑包括通過成骨細胞合成骨基質(zhì)和其通過破骨細胞的再吸收。破骨 細胞，來源于造血細胞，是巨噬細胞組織的獨特形式，其具有再吸收骨組織的能力。成骨細 胞是具有分泌骨膠原蛋白能力的專門的成纖維細胞。在連接骨形成和骨再吸收過程的這些 骨細胞活動之間存在精巧的協(xié)調(diào)作用。
[0006] 骨重塑由RANK-L/RANK和RANK-L假受體0PG之間的平衡控制。RANK-L及其受體 RANK是破骨細胞發(fā)育和活化所必需的。0PG，一種分泌的蛋白，是破骨細胞成熟和破骨細胞 活化的有效抑制劑。在正常的骨體內(nèi)平衡中，RANK-L和0PG參與緊密控制破骨細胞由單核 細胞前體生成的細胞因子軸。RANK-L，其由成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞表達，結(jié)合其功能受體 RANK，以刺激由前體細胞分化破骨細胞和成熟的破骨細胞的增殖和活性。0PG，其由成骨細 胞、基質(zhì)細胞、樹突細胞和巨核細胞表達，通過作用為RANK-L的可溶假受體而限制該過程。
[0007] TNF家族分子RANK-L由在人染色體13ql4上的單一基因（rankl)編碼。RANK-L mRNA在骨和骨髓中、以及在淋巴組織（淋巴結(jié)，胸腺（thumus)，脾，胎兒肝臟，和派伊爾小結(jié) (Peyer's patches))中以最高水平表達（Anderson 等，1997,Nature (自然）390 :175-179 ; Wong 等，1997, J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志）272 :25190-25194 ;Lacey 等，1998, Cell (細 胞）93 :165-176 ;Yasuda 等，1998, Proc. Natl. Acad. Sci.USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報）95 : 3597-3602)。RANK-L mRNA的可變剪接允許表達為316或270個氨基酸的II型跨膜糖蛋白 或 243 個氨基酸的可溶配體（Kong 等，1999, Nature (自然）397:315-323 ;Nagai 等，2000， Biochem Biophys. Res. Commun.(生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊）269:532-536)。另 夕卜，RANK-L可以通過金屬蛋白酶、包括TNF-α轉(zhuǎn)化酶由其膜結(jié)合狀態(tài)釋放（Lum等，1999， J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志）274 :13613-13618)。RANK-L的所有4種同種型締合成能夠 促進破骨細胞生成的三聚體分子。
[0008] RANK (NF κ B的受體激活劑，還稱為TRANCE-R，0DAR，或TNFRSF11A)，其在前破骨細 胞（preosteoclastic cell)上表達，是這些細胞上關(guān)于RANK-L的唯一受體（Li等，2000， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報）97 :1566-1571)。RANK-L 激活 RANK 之后 是其與TNF受體-相關(guān)（TRAF)家族成員相互作用，激活核因子（NF)-kB和c-Fos，JNK， c_src，和絲氨酸 / 蘇氨酸激酶 Akt/PKB (Anderson 等，1997，Nature (自然）390 :175-179 ; Hsu 等，1999, Proc. Acad. Sci. USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報）96 :3540-3545)。
[0009] 0PG(護骨蛋白；"骨保護劑";還稱為破骨細胞生成抑制因子（0CIF))是一種由激 活的成骨細胞產(chǎn)生并釋放的可溶的、110-kDa、二硫鍵連接的、同源二聚體糖蛋白（Simonet 等，1997, Cell (細胞）89 :309-319)，具有與TNF受體家族的同源性，其作用為RANK-L的假 受體，且與RANK競爭RANK-L的結(jié)合。因此，0PG是破骨細胞成熟和破骨細胞活化的有效抑制 劑（Simonet 等，1997, Cell (細胞）89 :309-319 ;Lacey 等，1998, Cell (細胞）93 :165-176 ; Kong等，1999, Nature (自然）397 :315-323)，由此減少骨的再吸收。
[0010] 在 Khosla, (2001Endocrinology (內(nèi)分泌學(xué)）142 :5050-5055)，Holstead Jones 等，（2002，Ann.Rheum.Dis.(年度風(fēng)濕?。?1(增刊 II) :ii32-ii39)，Bezerra 等，（2005， Brazilian J. Med. Biol. Res.(巴西醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究雜志）38:161-170)和 McClung(2006， Current Osteoporosis Reports(當(dāng)代骨質(zhì)疏松癥報告）4:28-33)中記述了 0PG/RANK-L/ RANK系統(tǒng)作為骨形成和破壞的調(diào)節(jié)劑的更詳細的概述。
[0011] 當(dāng)在骨的重塑活動的再吸收和形成成分之間存在不平衡時（骨體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的解 離），發(fā)生一些骨的病癥。破骨細胞和成骨細胞活性之間的不平衡可以由廣泛種類的激素改 變或炎性和生長因子的混亂引起，諸如例如改變的0PG和RANK-L之間的平衡。當(dāng)骨的再吸 收大于骨的形成時，隨著時間在骨中存在凈損失。這可以最終導(dǎo)致低骨量（骨量減少）或 骨質(zhì)疏松。當(dāng)骨形成超過再吸收時，在骨質(zhì)中存在凈增加（骨硬化癥）。
[0012] 由于較高的RANK-L、較低的0PG或二者引起的過量骨損失或破壞已經(jīng)參與許多 疾病狀態(tài)，包括絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（Eghbali-Fatourechi等，2003，Journal of Clinical Investigation (臨床研究雜志）111 : 1221-1230 ;Tsangari 等，2004，Bone (骨）35 : 334-342 ;Abdallah 等，2005，Calcified Tissue International(國際 |丐化組織）76 : 90-97)，原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進（Stilgren 等，2004, Bone(骨）35 :256-265 Johne 11 等，2005, Journal of Bone and Mineral Research(骨和礦物研究雜志）20:1185-1194), 骨的佩吉特病（Reddy 2004，Journal of Cellular Biochemistry (細胞生物化學(xué)雜 志）93 :688_696)，轉(zhuǎn)移骨病（metastatic bone disease) (Brown 2004, Cancer Treatment and Research(癌癥治療和研究）118:149_172)，骨髓瘤（Okada 等，2003，Clinical and Experimental Metastasis(臨床和實驗性轉(zhuǎn)移）20 :639_646)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Crotti 等，2002，Annals of the Rheumatic Diseases (風(fēng)濕病年報）61 :1047-1054)和一些其他 的代謝或炎性骨和關(guān)節(jié)病癥（Locklin等，2001，Bone(骨）28(增刊）：S80 ;Lewiecki 2006， Expert Opin. Biol. Ther.(生物學(xué)治療的專家觀點）6 :1041-1050)。
[0013] 在十多年以來已經(jīng)可以獲得降低骨折危險的藥學(xué)試劑。抗分解代謝藥 (anticatablolic drugs)(雌激素，雙磷酸脂，降鈣素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑）降低骨 的再吸收，而同化激素類藥，諸如重組的人甲狀旁腺激素（PTH)，增加骨的形成和骨的尺寸。 雙磷酸脂種類的藥物是最常用于治療骨質(zhì)疏松癥的一種。盡管該藥物種類通常是非常安全 的，但是口服給藥是復(fù)雜的，且已經(jīng)在少量的臨床實踐患者中與胃腸不利事件相關(guān)。臨床試 驗正評估增加靜脈內(nèi)雙磷酸脂給藥的時間間隔。
[0014] 最近的發(fā)現(xiàn)，即0PG/RANK-L/RANK系統(tǒng)作為骨的疾病和病癥如骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機 理中的關(guān)鍵調(diào)控因子，為治療劑提供了特有的祀標。在實驗室動物和在人類中，0PG的施 用形式顯著抑制破骨細胞活性，且提高骨強度（Bekker等，2001，J. Bone Miner. Res.(骨骼 礦物質(zhì)研究雜志）16 :348-360 ;Campagnuolo 等，2002，Arthritis Rheum.(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎）46:1926-1936 ;Bezerra 等，2005，Brazilian J. Med. Biol. Res.(巴西醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究 雜志）38:161-170 ;McClung 2006，Current Osteoporosis Reports (現(xiàn)代骨質(zhì)疏松癥報 告）4 :28-33)。在早期的人類研究中，針對RANK-L的完整人抗體（denosumab)減少骨的 更新，且提高骨密度（Body 等，2003, Cancer (癌癥）97:887-892 ;Bekker 等，2004, J. Bone Miner. Res.(骨豁礦物質(zhì)研究雜志）19:1059-1066 ;McClung 2006, Current Osteoporosis Reports (現(xiàn)代骨質(zhì)疏松癥報告）4 :28-33 ;Lewiecki 2006，Expert Opin. Biol. Ther.(生 物學(xué)治療的專家觀點）6 :1041-1050 ;McClung等，2006, N. Engl. J. Med.(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜 志）354 :821-831)。然而，這樣的完整抗體面臨完整大小抗體的缺點，如高的生產(chǎn)成本，低 的穩(wěn)定性，和它們的大尺寸，其例如干擾它們接近某些隱藏的表位。
[0015] 納米抗體比常規(guī)四鏈抗體更有效且更穩(wěn)定，其導(dǎo)致：⑴更低的劑型，更低頻率的 給藥導(dǎo)致更少的副作用；和（2)提高的穩(wěn)定性，導(dǎo)致對施用途徑的更寬泛的選擇，除了靜脈 內(nèi)途徑之外，包括口服或皮下途徑和緩慢釋放制劑。
[0016] 因為它們的小尺寸，納米抗體具有穿過膜和穿透彼此不接近的生理區(qū)室、組織和 器官、更大的多肽和蛋白質(zhì)的能力。納米抗體可以，例如，容易地穿透到骨基質(zhì)中，使得它們 適合用于治療骨疾病和病癥。
[0017] 納米抗體的小尺寸還使得它們理想的適合將它們加工成多價或多特異性的多肽。 與可以僅結(jié)合RANK-L三聚體的一個亞基的完整抗體相反，二價或三價的多肽（分別基于兩 個或三個針對RANK-L的納米抗體），能夠分別結(jié)合三聚體RANK-L分子的2或3個亞基，且 可以因為它們更高的功效而是有利的。
[0018] 本發(fā)明的氨基酸序列、多肽和組合物通?？梢杂脕碚{(diào)節(jié)，且特別是抑制和/或防 止RANK-L與RANK結(jié)合，且因此以調(diào)節(jié)，且特別是抑制或防止由RANK-L，RANK和/或0PG介 導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)其中包括RANK-L和/或RANK的生物學(xué)途徑，和/或從而調(diào)節(jié)與所 述信號傳導(dǎo)或這些途徑相關(guān)的生物學(xué)機制、反應(yīng)和作用。與在相同條件下，但不存在本發(fā)明 的氨基酸序列、納米抗體或多肽的條件下的RANK-L與RANK的結(jié)合和/或由RANK-L、RANK 和/或0PG介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)相比較，RANK-L與RANK的結(jié)合和/或由RANK-L、RANK和/或 0PG介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)可以被抑制和/或防止至少1%，優(yōu)選至少5%，諸如至少10%或至少 25%，例如至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，或90%或更多。
[0019] 在本發(fā)明的另一方面中，本發(fā)明的氨基酸序列、多肽和組合物可以用來調(diào)節(jié)，且 特別是抑制和/或防止RANK-L與0PG結(jié)合，且因此以調(diào)節(jié)（抑制和/或防止或加強）由 RANK-L，RANK和/或0PG介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)其中包括RANK-L，RANK和/或0PG的生 物學(xué)途徑，和/或從而調(diào)節(jié)與所述信號傳導(dǎo)或這些途徑相關(guān)的生物學(xué)機制、反應(yīng)和作用。本 發(fā)明的氨基酸序列、多肽和組合物可以是RANK-L和/或所述信號傳導(dǎo)的激動劑或拮抗劑。 它們可以以與OPG相同的方式抑制RANK/RANK-L介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，或者它們可以完全或部 分地防止OPG抑制RANK/RANK-L介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。與在相同條件下，但不存在本發(fā)明的氨 基酸序列、納米抗體或多肽的條件下，RANK-L與OPG的結(jié)合和/或由RANK-L、RANK和/或 OPG介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)相比較，RANK-L與OPG的結(jié)合和/或由RANK-L、RANK和/或OPG介導(dǎo) 的信號傳導(dǎo)可以被抑制和/或防止至少1 %，優(yōu)選地至少5%，諸如至少10 %或至少25%， 例如至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，或90%或更多。
[0020] 在本發(fā)明的另一個方面中，本發(fā)明的氨基酸序列、多肽和組合物可以用來調(diào)節(jié) (抑制和/或防止或加強）破骨細胞的分化和/或增殖。與在相同條件下，但不存在本發(fā) 明的氨基酸序列、納米抗體或多肽的條件下的破骨細胞的分化和/或增殖相比較，破骨細 胞的分化和/或增殖可以分別增加或減少至少1 %，優(yōu)選地至少5%，諸如至少10 %或至少 25%，例如至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，或90%或更多。
[0021] 在本發(fā)明的另一個方面中，本發(fā)明的氨基酸序列、多肽和組合物可以用來調(diào)節(jié)骨 重塑。與在相同條件下，但不存在本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽的條件下的骨重塑 相比較，骨重塑可以被調(diào)節(jié)至少1 %，優(yōu)選地至少5 %，諸如至少10 %或至少25 %，例如至少 50%，至少60%，至少70%，至少80%，或90%或更多。
[0022] 因此，本發(fā)明的多肽和組合物可以用于預(yù)防和治療（如本文定義那樣）骨疾病和 病癥。通常，"骨疾病和病癥"可以定義為這樣的疾病和病癥，即其可以分別通過向需要其的 受試者（即，患有所述疾病或病癥或其至少一種癥狀和/或處于易患或發(fā)展所述疾病或病 癥的危險中）適當(dāng)施用本發(fā)明的多肽或組合物（且特別地，其藥物活性量的）和/或已知 針對RANK-L或其中包括RANK-L的生物學(xué)途徑或機制有活性的活性成分（principle)(且 特別地，其藥物活性量的）而得到預(yù)防和/或治療。
[0023] 骨疾病和病癥包括與骨形成和再吸收的調(diào)節(jié)相關(guān)的疾病和病癥。特征為凈骨損失 (骨再吸收超過骨形成）的骨疾病和病癥也稱為骨質(zhì)減少病癥，其包括骨質(zhì)減少癥、骨質(zhì)疏 松癥和骨質(zhì)溶解，且其特征在于過量的和/或不需要的由RANK-L介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。調(diào)節(jié)且 特別是抑制和/或防止RANK-L與RANK結(jié)合的本發(fā)明的多肽和組合物作用為拮抗劑，且通 常用于預(yù)防和治療（如本文定義那樣）特征為凈骨損失的骨疾病和病癥。此外，調(diào)節(jié)且特 別是抑制和/或防止RANK-L與0PG結(jié)合的本發(fā)明的多肽和組合物可以作用為拮抗劑，且通 常用于預(yù)防和治療（如本文定義那樣）特征為凈骨損失的骨疾病和病癥。
[0024] 特征為凈骨量增加的骨疾病和病癥稱為骨硬化癥，且特征在于極少的由RANK-L 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。調(diào)節(jié)且特別是抑制和/或防止RANK-L與0PG結(jié)合的本發(fā)明的多肽和組 合物可以作用為激動劑，且通常用于預(yù)防和治療（如本文定義那樣）特征為凈骨量增加的 骨疾病和病癥。
[0025] 基于本文的公開內(nèi)容，所述骨疾病和病癥的實例對于熟練的技術(shù)人員將是清楚 的，且例如，包括下述疾病和病癥：骨質(zhì)疏松癥（McClung 2006，Current Osteoporosis R印orts(現(xiàn)代骨質(zhì)疏松癥報告）4 :28-33)，其包括但不限于，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，內(nèi)分 泌性骨質(zhì)疏松癥（包括但不限于，甲狀腺機能亢進，甲狀旁腺功能亢進（Anandarajah和 Schwarz 2006, J. Cell Biochem.(細胞生物化學(xué)雜志）97 :226-232)，Cushing' s 綜合征， 和肢端肥大癥），遺傳和先天形式的骨質(zhì)疏松癥（包括但不限于，成骨不全，高胱氨酸尿癥， Menkes'綜合征，Riley-Day綜合征），由于肢體固定導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥，糖皮質(zhì)激素-誘 導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥（Locklin 等，2001，Bone(骨）28(增刊）：S80 ;McClung 2006, Current Osteoporosis Reports (現(xiàn)代骨質(zhì)疏松癥報告）4 :28-33 ;Anandarajah 和 Schwarz 2006， J. Cell Biochem.(細胞生物化學(xué)雜志）97 :226-232)和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（McClung 2006， Current Osteoporosis Reports (現(xiàn)代骨質(zhì)疏松癥報告）4:28-33);(青少年或家族性的） 佩吉特氏?。–undy 等，2002，Hum. Mol. Genet.(人類分子遺傳學(xué)）11 :2119-2127 ;Whyte 等，2002, J. Bone Miner. Res.(骨骼礦物質(zhì)研究雜志）17 :26-29 ;Whyte 等，2002, Ν· Engl. J. Med.(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志）347 :175-184 ;Johnson_Pais 等，2003，J. Bone Miner Res. (骨豁礦物質(zhì)研究雜志）18 :376-380 ;Anandarajah 和 Schwarz 2006，J. Cell Biochem. (細胞生物化學(xué)雜志）97 :226-232 ;Anandarajah 和 Schwarz 2〇〇6, J. Cell Biochem.(細 胞生物化學(xué)雜志）97 :226-232);骨髓炎，S卩，一種骨感染性損傷，其導(dǎo)致骨損失；高鈣血癥 (Anandarajah和 Schwarz 2006, J. Cell Biochem.(細胞生物化學(xué)雜志）97:226-232)，其包 括但不限于，由實體瘤（包括但不限于，乳腺、肺和腎）和惡性血液?。òǖ幌抻冢喟l(fā) 性骨髓瘤（Sordillo 和 Pearse 2003，Cancer (癌癥）97(3 增刊）：802-812 ;Vanderkerken 等，2003, Cancer Res.(癌癥研究）63:287-289),淋巴瘤和白血?。?dǎo)致的高鈣血癥，特發(fā) 性高鈣血癥，和與甲狀腺機能亢進和腎功能病癥相關(guān)的高鈣血癥；骨損失，包括但不限于， 手術(shù)后的骨質(zhì)減少癥，由于類固醇施用誘導(dǎo)的骨質(zhì)減少癥，與小腸和大腸病癥相關(guān)的骨質(zhì) 減少癥，和與慢性肝和腎病相關(guān)的骨質(zhì)減少癥；骨壞死，即，骨細胞死亡，其包括但不限于， 與外傷性損傷相關(guān)的骨壞死，與Gaucher' s病相關(guān)的骨壞死，與鐮刀細胞貧血癥相關(guān)的 骨壞死，與系統(tǒng)狼瘡紅斑相關(guān)的骨壞死，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的骨壞死，與牙周疾病相關(guān) 的骨壞死，與溶骨性轉(zhuǎn)移瘤相關(guān)的骨壞死，和與其它病況相關(guān)的骨壞死；與關(guān)節(jié)炎病癥如 銀屑病關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的骨損失，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的軟骨損失和關(guān)節(jié)磨 損（Bezerra 等，2005, Brazilian Journal of Medical and Biological Research (巴西 醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究雜志）38 :161-170 ;Anandarajah 和 Schwarz 2006，J. Cell Biochem. (細胞生物化學(xué)雜志）97 :226-232);關(guān)節(jié)炎（Bezerra 等，2005，Brazilian Journal of Medical and Biological Research(巴西醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究雜志）38 :161_170)，其包括 炎性關(guān)節(jié)炎（McClung 2006，Current Osteoporosis Reports(現(xiàn)代骨質(zhì)疏松癥報告）4: 28-33)，膠原蛋白-誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（Bezerra 等，2005，Brazilian Journal of Medical and Biological Research(巴西醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究雜志）38 :161-170);人工關(guān)節(jié)假體周圍骨 溶角軍（Periprosthetic osteolysis) (McClung 2006, Current Osteoporosis Reports (現(xiàn) 代骨質(zhì)疏松癥報告）4 :28-33 ;Anandarajah 和 Schwarz 2006，J. Cell Biochem.(細胞生 物化學(xué)雜志）97 :226-232);癌癥相關(guān)的骨疾病（McClung 2006, Current Osteoporosis Reports (現(xiàn)代骨質(zhì)疏松癥報告）4 :28-33);與芳香酶抑制劑治療相關(guān)的骨損失（Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol. Ther.(生物學(xué)治療的專家觀點）6:1041-1050);與雄激素耗 盡治療相關(guān)的骨損失（Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol. Ther.(生物學(xué)治療的專家觀 點）6 :1041-1050);與骨轉(zhuǎn)移病相關(guān)的骨損失；與免疫系統(tǒng)參與的疾病相關(guān)的骨損失，所述 疾病如成年人和兒童白血病、癌癥轉(zhuǎn)移、自體免疫、和各種病毒感染（Holstead Jones等， 2002, Ann. Rheum.Dis.(年度風(fēng)濕病）61(增刊II) :ii32-ii39)骨質(zhì)減少病癥，如成年人 和兒童白血病（Oliveri等，1999, Henry Ford Hosp. Med. 39 :45_48)，慢性感染如丙型肝炎 或 HIV(Stellon 等，1985，Gastroenterology (腸胃病學(xué)）89 :1078-1083),自體免疫病癥 如糖尿?。≒i印kom等，1997, Horm. Metab. Res.(激素代謝研究）29 :584-91)，和紅斑狼瘡 (Seitz 等，1985，Ann. Rheum Dis.(年度風(fēng)濕病）44 :438-445)，過敏性疾病如哮喘（Ebeling 等，1998, J. Bone Min. Res.(骨骼礦物質(zhì)研究雜志）13 :1283-1289)，多發(fā)性癌癥如乳腺 癌中的溶骨轉(zhuǎn)移?。–oleman 1998，Curr. Opin. Oncol.(現(xiàn)代腫瘤學(xué)觀點）10 (增刊1): 7_13);前列腺癌；骨髓瘤骨?。ˋnandarajah 和 Schwarz 2006，J. Cell Biochem.(細胞生 物化學(xué)雜志）97 :226-232);牙周感染（Anandarajah 和 Schwarz 2006，J. Cell Biochem. (細胞生物化學(xué)雜志）97 :226-232);擴張性骨磷酸酯酶過多癥（Expansile skeletal hyperphosphatasia) (Anandarajah 和 Schwarz 2006，J. Cell Biochem.(細胞生物化學(xué)雜 志）97 :226-232);骨轉(zhuǎn)移（Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol. Ther.(生物學(xué)治療的專家 觀點）6 :1041-1050 ;Anandarajah 和 Schwarz 2006，J. Cell Biochem.(細胞生物化學(xué)雜 志）97 :226-232)。
[0026] 本發(fā)明范圍內(nèi)還包括使用本發(fā)明的氨基酸序列、組合物和/或多肽預(yù)防和/或治 療與RANK-L/RANK/0PG途徑的失衡相關(guān)的其它疾病和病癥。所述疾病和病癥包括但不限 于骨質(zhì)疏松癥，炎性病況，自體免疫病況，哮喘，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化病，多發(fā)性骨 髓瘤（Sordillo 和 Pearse 2003，Cancer (癌癥）97(3 增刊）：802-812 ;Vanderkerken 等， 2003，Cancer Res.(癌癥研究）63:287-289);血管疾?。ˋnandarajah 和 Schwarz 2006， J.CellBiochem.(細胞生物化學(xué)雜志）97 :226-232)和心血管疾?。↙ewiecki 2006，Expert Opin. Biol. Ther.(生物學(xué)治療的專家觀點）6 :1041-1050)。
[0027] 本發(fā)明范圍內(nèi)還包括使用本發(fā)明的氨基酸序列、化合物和/或多肽預(yù)防和/或治 療與骨硬化癥如遲發(fā)性骨硬化癥、先天性骨硬化癥和大理石狀骨病相關(guān)的疾病和病癥。
[0028] 特別地，本發(fā)明的多肽和組合物可以用來預(yù)防和治療由包括RANK-L的途徑介導(dǎo) 的骨疾病和病癥?；诒疚墓_的內(nèi)容，所述骨疾病和病癥的實例同樣對于熟練的技術(shù)人 員是清楚的。
[0029] 因此，不限于此，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以，例如，用來預(yù)防和/或治療目 前使用可以調(diào)節(jié)RANK-L-介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的活性成分來預(yù)防或治療的所有疾病和病癥，諸 如在上文引用的現(xiàn)有技術(shù)中提到的那些。還考慮了本發(fā)明的多肽可以用來預(yù)防和/或治療 這樣的所有的疾病和病癥，對于使用所述活性成分來治療所述疾病和病癥，目前正在研發(fā) 中、已經(jīng)提議了、或?qū)⒃趯硖嶙h或研發(fā)。另外，因為它們?nèi)绫疚倪M一步所述的有利特性，考 慮了本發(fā)明的多肽可以用來預(yù)防和治療除使用或?qū)⑻嶙h或研發(fā)的這些已知的活性成分的 那些之外的其他疾病和病癥；和/或本發(fā)明的多肽可以提供用于治療本文所述的疾病和病 癥的新方法和方案。
[0030] 因此，不限于此，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以，例如，用于預(yù)防和/或治療目 前正用denosumab預(yù)防或治療的所有疾病和病癥。
[0031] 對于熟練的技術(shù)人員，通過本文進一步的公開內(nèi)容，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽 的其他應(yīng)用和用途將變得清楚。
[0032] 通常，本發(fā)明的一個目的是提供藥物活性試劑，以及包括其的組合物，其可以用于 骨疾病和病癥以及本文提及的其他疾病和病癥的診斷、預(yù)防和/或治療；且提供用于診斷、 預(yù)防和/或治療所述疾病和病癥的方法，所述方法包括施用和/或使用所述試劑和組合物。
[0033] 特別地，本發(fā)明的一個目的是提供與本領(lǐng)域中目前所用的和/或所知的試劑、組 合物和/或方法相比具有某些優(yōu)點的這樣的藥物活性試劑、組合物和/或方法。這些優(yōu)點 將通過下文的進一步描述變得清楚。
[0034] 更特別地，本發(fā)明的目的是提供可以用作藥物活性試劑的治療性蛋白，以及包括 其的組合物，其用于診斷、預(yù)防和/或治療骨疾病和病癥以及本文提及的其他的疾病和病 癥；和提供用于診斷、預(yù)防和/或治療所述疾病和病癥的方法，所述方法包括施用和/或使 用所述治療性蛋白和組合物。
[0035] 因此，本發(fā)明的具體目的是提供針對（如本發(fā)明所定義）RANK-L、特別是針對來自 溫血動物的RANK-L、更特別是針對來自哺乳動物的RANK-L、并且尤其是針對人RANK-L的氨 基酸序列；并且提供包括至少一種所述氨基酸序列或基本上由其組成的蛋白和多肽。
[0036] 特別地，本發(fā)明的具體目的是提供適合在溫血動物、并且特別是在哺乳動物、且更 特別是在人類中用于預(yù)防、治療和/或診斷應(yīng)用的所述氨基酸序列和所述蛋白和/或多肽。
[0037] 更特別地，本發(fā)明的具體目的是提供可以在溫血動物、特別是在哺乳動物、且更特 別是在人中用于預(yù)防、治療、減輕和/或診斷一種或多種與RANK-L相關(guān)和/或由RANK-L介 導(dǎo)的疾病、病癥或病況（如本文所提及的疾病、病癥和病況）的所述氨基酸序列和所述蛋白 和/或多肽。
[0038] 本發(fā)明還有一個具體目的是提供可以用于制備用于預(yù)防和/或治療溫血動物、特 別是哺乳動物、且更特別是人類中的一種或多種與RANK-L相關(guān)的和/或由RANK-L介導(dǎo)的 疾病、病癥或病況（如本文所提及的疾病、病癥和病況）的藥物或獸醫(yī)組合物的所述氨基酸 序列和所述蛋白和/或多肽。
[0039] 在本發(fā)明中，通常，這些目的通過利用本發(fā)明所述的氨基酸序列、蛋白、多肽和組 合物實現(xiàn)。
[0040] 一般地，本發(fā)明提供針對（如本發(fā)明所定義）和/或可以特異性結(jié)合（如本發(fā)明 所定義）RANK-L的氨基酸序列；以及包括至少一個所述氨基酸序列的化合物和構(gòu)建體、且 特別是蛋白和多肽。
[0041] 更特別地，本發(fā)明提供可以以如本發(fā)明所定義的親和力（適當(dāng)測量和/或表示為 KD_值（實際的或表觀的），KA-值（實際的或表觀的），km_速率和/或kf-速率，或備選 地為IC 5(I值，如本發(fā)明進一步所述）與RANK-L結(jié)合的氨基酸序列；以及包括至少一個所述 氨基酸序列的化合物和構(gòu)建體、且特別是蛋白和多肽。
[0042] 特別地，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽優(yōu)選這樣，以致它們：
[0043] -以1(Γ5-1(Γ12摩爾/升或更小、并且優(yōu)選地1(Γ7-1(Γ 12摩爾/升或更小、并且更優(yōu)選 地1(Γ8-1(Γ12摩爾/升的解離常數(shù)（K D) ( S卩，以1〇5-1〇12升/摩爾或更大、并且優(yōu)選地1〇7-1〇 12 升/摩爾或更大、且更優(yōu)選地108-1012升/摩爾的締合常數(shù)（KA))與RANK-L結(jié)合；
[0044] 和/或這樣，以致它們：
[0045] -以 102Μ?-約 107Μ? 優(yōu)選 103Μ?-107Μ?，更優(yōu)選 104Μ?-107Μ? 諸如 105Μ?107Μ? 的 k"-速率與 RANK-L 結(jié)合；
[0046] 和/或這樣，以致它們：
[0047] -以Is-1 (t1/2 = 0· 69s) -ΙΟ-、-1 (假定具有多天的t1/2的幾乎不可逆的復(fù)合體），優(yōu) 選ΙΟΛΗ-ΙΟ?，更優(yōu)選ΙΟ?-ΙΟ?，諸如ΙΟ?-ΙΟΛ-1的k。^速率與RANK-L結(jié)合。
[0048] 優(yōu)選地，本發(fā)明的單價氨基酸序列（或包含僅一個本發(fā)明的氨基酸序列的多肽） 優(yōu)選是這樣，以致它將以小于500nM，優(yōu)選小于200nM，更優(yōu)選小于ΙΟηΜ，諸如小于500pM的 親和力與RANK-L結(jié)合。
[0049] 對于本發(fā)明的氨基酸序列或多肽與RANK-L結(jié)合的一些優(yōu)選的EC50和IC50值將 從本發(fā)明的進一步描述和實施例中變得清楚。
[0050] 對于與RANK-L結(jié)合，本發(fā)明的氨基酸序列通常將在其氨基酸序列內(nèi)包含一個或 多個氨基酸殘基、或氨基酸殘基的一個或多個序列（即，每個"序列"包括彼此相鄰或彼此 緊鄰的兩個（或多個）氨基酸殘基，即，在該氨基酸序列的一級或三級結(jié)構(gòu)上），通過其本 發(fā)明的氨基酸序列可以與RANK-L結(jié)合，因此所述氨基酸殘基或氨基酸殘基序列形成結(jié)合 RANK-L的"位點"（本發(fā)明還稱為"抗原結(jié)合位點"）。
[0051] 本發(fā)明提供的氨基酸序列優(yōu)選地基本上采用分離形式（如本發(fā)明所定義）、或形 成本發(fā)明的蛋白或多肽的一部分（如本文所定義），其可以包括一個或多個本發(fā)明的氨基 酸序列或基本上由其組成，并且其可以任選地還包括一個或多個其它氨基酸序列（全部任 選地通過一個或多個適當(dāng)?shù)慕宇^連接）。例如，并且不限于，本發(fā)明的一個或多個氨基酸序 列可以用作在這樣的蛋白或多肽內(nèi)的結(jié)合單位，所述蛋白或多肽可以任選地包含可以作為 結(jié)合單位的一個或多個其它氨基酸序列（即，針對除RANK-L外的一個或多個其它靶標），以 便分別提供單價、多價或多特異性的本發(fā)明的多肽，全如本發(fā)明所述。這樣的蛋白或多肽還 可以采用基本上分離的形式（如本發(fā)明所定義）。
[0052] 因此，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽優(yōu)選地基本上由不通過二硫鍵與任一另一氨基 酸序列或鏈連接（但是其可以或可以不包含一個或多個分子內(nèi)二硫鍵。例如，已知納米抗 體--如本文所述--有時可以在⑶R3和⑶R1或FR2之間包含二硫鍵）的單一氨基酸 鏈組成。然而，應(yīng)該注意，一個或多個本發(fā)明的氨基酸序列可以彼此連接和/或與其他氨 基酸序列連接（例如，通過二硫鍵），以提供也可以用于本發(fā)明的肽構(gòu)建體（例如，F(xiàn)ab'片 段，F(xiàn)(ab'） 2片段，ScFv構(gòu)建體，"雙抗體"和其他多特異性構(gòu)建體。例如，參考Holliger和 Hudson，Nat Biotechnol.(自然生物技術(shù)）2005 年 9 月；23 (9) :1126-36 的綜述）。
[0053] -般地，當(dāng)本發(fā)明的氨基酸序列（或包括其的化合物、構(gòu)建體或多肽）意欲施用給 受試者時（例如，為了如本文所述的治療和/或診斷目的），優(yōu)選在所述受試者內(nèi)不天然存 在的氨基酸序列；或當(dāng)它在所述受試者內(nèi)不天然存在時，采用基本上分離的形式（如本文 所定義）。
[0054] 熟練的技術(shù)人員還應(yīng)該清楚，對于藥物應(yīng)用，本發(fā)明的氨基酸序列（以及包括其 的化合物、構(gòu)建體和多肽）優(yōu)選地針對人RANK-L ;而對于獸醫(yī)用目的，本發(fā)明的氨基酸序列 和多肽優(yōu)選地針對來自待治療的物種的RANK-L，或至少與來自待治療的物種的RANK-L交 叉反應(yīng)。
[0055] 此外，本發(fā)明的氨基酸序列可以任選地，并且除了所述至少一個針對RANK-L結(jié)合 的結(jié)合位點之外，包含針對其它抗原、蛋白或靶標結(jié)合的一個或多個其它結(jié)合位點。
[0056] 本發(fā)明的氨基酸序列和多肽的功效、以及包括其的組合物的功效可以使用任何 適合的體外測定、基于細胞的測定、體內(nèi)測定和/或本質(zhì)上已知的動物模型、或它們的 任何組合進行檢測，這取決于所涉及的具體的疾病或病癥。適當(dāng)?shù)捏w外測定對于熟練 的技術(shù)人員將是清楚的，并且例如，包括ELISA ;FACS結(jié)合測定；Biacore ;競爭性結(jié)合測 定（Alpha Screen?, Perkin Elmer, Massachusetts,美國；FMAT) ;TRAP 測定（破骨細 胞分化測定；Rissanen等，2005，J. Bone Miner. Res.(骨豁礦物質(zhì)研究雜志）20,增刊1 : S256) ;NF- κ B 報道基因測定（Mizukami 等，2002, Mol. Cell. Biol.(分子細胞生物學(xué)）22 : 992-1000)。關(guān)于在例如ELISA或FACS中本發(fā)明的納米抗體（和包括其的多肽）與RANK-L 結(jié)合的EC50值優(yōu)選為1 μ M-lpM，更優(yōu)選InM-lpM，且更優(yōu)選地100pM-lpM。關(guān)于在例如 Alpha Screen_ A NF- κ B測定或TRAP測定中本發(fā)明的納米抗體（和包括其的多肽）與 RANK-L結(jié)合的IC50值優(yōu)選為1 μ M-lpM，更優(yōu)選InM-lpM，且更優(yōu)選100pM-lpM。
[0057] 適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ蛯τ谑炀毜募夹g(shù)人員將是清楚的，例如包括（SCID)/ARH-77小鼠 模型（Sordillo 和 Pearse 2003, Cancer (癌癥）97(3 增刊）：802-812);人 MM 的 SCID-hu 小鼠模型（Sordillo 和 Pearse 2003, Cancer (癌癥）97(3 增刊）：802-812 ;Tassone 等， 2005, Blood(血液）106 :713-716);在apoE基因啟動子和相關(guān)的增強子的控制下過量表達 0PG的轉(zhuǎn)基因小鼠（Simonet等，1997, Cell (細胞）89 :309-319);肉瘤-誘導(dǎo)的骨破壞的小 鼠模型（Honore等，2000，Nat. Med.(自然醫(yī)學(xué)）6:521-528);切除卵巢的動物模型，諸如例 如，切除卵巢的猴（>1'〇1^等，1995,8 〇1^(骨骼）17:4035-4085)，切除卵巢的小鼠〇?(^1& 等，2001，Proc. Natl. Acad. Sci.USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報）20 :13960-13965)或切除卵 巢的大鼠和食蟹猴（cynomolgus monkeys) (Simonet 等，1997，Cell (細胞）89 :309-319 ; ll.oey.il -Andersen 等，2004，Arthritis Res. Ther.(關(guān)節(jié)炎研究治療）6 :R169_R180); 關(guān)節(jié)炎的大鼠（動物）模型（Bendele等，1999, Toxicologic Pathology (毒物學(xué)病理 性）27 :134-142 ;Romas 等，2002, Am. J. Pathol.(美國病理性雜志）161 :1419-1427 ;Mori 等，2002，Histochemistry and Cell Biology (組織化學(xué)和細胞生物學(xué)）117:283_292)， 如膠原蛋白-誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型或佐劑-誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型；腫瘤-來源的PTHrP-誘導(dǎo) 的高鈣血癥動物模型（Morony等，1999, J. Bone Miner. Res.(骨骼礦物質(zhì)研究雜志）14 : 1478-1485 ;Capparelli 等，2000, Cancer Res.(癌癥研究）60 :783-778);多發(fā)性骨髓瘤 的鼠源模型（Vanderkerken等，2003，Cancer Res.(癌癥研究）63:287-289);小鼠中的炎 性腸病模型（Byrne等，2005, Gut 54:78-86);過量表達MIF的轉(zhuǎn)基因小鼠（Onodera等， 2006, J. Bone Miner. Res.(骨骼礦物質(zhì)研究雜志）21:876-885);過量表達可溶性破骨細胞 分化因子（800?)的轉(zhuǎn)基因小鼠（1^2皿〇等，2002,20 :337-44);在05?-11?啟動子/第一內(nèi) 含子驅(qū)動的控制下表達CSF-1的轉(zhuǎn)基因小鼠[轉(zhuǎn)基因 TgN(CSflr-Csfl)Ers(TgRC)小鼠] (Wei等，2006, J.Leukoc. Biol.(白細胞生物學(xué)雜志）80 :1445-1453);過量表達核心-結(jié) 合因子a l(Cbfal)的轉(zhuǎn)基因小鼠（Geoffroy等，Mol.Cell Biol?(分子細胞生物學(xué)）22 : 6222-6233);過量表達假受體3 (DcR3)的轉(zhuǎn)基因小鼠（Tang等，2007, J. Biol. Chem.(生物 化學(xué)雜志）282 :2346-2354)，以及在下述實驗部分和在本文引用的現(xiàn)有技術(shù)中所用的測定 法和動物模型。
[0058] 此外，按照本發(fā)明，針對來自第一溫血動物物種的RANK-L的氨基酸序列和多肽可 以或可以不表現(xiàn)出與來自一種或多種其它溫血動物物種的RANK-L的交叉反應(yīng)性。例如，針 對人RANK-L的氨基酸序列和多肽可以或可以不表現(xiàn)出與來自一種或多種其它靈長類物種 (諸如，不限于，來自獼猴屬（Macaca)的猴子（諸如，并且特別地，食蟹猴（食蟹猴（Macaca fascicularis))和/或恒河猴（恒河猴（Macaca mulatta)))和狒狒（豚尾狒狒（Papio ursinus)))的RANK-L的交叉反應(yīng)性，和/或與來自通常用于疾病動物模型中的（例如小 鼠、大鼠、兔、豬或狗）、且特別是用于與RANK-L相關(guān)的疾病和病癥的動物模型中（諸如本 發(fā)明提及的物種和動物模型）的一種或多種動物物種的RANK-L的交叉反應(yīng)性。在這一方 面，對于熟練的技術(shù)人員應(yīng)該清楚，從藥物開發(fā)觀點來看，所述交叉反應(yīng)性，當(dāng)存在時，可以 具有優(yōu)點，因為它允許在所述疾病模型中檢測所述針對人RANK-L的氨基酸序列和多肽。
[0059] 更一般地，與來自多個哺乳動物物種的RANK-L交叉反應(yīng)的本發(fā)明的氨基酸序列 和多肽將通常有利于用于獸醫(yī)應(yīng)用，原因在于它將允許在多種物種之間使用相同的氨基酸 序列或多肽。因此，在本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括針對來自一個動物物種的RANK-L的氨基酸序 列和多肽（諸如針對人RANK-L的氨基酸序列和多肽）可以用于治療另一個動物物種，只要 所述氨基酸序列和/或多肽的應(yīng)用在待治療的物種中提供所需要的作用。
[0060] 在一個實施方案中，針對人RANK-L的本發(fā)明的氨基酸序列和多肽與來自食蟹猴 的RANK-L交叉反應(yīng)。
[0061] 在另一個實施方案中，針對人RANK-L的本發(fā)明的氨基酸序列和多肽與來自小鼠 或大鼠的RANK-L交叉反應(yīng)。
[0062] 在另一個實施方案中，針對人RANK-L的本發(fā)明的氨基酸序列和多肽與來自食蟹 猴的RANK-L且與來自小鼠或大鼠的RANK-L交叉反應(yīng)。
[0063] 在另一個實施方案中，針對人RANK-L的本發(fā)明的氨基酸序列和多肽不與來自小 鼠或大鼠的RANK-L交叉反應(yīng)。
[0064] 在另一個實施方案中，針對人RANK-L的本發(fā)明的氨基酸序列和多肽與來自食蟹 猴的RANK-L交叉反應(yīng)，而不與來自小鼠或大鼠的RANK-L交叉反應(yīng)。
[0065] 在另一個實施方案中，針對人RANK-L的本發(fā)明的氨基酸序列和多肽不與來自食 蟹猴的RANK-L交叉反應(yīng)。
[0066] 在另一個實施方案中，針對人RANK-L的本發(fā)明的氨基酸序列和多肽不與來自食 蟹猴的RANK-L交叉反應(yīng)，且不與來自小鼠或大鼠的RANK-L交叉反應(yīng)。
[0067] 本發(fā)明在其最廣泛意義上還不特別限于或限定在本發(fā)明的氨基酸序列和多肽所 針對的RANK-L的特異性抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域、亞基或構(gòu)象（confirmation)(在適 用時）。例如，所述氨基酸序列和多肽可以或可以不針對"相互作用位點"（如本文定義）。 然而，通常假定并且優(yōu)選本發(fā)明的氨基酸序列和多肽優(yōu)選地針對相互作用位點（如本文定 義），且特別地針對RANK-L上關(guān)于RANK的結(jié)合位點或針對RANK-L上關(guān)于0PG的結(jié)合位點。
[0068] 因此，在一個優(yōu)選而非限制性的方面中，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽針對RANK-L 上的RANK受體結(jié)合位點，且如本文進一步所定義那樣。本發(fā)明的氨基酸序列和多肽與 RANK-L上的RANK受體結(jié)合位點的結(jié)合可以抑制和/或防止RANK-L與RANK結(jié)合，且因此抑 制或防止由該RANK-L/RANK結(jié)合所介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。本發(fā)明的氨基酸序列和多肽因此可以 作用為RANK-L/RANK介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的拮抗劑。
[0069] 在一個具體而非限制性的方面中，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽針對RANK-L上的 RANK受體結(jié)合位點，而不干擾（減少/抑制）RANK-L/0PG相互作用。在該具體方面中，除 了 0PG介導(dǎo)的對破骨細胞成熟和活化的抑制之外，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽將作用為 RANK-L/RANK介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的拮抗劑（并且抑制破骨細胞成熟和活化）。
[0070] 在另一個優(yōu)選的但非限制性的方面中，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽針對RANK-L 上的0PG結(jié)合位點，且如本發(fā)明進一步所述。本發(fā)明的氨基酸序列和多肽與RANK-L上0PG 結(jié)合位點的結(jié)合可以抑制和/或防止RANK-L與0PG的結(jié)合。因此，本發(fā)明的氨基酸序列 和多肽可以作用為RANK-L與0PG結(jié)合的競爭性或非競爭性抑制劑（例如，在ELISA中，在 Alpha Screen?測定中，在TRAP測定中和/或在NF κ B測定中）。本發(fā)明的氨基酸序列和 多肽與在RANK-L上的0PG結(jié)合位點的結(jié)合又可以抑制和/或防止RANK-L與RANK的結(jié)合， 且因此抑制和/或防止由這種RANK-L/RANK結(jié)合介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。因此，本發(fā)明的氨基酸 序列和多肽可以作用為RANK-L和RANK-L/RANK介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的拮抗劑（S卩，它們抑制 RANK/RANK-L 相互作用）。
[0071] 然而，在一些情形中，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以針對RANK-L上的0PG結(jié)合 位點，且干擾RANK-L與0PG的結(jié)合，而基本上不減少RANK-L與RANK的結(jié)合。在該情形中， 本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以加強由該RANK-L/RANK相互作用介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，且作用 為RANK-L和RANK-L/RANK介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的激動劑（S卩，它們作用為0PG作用的拮抗劑）。
[0072] 在本發(fā)明的另一個方面中，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽優(yōu)選地針對RANK-L上與 denosumab的表位重疊的表位。本發(fā)明的氨基酸序列和多肽與RANK-L上同denosumab的表 位重疊的表位的結(jié)合可以抑制和/或防止denosumab與RANK-L的結(jié)合。因此，本發(fā)明的氨 基酸序列和多肽可以作用為denosumab與RANK-L結(jié)合的競爭性或非競爭性抑制劑（例如， 在elisa中，在Alpha Screen?測定中，在TRAP測定中和/或在NFk B測定中）。
[0073] 如本文進一步所述，本發(fā)明的多肽可以包含兩個或多個本發(fā)明針對RANK-L的 氨基酸序列。通常，所述多肽以與本發(fā)明的單一氨基酸序列相比增加的抗體親抗源性 (avidity)與RANK-L結(jié)合。所述多肽可以，例如，包括兩個本發(fā)明的氨基酸序列，所述氨基 酸序列針對RANK-L相同的抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域、亞基或構(gòu)象（在適用情形中） (其可以或可以不是相互作用位點）；或包括至少一個本發(fā)明的"第一"氨基酸序列，其針對 RANK-L的第一個相同的抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域、亞基或構(gòu)象（在適用情形中）（其 可以或可以不是相互作用位點）；和至少一個本發(fā)明的"第二"氨基酸序列，其針對與所述 第一個不同的第二個抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域、亞基或構(gòu)象（在適用情形中）（且其 同樣可以或可以不是相互作用位點）。優(yōu)選地，在所述本發(fā)明的"二互補位（biparatopic)" 多肽中，至少一個本發(fā)明的氨基酸序列針對相互作用位點（如本文定義），盡管本發(fā)明在其 最廣泛意義上不限于此。
[0074] 因此，在一個特別的方面中，本發(fā)明的多肽可以包括兩個或多個針對RANK-L上 RANK結(jié)合位點的本發(fā)明的氨基酸序列；或包括至少一個針對RANK-L上RANK結(jié)合位點的 "第一"本發(fā)明的氨基酸序列；和至少一個"第二"本發(fā)明的氨基酸序列，其針對與所述第一 不同的第二抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域、亞基或構(gòu)象，且其不是在RANK-L的RANK結(jié)合 位點。
[0075] 因此，在另一個特定方面中，本發(fā)明的多肽可以包括兩個或多個針對RANK-L上 0PG的結(jié)合位點的本發(fā)明的氨基酸序列；或包括至少一個針對RANK-L上0PG結(jié)合位點的 "第一"本發(fā)明的氨基酸序列；和至少一個"第二"本發(fā)明的氨基酸序列，其針對與所述第一 不同的第二抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域、亞基或構(gòu)象，且其不是在RANK-L的0PG結(jié)合位 點。
[0076] 此外，當(dāng)靶標是結(jié)合對（例如，受體-配體結(jié)合對）的一部分時，所述氨基酸序列 和多肽可以是這樣的，以致它們與同源結(jié)合配偶體（例如，配體、受體或其他結(jié)合配偶體， 在適用時）競爭與所述靶標結(jié)合，和/或是這樣的，以致它們（完全或部分地）中和所述結(jié) 合配偶體與所述靶標的結(jié)合。
[0077] 以下也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，即，在適用時，本發(fā)明的氨基酸序列可以結(jié)合兩個或多 個RANK-L的抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域、亞基或構(gòu)象。在這樣的情形中，與本發(fā)明的氨 基酸序列和/或多肽結(jié)合的RANK-L的抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域或亞基可以是基本上 相同的（例如，如果RANK-L包含重復(fù)的結(jié)構(gòu)基序或存在于多聚體形式中）或可以是不同的 (且在后一種情形中，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以以可能是相同或不同的親和力和/ 或特異性結(jié)合所述不同的RANK-L抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域、亞基）。在一個優(yōu)選但非 限制性方面中，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽結(jié)合RANK-L三聚體的兩個或三個亞基。此外， 例如，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以結(jié)合其中與相關(guān)配體結(jié)合的RANK-L構(gòu)象，可以結(jié)合 其中不與相關(guān)配體結(jié)合的RANK-L構(gòu)象，或可以結(jié)合所述兩種構(gòu)象（同樣以可能是相同或不 同的親和力和/或特異性）。例如，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以結(jié)合其中結(jié)合RANK的 RANK-L構(gòu)象，可以結(jié)合其中不結(jié)合RANK的RANK-L構(gòu)象，或可以結(jié)合所述兩種構(gòu)象（同樣以 可能是相同或不同的親和力和/或特異性）。例如，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以結(jié)合其 中結(jié)合0PG的RANK-L構(gòu)象，可以結(jié)合其中不結(jié)合0PG的RANK-L構(gòu)象，或可以結(jié)合所述兩種 構(gòu)象（同樣以可能是相同或不同的親和力和/或特異性）。
[0078] RANK-L以膜結(jié)合和可溶形式存在。本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以結(jié)合任一種形 式，或者優(yōu)選地，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以結(jié)合這兩種形式。RANK-L以4種不同的同 種型存在（參見如前所述）。本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以結(jié)合RANK-L四種同種型中的 任一種，或者可以結(jié)合多于一種，諸如兩種、三種或全部四種RANK-L同種型。
[0079] 還預(yù)測本發(fā)明的氨基酸序列和多肽通常將結(jié)合RANK-L的所有天然存在的或合成 的類似物、變體、突變體、等位基因、部分和片段；或至少結(jié)合包含一個或多個抗原決定簇或 表位的那些RANK-L的類似物、變體、突變體、等位基因、部分和片段，所述抗原決定簇或表 位與本發(fā)明的氨基酸序列和多肽在RANK-L中（例如，在野生型RANK-L中）結(jié)合的抗原決定 簇或表位基本相同。同樣地，在這樣的情形中，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以以與本發(fā)明 的氨基酸序列結(jié)合（野生型）RANK-L的親和力和特異性相同、或不同（例如，高于或低于） 的親和力和/或特異性結(jié)合所述類似物、變體、突變體、等位基因、部分和片段。在本發(fā)明的 范圍內(nèi)還包括本發(fā)明的氨基酸序列和多肽結(jié)合RANK-L的一些類似物、變體、突變體、等位 基因、部分和片段，但不結(jié)合另一些。
[0080] 本發(fā)明的氨基酸序列和多肽可以結(jié)合其它的、相關(guān)TNF家族成員（例如，TRAIL， TNF-α和/或CD40配體）。然而，在一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽對于 相關(guān)的TNF家族成員不具有可檢測的親和力（S卩，比其針對RANK-L的親和力低多于10倍、 優(yōu)選多于100倍、更優(yōu)選多于1000倍的親和力）。在一個方面中，本發(fā)明的氨基酸序列和多 肽不具有針對TRAIL的可檢測的親和力。在另一個方面中，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽不 具有針對TNF-α的可檢測的親和力。在另一個方面中，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽不具有 針對CD40配體的可檢測的親和力。在另一個方面中，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽不具有針 對TRAIL、TNF- α和/或⑶40配體的可檢測的親和力。
[0081] 與所有已知的TNF細胞因子家族成員相似，RANK-L自我組裝成非共價締合的三 聚體。當(dāng)RANK-L以單體形式存在和以一個或多個多聚體形式存在時，以下在本發(fā)明的 范圍內(nèi)，即，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽僅結(jié)合單體形式的RANK-L，僅結(jié)合多聚體形式的 RANK-L，或結(jié)合所述單體和多聚體兩種形式。同樣地，在所述情形中，本發(fā)明的氨基酸序列 和多肽可以以與本發(fā)明的氨基酸序列與多聚體形式結(jié)合的親和力和特異性相同、或不同 (即，高于或低于）的親和力和/或特異性結(jié)合單體形式。
[0082] 在本發(fā)明的一個非限制性的方面中，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽結(jié)合RANK-L，以 致防止和/或抑制RANK-L三聚體的形成。
[0083] 公認RANK-L結(jié)合沿著由同型三聚體的相鄰單體形成的三個裂口（或溝）的每一 個結(jié)合一個受體分子（RANK)。以這種方式，RANK-L三聚體表現(xiàn)出三種空間不同的、但是等 價的、亞基之間的受體-結(jié)合溝，三種受體分子結(jié)合在所述溝內(nèi)。因此，為了抑制RANK-L及 其受體之間的相互作用，治療分子應(yīng)該優(yōu)選靶向RANK-L的這些亞基之間的受體結(jié)合溝。納 米抗體（如本文進一步定義）可以表現(xiàn)出所謂的腔-結(jié)合特性（與常規(guī)％結(jié)構(gòu)域比較， 特別是由于它們延長的⑶R3環(huán)），且因此理想地適于抑制RANK-L與其RANK受體的相互作 用。因此，在一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽結(jié)合RANK-L的亞基之間的受 體-結(jié)合溝。
[0084] 此外，當(dāng)RANK-L可以與其他蛋白或多肽締合形成蛋白質(zhì)復(fù)合物時（例如，具有多 個亞基）時，以下在本發(fā)明的范圍內(nèi)，g卩，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽結(jié)合非締合狀態(tài)的 RANK-L，結(jié)合締合狀態(tài)的RANK-L，或結(jié)合兩者。在所有這些情形中，本發(fā)明的氨基酸序列和 多肽可以以與本發(fā)明的氨基酸序列和多肽結(jié)合單體和非締合狀態(tài)的RANK-L的親和力和/ 或特異性相同或不同（即，高于或低于）的親和力和/或特異性結(jié)合所述多聚體或締合的 蛋白質(zhì)復(fù)合物。
[0085] 通常，本發(fā)明的氨基酸序列和多肽至少結(jié)合這些形式的RANK-L(包括單體、多聚 體和締合形式），其與生物學(xué)和/或治療觀點最相關(guān)，這對于熟練的技術(shù)人員是清楚的。
[0086] 此外，通常，包含兩個或多個針對RANK-L的氨基酸序列和/或納米抗體的本發(fā)明 的多肽可以以比相對應(yīng)的單體氨基酸序列和/或納米抗體更高的抗體親抗源性進行結(jié)合。
[0087] 例如，且不限于，包含針對不同RANK-L表位的兩個或多個氨基酸序列和/或納米 抗體的多價（如本文定義）蛋白質(zhì)或多肽可以以比相對應(yīng)的單體更高的抗體親抗源性與 RANK-L 結(jié)合。
[0088] 更重要的是，包含針對RANK-L的兩個或多個氨基酸序列和/或納米抗體的多價 (如本文定義）蛋白質(zhì)或多肽可以（且通常將）以比與RANK-L單體更高的抗體親抗源性結(jié) 合RANK-L多聚體，且通常還將以比相對應(yīng)的單體氨基酸序列和/或納米抗體更高的抗體親 抗源性結(jié)合。在這樣的多價蛋白質(zhì)或多肽中，所述兩個或多個氨基酸序列和/或納米抗體 可以，例如，針對相同的表位、實質(zhì)上等價的表位、或不同的表位。在所述多價蛋白質(zhì)或多肽 的一個實施方案中，所述兩個或多個氨基酸序列和/或納米抗體可以是相同的（且因此針 對相同的表位）。
[0089] 后者是特別重要的，因為已知通過RANK-L的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要模式包括RANK受體 與RANK-L分子三聚體的結(jié)合，所述RANK-L分子三聚體包含三個受體結(jié)合位點（參見，例 如，Lam 等· 2001，J. Clin. Invest.(臨床研究雜志）108 :971-979)。
[0090] 在本發(fā)明中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在體外模型和在細胞模型中氨基酸序列和/或納米抗體能 夠以這樣的方式與RANK-L結(jié)合以致減少RANK-L活性（參見下文實驗部分）。盡管本發(fā)明 不限于任何具體的機制、解釋或假說，但是假定由于它們的小尺寸和針對RANK-L的高親和 力，本發(fā)明的兩種或三種單價氨基酸序列和/或納米抗體能夠同時占據(jù)RANK-L三聚體上 的兩個或三個不同的受體結(jié)合位點，由此防止該三聚體起始受體結(jié)合且由此起始信號轉(zhuǎn)導(dǎo) (然而，不排除其他作用機制：例如，依賴于其所針對的表位，本發(fā)明的氨基酸序列和/或納 米抗體也可以抑制RANK-L締合成三聚體狀態(tài)）。
[0091] 還應(yīng)該注意到，除了或者作為與單一 RANK-L三聚體上的兩個或多個受體結(jié)合位 點結(jié)合的備選方案，本發(fā)明的蛋白或多肽，其包括兩個或多個針對RANK-L表位的氨基酸序 列和/或納米抗體或由其組成，可以結(jié)合（例如，分子間地）在兩個單獨的RANK-L分子（例 如，兩個單獨的三聚體）上的表位。
[0092] 然而，按照一個特別優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明涉及這樣的蛋白或多肽，其包括兩個 或多個分別針對RANK-L上（且特別是在RANK-L三聚體上）的表位的氨基酸序列和/或納 米抗體或基本上由其組成，所述RANK-L上的表位位于和/或形成RANK-L三聚體受體結(jié)合 位點的一部分，以致所述多肽，在與RANK-L三聚體結(jié)合時，能夠抑制或減少由所述RANK-L 三聚體介導(dǎo)的RANK受體結(jié)合和/或由所述受體結(jié)合介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0093] 特別地，按照該優(yōu)選實施方案，本發(fā)明涉及這樣的蛋白或多肽，其包括兩個或多個 分別針對RANK-L上（且特別是在RANK-L三聚體上）的表位的氨基酸序列和/或納米抗體 或基本上由其組成，所述RANK-L上的表位位于和/或形成RANK-L三聚體受體結(jié)合位點的 一部分，其中所述氨基酸序列和/或納米抗體以這樣的方式彼此連接，以致所述蛋白或多 肽能夠同時與單一 RANK-L三聚體上的兩個或多個受體結(jié)合位點結(jié)合（換言之，能夠分子內(nèi) 結(jié)合在RANK-L三聚體上的至少兩個RANK-L受體結(jié)合位點）。在該實施方案中，所述兩種或 多種氨基酸序列和/或納米抗體優(yōu)選如上文定義，且最優(yōu)選是納米抗體（以致所述蛋白或 多肽是多價納米抗體構(gòu)建體，如本文進一步所述）。此外，在該實施方案中，所述兩種或多種 氨基酸序列和/或納米抗體可以是相同的或不同的；且可以針對RANK受體結(jié)合位點之內(nèi)的 不同表位，但是優(yōu)選是針對相同的表位。本發(fā)明該實施方案的一些優(yōu)選的但非限制性的構(gòu) 建體為 SEQ ID NO' s :622-693, 761-762 和 766-773。
[0094] 在本發(fā)明的該實施方案中，所述兩個或多個氨基酸序列和/或納米抗體將通常通 過一個或多個適當(dāng)?shù)慕宇^連接，所述接頭是這樣的，以致每個氨基酸序列和/或納米抗體 可以結(jié)合在同一 RANK-L三聚體上的不同受體結(jié)合位點。適當(dāng)?shù)慕宇^將特別依賴于與所述 氨基酸序列和/或納米抗體結(jié)合的在RANK-L三聚體上的表位（之間的距離），且基于本文 的公開內(nèi)容，任選地在進行一些有限程度的常規(guī)實驗之后，對于熟練的技術(shù)人員將是清楚 的。例如，當(dāng)兩個或多個氨基酸序列是（單）結(jié)構(gòu)域抗體或納米抗體時，適當(dāng)?shù)慕宇^可以選 自本文所述的接頭，但是具有這樣的接頭長度，其是這樣的，以致所述兩個或多個（單）結(jié) 構(gòu)域抗體或納米抗體可以分別結(jié)合在同一 RANK-L三聚體上的不同受體結(jié)合位點。
[0095] 此外，當(dāng)結(jié)合RANK-L受體結(jié)合位點的所述兩種或多種氨基酸序列是（單）結(jié)構(gòu)域 抗體或納米抗體時，它們還可以通過第三（單）結(jié)構(gòu)域抗體或納米抗體彼此連接（其中所 述兩種或多種（單）結(jié)構(gòu)域抗體或納米抗體可以直接與第三（單）結(jié)構(gòu)域抗體/納米抗體 連接或通過適當(dāng)?shù)慕宇^連接）。所述第三（單）結(jié)構(gòu)域抗體或納米抗體可以例如是提供增加 半衰期的（單）結(jié)構(gòu)域抗體或納米抗體，如本文進一步所述。例如，后一（單）結(jié)構(gòu)域抗體 或納米抗體可以是能夠與（人）血清蛋白如（人）血清白蛋白結(jié)合的（單）結(jié)構(gòu)域抗體或 納米抗體，如本文進一步所述。所述構(gòu)建體的一些非限制性的實例是SEQ ID NO's :694-729 和759-760的構(gòu)建體。所述第三（單）結(jié)構(gòu)域抗體或納米抗體可以例如是針對和/或可以 結(jié)合RANK-L上的另一個表位的（單）結(jié)構(gòu)域抗體或納米抗體，提供二互補位（單）結(jié)構(gòu)域 抗體或納米抗體，如本文進一步所述。
[0096] 備選地，與RANK-L上的受體結(jié)合位點結(jié)合的兩種或多種氨基酸序列和/或納米抗 體可以連續(xù)連接（直接地或通過適當(dāng)?shù)慕宇^），且所述第三（單）結(jié)構(gòu)域抗體或納米抗體 (可以提供其來增加半衰期或其可以結(jié)合在RANK-L上的另一個表位，如上文所述）可以直 接或通過接頭與這兩種或多種前述氨基酸序列和/或納米抗體中的一種連接。
[0097] 更一般地，在所述兩種或多種氨基酸序列和/或納米抗體之間的距離應(yīng)該是這樣 的，以致其允許所述蛋白或多肽進行與RANK-L三聚體的分子內(nèi)結(jié)合（即，不是分子間結(jié) 合）。兩種抗-RANK-L氨基酸序列和/或納米抗體的N-端和C-端之間的距離可以通過任 何適當(dāng)?shù)姆绞酱_定，諸如通過晶體學(xué)或分子建模（例如，如由Lam等.2001，J. Clin. Invest. (臨床研究雜志）108 :971-979所述）。這些技術(shù)通常也使得確定具體的多價或多特異性蛋 白或多肽是否能夠提供分子內(nèi)建模成為可能。備選地，尺寸排阻色譜法（如由Santora等， Anal. Biochem.，（生物化學(xué)年刊）299 :119-129所述）可以用來確定本發(fā)明給定的蛋白或 多肽是否將（主要）提供與RANK-L三聚體的分子內(nèi)結(jié)合或（主要）在兩個或多個RANK-L 三聚體之間的分子間結(jié)合。因此，在本發(fā)明的一個特定實施方案中，本發(fā)明的蛋白或多肽 優(yōu)選是這樣的，以致，在該實驗中，它主要或基本上專一地導(dǎo)致分子內(nèi)結(jié)合。然而，如上文強 調(diào)，應(yīng)該注意到，通過單獨的RANK-L分子（例如，三聚體）的分子內(nèi)結(jié)合運作的本發(fā)明的蛋 白或多肽也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0098] 因此，在另一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明提供包括針對RANK-L(且特別是RANK-L三 聚體）的至少兩個氨基酸序列和/或納米抗體的多價或多特異性蛋白或多肽，其中所述至 少兩種氨基酸序列和/或納米抗體以這樣的方式連接，以致在所述至少兩個抗-RANK-L氨 基酸序列和/或納米抗體的N-端和C-端之間的距離是這樣的，以致所述蛋白或多肽能夠 進行與RANK-L三聚體的分子內(nèi)結(jié)合（如本文所述）。
[0099] 在這樣優(yōu)選的蛋白或多肽中，所述兩種或多種氨基酸序列和/或納米抗體可以以 任何適當(dāng)?shù)姆绞竭B接，只要可以獲得在所述至少兩種抗-RANK-L氨基酸序列和/或納米抗 體的N-端和C-端之間的優(yōu)選距離，和/或只要所述蛋白或多肽能夠進行與RANK-L三聚體 的分子內(nèi)結(jié)合（如本文所述）。
[0100] 例如，在其最簡單的形式中，所述至少兩種氨基酸序列和/或納米抗體直接通過 適當(dāng)?shù)慕宇^或間隔體連接，所述接頭或間隔體提供所述至少兩種抗-RANK-L氨基酸序列 和/或納米抗體的N-端和C-端之間的優(yōu)選距離，且其可以允許所述蛋白或多肽進行與 RANK-L三聚體的分子內(nèi)結(jié)合（如本文所述）。適當(dāng)?shù)慕宇^如本文所述，且可以--例如且 不限于包括這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列優(yōu)選具有1-50或更多個氨基酸的長 度，更優(yōu)選5-30個氨基酸，如約9-20個氨基酸的長度。優(yōu)選地，所述氨基酸序列還應(yīng)該是 這樣的，以致其允許所述蛋白或多肽進行與RANK-L三聚體的分子內(nèi)結(jié)合（如本文所述）。
[0101] 因此，在另一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明提供包括針對RANK-L(且特別是RANK-L三 聚體）的至少兩種氨基酸序列和/或納米抗體的多價或多特異性的蛋白或多肽，其中所述 氨基酸序列和/或納米抗體優(yōu)選使用適當(dāng)?shù)慕宇^或間隔體直接彼此連接，以致在所述至少 兩種抗-RANK-L氨基酸序列和/或納米抗體的N-端和C-端之間的距離是這樣的，以致所 述蛋白或多肽能夠進行與RANK-L三聚體的分子內(nèi)結(jié)合（如本文所述）。
[0102] 更優(yōu)選地，在該優(yōu)選的方面中，所述接頭或間隔體是一種氨基酸序列，其優(yōu)選具有 1-50個或更多個氨基酸的長度，更優(yōu)選5-30個氨基酸，諸如約9-20個氨基酸的長度。在一 個優(yōu)選的、但非限制性的實施方案中，所述接頭基本由甘氨酸和絲氨酸殘基組成（如下文 進一步所述）。例如，一種適當(dāng)?shù)慕宇^是本文所述的GS9接頭，其包括9個氨基酸殘基，本文 所述的GS15接頭，其包括15個氨基酸殘基，本文所述的GS20接頭，其包括20個氨基酸殘 基，和本文所述的GS30接頭，其包括30個氨基酸殘基。
[0103] 在另一個實施方案中，針對RANK-L的所述至少兩種氨基酸序列和/或納米抗體通 過另一部分諸如另一種蛋白或多肽（任選地通過一個或多個接頭）彼此連接。在該實施方 案中，在所述至少兩種抗-RANK-L氨基酸序列和/或納米抗體的N-端和C-端之間具有優(yōu) 選距離（即，如上文提及）可能是理想的，例如以致所述蛋白或多肽仍然可以進行與RANK-L 三聚體的分子內(nèi)結(jié)合（如本文所述）。在該實施方案中，所述至少兩種氨基酸序列和/或 納米抗體可以直接與所述另一部分連接，或使用適當(dāng)?shù)慕宇^或間隔體連接，同樣只要仍然 可以獲得優(yōu)選的距離和/或需要的分子內(nèi)結(jié)合。所述部分可以是任何適當(dāng)?shù)牟糠?，其不?低（太多）所述蛋白或多肽與RANK-L的結(jié)合和/或所述蛋白或多肽進一步所述需要的生 物學(xué)或藥學(xué)特性。因此，所述部分可以是基本上無活性的，或可以是生物學(xué)活性的，且因此 可以或可以不提高所述蛋白或多肽的理想特性和/或可以賦予所述蛋白或多肽一種或多 種額外需要的特性。例如，且不限于，所述部分可以提高所述蛋白或多肽的半衰期，和/或 可以減少其免疫原性或提高任何其他需要的特性。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述部分可 以是另一種氨基酸序列和/或納米抗體（包括但不限于針對RANK-L的第三氨基酸序列和 /或納米抗體，盡管這不是必需的且通常較不優(yōu)選），且特別是提高所述蛋白或多肽的半衰 期的另一種氨基酸序列和/或納米抗體，諸如針對血清蛋白、例如針對人血清白蛋白的氨 基酸序列和/或納米抗體。本文描述了所述蛋白和多肽的實例。
[0104] 因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及這樣的多價多特異性的構(gòu)建體，其包括分別 針對RANK-L上（例如，RANK-L三聚體上）的表位的兩個或多個氨基酸序列和/或納米抗 體，所述表位位于和/或形成受體結(jié)合位點的一部分，且其通過提供增加的半衰期的至少 一個氨基酸序列和/或納米抗體（且任選地，通過一個或多個適當(dāng)?shù)慕宇^）彼此連接，以致 所述多肽，在與RANK-L三聚體結(jié)合時，能夠抑制或減少RANK受體結(jié)合和/或由所述RANK 三聚體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。所述多肽可以是這樣的，以致所述前文提及的兩種或多種氨基酸 序列和/或納米抗體可以分別結(jié)合在RANK-L三聚體上的不同受體結(jié)合位點。
[0105] 特別地，在該實施方案中，所述多肽可以包括三價雙特異性的納米抗體，其包括兩 個分別針對RANK-L上（且特別是RANK-L三聚體上）的表位的納米抗體，所述表位位于和 /或形成受體結(jié)合位點的一部分，其中所述納米抗體通過提供增加的半衰期的第三納米抗 體（例如，針對血清蛋白如人血清白蛋白的納米抗體）彼此連接，其中每一個前文提及的兩 種納米抗體可以直接與所述第三納米抗體或通過一個或多個適當(dāng)?shù)慕宇^連接，以致所述多 肽，在與RANK-L三聚體結(jié)合時，能夠抑制或減少RANK受體結(jié)合和/或由所述RANK-L三聚 體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。所述多肽可以是這樣的，以致所述前文提及的兩種納米抗體可以分別 結(jié)合在RANK-L三聚體上的不同受體結(jié)合位點。同樣地，用于本發(fā)明該實施方案中的一些特 別優(yōu)選的納米抗體描述在SEQ ID NO's :560-621中，以及其人源化的和其他變體（諸如例 如SEQ ID NO's :730-757和765);和本文所述的針對人血清白蛋白的納米抗體。本發(fā)明該 實施方案的一個優(yōu)選的、但非限制性的構(gòu)建體是SEQ ID NO' s :694-729和759-760。
[0106] 以下也在本發(fā)明的范圍內(nèi)：使用本發(fā)明氨基酸序列和多肽的部分、片段、類似物、 突變體、變體、等位基因和/或衍生物，和/或使用包括一種或多種所述部分、片段、類似物、 突變體、變體、等位基因和/或衍生物或基本上由其組成的蛋白或多肽，只要這些適于本文 所述的應(yīng)用。所述部分、片段、類似物、突變體、變體、等位基因和/或衍生物通常包含（至 少部分）用于結(jié)合RANK-L的功能性抗原-結(jié)合位點；且更優(yōu)選地能夠與RANK-L特異性結(jié) 合，且甚至更優(yōu)選地能夠以本文所述的親和力（適當(dāng)?shù)販y量和/或表示為K D-值（實際的 或表觀的），KA-值（實際的或表觀的），km-速率和/或k。^-速率，或備選地作為IC 5(I值， 如本發(fā)明進一步所述）與RANK-L結(jié)合。所述部分、片段、類似物、突變體、變體、等位基因、 衍生物、蛋白和/或多肽的一些非限制性實例將通過本發(fā)明的進一步描述變得清楚。還可 以通過適當(dāng)組合（即，通過連接或基因融合）一個或多個（更小的）本發(fā)明所述的部分或 片段而提供本發(fā)明的其他片段或多肽。
[0107] 在本發(fā)明的一個具體而非限制性方面中，其將在本發(fā)明中進一步描述，與它們衍 生而來的氨基酸序列相比，所述類似物、突變體、變體、等位基因、衍生物在血清中具有增加 的半衰期（如本文進一步所述）。例如，可以將本發(fā)明的氨基酸序列連接到（化學(xué)或其他方 式）一個或多個延長半衰期的基團或部分（諸如PEG)上，以提供具有增加的半衰期的本發(fā) 明的氨基酸序列的衍生物。
[0108] 在一個具體而非限制性的方面中，本發(fā)明的氨基酸序列可以是包括免疫球蛋白 折疊的氨基酸序列，或可以是在適當(dāng)條件（諸如生理條件）下能夠形成免疫球蛋白折疊 (即，通過折疊）的氨基酸序列。其中特別參考Halaby等，J. (1999)蛋白質(zhì)工程（Protein Eng. ) 12,563-71的綜述。優(yōu)選地，當(dāng)正確折疊以形成免疫球蛋白折疊時，這樣的氨基酸序 列能夠特異性結(jié)合（如本發(fā)明所定義）RANK-L ;并且更優(yōu)選地能夠以如本發(fā)明所定義的親 和力（適當(dāng)?shù)販y量和/或表示為KD-值（實際的或表觀的），K A-值（實際的或表觀的）， km_速率和/或kf-速率，或備選地作為IC5(I值，如本發(fā)明進一步所述）結(jié)合RANK-L。此 夕卜，所述氨基酸序列的部分、片段、類似物、突變體、變體、等位基因和/或衍生物優(yōu)選是這 樣的，以致它們包括免疫球蛋白折疊或者能夠在適當(dāng)?shù)臈l件下形成免疫球蛋白折疊。
[0109] 特別地，但不限于，本發(fā)明的氨基酸序列可以是基本上由4個構(gòu)架區(qū)（分別為 FRi-FR4)和3個互補性決定區(qū)（分別為⑶R1-⑶R3)組成的氨基酸序列；或所述氨基酸序 列的任何適當(dāng)?shù)钠危敲雌渫ǔ辽僖恍┬纬芍辽僖粋€CDR的氨基酸殘基，如本 文進一步所述）。
[0110] 本發(fā)明的氨基酸序列可以特別是免疫球蛋白序列或其適當(dāng)?shù)钠危⑶腋貏e地 是免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序列或其適當(dāng)?shù)钠?，諸如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列（例如，\，-序 列）或其適當(dāng)?shù)钠危换蛑劓溈勺兘Y(jié)構(gòu)域序列（例如，V H-序列）或其適當(dāng)?shù)钠巍．?dāng)本發(fā) 明的氨基酸序列是重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列時，它可以是來源于常規(guī)四鏈抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu) 域序列（諸如，不限于，來源于人抗體的V H序列），或是來源于所謂的"重鏈抗體"（如本文 所定義）的所謂的VHH-序列（如本文所定義）。
[0111] 然而，應(yīng)該注意到，本發(fā)明不限制本發(fā)明的氨基酸序列的來源（或用于表達其的 本發(fā)明的核苷酸序列的來源），也不限制產(chǎn)生或獲得（或已經(jīng)產(chǎn)生或獲得）本發(fā)明的氨基酸 序列或核苷酸序列的方法。因此，本發(fā)明的氨基酸序列可以是天然存在的氨基酸序列（來 自任何適當(dāng)?shù)奈锓N）或合成的或半合成的氨基酸序列。在本發(fā)明的具體而非限制性方面， 所述氨基酸序列是天然存在的免疫球蛋白序列（來自任何適當(dāng)?shù)奈锓N）或合成的或半合成 的免疫球蛋白序列，包括但不限于"人源化的"（如本文所定義）免疫球蛋白序列（諸如部 分或完全人源化的小鼠或兔免疫球蛋白序列，并且特別是部分或完全人源化的V HH序列或 納米抗體），"駱駝源化的（camelized)"（如本文所定義）免疫球蛋白序列，以及已經(jīng)通過 下列技術(shù)獲得的免疫球蛋白序列：諸如親和力成熟（例如，起始于合成的、隨機的或天然存 在的免疫球蛋白序列），CDR移植，鑲蓋術(shù)（veneering)，組合來源于不同的免疫球蛋白序列 的片段，利用重疊的引物進行的PCR裝配，以及熟練的技術(shù)人員公知的加工免疫球蛋白序 列的相似技術(shù)；或前述任一項的任何適當(dāng)?shù)慕M合。例如，參考標準手冊，以及進一步描述和 本文提及的現(xiàn)有技術(shù)。
[0112] 類似地，本發(fā)明的核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或合成的或半合成的 序列，并且例如，可以是通過PCR從適當(dāng)?shù)奶烊淮嬖诘哪０澹ɡ?，從細胞分離的DNA或 RNA)分離的序列，已經(jīng)從文庫（并且特別是表達文庫）分離的核苷酸序列，已經(jīng)通過向天然 存在的核苷酸序列中引入突變（利用任何適當(dāng)?shù)谋旧硪阎募夹g(shù)，諸如錯配PCR)而制備的 核苷酸序列，已經(jīng)使用重疊的引物通過PCR制備的核苷酸序列，或已經(jīng)利用本身已知的DNA 合成技術(shù)制備的核苷酸序列。
[0113] 本發(fā)明的氨基酸序列可以特別是結(jié)構(gòu)域抗體（或適合用作結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸 序列），單結(jié)構(gòu)域抗體（或適合用作單結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序列），"dAb"(或適合用作 dAb的氨基酸序列）或納米抗體（如本文所定義，并且包括但不限于Vhh序列）；其它單可 變結(jié)構(gòu)域，或它們中任一種的任何適當(dāng)?shù)钠巍τ冢▎危┙Y(jié)構(gòu)域抗體的概括描述，參考上 文引用的現(xiàn)有技術(shù)，以及參考EP 0 368 684。對于術(shù)語"dAb' s"，例如，參考Ward等（自 然（Nature) 1989 年 10 月 12 日；341 (6242) :544-6)，參考 Holt 等，生物技術(shù)趨勢（Trends Biotechnol·)，2003, 21 (11) :484-490 ;以及例如參考 TO 06/030220, W006/003388 與 Domantis(Domantis Ltd.)有限公司的其它公布的專利申請。還應(yīng)該注意到，盡管由于它們 不是哺乳動物來源的，在本發(fā)明的情形中較不優(yōu)選，但是單結(jié)構(gòu)域抗體或單可變結(jié)構(gòu)域可 以來源于某些鯊魚（shark)物種（例如，所謂的"IgNAR結(jié)構(gòu)域"，參見例如W0 05/18629)。
[0114] 特別地，本發(fā)明的氨基酸序列可以是納米抗體? (如本文所定義）或其適當(dāng)?shù)?片段。[注意：納米抗參? CMawlwrfjXl) Λ納米抗擊? OViiiwdoifcs) ?和納米克凝_ 蘭e.+κ)為埃博靈克斯股份有限公司（Ablynx N.V.)的注冊商標]。所述針對 RANK-L的納米抗體在本文也稱為"本發(fā)明的納米抗體"。
[0115] 對于納米抗體的概括描述，參考下文的進一步描述，以及參考本文所引用的現(xiàn)有 技術(shù)。在這一方面，然而，應(yīng)該注意到，本文描述和現(xiàn)有技術(shù)主要描述所謂"V H3種類"的納 米抗體（即，與VH3種類的人種系序列如DP-47、DP-51或DP-29具有高度序列同源性的納 米抗體），所述納米抗體形成本發(fā)明的優(yōu)選方面。然而，應(yīng)該注意到，本發(fā)明在其最廣泛意 義上通常涵蓋任何類型的針對RANK-L的納米抗體，并且例如，還涵蓋屬于所謂的"VH4種類" 的納米抗體（即，與VH4種類的人種系序列如DP-78具有高度序列同源性的納米抗體），例 如，如在W0 07/118670中描述。
[0116] 一般地，納米抗體（特別是Vhh序列和部分人源化的納米抗體）可以特別地特征 在于，在一個或多個構(gòu)架序列（同樣如本文進一步所述）中存在一個或多個"標志殘基 (hallmark residues) "（如本文所述）。
[0117] 因此，通常，納米抗體可以定義為具有下述（通用）結(jié)構(gòu)的氨基酸序列：
[0118] FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0119] 其中FR1-FR4分別是指構(gòu)架區(qū)1-4,并且其中⑶R1-⑶R3分別是指互補性決定區(qū) 1-3,并且其中一個或多個標志殘基如本文進一步所定義。
[0120] 特別地，納米抗體可以是具有下述（通用）結(jié)構(gòu)的氨基酸序列：
[0121] FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0122] 其中FR1-FR4分別是指構(gòu)架區(qū)1-4,并且其中⑶R1-⑶R3分別是指互補性決定區(qū) 1-3,并且其中所述構(gòu)架序列如本文進一步所定義。
[0123] 更特別地，納米抗體可以是具有下述（通用）結(jié)構(gòu)的氨基酸序列：
[0124] FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0125] 其中FR1-FR4分別是指構(gòu)架區(qū)1-4,并且其中⑶R1-⑶R3分別是指互補性決定區(qū) 1-3,并且其中：
[0126] i)優(yōu)選地，在按照 Kabat 編號的位置 11，37,44,45,47, 83,84,103,104 和 108 的氨 基酸殘基的一個或多個選自下表A-3中提及的標志殘基；
[0127] 并且其中：
[0128] ii)所述氨基酸序列與SEQ ID NO' s :1-22中的至少一種氨基酸序列具有至少 80%的氨基酸同一性，其中為了確定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基 酸殘基（在序列SEQ ID NO' s :1-22中表示為X)。
[0129] 在這些納米抗體中，所述⑶R序列通常如本文進一步所定義。
[0130] 因此，本發(fā)明還涉及這樣的納米抗體，其可以結(jié)合（如本文定義）和/或針對 RANK-L，涉及其適當(dāng)?shù)钠?，以及涉及包括一種或多種所述納米抗體和/或適當(dāng)?shù)钠位?基本上由其組成的多肽。
[0131] SEQ ID NO' s :560-621給出已經(jīng)針對RANK-L獲得的多種Vhh序列的氨基酸序列。
[0132] 特別地，本發(fā)明在一些具體的方面中提供：
[0133] -針對（如本文定義）RANK-L和與SEQ ID NO's :560-621的至少一種氨基酸序列 具有至少80 %、優(yōu)選至少85 %、如90 %或95 %或更多的序列同一性的的氨基酸序列。這些 氨基酸序列可以進一步是這樣的，以致它們中和RANK或0PG與RANK-L的結(jié)合；和/或與 RANK或0PG競爭與RANK-L結(jié)合；和/或針對RANK-L上的相互作用位點（如本文定義）（諸 如RANK或0PG結(jié)合位點）；
[0134] -交叉阻斷（如本文定義）SEQ ID NO's :560-621的至少一種氨基酸序列與RANK-L 的結(jié)合和/或與SEQ ID NO's :560-621的至少一種氨基酸序列競爭與RANK-L結(jié)合的氨基 酸序列。同樣地，這些氨基酸序列可以進一步是這樣的，以致它們中和同源配體與RANK-L 的結(jié)合；和/或與所述同源配體競爭與RANK-L的結(jié)合；和/或針對RANK-L上的相互作用位 點（如本文定義）（諸如RANK或OPG結(jié)合位點）；
[0135] 所述氨基酸序列可以如本文進一步所述（且可以例如是納米抗體）；以及包括一 種或多種所述氨基酸序列的本發(fā)明的多肽（其可以如本文進一步所述，且可以例如是雙特 異性和/或二互補位多肽，如本文所述），和編碼所述氨基酸序列和多肽的核酸序列。所述 氨基酸序列和多肽不包括任何天然存在的配體。
[0136] 因此，本發(fā)明的一些特別優(yōu)選的納米抗體是可以結(jié)合（如本文進一步所定義）和 /或針對RANK-L的納米抗體，且其：
[0137] i)與SEQ ID NO' s :560-621的至少一個氨基酸序列具有80%的氨基酸同一性， 其中為了確定氨基酸同一性的程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸殘基。在這一方面， 還參考表A-1，其列出了 SEQ ID NO' s :560-621的納米抗體的構(gòu)架1序列（SEQ ID NO' s : 126-187)，構(gòu)架 2 序列（SEQ ID NO' s :250-311)，構(gòu)架 3 序列（SEQ ID NO' s :374-435)和 構(gòu)架4序列（SEQ ID NO's :498-559)(關(guān)于在所述構(gòu)架1序列的位置1-4和27-30的氨基 酸殘基，還參考下文的評述。因此，為了確定氨基酸同一性的程度，優(yōu)選地忽略這些殘基；
[0138] 并且其中：
[0139] ii)優(yōu)選地，在按照 Kabat 編號的位置 11，37,44,45,47,83,84,103,104 和 108 的 氨基酸殘基的一個或多個選自下表A-3中提及的標志殘基。在這些納米抗體中，所述CDR 序列通常如本文進一步所定義。
[0140] 同樣地，所述納米抗體可以以任何適當(dāng)?shù)姆绞将@得，并且來源于任何適當(dāng)?shù)膩碓矗?并且例如，可以是天然存在的Vhh序列（即，來自于適當(dāng)?shù)鸟橊劊–amelid)物種）或合成的 或半合成的氨基酸序列，包括但不限于"人源化的"（如本文所定義）納米抗體，"駱駝源化 的"（如本文所定義）免疫球蛋白序列（并且特別是駱駝源化的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列），以 及已經(jīng)通過下列技術(shù)獲得的納米抗體：諸如親和力成熟（例如，起始于合成的、隨機的或天 然存在的免疫球蛋白序列），CDR移植，鑲蓋術(shù)，組合來源于不同的免疫球蛋白序列的片段， 利用重疊的引物進行的PCR裝配，以及熟練的技術(shù)人員公知的加工免疫球蛋白序列的相似 技術(shù)；或前述任一項的任何適當(dāng)?shù)慕M合，這如本文進一步描述。此外，當(dāng)納米抗體包括V HH序 列時，所述納米抗體可以適當(dāng)?shù)乇蝗嗽椿?，如本文進一步所述，以便提供一個或多個本發(fā)明 的進一步（部分或完全）人源化的納米抗體。類似地，當(dāng)納米抗體包括合成的或半合成的 序列（諸如部分人源化的序列）時，所述納米抗體可以任選地進一步適當(dāng)?shù)乇蝗嗽椿?，同?如本文所述，同樣以便提供一個或多個其他本發(fā)明的（部分或完全）人源化的納米抗體。
[0141] 特別地，人源化的納米抗體可以是如前述段落中關(guān)于納米抗體概括定義的氨基酸 序列，但是其中存在至少一個這樣的氨基酸殘基（并且特別地，在至少一個構(gòu)架殘基中）， 所述氨基酸殘基是和/或?qū)?yīng)人源化的取代（如本文所定義）?；诒疚墓_的內(nèi)容，對于 熟練的技術(shù)人員，一些優(yōu)選的、而非限制性的人源化取代（及其適當(dāng)?shù)慕M合）將變得清楚。 另外，或者備選地，通過比較天然存在的V HH序列的構(gòu)架區(qū)序列與一個或多個緊密相關(guān)的人 VH序列的相對應(yīng)的構(gòu)架序列，可以確定其它潛在有用的人源化取代，此后，可以將由此確定 的一個或多個潛在有用的人源化取代（或其組合）引入到所述Vhh序列中（以本身已知的 任何方式，如本文進一步所述），并且可以檢測所得到的人源化的V HH序列對靶標的親和力、 穩(wěn)定性、表達的容易性和水平、和/或其它需要的特性。以這種方式，通過利用有限的試驗 和誤差程度，熟練的技術(shù)人員基于本文公開的內(nèi)容可以確定其它適當(dāng)?shù)娜嗽椿〈ɑ蚱?適當(dāng)?shù)慕M合）。此外，基于前述內(nèi)容，納米抗體（的構(gòu)架區(qū)）可以是部分人源化的或完全人 源化的。
[0142] 本發(fā)明一些特別優(yōu)選的人源化的納米抗體是SEQ ID NO' s :560-621的納米抗體 的人源化變體，其中SEQ ID NO' s :730-757和765的氨基酸序列是一些特別優(yōu)選的實例。
[0143] 因此，本發(fā)明一些其它優(yōu)選的納米抗體是這樣的納米抗體，其可以結(jié)合（如本文 進一步所述）RANK-L，并且其：
[0144] i)是SEQ ID NO' s :560-621的氨基酸序列之一的人源化變體；和/或
[0145] ii)與SEQ ID NO's :560-621 的至少一個氨基酸序列和/或SEQ ID NO's :730-757 和765的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一'丨生，其中為了確定氨基酸同一·I"生 程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸殘基；
[0146] 并且其中：
[0147] i)優(yōu)選地，在依據(jù) Kabat 編號的位置 11，37,44,45,47, 83,84,103,104 和 108 的一 個或多個氨基酸殘基選自下表A-3中提及的標志殘基。
[0148] 按照本發(fā)明的另一個具體方面，本發(fā)明提供許多特別適合結(jié)合RANK-L的氨基酸 殘基的序列（streches)(即，小肽）。這些氨基酸殘基的序列可以存在于，和/或可以結(jié)合 在本發(fā)明的氨基酸序列中，特別以它們形成本發(fā)明的氨基酸序列的（部分）抗原結(jié)合位點 這樣的方式存在和/或結(jié)合。由于這些氨基酸殘基序列最初作為針對RANK-L產(chǎn)生的重鏈 抗體或V HH序列的CDR序列產(chǎn)生（或可以基于和/或來源于所述CDR序列，如本文進一步 所述），在本發(fā)明中它們還將通常被稱為"CDR序列"（即，分別稱為CDR1序列，CDR2序列 和CDR3序列）。然而，應(yīng)該注意到，本發(fā)明在其最廣泛意義上不限于這些氨基酸殘基序列 可能在本發(fā)明的氨基酸序列中具有的特有的結(jié)構(gòu)作用或功能，只要這些氨基酸殘基序列允 許本發(fā)明的氨基酸序列與RANK-L結(jié)合。因此，一般地，本發(fā)明在其最廣泛意義上包括任何 這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列能夠與RANK-L結(jié)合，并且包括一個或多個本文所述的 CDR序列，并且特別地兩個或更多個所述CDR序列的適當(dāng)組合，其通過一個或多個其它氨基 酸序列彼此適當(dāng)連接，以致整個氨基酸序列形成能夠結(jié)合RANK-L的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或結(jié)合 單位。然而，還應(yīng)該注意到，在本發(fā)明的氨基酸序列中僅存在一個所述CDR序列可以本身已 經(jīng)足以提供能夠結(jié)合RANK-L的本發(fā)明的氨基酸序列；例如，同樣參考W0 03/050531中描述 的所謂的"派遣片段（Expedite fragments)"。
[0149] 因此，在另一個具體而非限制性的方面，本發(fā)明的氨基酸序列可以是這樣的氨基 酸序列，所述氨基酸序列包括選自由本文所述的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列（或它 們的任何適當(dāng)?shù)慕M合）組成的組的至少一個氨基酸序列。特別地，本發(fā)明的氨基酸序列可 以是包括至少一個抗原結(jié)合位點的氨基酸序列，其中所述抗原結(jié)合位點包括選自由本文所 述的⑶R1序列XDR2序列和⑶R3序列（或它們的任何適當(dāng)?shù)慕M合）組成的組的至少一個 氨基酸序列。
[0150] 一般地，在本發(fā)明的這一方面中，本發(fā)明的氨基酸序列可以是包括至少一個氨基 酸殘基序列的任何氨基酸序列，其中所述氨基酸殘基序列具有與本文所述的至少一個CDR 序列的序列相對應(yīng)的氨基酸序列。這樣的氨基酸序列可以或可以不包括免疫球蛋白折疊。 例如，并且不限于，這樣的氨基酸序列可以是適當(dāng)?shù)拿庖咔虻鞍仔蛄衅危銎伟ㄖ?少一個所述CDR序列，但是其不夠大，不足以形成（完整）的免疫球蛋白折疊（例如，同樣 參考WO 03/050531中所述的"派遣片段"）。備選地，這樣的氨基酸序列可以是適當(dāng)?shù)?蛋 白支架"，所述蛋白支架包括與這樣的CDR序列相對應(yīng)（S卩，作為其抗原結(jié)合位點的一部分） 的至少一個氨基酸殘基序列。用于呈遞氨基酸序列的適當(dāng)?shù)闹Ъ軐τ谑炀毜募夹g(shù)人員將是 清楚的，并且例如，包括，但不限于，基于或來源于免疫球蛋白的結(jié)合支架（即，除了本文已 經(jīng)描述的免疫球蛋白序列之外），來源于蛋白質(zhì)A結(jié)構(gòu)域的蛋白支架（諸如Affibodies?)， 淀粉酶抑肽（tendamistat)，纖連蛋白，脂籠蛋白，CTLA-4, T-細胞受體，設(shè)計的錨蛋白重復(fù) 序列，avimers 和 PDZ 結(jié)構(gòu)域（Binz 等，Nat. Biotech (自然生物技術(shù)）2005,卷 23 :1257), 和基于DNA或RNA的結(jié)合部分，包括但不限于DNA或RNA適體（Ulrich等，組合化學(xué)高通量 篩選（Comb Chem High Throughput Screen) 20069 (8) :619-32)。
[0151] 同樣地，包括一個或多個這些CDR序列的任何本發(fā)明的氨基酸序列優(yōu)選是這樣 的，以致其可以特異性結(jié)合（如本文所定義）RANK-L，并且更特別地是這樣的，以致其可以 以如本文所限定的親和力（適當(dāng)測量和/或表示為K D-值（實際的或表觀的），KA-值（實 際的或表觀的），km-速率和/或k。^-速率，或備選地作為IC 5(I值，如本文進一步所述）與 RANK-L 結(jié)合。
[0152] 更特別地，本發(fā)明該方面所述的氨基酸序列可以是包括至少一個抗原結(jié)合位點的 任何氨基酸序列，其中所述抗原結(jié)合位點包括選自由本文所述的CDR1序列、本文所述的 CDR2序列和本文所述的CDR3序列組成的組的至少兩個氨基酸序列，以致（i)當(dāng)?shù)谝话被?序列選自本文所述的CDR1序列時，第二氨基酸序列選自本文所述的CDR2序列或本文所述 的CDR3序列；（ii)當(dāng)?shù)谝话被嵝蛄羞x自本文所述的CDR2序列時，第二氨基酸序列選自 本文所述的CDR1序列或本文所述的CDR3序列；或（iii)當(dāng)?shù)谝话被嵝蛄羞x自本文所述 的CDR3序列時，第二氨基酸序列選自本文所述的CDR1序列或本文所述的CDR3序列。
[0153] 甚至更特別地，本發(fā)明的氨基酸序列可以是包括至少一個抗原結(jié)合位點的氨基酸 序列，其中所述抗原結(jié)合位點包括選自由本文所述的CDR1序列、本文所述的CDR2序列和本 文所述的CDR3序列組成的組的至少三個氨基酸序列，以致第一氨基酸序列選自本文所述 的CDR1序列，第二氨基酸序列選自本文所述的CDR2序列，并且第三氨基酸序列選自本文所 述的⑶R3序列。⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的優(yōu)選組合將通過本文的進一步描述變得清楚。 對于熟練的技術(shù)人員將是清楚的，這樣的氨基酸序列優(yōu)選是免疫球蛋白序列（如本文進一 步所述），但是例如，它也可以是包括呈遞所述CDR序列的適當(dāng)?shù)闹Ъ艿娜魏纹渌陌被?序列。
[0154] 因此，在一個具體而非限制性方面中，本發(fā)明涉及針對RANK-L的氨基酸序列，其 包括選自由下列各項組成的組的一個或多個氨基酸殘基序列：
[0155] a) SEQ ID NO' s :188-249 的氨基酸序列；
[0156] b)與SEQ ID NO's :188-249的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0157] c)與SEQ ID NO's :188-249的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0158] d)SEQ ID NO' s :312-373 和 758 的氨基酸序列；
[0159] e)與SEQ ID NO's :312-373和758的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基 酸同一性的氨基酸序列；
[0160] f)與SEQ ID NO's :312-373和758的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基 酸差異的氨基酸序列；
[0161] g)SEQ ID NO' s :436-497 的氨基酸序列；
[0162] h)與SEQ ID NO's :436-497的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0163] i)與SEQ ID NO's :436-497的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0164] 或它們的任何適當(dāng)?shù)慕M合。
[0165] 當(dāng)本發(fā)明的氨基酸序列包含b)和/或c)所述的一個或多個氨基酸序列時：
[0166] i)與a)所述的相對應(yīng)氨基酸序列相比，在b)和/或c)所述的氨基酸序列中的任 何氨基酸取代優(yōu)選是保守氨基酸取代，（如本文所定義）；
[0167] 和/或
[0168] ii)與a)所述的相對應(yīng)氨基酸序列相比，b)和/或c)所述的氨基酸序列優(yōu)選地 僅包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入；
[0169] 和/或
[0170] iii)利用一種或多種本身已知的的親和力成熟技術(shù)通過親和力成熟的方式，b) 和/或c)所述的氨基酸序列可以是來源于a)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0171] 類似地，當(dāng)本發(fā)明的氨基酸序列包含e)和/或f)所述的一個或多個氨基酸序列 時：
[0172] i)與d)所述的相對應(yīng)氨基酸序列相比，在e)和/或f)所述的氨基酸序列中的任 何氨基酸取代優(yōu)選是保守氨基酸取代，（如本文所定義）；
[0173] 和 / 或
[0174] ii)與d)所述的相對應(yīng)氨基酸序列相比，e)和/或f)所述的氨基酸序列優(yōu)選地 僅包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入；
[0175] 和 / 或
[0176] iii)利用一種或多種本身已知的親和力成熟技術(shù)通過親和力成熟的方式，e)和/ 或f)所述的氨基酸序列可以是來源于d)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0177] 此外，類似地，當(dāng)本發(fā)明的氨基酸序列包含h)和/或i)所述的一個或多個氨基酸 序列時：
[0178] i)與g)所述的相對應(yīng)氨基酸序列相比，在h)和/或i)所述的氨基酸序列中的任 何氨基酸取代優(yōu)選是保守氨基酸取代，（如本文所定義）；
[0179] 和 / 或
[0180] ii)與g)所述的相對應(yīng)氨基酸序列相比，h)和/或i)所述的氨基酸序列優(yōu)選地 僅包含氨基酸取代，并且沒有氨基酸刪除或插入；
[0181] 和/或
[0182] iii)利用一種或多種本身已知的的親和力成熟技術(shù)通過親和力成熟的方式，h) 和/或i)所述的氨基酸序列可以是來源于g)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0183] 應(yīng)該理解，最后的前述段落通常也適用于分別包括13)，(3)，6)4)，11)或1)所述的 一個或多個氨基酸序列的本發(fā)明的任何氨基酸序列。
[0184] 在該具體方面中，所述氨基酸序列優(yōu)選地包括選自由下列各項組成的組的一個或 多個氨基酸殘基序列：
[0185] i)SEQ ID NO' s :188-249 的氨基酸序列；
[0186] ii)SEQ ID NO' s :312-373 和 758 的氨基酸序列；和
[0187] iii)SEQ ID NO' s :436-497 的氨基酸序列；
[0188] 或它們的任何適當(dāng)組合。
[0189] 此外，優(yōu)選地，在這樣的氨基酸序列中，至少一個所述氨基酸殘基序列形成結(jié)合 RANK-L的抗原結(jié)合位點的一部分。
[0190] 在一個更具體而同樣非限制性的方面中，本發(fā)明涉及針對RANK-L的氨基酸序列， 其包括選自由下列各項組成的組的兩個或更多個氨基酸殘基序列：
[0191] a) SEQ ID NO' s :188-249 的氨基酸序列；
[0192] b)與SEQ ID NO's :188-249的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0193] c)與SEQ ID NO's :188-249的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0194] d)SEQ ID NO' s :312-373 和 758 的氨基酸序列；
[0195] e)與SEQ ID NO's :312-373和758的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基 酸同一性的氨基酸序列；
[0196] f)與SEQ ID NO's :312-373和758的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基 酸差異的氨基酸序列；
[0197] g)SEQ ID NO' s :436-497 的氨基酸序列；
[0198] h)與SEQ ID NO's :436-497的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0199] i)與SEQ ID NO's :436-497的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0200] 以致（i)當(dāng)?shù)谝话被釟埢蛄袑?yīng)于a)，b)或c)所述的氨基酸序列之一時，第 二氨基酸殘基序列對應(yīng)于d)，e)，f)，g)，h)或i)所述的氨基酸序列之一；（ii)當(dāng)?shù)谝话被?酸殘基序列對應(yīng)于d)，e)或f)所述的氨基酸序列之一時，第二氨基酸殘基序列對應(yīng)于a)， b)，c)，g)，h)或i)所述的氨基酸序列之一；或（iii)當(dāng)?shù)谝话被釟埢蛄袑?yīng)于g)，h) 或i)所述的氨基酸序列之一時，第二氨基酸殘基序列對應(yīng)于a)，b)，c)，d)，e)或f)所述 的氨基酸序列之一。
[0201] 在該具體方面中，所述氨基酸序列優(yōu)選地包括選自由下列各項組成的組的兩個以 上的氨基酸殘基序列：
[0202] i)SEQ ID NO' s :188-249 的氨基酸序列；
[0203] ii)SEQ ID NO' s :312-373 和 758 的氨基酸序列；和
[0204] iii) SEQ ID NO' s :436-497 的氨基酸序列；
[0205] 以致，（i)當(dāng)?shù)谝话被釟埢蛄袑?yīng)于SEQ ID NO' s :188-249的氨基酸序列之 一時，第二氨基酸殘基序列對應(yīng)于SEQ ID NO's :312-373和758或SEQ ID NO's :436-497 的氨基酸序列之一；（ii)當(dāng)?shù)谝话被釟埢蛄袑?yīng)于SEQ ID NO' s :312-373和758的 氨基酸序列之一時，第二氨基酸殘基序列對應(yīng)于SEQ ID NO's :188-249或SEQ ID NO's: 436-497的氨基酸序列之一；或（iii)當(dāng)?shù)谝话被釟埢蛄袑?yīng)于SEQ ID NO's :436-497 的氨基酸序列之一時，第二氨基酸殘基序列對應(yīng)于SEQ ID NO's :188-249或SEQ ID NO's: 312-373和758的氨基酸序列之一。
[0206] 此外，在這樣的氨基酸序列中，所述至少兩個氨基酸殘基序列同樣優(yōu)選地形成結(jié) 合RANK-L的抗原結(jié)合位點的一部分。
[0207] 在甚至更具體而非限制性的方面中，本發(fā)明涉及針對RANK-L的氨基酸序列，其包 括三個或更多個氨基酸殘基序列，其中第一氨基酸殘基序列選自由下列各項組成的組：
[0208] a) SEQ ID NO' s :188-249 的氨基酸序列；
[0209] b)與SEQ ID NO's :188-249的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0210] c)與SEQ ID NO's :188-249的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0211] 第二氨基酸殘基序列選自由下列各項組成的組：
[0212] d)SEQ ID NO' s :312-373 和 758 的氨基酸序列；
[0213] e)與SEQ ID NO's :312-373和758的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基 酸同一性的氨基酸序列；
[0214] f)與SEQ ID NO's :312-373和758的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基 酸差異的氨基酸序列；
[0215] 并且第三氨基酸殘基序列選自由下列各項組成的組：
[0216] g)SEQ ID NO' s :436-497 的氨基酸序列；
[0217] h)與SEQ ID NO's :436-497的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0218] i)與SEQ ID NO's :436-497的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0219] 優(yōu)選地，在該具體方面中，第一氨基酸殘基序列選自由SEQ ID NO' s :188-249的 氨基酸序列組成的組；第二氨基酸殘基序列選自由SEQ ID NO's :312-373和758的氨基酸 序列組成的組；并且第三氨基酸殘基序列選自由SEQ ID NO's :436-497的氨基酸序列組成 的組。
[0220] 同樣地，優(yōu)選地，在這樣的氨基酸序列中，所述至少三個氨基酸殘基序列形成結(jié)合 RANK-L的抗原結(jié)合位點的一部分。
[0221] 所述氨基酸序列的序列的優(yōu)選組合將通過本文進一步的公開內(nèi)容變得清楚。
[0222] 優(yōu)選地，在所述氨基酸序列中，所述⑶R序列與SEQ ID NO's 560-621的至少一個 氨基酸序列的CDR序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同一性，更 優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，諸如95%的氨基酸同一性或更多，或甚至基本上100%的 氨基酸同一性。這種氨基酸同一性程度可以例如通過確定所述氨基酸序列與SEQ ID NO's 560-621中的一個或多個序列之間的氨基酸同一'丨生的程度（以本文所述的方式）而確定，其 中忽視形成構(gòu)架區(qū)的氨基酸殘基。此外，本發(fā)明的所述氨基酸序列可以如本文進一步所述。
[0223] 此外，所述氨基酸序列優(yōu)選是這樣的，以致它們可以特異性結(jié)合（如本文所定義） RANK-L ;并且更特別地以如本文所定義的親和力結(jié)合RANK-L (適當(dāng)測量和/或表示為KD-值 (實際的或表觀的），KA-值（實際的或表觀的），km-速率和/或kf-速率，或備選地為IC 5Q 值，如本文進一步所述）。
[0224] 當(dāng)本發(fā)明的氨基酸序列基本上由4個構(gòu)架區(qū)（分別為FR1-FR4)和3個互補性決 定區(qū)（分別為CDR1-CDR3)組成時，本發(fā)明的氨基酸序列優(yōu)選地是這樣的，以致：
[0225] -⑶R1選自由下列各項組成的組：
[0226] a) SEQ ID NO' s :188-249 的氨基酸序列；
[0227] b)與SEQ ID NO's :188-249的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0228] c)與SEQ ID NO's :188-249的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0229] 和 / 或
[0230] -⑶R2選自由下列各項組成的組：
[0231] d)SEQ ID NO' s :312-373 和 758 的氨基酸序列；
[0232] e)與SEQ ID NO's :312-373和758的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基 酸同一性的氨基酸序列；
[0233] f)與SEQ ID NO's :312-373和758的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基 酸差異的氨基酸序列；
[0234] 和 / 或
[0235] -⑶R3選自由下列各項組成的組：
[0236] g)SEQ ID NO' s :436-497 的氨基酸序列；
[0237] h)與SEQ ID NO's :436-497的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0238] i)與SEQ ID NO's :436-497的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基酸差異 的氨基酸序列。
[0239] 特別地，這樣的本發(fā)明的氨基酸序列可以是這樣的，以致⑶R1選自由SEQ ID NO's :188-249的氨基酸序列組成的組；和/或CDR2選自由SEQ ID NO's :312-373和758 的氨基酸序列組成的組；和/或⑶R3選自由SEQ ID NO' s :436-497的氨基酸序列組成的 組。
[0240] 特別地，當(dāng)本發(fā)明的氨基酸序列基本上由4個構(gòu)架區(qū)（分別為FR1-FR4)和3個互 補性決定區(qū)（分別為⑶R1-⑶R3)組成時，本發(fā)明的氨基酸序列優(yōu)選地是這樣，以致：
[0241] -⑶R1選自由下列各項組成的組：
[0242] a) SEQ ID NO' s :188-249 的氨基酸序列；
[0243] b)與SEQ ID NO's :188-249的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0244] c)與SEQ ID NO's :188-249的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；
[0245] 并且
[0246] -⑶R2選自由下列各項組成的組：
[0247] d)SEQ ID NO' s :312-373 和 758 的氨基酸序列；
[0248] e)與SEQ ID NO's :312-373和758的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基 酸同一性的氨基酸序列；
[0249] f)與SEQ ID NO's :312-373和758的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基 酸差異的氨基酸序列；
[0250] 并且
[0251] -⑶R3選自由下列各項組成的組：
[0252] g)SEQ ID NO' s :436-497 的氨基酸序列；
[0253] h)與SEQ ID NO's :436-497的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一 性的氨基酸序列；
[0254] i)與SEQ ID NO's :436-497的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基酸差異 的氨基酸序列；或這樣的氨基酸序列的任何適當(dāng)?shù)钠巍?br> [0255] 特別地，這樣的本發(fā)明的氨基酸序列可以是這樣的，以致⑶R1選自由SEQ ID NO's :188-249的氨基酸序列組成的組；并且CDR2選自由SEQ ID NO's :312-373和758的 氨基酸序列組成的組；并且⑶R3選自由SEQ ID NO' s :436-497的氨基酸序列組成的組。
[0256] 同樣地，優(yōu)選的⑶R序列的組合將通過本文的進一步描述而變得清楚。
[0257] 此外，所述氨基酸序列優(yōu)選是這樣的，以致它們可以特異性結(jié)合（如本文所定義） RANK-L ;并且更特別地以如本文所定義的親和力結(jié)合RANK-L (適當(dāng)測量和/或表示為KD-值 (實際的或表觀的），KA-值（實際的或表觀的），k m_速率和/或k。^-速率，或備選地作為 IC5(I值，如本文進一步所述）。
[0258] 在一個優(yōu)選而非限制性方面中，本發(fā)明涉及基本上由4個構(gòu)架區(qū)（分別為 FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)（分別為CDR1-CDR3)組成的氨基酸序列，其中所述氨基酸序 列的⑶R序列與SEQ ID NO' s :560-621的至少一個氨基酸序列的⑶R序列具有至少70% 的氨基酸同一性，優(yōu)選至少80%的氨基酸同一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，諸如 95%的氨基酸同一性或更多，或者甚至基本上100%的氨基酸同一性。例如，這種氨基酸同 一性的程度可以通過確定在所述氨基酸序列和SEQ ID NO's :560-621的一個或多個序列 之間的氨基酸同一性程度（以本文所述的方式）而確定，其中忽略形成所述構(gòu)架區(qū)的氨基 酸殘基。本發(fā)明的所述氨基酸序列可以如本文進一步所述。
[0259] 在這樣的本發(fā)明的氨基酸序列中，所述構(gòu)架序列可以是任何適當(dāng)?shù)臉?gòu)架序列，并 且例如，基于標準手冊和進一步公開的內(nèi)容以及本文引用的現(xiàn)有技術(shù)，適當(dāng)?shù)臉?gòu)架序列的 實例對于熟練的技術(shù)人員將是清楚的。
[0260] 所述構(gòu)架序列優(yōu)選是免疫球蛋白構(gòu)架序列或已經(jīng)來源于免疫球蛋白構(gòu)架序列 (例如，通過人源化或駱駝源化）的構(gòu)架序列（的適當(dāng)組合）。例如，所述構(gòu)架序列可以是 來源于輕鏈可變結(jié)構(gòu)域（例如，\_序列）和/或來源于重鏈可變結(jié)構(gòu)域（例如，V H_序列） 的構(gòu)架序列。在一個特別優(yōu)選的方面中，所述構(gòu)架序列是已經(jīng)來源于VHH-序列的構(gòu)架序列 (其中所述構(gòu)架序列可以任選地已經(jīng)被部分或完全人源化）或是已經(jīng)駱駝源化（如本文所 定義）的常規(guī)V H序列。
[0261] 所述構(gòu)架序列優(yōu)選地是這樣的，以致本發(fā)明的氨基酸序列是結(jié)構(gòu)域抗體（或適合 用作結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序列）；是單結(jié)構(gòu)域抗體（或適合用作單結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序 列）；是"dAb"(或適合用作dAb的氨基酸序列）；或是納米抗體?(包括但不限于VHH序 列）。同樣地，例如，基于標準手冊和進一步的公開內(nèi)容以及本文所提及的現(xiàn)有技術(shù)，適當(dāng)?shù)?構(gòu)架序列對于熟練的技術(shù)人員將是清楚的。
[0262] 特別地，在本發(fā)明的氨基酸序列中存在的所述構(gòu)架序列可以包含一個或多個標志 殘基（如本文所定義），以致本發(fā)明的氨基酸序列是一種納米抗體。所述構(gòu)架序列（的適當(dāng) 的組合）的一些優(yōu)選的、而非限制性的實例將通過本文進一步的公開內(nèi)容變得清楚。
[0263] 同樣地，如本文關(guān)于本發(fā)明的氨基酸序列概括所述，還可以使用前述任一種的適 當(dāng)?shù)钠危ɑ蚱谓M合），諸如包含適當(dāng)與一個或多個構(gòu)架序列側(cè)連和/或通過一個或多個 構(gòu)架序列連接的一個或多個⑶R序列的片段（例如，以如這些⑶R相同的順序，并且構(gòu)架序 列可以以所述片段所來源的完全大小的免疫球蛋白序列存在）。所述片段還可以也是這樣 的，以致它們包括或可以形成免疫球蛋白折疊，或者備選地是這樣的，以致它們不包括或不 能形成免疫球蛋白折疊。
[0264] 在一個具體的方面中，這樣的片段包括如本文所述的單CDR序列（并且特別是 ⑶R3序列），其在每一邊側(cè)連構(gòu)架序列（的一部分）（并且特別地，在所述片段所來源的免 疫球蛋白序列中與所述CDR序列相鄰的構(gòu)架序列的一部分。例如，CDR3序列可以在FR3序 列（的一部分）之后并且在FR4序列（的一部分）之前）。這樣的片段還可以包含二硫鍵， 并且特別是連接分別在所述⑶R序列之前和之后的兩個構(gòu)架區(qū)的二硫鍵（為了形成這樣的 二硫鍵的目的，可以使用在所述構(gòu)架區(qū)中天然存在的半胱氨酸殘基，或備選地，半胱氨酸殘 基可以合成添加或引入到所述構(gòu)架區(qū)）。對于這些"派遣片段"的進一步描述，同樣參考W0 03/050531，以及埃博靈克斯股份有限公司（Ablynx N. V.)于2006年12月5日提交的題目 為 "Peptides capable of binding to serum proteins (能夠結(jié)合血清蛋白的膚）"的埃 博靈克斯股份有限公司美國臨時申請（發(fā)明人：Revets, Hilde Adi Pierrette ;Kolkman， Joost Alexander ;和 Hoogenboom，Hendricus Renerus Jacobus Mattheus)(還參見 PCT/ EP2007/063348)。
[0265] 在另一個方面中，本發(fā)明涉及這樣的化合物和構(gòu)建體，且特別是蛋白或多肽（本 文也分別稱為"本發(fā)明的化合物"或"本發(fā)明的多肽"），其包括一個或多個本發(fā)明的氨基酸 序列（或其適當(dāng)?shù)钠危┗蚧旧嫌善浣M成，且任選地還包括一個或多個其他基團、殘基、 部分或結(jié)合單位。熟練的技術(shù)人員通過本文進一步的公開內(nèi)容將清楚，所述其他基團、殘 基、部分、結(jié)合單位或氨基酸序列可以或可以不為本發(fā)明的氨基酸序列（和/或為其所存在 于其中的化合物或構(gòu)建體）提供進一步的官能性，且可以或可以不修飾本發(fā)明的氨基酸序 列的特性。
[0266] 例如，所述其它基團、殘基、部分或結(jié)合單位可以是一個或多個額外的氨基酸序 列，以致所述化合物或構(gòu)建體是一種（融合）蛋白或（融合）多肽。在一個優(yōu)選而非限制 性的方面中，所述一個或多個其它基團、殘基、部分或結(jié)合單位是免疫球蛋白序列。甚至更 優(yōu)選地，所述一個或多個其它基團、殘基、部分或結(jié)合單位選自由下列各項組成的組：結(jié)構(gòu) 域抗體、適合用作結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序列、單結(jié)構(gòu)域抗體、適合用作單結(jié)構(gòu)域抗體的氨基 酸序列、"dAb"、適合用作dAb的氨基酸序列、或納米抗體。
[0267] 備選地，例如，所述基團、殘基、部分或結(jié)合單位可以是化學(xué)基團、殘基、部分，其自 身可以是或可以不是生物學(xué)和/或藥理學(xué)活性的。例如，并且不限于，所述基團可以連接到 一個或多個本發(fā)明的氨基酸序列上，以提供本發(fā)明的氨基酸序列或多肽的"衍生物"，如本 文進一步所述。
[0268] 也在本發(fā)明范圍內(nèi)的是這樣的化合物或構(gòu)建體，其包括一個或多個本文所述的衍 生物或基本上由其組成，并且任選地還包括任選地通過一個或多個接頭連接的一個或多個 其它基團、殘基、部分或結(jié)合單位。優(yōu)選地，所述一個或多個其它基團、殘基、部分或結(jié)合單 位是氨基酸序列。
[0269] 在上述化合物或構(gòu)建體中，所述一個或多個本發(fā)明的氨基酸序列以及所述一個或 多個基團、殘基、部分或結(jié)合單位可以彼此直接連接和/或通過一個或多個適當(dāng)?shù)慕宇^或 間隔體連接。例如，當(dāng)所述一個或多個基團、殘基、部分或結(jié)合單位是氨基酸序列時，所述接 頭可以也是氨基酸序列，以致所得到的化合物或構(gòu)建體是融合（蛋白）或融合（多肽）。
[0270] 本發(fā)明的化合物或多肽通?？梢酝ㄟ^這樣的方法制備，所述方法包括將所述一個 或多個本發(fā)明的氨基酸序列任選地通過一個或多個適當(dāng)?shù)慕宇^適當(dāng)?shù)剡B接到所述一個或 多個其它基團、殘基、部分或結(jié)合單位上的至少一個步驟，以提供本發(fā)明的化合物或多肽。 本發(fā)明的多肽還可以優(yōu)選地通過這樣的方法制備，所述方法通常至少包括下述步驟：提供 編碼本發(fā)明的多肽的核酸，以適當(dāng)方式表達所述核酸，和回收所表達的本發(fā)明的多肽。這樣 的方法可以以本身已知的方式進行，例如，基于本發(fā)明進一步所述的方法和技術(shù)，其對于熟 練的技術(shù)人員將是清楚的。
[0271] 由本發(fā)明的氨基酸序列起始，設(shè)計/選擇和/或制備本發(fā)明的化合物或多肽的方 法在本發(fā)明中還稱為"格式化"所述的本發(fā)明的氨基酸序列；并且組成本發(fā)明的化合物或多 肽的一部分的本發(fā)明的氨基酸被認為是"格式化的"或采用所述的本發(fā)明的化合物或多肽 的"格式"?；诒景l(fā)明的公開內(nèi)容，熟練的技術(shù)人員將清楚本發(fā)明的氨基酸序列可以被格 式化的方法實例以及所述格式的實例；并且所述格式化的氨基酸序列形成本發(fā)明的另一個 方面。
[0272] 在本發(fā)明的一個具體方面中，與相對應(yīng)的本發(fā)明的氨基酸序列相比，本發(fā)明的化 合物或本發(fā)明的多肽可以具有增加的半衰期?；诒疚倪M一步的公開內(nèi)容，所述化合物 和多肽的一些優(yōu)選而非限制性實例對于熟練的技術(shù)人員將變得清楚，并且例如包括下列各 項：已經(jīng)被化學(xué)修飾以增加其半衰期（例如，通過聚乙二醇化方式）的本發(fā)明的氨基酸序列 或多肽；包括至少一個用于結(jié)合血清蛋白（諸如血清白蛋白）的另外的結(jié)合位點的本發(fā)明 的氨基酸序列；或包括至少一個與增加本發(fā)明的氨基酸序列的半衰期的至少一個部分（并 且特別是至少一個氨基酸序列）連接的本發(fā)明的氨基酸序列的本發(fā)明的多肽?；诒景l(fā)明 進一步的公開內(nèi)容，包括所述半衰期延長部分或氨基酸序列的本發(fā)明的多肽的實例對于熟 練的技術(shù)人員將變得清楚；并且例如，包括，但不限于，這樣的多肽，其中所述一個或多個本 發(fā)明的氨基酸序列適當(dāng)?shù)剡B接一個或多個血清蛋白或其片段（諸如（人）血清白蛋白或其 適當(dāng)?shù)钠危┗蜻B接一個或多個可以結(jié)合血清蛋白的結(jié)合單位（諸如，例如，結(jié)構(gòu)域抗體， 適合用作結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序列，單結(jié)構(gòu)域抗體，適合用作單結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序列， "dAb"'，適合用作dAb的氨基酸序列，或可以結(jié)合血清蛋白如血清白蛋白（諸如人血清白蛋 白）的納米抗體、血清免疫球蛋白如IgG、或運鐵蛋白；參考進一步的描述和本發(fā)明提及的 參考文獻）；這樣的多肽，其中本發(fā)明的氨基酸序列連接Fc部分（諸如人Fc)或其適當(dāng)?shù)?部分或片段；或這樣的多肽，其中所述一個或多個本發(fā)明的氨基酸序列適當(dāng)連接一個或多 個可以結(jié)合血清蛋白的小蛋白或肽（諸如，但不限于，記述在WO 91/01743, WO 01/45746， W002/076489和埃博靈克斯股份有限公司（Ablynx N. V.)于2006年12月5日提交的題目 為 "Peptides capable of binding to serum proteins (能夠結(jié)合血清蛋白的膚）"的埃 博靈克斯股份有限公司的美國臨時申請（也參見PCT/EP2007/063348)中的蛋白和肽）。
[0273] 通常，具有增加的半衰期的本發(fā)明的化合物或多肽優(yōu)選地具有是相對應(yīng)的本發(fā)明 的氨基酸序列本身的半衰期的至少1. 5倍、優(yōu)選地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或 超過20倍的半衰期。例如，與相對應(yīng)的本發(fā)明的氨基酸序列本身相比，具有增加的半衰期 的本發(fā)明的化合物或多肽可以具有增加超過1小時，優(yōu)選超過2小時，更優(yōu)選超過6小時， 諸如超過12小時，或甚至超過24、48或72小時的半衰期。
[0274] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選而非限制性方面中，與相對應(yīng)的本發(fā)明的氨基酸序列本身相 t匕，所述本發(fā)明的化合物或多肽具有增加超過1小時，優(yōu)選超過2小時，更優(yōu)選超過6小時， 諸如超過12小時，或甚至超過24、48或72小時的血清半衰期。
[0275] 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選而非限制性方面中，所述本發(fā)明的化合物或多肽在人中表 現(xiàn)出至少約12小時、優(yōu)選至少24小時、更優(yōu)選至少48小時、甚至更優(yōu)選至少72小時或更多 的血清半衰期。例如，本發(fā)明的化合物或多肽可以具有至少5天（諸如約5-10天）、優(yōu)選至 少9天（諸如約9-14天）、更優(yōu)選至少約10天（諸如約10-15天）、或至少約11天（諸如 約11-16天）、更優(yōu)選至少約12天（諸如約12-18天或更多）、或超過14天（諸如約14-19 天）的半衰期。
[0276] 在另一個方面中，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的氨基酸序列或本發(fā)明的多肽（或其適 當(dāng)?shù)钠危┑暮怂?。這樣的核酸在本發(fā)明中還稱為"本發(fā)明的核酸"，并且例如，可以采用遺 傳構(gòu)建體的形式，如本發(fā)明進一步所述。
[0277] 在另一個方面中，本發(fā)明涉及表達（或在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下能夠表達）本發(fā)明的氨基 酸序列和/或本發(fā)明的多肽的宿主或宿主細胞，和/或包含本發(fā)明的核酸的宿主或宿主細 胞。通過本文進一步的描述，所述宿主或宿主細胞的一些優(yōu)選而非限制性的實例將變得清 楚。
[0278] 本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)品或組合物，所述產(chǎn)品或組合物包含或包括至少一種本發(fā)明 的氨基酸序列、至少一種本發(fā)明的多肽（或其適當(dāng)?shù)钠危┖?或至少一種本發(fā)明的核酸、 以及任選地一種或多種所述組合物本身已知的其它成分，即，取決于所述組合物的目的用 途。例如，這樣的產(chǎn)品或組合物可以是藥物組合物（如本文所述）、獸醫(yī)用組合物或用于診 斷用途的產(chǎn)品或組合物（同樣如本文所述）。通過本發(fā)明進一步的描述，所述產(chǎn)品或組合物 的一些優(yōu)選而非限制性的實例將變得清楚。
[0279] 本發(fā)明還涉及本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽、或包括其的組合物在體外 (例如，在體外或細胞測定法中）或體內(nèi)（例如，在單個細胞中或在多細胞生物體中，且特別 是在哺乳動物中，且更特別是在人類中，諸如在處于骨疾病或病癥的危險中或患有其的人 中）調(diào)節(jié)RANK-L (的方法或組合物）中的應(yīng)用。
[0280] 本發(fā)明還涉及使用至少一種本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽用于體外（例 如，在體外或細胞測定法中）或體內(nèi)（例如，在單個細胞中或在多細胞生物體中，且特別是 在哺乳動物中，且更特別是在人類中，諸如在處于骨疾病或病癥的危險中或患有其的人中） 調(diào)節(jié)RANK-L的方法，所述方法至少包括使RANK-L與至少一種本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗 體或多肽、或包括其的組合物以適于調(diào)節(jié)RANK-L的方式和量相接觸的步驟。
[0281] 本發(fā)明還涉及一種本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽在制備用于體外（例 如，在體外或細胞測定法中）或體內(nèi)（例如，在單個細胞中或在多細胞生物體中，且特別是 在哺乳動物中，且更特別是在人類中，諸如在處于骨疾病或病癥的危險中或患有其的人中） 調(diào)節(jié)RANK-L的組合物（諸如，但不限于如本文進一步所述藥物組合物或制劑）中的應(yīng)用。
[0282] 在本發(fā)明的上下文中，"調(diào)節(jié)（modulating) "或"調(diào)節(jié)（to modulate) "通常意指 減少或抑制RANK-L的活性，或備選地增加 RANK-L的活性，如使用適當(dāng)?shù)捏w外、細胞或體 內(nèi)測定法（諸如本文提及的那些）測量的。特別地，"調(diào)節(jié)（modulating)"或"調(diào)節(jié)（to modulate) "可以意指減少或抑制RANK-L的活性，或備選地增加 RANK-L的活性，如使用適當(dāng) 的體外、細胞或體內(nèi)測定法（諸如本文提及的那些）測量的，與在相同條件但不存在本發(fā)明 的氨基酸序列、納米抗體或多肽的條件下，在相同測定中的RANK-L活性相比較，至少1%， 優(yōu)選至少5 %，諸如至少10 %或至少25 %，例如至少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80 %， 或90%或更多。
[0283] 熟練的技術(shù)人員應(yīng)該清楚，"調(diào)節(jié)"還可以包括與相同條件但不存在本發(fā)明的氨基 酸序列、納米抗體或多肽相比較，對RANK-L對其靶標、配體或底物中的一種或多種的親和 力、抗體親抗源性、特異性和/或選擇性施加改變（其可以是增加或減少）；和/或?qū)ANK-L 對于在所述RANK-L存在于其中的介質(zhì)或環(huán)境中的一種或多種條件（諸如pH、離子強度、輔 因子的存在、等等）的敏感性施加改變（其可以是增加或減少）。熟練的技術(shù)人員應(yīng)該清楚， 這同樣可以以任何適當(dāng)?shù)姆绞胶?或使用本身已知的任何適當(dāng)?shù)臏y定法來確定，諸如本文 或在本文引用的現(xiàn)有技術(shù)中所述的測定法。
[0284] "調(diào)節(jié)"還可以意指對包括RANK-L(或其中包括其底物、配體、或途徑，如其信號傳 導(dǎo)途徑或代謝途徑以及它們相關(guān)的生物學(xué)或生理學(xué)作用）的一種或多種生物學(xué)或生理學(xué) 機制、作用、反應(yīng)、功能、途徑或活性施加改變（即，分別作為激動劑或作為拮抗劑的活性）。 同樣，熟練的技術(shù)人員應(yīng)該清楚，這樣的作為激動劑或拮抗劑的作用可以以任何適當(dāng)方式 和/或使用本身已知的任何適當(dāng)?shù)模w外且通常是細胞或測定法）測定法確定，諸如本文 或在本文引用的現(xiàn)有技術(shù)中所述的測定法。特別地，作為激動劑或拮抗劑的作用可以是這 樣的，以致與在相同條件下但不存在本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽的相同測定法 中，分別將目的生物學(xué)或生理學(xué)活性增加或減少至少1%，優(yōu)選至少5%，諸如至少10%或 至少25 %，例如至少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80 %，或90 %或更多。
[0285] 例如，調(diào)節(jié)還可以包括減少或抑制RANK-L與其底物或配體之一的結(jié)合和/或與天 然配體、底物競爭與RANK-L的結(jié)合。調(diào)節(jié)還可以包括激活RANK-L或其中包括RANK-L的機 制或途徑。調(diào)節(jié)可以是可逆的或不可逆的，但是對于制藥學(xué)和藥學(xué)目的，通常應(yīng)該是以可逆 的方式。
[0286] 本發(fā)明還涉及用于制備或產(chǎn)生本文所述的氨基酸序列、多肽、核酸、宿主細胞、產(chǎn) 品和組合物的方法。所述方法的一些優(yōu)選但非限制性的實例將通過本文進一步的描述變得 清楚。
[0287] 一般地，這些方法可以包括下列步驟：
[0288] a)提供氨基酸序列的組、集合或文庫；和
[0289] b)從所述氨基酸序列的組、集合或文庫中篩選可以結(jié)合和/或具有針對RANK-L的 親和性的氨基酸序列；
[0290] 和
[0291] c)分離所述可以結(jié)合和/或具有針對RANK-L的親和性的氨基酸序列。
[0292] 在這樣的方法中，所述氨基酸序列的組、集合或文庫可以是任何適當(dāng)?shù)陌被嵝?列的組、集合或文庫。例如，所述氨基酸序列的組、集合或文庫可以是免疫球蛋白序列的組、 集合或文庫（如本文所述），諸如免疫球蛋白序列的首次用于實驗的組、集合或文庫；免疫 球蛋白序列的合成的或半合成的組、集合或文庫；和/或已經(jīng)進行了親和力成熟的免疫球 蛋白序列的組、集合或文庫。
[0293] 此外，在這樣的方法中，所述氨基酸序列的組、集合或文庫可以是重鏈可變結(jié)構(gòu)域 (諸如V H結(jié)構(gòu)域或VHH結(jié)構(gòu)域）或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的組、集合或文庫。例如，所述氨基酸序 列的組、集合或文庫可以是結(jié)構(gòu)域抗體或單結(jié)構(gòu)域抗體的組、集合或文庫，或可以是能夠作 為結(jié)構(gòu)域抗體或單結(jié)構(gòu)域抗體行使功能的氨基酸序列的組、集合或文庫。
[0294] 在本方法的優(yōu)選方面中，所述氨基酸序列的組、集合或文庫可以是免疫球蛋白序 列的免疫組、集合或文庫，例如，來自已經(jīng)用RANK-L適當(dāng)免疫的、或用基于其或來源于其的 適當(dāng)?shù)目乖瓫Q定簇（諸如其抗原部分、片段、區(qū)域、結(jié)構(gòu)域、環(huán)或其它表位）適當(dāng)免疫的哺乳 動物的免疫球蛋白序列的免疫組、集合或文庫。在一個特別的方面中，所述抗原決定簇可以 是細胞外部分、區(qū)域、結(jié)構(gòu)域、環(huán)或其它細胞外表位。
[0295] 在上述方法中，所述氨基酸序列的組、集合或文庫可以被展示在噬菌體、噬菌 粒、核糖體、或適當(dāng)?shù)奈⑸铮ㄖT如酵母）上，以諸如促進篩選。用于展示和篩選氨基 酸序列（的組、集合或文庫）的適當(dāng)?shù)姆椒?、技術(shù)和宿主生物體對于本領(lǐng)域熟練的技術(shù) 人員將是清楚的，例如，基于本文進一步的公開內(nèi)容。同樣參考Hoogenboom在Nature Biotechnology(自然生物技術(shù)），23,9,1105-1116(2005)中的綜述。
[0296] 在另一個方面中，用于產(chǎn)生氨基酸序列的方法包括至少下列步驟：
[0297] a)提供表達氨基酸序列的細胞的集合或樣品；
[0298] b)從所述細胞的集合或樣品中篩選表達可以結(jié)合和/或具有針對RANK-L的親和 性的氨基酸序列的細胞；
[0299] 和
[0300] c) (i)分離所述氨基酸序列；或（ii)從所述細胞分離編碼所述氨基酸序列的核酸 序列，然后表達所述氨基酸序列。
[0301] 例如，當(dāng)所需要的氨基酸序列是免疫球蛋白序列時，所述細胞的集合或樣品可以 是，例如，B細胞的集合或樣品。此外，在該方法中，細胞樣品可以來源于已經(jīng)用RANK-L適 當(dāng)免疫的、或用基于其或來源于其的適當(dāng)?shù)目乖瓫Q定簇（諸如其抗原部分、片段、區(qū)域、結(jié) 構(gòu)域、環(huán)或其它表位）適當(dāng)免疫的哺乳動物。在一個特別的方面中，所述抗原決定簇可以是 細胞外部分、區(qū)域、結(jié)構(gòu)域、環(huán)或其它細胞外表位。
[0302] 上述方法可以以任何適當(dāng)?shù)姆绞竭M行，這對于熟練的技術(shù)人員將是清楚的。例如， 參考 EP 0 542 810, W0 05/19824, W0 04/051268 和 W004/106377。步驟 b)的篩選優(yōu)選地 使用流式細胞術(shù)技術(shù)諸如FACS進行。對于此，例如，參考Lieby等，Blood(血液），卷97， No. 12, 3820(2001)。
[0303] 在另一個方面中用于產(chǎn)生針對RANK-L的氨基酸序列的方法可以包括至少下列步 驟：
[0304] a)提供編碼氨基酸序列的核酸序列的組、集合或文庫；
[0305] b)從所述核酸序列的組、集合或文庫中篩選編碼可以結(jié)合和/或具有針對RANK-L 的親和性的氨基酸序列的核酸序列；
[0306] 和
[0307] c)分離所述核酸序列，然后表達所述氨基酸序列。
[0308] 在這樣的方法中，所述編碼氨基酸序列的核酸序列的組、集合或文庫可以是，例 如，編碼免疫球蛋白序列的首次用于實驗的組、集合或文庫的核酸序列的組、集合或文庫； 編碼免疫球蛋白序列的合成的或半合成的組、集合或文庫的核酸序列的組、集合或文庫；和 /或編碼已經(jīng)進行了親和力成熟的免疫球蛋白序列的組、集合或文庫的核酸序列的組、集合 或文庫。
[0309] 此外，在這樣的方法中，所述核酸序列的組、集合或文庫可以編碼重鏈可變結(jié)構(gòu)域 (諸如v H結(jié)構(gòu)域或vHH結(jié)構(gòu)域）或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的組、集合或文庫。例如，所述核酸序列 的組、集合或文庫可以編碼結(jié)構(gòu)域抗體或單結(jié)構(gòu)域抗體的組、集合或文庫，或能夠作為結(jié)構(gòu) 域抗體或單結(jié)構(gòu)域抗體行使功能的氨基酸序列的組、集合或文庫。
[0310] 在該方法的優(yōu)選方面中，所述氨基酸序列的組、集合或文庫可以是核酸序列的免 疫的組、集合或文庫，例如，所述核酸序列來源于已經(jīng)用RANK-L適當(dāng)免疫的、或用基于其或 來源于其的適當(dāng)?shù)目乖瓫Q定簇（諸如其抗原部分、片段、區(qū)域、結(jié)構(gòu)域、環(huán)或其它表位）適當(dāng) 免疫的哺乳動物。在一個特別的方面中，所述抗原決定簇可以是細胞外部分、區(qū)域、結(jié)構(gòu)域、 環(huán)或其它細胞外表位。
[0311] 例如，所述核酸序列的組、集合或文庫可以編碼重鏈可變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu) 域的免疫的組、集合或文庫。在一個具體的方面中，所述核苷酸序列的組、集合或文庫可以 編碼V HH序列的組、集合或文庫。
[0312] 在上述方法中，所述核苷酸序列的組、集合或文庫可以被展示在噬菌體、噬菌粒、 核糖體或適當(dāng)?shù)奈⑸铮ㄖT如酵母）上，以諸如促進篩選。用于展示和篩選編碼氨基酸序 列的核苷酸序列（的組、集合或文庫）的適當(dāng)?shù)姆椒ā⒓夹g(shù)和宿主生物體對于本領(lǐng)域熟練的 技術(shù)人員將是清楚的，例如，基于本文進一步的公開內(nèi)容。同樣參考Hoogenboom在Nature Biotechnology(自然生物技術(shù)），23,9,1105-1116(2005)中的綜述。
[0313] 在另一個方面中，所述用于產(chǎn)生針對RANK-L的氨基酸序列的方法可以包括至少 下列步驟：
[0314] a)提供編碼氨基酸序列的核酸序列的組、集合或文庫；
[0315] b)從所述核酸序列的組、集合或文庫中篩選編碼這樣的氨基酸序列的核酸序列， 所述氨基酸序列可以結(jié)合和/或具有針對RANK-L的親和性且被交叉阻斷或交叉阻斷本 發(fā)明的納米抗體如SEQIDN0's :560-621，或本發(fā)明的人源化納米抗體如SEQIDN0's: 730-757 和 765,或本發(fā)明的多肽或構(gòu)建體如 SEQ ID NO' s :622-729, 759-762 和 766-789 ; 和
[0316] c)分離所述核酸序列，然后表達所述氨基酸序列。
[0317] 本發(fā)明還涉及通過上述方法或備選地通過包括上述方法之一以及至少下列步驟 的方法而獲得的氨基酸序列，所述步驟為：確定所述免疫球蛋白序列的核苷酸序列或氨基 酸序列；并且以本身已知的方式表達或合成所述氨基酸序列，諸如通過在適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?或宿主生物體內(nèi)表達，或通過化學(xué)合成。
[0318] 此外，在上述步驟后，一個或多個本發(fā)明的氨基酸序列可以適當(dāng)?shù)乇蝗嗽椿ɑ?備選地，被駱駝源化）；和/或可以將這樣獲得的氨基酸序列彼此連接，或連接一個或多個 其它適當(dāng)?shù)陌被嵝蛄校ㄈ芜x地，通過一個或多個適當(dāng)?shù)慕宇^），以提供本發(fā)明的多肽。此 夕卜，編碼本發(fā)明的氨基酸序列的核酸序列可以被適當(dāng)?shù)厝嗽椿ɑ騻溥x地，被駱駝源化）并 且適當(dāng)?shù)乇磉_；和/或編碼本發(fā)明的氨基酸序列的一個或多個核酸序列可以彼此連接，或 連接編碼其它適當(dāng)?shù)陌被嵝蛄械囊粋€或多個核酸序列（任選地通過編碼一個或多個適 當(dāng)?shù)慕宇^的核苷酸序列），然后，這樣獲得的核苷酸序列可以進行適當(dāng)?shù)乇磉_，以提供本發(fā) 明的多肽。
[0319] 本發(fā)明還涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、構(gòu)建體、多肽、核酸、宿主細胞、產(chǎn) 品和組合物的應(yīng)用和用途，以及涉及用于預(yù)防和/或治療與RANK-L相關(guān)的疾病和病癥的方 法。通過本發(fā)明進一步的描述，一些優(yōu)選的但非限制性的應(yīng)用和用途將變得清楚。
[0320] 本發(fā)明還涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、構(gòu)建體、多肽、核酸、宿主細胞、產(chǎn) 品和組合物用于治療。
[0321] 特別地，本發(fā)明還涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、構(gòu)建體、多肽、核酸、宿主 細胞、產(chǎn)品和組合物用于這樣的疾病和病癥的治療，所述疾病和病癥可以通過給需要其的 受試者施用（藥物有效量的）如本文所述的氨基酸序列、化合物、構(gòu)建體或多肽而預(yù)防或治 療。
[0322] 更特別地，本發(fā)明涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、構(gòu)建體、多肽、核酸、宿主 細胞、產(chǎn)品和組合物用于骨疾病和病癥的治療。
[0323] 通過本文進一步的描述，本發(fā)明的其它方面、實施方案、優(yōu)點和應(yīng)用也將變得清 楚，其中本發(fā)明將更詳細地描述和討論本發(fā)明的納米抗體以及包括其的本發(fā)明的多肽，其 形成本發(fā)明的一些優(yōu)選方面。
[0324] 如通過本發(fā)明進一步的描述將變得清楚，與"dAb"或相似的（單）結(jié)構(gòu)域抗體或免 疫球蛋白序列相比，納米抗體通常提供某些優(yōu)點（本發(fā)明所述的），本發(fā)明的納米抗體也提 供所述優(yōu)點。然而，熟練的技術(shù)人員應(yīng)該清楚，下述教導(dǎo)的更通用的方面也可以適用于（直 接或類似地）本發(fā)明的其它氨基酸序列。
[0325] 本發(fā)明的詳述
[0326] 在本描述、實施例和權(quán)利要求中：
[0327] a)除非另外指明或限定，所用的所有術(shù)語具有它們在本領(lǐng)域內(nèi)的通用意思，其對 于熟練的技術(shù)人員應(yīng)該是清楚的。例如，參考標準手冊，如Sambrook等，"分子克?。簩?驗室手冊（Molecular Cloning :A Laboratory Manual)"(第 2 版），卷 1-3,冷泉港實驗 室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1989) ;F.Ausubel 等，編，"現(xiàn)代 分子生物學(xué)方法（Current protocols in molecular biology) "，Green Publishing 和 Wiley Interscience，紐約（1987) ;Lewin，"Genes II，'，John Wiley&Sons，New York，紐約， (1985) ;01d 等，"基因操作原理：基因工程導(dǎo)言（Principles of Gene Manipulation :An Introduction to Genetic Engineering)"，第 2 版，加利福尼亞大學(xué)出版社（University of California Press)，伯克利，CA (1981) ;Roitt 等，"免疫學(xué)（Immunology)"（第 6 版）， Mosby/Elsevier，Edinburgh(2001) ;Roitt 等，Roitt 基礎(chǔ)免疫學(xué)（Roitt，s Essential Immunology)，第 10版·Blackwell Publishing，英國（2001);和 Janeway 等，"免疫生物學(xué) (Immunobiology)，'（第 6 版），Garland Science Publishing/Churchi 11 Livingstone,紐 約（2005)，以及本發(fā)明所引用的公知【背景技術(shù)】；
[0328] b)除非另外指明，術(shù)語"免疫球蛋白序列"一不管其在本文中用來指重鏈抗體或 常規(guī)的4-鏈抗體--用作一般術(shù)語，包括完整大小的抗體、其單獨的鏈、以及其所有部分、 結(jié)構(gòu)域或片段（包括但不限于抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或片段，分別諸如Vhh結(jié)構(gòu)域或V H/\結(jié)構(gòu) 域）。另外，術(shù)語"序列"用于本文時（例如在類似"免疫球蛋白序列"、"抗體序列"、"可變結(jié) 構(gòu)域序列"、"V HH序列"或"蛋白序列"的術(shù)語中）通常應(yīng)該理解為包括相關(guān)的氨基酸序列、 以及編碼所述氨基酸序列的核酸序列或核苷酸序列，除非上下文需要更狹義的解釋；
[0329] c)除非另外指明，所有沒有具體詳細描述的方法、步驟、技術(shù)和操作可以以本身已 知的方式進行并且已經(jīng)進行，這對于熟練的技術(shù)人員是清楚的。例如，仍舊參考標準手冊， 參考本發(fā)明所提及的公知【背景技術(shù)】，和參考其中所引用的其它參考文獻；以及參考例如下 述綜述 Presta，Adv. Drug Deliv. Rev.(高級藥物遞送綜述）2006,58 (5-6) :640-56 ;Levin 和 Weiss，Mol. Biosyst. 2006, 2(1) :49-57 ;Irving 等，J. Immunol. Methods，（免疫學(xué)方法 雜志）2001，248 (1-2)，31-45 ;Schmitz 等，Placenta，2000, 21 增刊· A，S106-12, Gonzales 等，Tumour Biol.(腫瘤生物學(xué)），2005, 26(1)，31-43,其描述了用于蛋白質(zhì)加工的技術(shù)，諸 如親和力成熟，和用于提高蛋白如免疫球蛋白的特異性和其他需要的特性的其他技術(shù)；
[0330] d)氨基酸殘基按照標準的三字母或一字母的氨基酸密碼顯示，如在表A-2提及 的；
[0331] 表A-2 :-字母和三字母氨基酸密碼
[0332]
【權(quán)利要求】
1. 針對和/或能夠特異性結(jié)合RANK-L的氨基酸序列，其基本上由4個構(gòu)架區(qū)（分別為 FR1-FR4)和3個互補性決定區(qū)（分別為⑶R1-⑶R3)組成，其中： -⑶R1選自由下列各項組成的組： a) SEQ ID NO' s :188-249 的氨基酸序列； b) 與SEQ ID NO's :188-249的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； c) 與SEQ ID NO's :188-249的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和/或 -⑶R2選自由下列各項組成的組： d) SEQ ID NO' s :312-373 和 758 的氨基酸序列； e) 與SEQ ID NO's :312-373和758的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同 一性的氨基酸序列； f) 與SEQ ID NO's :312-373和758的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基酸差 異的氨基酸序列； 和/或 -⑶R3選自由下列各項組成的組： g) SEQ ID NO' s :436-497 的氨基酸序列； h) 與SEQ ID NO's :436-497的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； i) 與SEQ ID NO' s :436-497的至少一個氨基酸序列具有3,2或1個氨基酸差異的氨 基酸序列。
2. 按照權(quán)利要求1的氨基酸序列，其基本上由4個構(gòu)架區(qū)（分別為FR1-FR4)和3個互 補性決定區(qū)（分別為⑶R1-⑶R3)組成，其中 ： -⑶R1選自由下列各項組成的組： a) SEQ ID NO' s :188-249 的氨基酸序列； b) 與SEQ ID NO's :188-249的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； c) 與SEQ ID NO's :188-249的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基酸差異的氨 基酸序列； 和 -⑶R2選自由下列各項組成的組： d) SEQ ID NO' s :312-373 和 758 的氨基酸序列； e) 與SEQ ID NO's :312-373和758的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同 一性的氨基酸序列； f) 與SEQ ID NO's :312-373和758的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基酸差 異的氨基酸序列； 和 -⑶R3選自由下列各項組成的組： g) SEQ ID NO' s :436-497 的氨基酸序列； h) 與SEQ ID NO's :436-497的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性的 氨基酸序列； i) 與SEQ ID NO's :436-497的至少一個氨基酸序列具有3, 2,或1個氨基酸差異的氨 基酸序列。
3. 按照權(quán)利要求1-2中任一項的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列的CDR序列與SEQ ID NO's :560-621的至少一個氨基酸序列的⑶R序列具有至少70%的氨基酸同一性，優(yōu)選 至少80%的氨基酸同一性，更優(yōu)選至少90%的氨基酸同一性，諸如95%的氨基酸同一性或 更多或者甚至基本上100%的氨基酸同一性。
4. 針對RANK-L的氨基酸序列，其交叉阻斷按照權(quán)利要求1-3中任一項的至少一個氨基 酸序列與RANK-L的結(jié)合。
5. 針對RANK-L的氨基酸序列，其與RANK-L的結(jié)合被按照權(quán)利要求1-3中任一項的至 少一個氨基酸序列交叉阻斷。
6. 按照權(quán)利要求4或5任一項的氨基酸序列，其中在Biacore測定法中檢測所述氨基 酸序列交叉阻斷或被交叉阻斷的能力。
7. 按照權(quán)利要求4或5任一項的氨基酸序列，其中在ELISA測定法中檢測所述氨基酸 序列交叉阻斷或被交叉阻斷的能力。
8. 按照權(quán)利要求1-7中任一項的氨基酸序列，其基本上由輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列（例如 序列）組成；或基本上由重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列（例如V H_序列）組成。
9. 按照權(quán)利要求1-8中任一項的氨基酸序列，其基本上由來源于常規(guī)4鏈抗體的重鏈 可變結(jié)構(gòu)域序列組成，或其基本上由來源于重鏈抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列組成。
10. 按照權(quán)利要求1-9中任一項的氨基酸序列，其基本上由結(jié)構(gòu)域抗體（或適合用作結(jié) 構(gòu)域抗體的氨基酸序列）組成，基本上由單結(jié)構(gòu)域抗體（或適合用作單結(jié)構(gòu)域抗體的氨基 酸序列）組成，基本上由"dAb "(或適合用作dAb的氨基酸序列）組成或基本上由納米抗 體（包括但不限于VHH序列）組成。
11. 按照權(quán)利要求1-10中任一項的氨基酸序列，其基本上由納米抗體組成。
12. 按照權(quán)利要求1-11中任一項的氨基酸序列，其基本上由這樣的納米抗體組成，所 述納米抗體 i) 與SEQ ID NO's :1-22的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性，其中 為了確定氨基酸同一性的程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸殘基； 并且其中： ii) 在按照Kabat編號的位置11，37,44,45,47,83,84,103,104和108的一個或多個氨 基酸殘基優(yōu)選選自表A-3中提及的標志殘基。
13. 按照權(quán)利要求1-12中任一項的氨基酸序列，其基本上由這樣的納米抗體組成，所 述納米抗體 i) 與SEQ ID NO' s :560-621的至少一個氨基酸序列具有至少80%的氨基酸同一性， 其中為了確定氨基酸同一性的程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸殘基； 并且其中： ii) 在按照Kabat編號的位置11，37,44,45,47,83,84,103,104和108的一個或多個氨 基酸殘基優(yōu)選選自表A-3中提及的標志殘基。
14. 按照權(quán)利要求1-13中任一項的氨基酸序列，其基本上由人源化的納米抗體組成。
15. 按照權(quán)利要求1-14中任一項的納米抗體，其選自由SEQ ID NO' s :560-621組成 的組，或選自由與SEQ ID NO' s :560-621的至少一個氨基酸序列具有大于80%，優(yōu)選大于 90%，更優(yōu)選大于95%，諸如99%或更多序列同一性（如本文所定義）的氨基酸序列組成 的組。
16. 按照權(quán)利要求1-14中任一項的納米抗體，其是這樣的人源化納米抗體，所述納米 抗體選自由SEQ ID NO's :730-757和765組成的組，或選自由與SEQ ID NO's :730-757和 765的至少一個氨基酸序列具有大于80 %，優(yōu)選大于90 %，更優(yōu)選大于95 %，諸如99 %或更 多序列同一性（如本文所定義）的氨基酸序列組成的組。
17. 按照權(quán)利要求1-16中任一項的納米抗體，其選自由SEQ ID NO's :560-621組成的 組或選自由SEQ ID NO' s :730-757和765組成的組。
18. 多肽，其包括按照權(quán)利要求1-14中任一項的一個或多個氨基酸序列和/或按照權(quán) 利要求15-17中任一項的一個或多個納米抗體或基本上由其組成，并且任選地還包括任選 地通過一個或多個肽接頭連接的一個或多個其他氨基酸結(jié)合單位。
19. 按照權(quán)利要求18的多肽，其中所述一個或多個其他結(jié)合單位選自由下列各項組成 的組：結(jié)構(gòu)域抗體、適合用作結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序列、單結(jié)構(gòu)域抗體、適合用作單結(jié)構(gòu)域 抗體的氨基酸序列、"dAb"、適合用作dAb的氨基酸序列、或納米抗體。
20. 按照權(quán)利要求18-19中任一項的多肽，其是多價構(gòu)建體。
21. 按照權(quán)利要求18-20中任一項的多肽，其是多互補位的構(gòu)建體。
22. 按照權(quán)利要求18-21中任一項的多肽，其是多特異性構(gòu)建體。
23. 化合物或構(gòu)建體，其包括按照權(quán)利要求1-14中任一項的一個或多個氨基酸序列和 /或按照權(quán)利要求15-17中任一項的一個或多個納米抗體或基本上由其組成，并且任選地 還包括任選地通過一個或多個接頭連接的一個或多個其他基團、殘基、部分或結(jié)合單位。
24. 按照權(quán)利要求23的化合物或構(gòu)建體，分別與相對應(yīng)的按照權(quán)利要求1-14中任一項 的氨基酸序列本身或與按照權(quán)利要求15-17中任一項的納米抗體本身相比較，所述化合物 或構(gòu)建體具有增加的半衰期。
25. 按照權(quán)利要求24的化合物或構(gòu)建體，其中分別與相對應(yīng)的按照權(quán)利要求1-14中任 一項的氨基酸序列本身或與按照權(quán)利要求15-17中任一項的納米抗體本身相比較，所述一 個或多個其他基團、殘基、部分或結(jié)合單位為所述化合物或構(gòu)建體提供增加的半衰期。
26. 按照權(quán)利要求26的化合物或構(gòu)建體，其中為所述化合物或構(gòu)建體提供增加的半衰 期的所述一個或多個其他基團、殘基、部分或結(jié)合單位選自由下列各項組成的組：血清蛋白 或其片段，可以結(jié)合血清蛋白的結(jié)合單位，F(xiàn)c部分，以及可以結(jié)合血清蛋白的小蛋白或肽。
27. 按照權(quán)利要求26的化合物或構(gòu)建體，其中為所述化合物或構(gòu)建體提供增加的半衰 期的所述一個或多個其他基團、殘基、部分或結(jié)合單位選自由人血清白蛋白或其片段組成 的組。
28. 按照權(quán)利要求26的化合物或構(gòu)建體，其中為所述化合物或構(gòu)建體提供增加的半衰 期的所述一個或多個其他基團、殘基、部分或結(jié)合單位選自由可以結(jié)合血清白蛋白（諸如 人血清白蛋白）或血清免疫球蛋白（諸如IgG)的結(jié)合單位組成的組。
29. 按照權(quán)利要求26的化合物或構(gòu)建體，其中為所述化合物或構(gòu)建體提供增加的半衰 期的所述一個或多個其他基團、殘基、部分或結(jié)合單位選自由下列各項組成的組：結(jié)構(gòu)域抗 體，適合用作結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序列，單結(jié)構(gòu)域抗體，適合用作單結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序 列，"dAb"，適合用作dAb的氨基酸序列，或可以結(jié)合血清白蛋白（諸如人血清白蛋白）或血 清免疫球蛋白（諸如IgG)的納米抗體。
30. 按照權(quán)利要求26的化合物或構(gòu)建體，其中為所述化合物或構(gòu)建體提供增加的半衰 期的所述一個或多個其他基團、殘基、部分或結(jié)合單位是可以結(jié)合血清白蛋白（諸如人血 清白蛋白）或血清免疫球蛋白（諸如IgG)的納米抗體。
31. 按照權(quán)利要求24-30中任一項的化合物或構(gòu)建體，其具有分別是相對應(yīng)的按照權(quán) 利要求1-14中任一項的氨基酸序列本身或按照權(quán)利要求15-17中任一項的納米抗體本身 的半衰期的至少1. 5倍、優(yōu)選地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超過20倍的血清 半衰期。
32. 按照權(quán)利要求24-31中任一項的化合物或構(gòu)建體，分別與相對應(yīng)的按照權(quán)利要求 1-14中任一項的氨基酸序列本身或按照權(quán)利要求15-17中任一項的納米抗體本身相比較， 所述化合物或構(gòu)建體具有增加超過1小時，優(yōu)選超過2小時，更優(yōu)選超過6小時，諸如超過 12小時，或甚至超過24、48或72小時的血清半衰期。
33. 按照權(quán)利要求24-32中任一項的化合物或構(gòu)建體，其在人中具有至少約12小時、優(yōu) 選至少24小時、更優(yōu)選至少48小時、甚至更優(yōu)選至少72小時或更多的血清半衰期；例如， 至少5天（諸如約5-10天）、優(yōu)選至少9天（諸如約9-14天）、更優(yōu)選至少約10天（諸如 約10-15天）、或至少約11天（諸如約11-16天）、更優(yōu)選至少約12天（諸如約12-18天 或更多）、或超過14天（諸如約14-19天）的血清半衰期。
34. 核酸或核苷酸序列，其編碼下列各項：按照權(quán)利要求1-14中任一項的氨基酸序列、 按照權(quán)利要求15-17中任一項的納米抗體、按照權(quán)利要求18-22中任一項的多肽、或按照權(quán) 利要求23-33中任一項的化合物或構(gòu)建體。
35. 按照權(quán)利要求34的核酸或核苷酸序列，其以遺傳構(gòu)建體的形式存在。
36. 宿主或宿主細胞，所述宿主或宿主細胞表達或其在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下能夠表達下列各 項：按照權(quán)利要求1-14中任一項的氨基酸序列、按照權(quán)利要求15-17中任一項的納米抗體、 按照權(quán)利要求18-22中任一項的多肽、按照權(quán)利要求23-33中任一項的化合物或構(gòu)建體；和 /或所述宿主或宿主細胞包括按照權(quán)利要求34的核酸或核苷酸序列、或按照權(quán)利要求35的 遺傳構(gòu)建體。
37. 組合物，其包括至少一種下列各項：按照權(quán)利要求1-14中任一項的氨基酸序列、按 照權(quán)利要求15-17中任一項的納米抗體、按照權(quán)利要求18-22中任一項的多肽、按照權(quán)利要 求23-33中任一項的化合物或構(gòu)建體、或按照權(quán)利要求34-35的核酸或核苷酸序列。
38. 按照權(quán)利要求37的組合物，其是藥物組合物。
39. 按照權(quán)利要求38的組合物，其是藥物組合物，其還包括至少一種藥用載體、稀釋劑 或賦形劑和/或佐劑，且其任選地包括一種或多種其他藥物活性多肽和/或化合物。
40. 用于生產(chǎn)按照權(quán)利要求1-14中任一項的氨基酸序列、按照權(quán)利要求15-17中任一 項的納米抗體、按照權(quán)利要求18-22中任一項的多肽、按照權(quán)利要求23-33中任一項的化合 物或構(gòu)建體、或按照權(quán)利要求38或39任一項的藥物組合物的方法，其是這樣的，以致其可 以通過表達編碼其的核酸或核苷酸序列獲得，所述方法至少包括下列步驟： -在適當(dāng)?shù)乃拗骷毎蛩拗魃矬w內(nèi)或在另一種適當(dāng)?shù)谋磉_系統(tǒng)內(nèi)表達按照權(quán)利要求 34的核酸或核苷酸序列、或按照權(quán)利要求35的遺傳構(gòu)建體； 任選地接著： -分離和/或純化這樣獲得的按照權(quán)利要求1-14中任一項的氨基酸序列，按照權(quán)利 要求15-17中任一項的納米抗體，按照權(quán)利要求18-22中任一項的多肽，或按照權(quán)利要求 23-33中任一項的化合物或構(gòu)建體，其是這樣的，以致其可以通過表達編碼其的核酸或核苷 酸序列而獲得。
41. 用于生產(chǎn)按照權(quán)利要求1-14中任一項的氨基酸序列、按照權(quán)利要求15-17中任一 項的納米抗體、按照權(quán)利要求18-22中任一項的多肽、按照權(quán)利要求23-33中任一項的化合 物或構(gòu)建體、或按照權(quán)利要求38或39任一項的藥物組合物的方法，其是這樣的，以致其可 以通過表達編碼其的核酸或核苷酸序列獲得，所述方法至少包括下列步驟： -在這樣的條件下培育和/或維持按照權(quán)利要求36的宿主或宿主細胞，所述條件是這 樣的，以致所述宿主或宿主細胞表達和/或生產(chǎn)至少一種按照權(quán)利要求1-14中任一項的氨 基酸序列，按照權(quán)利要求15-17中任一項的納米抗體，按照權(quán)利要求18-22中任一項的多 肽，或按照權(quán)利要求23-33中任一項的化合物或構(gòu)建體，其是這樣的，以致其可以通過表達 編碼其的核酸或核苷酸序列而獲得， 任選地，然后： -分離和/或純化按照權(quán)利要求1-14中任一項的氨基酸序列，按照權(quán)利要求15-17中 任一項的納米抗體，按照權(quán)利要求18-22中任一項的多肽，或按照權(quán)利要求23-33中任一項 的化合物或構(gòu)建體，其是這樣的，以致其可以通過表達編碼其的核酸或核苷酸序列而獲得。
42. 用于篩選針對RANK-L的氨基酸序列的方法，所述方法包括至少下述步驟： a) 提供編碼氨基酸序列的核酸序列的組、集合或文庫； b) 從所述核酸序列的組、集合或文庫中篩選編碼氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸 序列能夠結(jié)合和/或具有針對RANK-L的親和性且被交叉阻斷或交叉阻斷選自由SEQ ID NO' s :560-621組成的組的納米抗體、或選自由SEQ ID NO' s :730-757和765組成的組的 人源化納米抗體、或選自由SEQ ID NO's :622-729、759-762和766-773組成的組的多肽或 構(gòu)建體；和 c) 分離所述核酸序列，然后表達所述氨基酸序列。
43. 用于預(yù)防和/或治療至少一種骨疾病或病癥的方法，所述方法包括給有此需要 的受試者施用藥物活性量的至少一種按照權(quán)利要求1-14中任一項的氨基酸序列、按照權(quán) 利要求15-17中任一項的納米抗體、按照權(quán)利要求18-22中任一項的多肽、按照權(quán)利要求 23-33中任一項的化合物或構(gòu)建體、或按照權(quán)利要求38或39的組合物。
44. 用于預(yù)防和/或治療至少一種疾病或病癥的方法，所述疾病或病癥與RANK-L、與其 生物學(xué)或藥物活性、和/或與其中涉及RANK-L的生物學(xué)途徑或信號傳導(dǎo)相關(guān)，所述方法包 括給有此需要的受試者施用藥物活性量的至少一種按照權(quán)利要求1-14中任一項的氨基酸 序列、按照權(quán)利要求15-17中任一項的納米抗體、按照權(quán)利要求18-22中任一項的多肽、按 照權(quán)利要求23-33中任一項的化合物或構(gòu)建體、或按照權(quán)利要求38或39的組合物。
45. 用于預(yù)防和/或治療至少一種疾病或病癥的方法，所述疾病或病癥可以通過給有 此需要的受試者施用按照權(quán)利要求1-14中任一項的氨基酸序列、按照權(quán)利要求15-17中任 一項的納米抗體、按照權(quán)利要求18-22中任一項的多肽、或按照權(quán)利要求23-33中任一項的 化合物或構(gòu)建體而得到預(yù)防和/或治療，所述方法包括給有此需要的受試者施用藥物活性 量的至少一種按照權(quán)利要求1-14中任一項的氨基酸序列、按照權(quán)利要求15-17中任一項的 納米抗體、按照權(quán)利要求18-22中任一項的多肽、按照權(quán)利要求23-33中任一項的化合物或 構(gòu)建體、或按照權(quán)利要求38或39的組合物。
46. 用于免疫治療的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用藥物活性量的至少 一種按照權(quán)利要求1-14中任一項的氨基酸序列、按照權(quán)利要求15-17中任一項的納米抗 體、按照權(quán)利要求18-22中任一項的多肽、按照權(quán)利要求23-33中任一項的化合物或構(gòu)建 體、或按照權(quán)利要求38或39的組合物。
47. 按照權(quán)利要求1-14中任一項的氨基酸序列、按照權(quán)利要求15-17中任一項的納米 抗體、按照權(quán)利要求18-22中任一項的多肽、或按照權(quán)利要求23-33中任一項的化合物或構(gòu) 建體在制備用于預(yù)防和/或治療至少一種骨疾病或病癥的藥物組合物中的應(yīng)用；和/或在 用于按照權(quán)利要求43-46的一種或多種方法中的應(yīng)用。
48. 按照權(quán)利要求1-14中任一項的氨基酸序列、按照權(quán)利要求15-17中任一項的納米 抗體、按照權(quán)利要求18-22中任一項的多肽、或按照權(quán)利要求23-33中任一項的化合物或構(gòu) 建體用于預(yù)防和/或治療至少一種骨疾病或病癥的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K19/00GK104231082SQ201410464977
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2008年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2007年5月24日
【發(fā)明者】埃爾斯·拜爾內(nèi)德, 西格利德·科內(nèi)利斯, 亨德里克斯·雷內(nèi)瑞斯·雅各布斯·馬托伊斯·霍根博姆 申請人:埃博靈克斯股份有限公司