用于天然彩色新品種蠶鑒定的絲蛋白肽段及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于天然彩色新品種蠶鑒定的絲蛋白肽段，其基因序列包括家蠶絲H鏈非結(jié)晶區(qū)基因、H鏈結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)的重組基因以及柞蠶、天蠶蠶絲H鏈基因；還公開(kāi)了該種絲蛋白肽段的制備方法，具體包括家蠶品種蠶絲非結(jié)晶區(qū)基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)，家蠶品種蠶絲結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)重組基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)，天然彩色繭品種蠶絲基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)。該方法簡(jiǎn)單易行，序列準(zhǔn)確無(wú)誤，構(gòu)建的表達(dá)載體沒(méi)有發(fā)生基因突變或缺失，保證了表達(dá)產(chǎn)物不會(huì)發(fā)生三聯(lián)碼的錯(cuò)配或個(gè)別氨基酸錯(cuò)誤，獲得的產(chǎn)物用于進(jìn)一步制備高精確度的蠶絲抗體。目前還沒(méi)有來(lái)自于家蠶白色絲品種(絲素非結(jié)晶區(qū)及結(jié)晶區(qū)/非結(jié)晶區(qū)單元的)和柞蠶黃色絲或天蠶綠色絲品種的肽段制備的報(bào)導(dǎo)。
【專利說(shuō)明】用于天然彩色新品種蠶鑒定的絲蛋白肽段及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于蠶品種鑒定抗體制備的絲蛋白肽段 (抗原）及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蠶絲絲素（以下簡(jiǎn)稱絲素）蛋白屬于天然動(dòng)物蛋白纖維，是一種結(jié)構(gòu)蛋白，由結(jié)晶 態(tài)和無(wú)定形態(tài)兩大部分組成。絲素蛋白包括家蠶絲和野蠶絲（柞蠶絲、天蠶絲等）。家蠶 絲素是重鏈（H鏈）蛋白、絲素輕鏈（L鏈）蛋白和糖蛋白P25三個(gè)部分組成的復(fù)合體，柞蠶 絲、天蠶絲絲素由Η鏈組成。
[0003] 家蠶絲素由于來(lái)源豐富，數(shù)十年來(lái)也是研究的熱點(diǎn)，學(xué)者對(duì)其結(jié)構(gòu)、性能及生物材 料應(yīng)用方面進(jìn)行了大量的研究，然而，有關(guān)野蠶絲素方面的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道極少，如天蠶絲 素、柞蠶絲素等天然彩色絲素。天蠶絲、柞蠶絲是天然彩色蠶絲的代表，天然彩色絲是一種 綠色產(chǎn)品，對(duì)減少環(huán)境污染，促進(jìn)人類健康非常有利。具有天然淡黃色的柞蠶絲在日本市場(chǎng) 及歐洲市場(chǎng)上極受歡迎。目前，國(guó)際市場(chǎng)的天然有色昆蟲(chóng)絲十分緊缺，以黃色野蠶絲為例， 價(jià)格是白色蠶絲的3-30倍。天然彩色黃繭或綠繭繭絲中含有的黃酮類化合物，來(lái)自于食用 的桑葉，因此不僅具有白色蠶絲良好的吸濕性、放濕性、保暖性和透氣性絲，還具有良好的 抑菌功效和抗氧化的阻擋紫外線的功能，能有效地防止因環(huán)境污染引起人體內(nèi)發(fā)生氧化作 用所造成的危害。除此，天蠶絲素、柞蠶絲素等天然彩色絲素蛋白肽鏈上含有一種特殊的序 列：精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸（RGD)三肽序列，這種R⑶三肽序列廣泛存在于膠原蛋白、 粘著蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)中，有助于細(xì)胞粘附，促使帖壁細(xì)胞粘附生長(zhǎng)，可以作為醫(yī)療領(lǐng)域組 織修復(fù)選用的最佳材料之一。因此，選育彩色繭實(shí)用品種，并及時(shí)進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)開(kāi)發(fā)，具 有非常誘人的商業(yè)前景，將大大推動(dòng)新型蠶品種的開(kāi)發(fā)力度和開(kāi)拓蠶絲業(yè)發(fā)展的新局面。
[0004] 但由于天蠶、柞蠶等天然彩色繭蠶品種難以飼養(yǎng)，蠶絲來(lái)源比較稀少，所以應(yīng)用極 其稀少，而且目前我們研究的天然黃色家蠶絲的色素主要存在于絲膠中。
[0005] 已經(jīng)研究證實(shí)天蠶、柞蠶等天然彩色絲的色素來(lái)自于桑葉，而且攝入家蠶體內(nèi)的 黃酮物質(zhì)是否能夠從消化管進(jìn)入血液、從血液進(jìn)入絲腺，受到消化管和絲腺上皮細(xì)胞的透 過(guò)性影響，即受到色素生成及運(yùn)輸?shù)幕虻目刂?。目前已有多種色繭基因已被鑒定，我們將 在分子育種時(shí)可以導(dǎo)入繭色相關(guān)基因，培育出具有穩(wěn)定遺傳的色素生成及運(yùn)輸控制基因的 蠶品種，使合成與分泌的蠶絲具有天然色素。另外色繭基因一經(jīng)鑒定，可以通過(guò)分子生物學(xué) 技術(shù)克隆可能的相關(guān)基因進(jìn)行遺傳雜交品種的篩選，選育出理想的天然彩色繭蠶品種，制 備不含任何化學(xué)成分的來(lái)自于天然植物并在蠶體內(nèi)經(jīng)修飾過(guò)的天然彩色蠶絲一新世紀(jì)的 綠色纖維及其產(chǎn)品。
[0006] 研究開(kāi)發(fā)基于白色絲家蠶和柞蠶、天蠶等天然彩色絲等品種蠶的優(yōu)良易飼養(yǎng)、穩(wěn) 定遺傳的天然彩色家蠶品種，品種育成后，我們必須對(duì)其產(chǎn)品（繭絲）進(jìn)行分子鑒定，以 確定合成與分泌的蠶絲具有雜交優(yōu)勢(shì)的蛋白質(zhì)，但目前還沒(méi)有方法能從分子水平上進(jìn)行鑒 定。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 針對(duì)目前的研究現(xiàn)狀，本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于天然彩色蠶品 種鑒定抗體制備的絲蛋白肽段及其制備方法，通過(guò)對(duì)白色繭絲的家蠶和天然彩色繭絲的柞 蠶、天蠶等絲素蛋白基因的分析，克隆了源于蠶新品種親本的典型的肽段基因序列，包括家 蠶絲Η鏈非結(jié)晶區(qū)基因、Η鏈結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)的重組基因；柞蠶、天蠶蠶絲Η鏈基因；構(gòu)建 了大腸桿菌表達(dá)載體，獲得了相應(yīng)肽段的表達(dá)產(chǎn)物（蠶絲蛋白肽段-用于抗體制備相應(yīng)的 抗原）。獲得的產(chǎn)物用于進(jìn)一步制備高精確度的蠶絲抗體。
[0008] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是：
[0009] -種用于天然彩色蠶品種鑒定抗體制備的絲蛋白肽段，其基因序列包括家蠶絲Η 鏈非結(jié)晶區(qū)基因、Η鏈結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)的重組基因以及天然彩色繭柞蠶、天蠶蠶絲Η鏈基 因。
[0010] 所述的家蠶絲Η鏈非結(jié)晶區(qū)基因的非重復(fù)序列肽段的編碼基因序列為 SGFGPYVANGGYSGYEYAffSSESDFAG 〇
[0011] 所述的天蠶絲素蛋白重鏈氨基酸編碼基因序列為SGAGGRGDGGYGSGSSG(-RGD-)。
[0012] 所述的絲蛋白肽段的制備方法，具體包括家蠶品種蠶絲非結(jié)晶區(qū)基因的克隆、表 達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)，家蠶品種蠶絲結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)重組基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與表 達(dá)，天然彩色繭品種蠶絲基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與與表達(dá)。
[0013] 一、家蠶品種蠶絲非結(jié)晶區(qū)基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)，包括以下步驟：
[0014] A、根據(jù)絲素蛋白主要組成部分的重鏈核心區(qū)域非結(jié)晶區(qū)氨基酸序列（圖1)及其 編碼基因信息，設(shè)計(jì)并合成（Invitrogen公司）了非重復(fù)序列肽段SGFGPYVANGGYSGYEYAWS SESDFAG(F(1))的編碼基因序列?；蛐蛄械?'端和3'端分別含有Hindlll和Bglll的 粘末端堿基，緊接其5'粘末端下游設(shè)計(jì)了限制性核酸內(nèi)切酶NgoMIV的識(shí)別位點(diǎn)，緊接3' 粘末端上游設(shè)計(jì)了限制核酸性內(nèi)切酶Agel的識(shí)別位點(diǎn)，后2個(gè)酶切位點(diǎn)用于與結(jié)晶區(qū)基因 進(jìn)行重組。選擇實(shí)驗(yàn)室保存的含常用多克隆位點(diǎn)的基礎(chǔ)質(zhì)粒來(lái)完成非結(jié)晶區(qū)基因序列的克 隆，用限制性核酸內(nèi)切酶Bglll/Hindlll消化pSLFA1180FA(如圖1)，插入設(shè)計(jì)合成的含有 Bglll和Hindlll的粘末端非結(jié)晶區(qū)基因序列，T4DNA連接酶連接后得到含有完整非結(jié)晶區(qū) 編碼基因的質(zhì)粒pSL-F(l)。
[0015] B、實(shí)驗(yàn)室保存有pGEX-Agel載體，由pGEX-KG經(jīng)過(guò)改造加入了限制性核酸內(nèi)切酶 Agel 位點(diǎn)（王建南，等。MaterialsScienceandEngineeringC, 2014, 34:429 - 436)。Agel/ HindllI酶切pGEX-Agel載體回收載體片段，Agel/HindllI酶切質(zhì)粒pSL-F (1)回收插入片 段，T4DNA連接酶連接構(gòu)建含有非結(jié)晶區(qū)肽段基因的表達(dá)載體表示為pGEX-F(l)。
[0016] C、構(gòu)建的表達(dá)載體表達(dá)外源蛋白時(shí)具有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST)的標(biāo)簽，表達(dá)的 產(chǎn)物融合蛋白記為GST-F(l)。將構(gòu)建的表達(dá)載體pGEX-F(l)轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌細(xì)胞， 加入0-1. 2mM的誘導(dǎo)劑異丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度轉(zhuǎn)速200rpm/min的 空氣搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)0-8小時(shí)。然后用4100rpm/min的速度離心收集表達(dá)GST融合蛋白的 BL21菌細(xì)胞。
[0017] D、菌細(xì)胞用適量的磷酸鹽緩沖液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl， 2. 7MmKCl，pH7. 3)重懸，置于冰上超聲破碎后13300r/min的速度離心lOmin，收集上清 液。取少量上清液加入蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液，打勻、煮沸5min，13300r/min的速度離心 lOmin，用微量移液器取出10ul的上清液樣品注入聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，最后當(dāng)溴 酚藍(lán)指示劑到達(dá)距凝膠底部lcm左右的位置時(shí)，結(jié)束電泳。
[0018] E、將超聲破碎后收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋 白GST-F(l)。純化后收集的各管融合蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。
[0019] F、采用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過(guò)程中的還原型谷胱甘肽后，融合 蛋白經(jīng)凝血酶酶切，再經(jīng)GST親和層析柱純化獲得設(shè)計(jì)所需要的源于家蠶蠶絲蛋白的多肽 F(l) (TGSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFAGKLDSS)(由于酶切位點(diǎn)的需要，目的肽段的首末段 增加了幾個(gè)氨基酸）。
[0020] 二、家蠶品種蠶絲結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)重組基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)，包括 以下步驟：
[0021] A、課題組設(shè)計(jì)并構(gòu)建保存了四種絲素結(jié)晶區(qū)的典型肽段[GAGAGX] 16的基因序列 載體（王建南，等.蠶業(yè)科學(xué)，2006, 32(1) :36-41)。在（GS) 16基因序列的5'有限制性核 酸內(nèi)切酶Agel的結(jié)合位點(diǎn)，前面家蠶絲非結(jié)晶區(qū)F(l)的基因序列的5'和3'端分別設(shè)計(jì) 了限制性核酸內(nèi)切酶NgoMIV和Agel的結(jié)合位點(diǎn)。用Agel酶切（GA) 16的質(zhì)粒插入NgoMIV 和Agel酶切獲得的F(l)的基因序列，Agel和NgoMIV是同尾酶，連接后F(l)3'的酶切位 點(diǎn)消失，形成Ala和Gly，是絲素蛋白核心區(qū)域中最富有的2種氨基酸。同時(shí)完成了家蠶品 種蠶絲結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)重組基因的克隆，使用的克隆載體為課題組凍存的pCDNA-2(王 建南，等.蠶業(yè)科學(xué)，2006,32(1):36-41)，構(gòu)建的質(zhì)粒為為？〇)嫩1 816€1。
[0022] B、用核酸限制性內(nèi)切酶Agel/Hindlll消化質(zhì)粒pGEX-Agel回收條帶作為載體片 段，同時(shí)用相同的內(nèi)切酶Agel/Hindlll消化上述構(gòu)建好的結(jié)晶區(qū)肽段與非結(jié)晶區(qū)肽段的 重組質(zhì)粒，并回收目的肽段編碼基因序列作為插入片段，T4DNA連接酶連接后構(gòu)建pGEX系 列表達(dá)載體，即 pGEX-gsl6fl，編碼的氨基酸序列為 GAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAG SGAGAGSGAGAGSGAG, AGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGSGFGPYVANGGYSGYEYA WSSESDFAG(GS16F1)。
[0023] C、構(gòu)建的表達(dá)載體表達(dá)外源蛋白時(shí)具有GST的標(biāo)簽，表達(dá)的產(chǎn)物融合蛋白記為 GST-GS16F1。將構(gòu)建的表達(dá)載體pGEX-gsl6f 1轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌細(xì)胞，加入0-1. 2mM的 誘導(dǎo)劑異丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度轉(zhuǎn)速200rpm/min的空氣搖床中誘導(dǎo)培 養(yǎng)0-8小時(shí)。然后用4100rpm/min的速度離心收集表達(dá)GST融合蛋白的BL21菌細(xì)胞。
[0024] D、菌細(xì)胞用適量的磷酸鹽緩沖液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl， 2. 7MmKCl，pH7. 3)重懸，置于冰上超聲破碎后13300r/min的速度離心10min，收集上清 液。取少量上清液加入蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液，打勻、煮沸5min，13300r/min的速度離心 l〇min，用微量移液器取出10ul的上清液樣品注入聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，最后當(dāng)溴 酚藍(lán)指示劑到達(dá)距凝膠底部lcm左右的位置時(shí)，結(jié)束電泳。
[0025] E、將超聲破碎后收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋 白GST-GS16F1。純化后收集的各管融合蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。
[0026] F、采用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過(guò)程中的還原型谷胱甘肽后，融合蛋 白經(jīng)凝血酶酶切，再經(jīng)GST親和層析柱純化獲得設(shè)計(jì)所需要的源于蠶絲蛋白的多肽GS16F1 (TGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAG SGAGAGSGAGAGSGAGSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFAGKL)。
[0027] 三、天然彩色繭品種蠶絲基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)，包括以下步驟：
[0028] A、根據(jù)天蠶絲素蛋白重鏈氨基酸序列特征及其編碼基因信息，設(shè)計(jì)并合成 (Invitrogen公司）了 SGAGGRGDGGYGSGSSG(-RGD-) "的編碼基因序列，設(shè)計(jì)的基因序列具有 以下特點(diǎn)：5'端設(shè)計(jì)了限制性核酸內(nèi)切酶Agel，用來(lái)把合成的"-RGD-"基序克隆入含多克 隆位點(diǎn)的質(zhì)粒。5'端下游限制性核酸內(nèi)切酶Bglll與3'端的BamHI是一對(duì)同尾酶，用于 單倍"-RGD-"基序的加倍。選擇實(shí)驗(yàn)室保存的含常用多克隆位點(diǎn)的基礎(chǔ)質(zhì)粒pSLFA1180FA 來(lái)完成"-1?0-"基序的克隆。質(zhì)粒？51^4118(^4含有4861、88111、8&111!113(3〇1?1等酶切位 點(diǎn)。"-RGD-"基因克隆的具體步驟為：用設(shè)計(jì)的5'端限制性核酸內(nèi)切酶Agel和BamHI消 化PSLFA1180FA質(zhì)粒，然后采用瓊脂糖凝膠電泳回收消化產(chǎn)物中的大片段，與設(shè)計(jì)合成的 "-RGD-"基因混合，用T4連接酶連接得到pSL-AYRl。
[0029] B、用限制性核酸內(nèi)切酶Bglll/EcoRI消化質(zhì)粒pSL-AYRl，瓊脂糖凝膠電泳回收 的小片段插入到BamHI/EcoRI消化同一質(zhì)粒pSL-AYRl獲得的載體中，T4連接酶連接構(gòu)建 PSL-AYR2,獲得設(shè)計(jì)的"-RGD-"基因序列加倍。連接后同尾酶的位點(diǎn)Bglll和BamHI均消 失，形成了甘氨酸Gly和絲氨酸Ser的密碼子。采用同樣的方法加倍獲得4倍設(shè)計(jì)序列的 基因克隆質(zhì)粒PSL-AYR4。
[0030] C、用核酸限制性內(nèi)切酶Agel/BamHI消化質(zhì)粒PSL-AYR4回收AYR4的基因片段， 插入Agel/BamHI消化的課題組保存的pCDNA-2質(zhì)粒中pCDNA-AYR4,構(gòu)建，然后采用Agel/ Hindlll消化pGEX-Agel回收條帶作為載體片段，同時(shí)用相同的內(nèi)切酶Agel/Hindlll消化 p⑶NA-AYR4,并回收目的肽段編碼基因序列作為插入片段，T4DNA連接酶連接后構(gòu)建pGEX 系列表達(dá)載體，即 PGEX-AYR4,編碼的相應(yīng)肽段為 SGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGS GAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSG(RGD4)。
[0031] D、構(gòu)建的表達(dá)載體表達(dá)外源蛋白時(shí)具有GST的標(biāo)簽，表達(dá)的產(chǎn)物融合蛋白記為 GST-RGD4。將構(gòu)建的表達(dá)載體pGEX-AYR4轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌細(xì)胞，加入0-1. 2mM的誘導(dǎo) 劑異丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度轉(zhuǎn)速200rpm/min的空氣搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng) 0-8小時(shí)。然后用4100rpm/min的速度離心收集表達(dá)GST融合蛋白的BL21菌細(xì)胞。
[0032] E、菌細(xì)胞用適量的磷酸鹽緩沖液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl， 2. 7MmKCl，pH7. 3)重懸，置于冰上超聲破碎后13300r/min的速度離心lOmin，收集上清 液。取少量上清液加入蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液，打勻、煮沸5min，13300r/min的速度離心 lOmin，用微量移液器取出10ul的上清液樣品注入聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，最后當(dāng)溴 酚藍(lán)指示劑到達(dá)距凝膠底部lcm左右的位置時(shí)，結(jié)束電泳。
[0033] F、將超聲破碎后收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋 白GST-RGD4。純化后收集的各管融合蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。
[0034] G、采用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過(guò)程中的還原型谷胱甘肽后，融合蛋 白經(jīng)凝血酶酶切，再經(jīng)GST親和層析柱純化獲得設(shè)計(jì)所需要的源于蠶絲蛋白的多肽RGD4(G STGRSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGS)(由 于加倍策略的需要設(shè)計(jì)了相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，所以RGD4的第一個(gè)氨基酸出現(xiàn) 在全部序列的最后，其余部分與設(shè)計(jì)的基序完全相同）。
[0035] 本發(fā)明的有益效果是：設(shè)計(jì)了源于家蠶親本之一蠶絲的典型肽段基因，源于另一 親本天蠶或柞蠶等天然彩色蠶絲的典型肽段基因，基因片段兩端設(shè)計(jì)與選擇的表達(dá)載體相 適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，克隆并采用原核表達(dá)系統(tǒng)制備了相應(yīng)的各親本蠶絲的抗原。方法 簡(jiǎn)單易行，序列準(zhǔn)確無(wú)誤，構(gòu)建的表達(dá)載體沒(méi)有發(fā)生基因突變或缺失，保證了表達(dá)產(chǎn)物不會(huì) 發(fā)生三聯(lián)碼的錯(cuò)配或個(gè)別氨基酸錯(cuò)誤，獲得的產(chǎn)物用于制備精確度高的蠶絲抗體進(jìn)行天然 彩色新品種蠶的鑒定。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0036] 圖1是本發(fā)明用的基礎(chǔ)質(zhì)粒PSLFA1180FA示意圖。
[0037] 圖2是家蠶品種蠶絲非結(jié)晶區(qū)基因表達(dá)載體融合蛋白GST-F⑴表達(dá)情況。
[0038] 其中，laneM:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；lanel :不含有表達(dá)載體的BL21菌細(xì)胞總蛋白； lane2 :含有表達(dá)載體但不攜帶外源蛋白基因的BL21菌細(xì)胞總蛋白；lane3 :含有GST-F1的 BL21菌細(xì)胞總蛋白。圖中的泳道3出現(xiàn)的一條寬且色深的條帶即為表達(dá)獲得的融合蛋白 GST-F ⑴。
[0039] 圖3是家蠶品種蠶絲非結(jié)晶區(qū)基因表達(dá)載體純化后的融合蛋白GST-F(l)的
[0040] 表達(dá)情況。
[0041] 圖4是家蠶品種蠶絲結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)重組基因表達(dá)載體融合蛋白
[0042] GST-GS16F1 表達(dá)情況。
[0043] 其中l(wèi)aneM:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；lanel :不含有表達(dá)載體的BL21菌細(xì)胞總蛋 白；lane2 :含有表達(dá)載體但不攜帶外源蛋白基因的BL21菌細(xì)胞總蛋白；lane3 :含有 GST-GS16F1的BL21菌細(xì)胞總蛋白.圖中的泳道3出現(xiàn)的一條寬且色深的條帶即為表達(dá)獲 得的融合蛋白GST-GS16F1。
[0044] 圖5是家蠶品種蠶絲結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)重組基因的表達(dá)載體純化后融合蛋白 GST-GS16F1表達(dá)情況。
[0045] 圖6是天然彩色繭品種蠶絲基因的表達(dá)載體融合蛋白GST-RGD4表達(dá)情況。
[0046] 其中，laneM:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；lanel :含有GST-RGD4的BL21菌細(xì)胞總蛋白。 圖中的泳道1出現(xiàn)的一條寬且色深的條帶即為表達(dá)獲得的融合蛋白GST-RGD4。
[0047] 圖7是天然彩色繭品種蠶絲基因的表達(dá)載體純化后融合蛋白GST-RGD4表達(dá)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 實(shí)施例
[0049] 家蠶品種蠶絲非結(jié)晶區(qū)基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)，包括以下步驟：
[0050] A、根據(jù)絲素蛋白主要組成部分的重鏈核心區(qū)域非結(jié)晶區(qū)氨基酸序列（圖1)及其 編碼基因信息，設(shè)計(jì)并合成（Invitrogen公司）了非重復(fù)序列肽段SGFGPYVANGGYSGYEYAWS SESDFAG(F(1))的編碼基因序列?；蛐蛄械?'端和3'端分別含有Hindlll和Bglll的 粘末端堿基，緊接其5'粘末端下游設(shè)計(jì)了限制性核酸內(nèi)切酶NgoMIV的識(shí)別位點(diǎn)，緊接3' 粘末端上游設(shè)計(jì)了限制核酸性內(nèi)切酶Agel的識(shí)別位點(diǎn)，后2個(gè)酶切位點(diǎn)用于與結(jié)晶區(qū)基因 進(jìn)行重組。選擇實(shí)驗(yàn)室保存的含常用多克隆位點(diǎn)的基礎(chǔ)質(zhì)粒來(lái)完成非結(jié)晶區(qū)基因序列的克 隆，用限制性核酸內(nèi)切酶Bglll/Hindlll消化pSLFA1180FA(如圖1)，插入設(shè)計(jì)合成的含有 Bglll和Hindlll的粘末端非結(jié)晶區(qū)基因序列，T4DNA連接酶連接后得到含有完整非結(jié)晶區(qū) 編碼基因的質(zhì)粒pSL-F(l)。
[0051] B、實(shí)驗(yàn)室保存有pGEX-Agel載體，由pGEX-KG經(jīng)過(guò)改造加入了限制性核酸內(nèi)切 酶Agel位點(diǎn)。Agel/Hindlll酶切pGEX-Agel載體回收載體片段，Agel/Hindlll酶切質(zhì)粒 pSL-F(l)回收插入片段，T4DNA連接酶連接構(gòu)建含有非結(jié)晶區(qū)肽段基因的表達(dá)載體表示為 pGEX-F ⑴。
[0052] C、構(gòu)建的表達(dá)載體表達(dá)外源蛋白時(shí)具有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST)的標(biāo)簽，表達(dá)的 產(chǎn)物融合蛋白記為GST-F(l)。將構(gòu)建的表達(dá)載體pGEX-F(l)轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌細(xì)胞，力口 入0. 5mM的誘導(dǎo)劑異丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度轉(zhuǎn)速200rpm/min的空氣搖 床中誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時(shí)。然后用4100rpm/min的速度離心收集表達(dá)GST融合蛋白的BL21菌 細(xì)胞。
[0053] D、菌細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl，2. 7MmKCl， pH7. 3)重懸，置于冰上超聲破碎后13300r/min的速度離心lOmin，收集上清液。取少量上 清液加入蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液，打勻、煮沸5min，13300r/min的速度離心lOmin，用微量 移液器取出l〇ul的上清液樣品注入聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，最后當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑到 達(dá)距凝膠底部lcm左右的位置時(shí)，結(jié)束電泳。如圖2。
[0054] E、將超聲破碎后收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋 白GST-F(l)。純化后收集的各管融合蛋白進(jìn)行了聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定如圖3。
[0055] F、采用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過(guò)程中的還原型谷胱甘肽后，融合 蛋白經(jīng)凝血酶酶切，再經(jīng)GST親和層析柱純化獲得設(shè)計(jì)所需要的源于家蠶蠶絲蛋白的多肽 F(l)(TGSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFAGKLDSS)〇
[0056] 家蠶品種蠶絲結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)重組基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)，包括以 下步驟：
[0057] A、課題組設(shè)計(jì)并構(gòu)建保存了四種絲素結(jié)晶區(qū)的典型肽段[GAGAGX] 16的基因序列 載體。在（GS) 16基因序列的5'有限制性核酸內(nèi)切酶Agel的結(jié)合位點(diǎn)，前面家蠶絲非結(jié)晶 區(qū)F(l)的基因序列的5'和3'端分別設(shè)計(jì)了限制性核酸內(nèi)切酶NgoMIV和Agel的結(jié)合位 點(diǎn)。用Agel酶切（GA) 16的質(zhì)粒插入NgoMIV和Agel酶切獲得的F(l)的基因序列，Agel和 NgoMIV是同尾酶，連接后F(l)3'的酶切位點(diǎn)消失，形成Ala和Gly，是絲素蛋白核心區(qū)域中 最富有的2種氨基酸。同時(shí)完成了家蠶品種蠶絲結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)重組基因的克隆，使用 的克隆載體為課題組凍存的P⑶NA-2,構(gòu)建的質(zhì)粒為為p⑶NA-g S16fl。
[0058] B、用核酸限制性內(nèi)切酶Agel/Hindlll消化質(zhì)粒pGEX-Agel回收條帶作為載體片 段，同時(shí)用相同的內(nèi)切酶Agel/Hindlll消化上述構(gòu)建好的結(jié)晶區(qū)肽段與非結(jié)晶區(qū)肽段的 重組質(zhì)粒，并回收目的肽段編碼基因序列作為插入片段，T4DNA連接酶連接后構(gòu)建pGEX系 列表達(dá)載體，即 pGEX-gsl6fl，編碼的氨基酸序列為 GAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAG SGAGAGSGAGAGSGAG, AGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGSGFGPYVANGGYSGYEYA WSSESDFAG(GS16F1)。
[0059] C、構(gòu)建的表達(dá)載體表達(dá)外源蛋白時(shí)具有GST的標(biāo)簽，表達(dá)的產(chǎn)物融合蛋白記為 GST-GS16F1。將構(gòu)建的表達(dá)載體pGEX-gsl6f 1轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌細(xì)胞，加入ImM的誘導(dǎo) 劑異丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度轉(zhuǎn)速200rpm/min的空氣搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)6 小時(shí)。然后用4100rpm/min的速度離心收集表達(dá)GST融合蛋白的BL21菌細(xì)胞。
[0060] D、菌細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl，2. 7MmKCl， pH7. 3)重懸，置于冰上超聲破碎后13300r/min的速度離心lOmin，收集上清液。取少量上 清液加入蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液，打勻、煮沸5min，13300r/min的速度離心lOmin，用微量 移液器取出l〇ul的上清液樣品注入聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，最后當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑到 達(dá)距凝膠底部lcm左右的位置時(shí)，結(jié)束電泳。如圖4。
[0061] E、將超聲破碎后收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋 白GST-GS16F1。純化后收集的各管融合蛋白進(jìn)行了聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定如圖5。
[0062] F、采用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過(guò)程中的還原型谷胱甘肽后，融合蛋 白經(jīng)凝血酶酶切，再經(jīng)GST親和層析柱純化獲得設(shè)計(jì)所需要的源于家蠶蠶絲蛋白的多肽GS 16F1(TGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSG AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFAGKL)〇
[0063] 天然彩色繭品種蠶絲基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)，包括以下步驟：
[0064] A、根據(jù)天蠶絲素蛋白重鏈氨基酸序列特征及其編碼基因信息，設(shè)計(jì)并合成 (Invitrogen公司）了 SGAGGRGDGGYGSGSSG(-RGD-) "的編碼基因序列，設(shè)計(jì)的基因序列具有 以下特點(diǎn)：5'端設(shè)計(jì)了限制性核酸內(nèi)切酶Agel，用來(lái)把合成的"-RGD-"基序克隆入含多克 隆位點(diǎn)的質(zhì)粒。5'端下游限制性核酸內(nèi)切酶Bglll與3'端的BamHI是一對(duì)同尾酶，用于 單倍"-RGD-"基序的加倍。選擇實(shí)驗(yàn)室保存的含常用多克隆位點(diǎn)的基礎(chǔ)質(zhì)粒pSLFA1180FA 來(lái)完成"-RGD-"基序的克隆。質(zhì)粒pSLFAl 180FA含有Agel、Bglll、BamHI、EcoRI等酶切位 點(diǎn)。"-RGD-"基因克隆的具體步驟為：用設(shè)計(jì)的5'端限制性核酸內(nèi)切酶Agel和BamHI消 化PSLFA1180FA質(zhì)粒，然后采用瓊脂糖凝膠電泳回收消化產(chǎn)物中的大片段，與設(shè)計(jì)合成的 "-RGD-"基因混合，用T4連接酶連接得到pSL-AYRl。
[0065] B、用限制性核酸內(nèi)切酶Bglll/EcoRI消化質(zhì)粒pSL-AYRl，瓊脂糖凝膠電泳回收 的小片段插入到BamHI/EcoRI消化同一質(zhì)粒pSL-AYRl獲得的載體中，T4連接酶連接構(gòu)建 PSL-AYR2,獲得設(shè)計(jì)的"-RGD-"基因序列加倍。連接后同尾酶的位點(diǎn)Bglll和BamHI均消 失，形成了甘氨酸Gly和絲氨酸Ser的密碼子。采用同樣的方法加倍獲得4倍設(shè)計(jì)序列的 基因克隆質(zhì)粒PSL-AYR4。
[0066] C、用核酸限制性內(nèi)切酶Agel/BamHI消化質(zhì)粒pSL-AYR4回收AYR4的基因片段， 插入Agel/BamHI消化的課題組保存的pCDNA-2質(zhì)粒中pCDNA-AYR4,構(gòu)建，然后采用Agel/ Hindlll消化pGEX-Agel回收條帶作為載體片段，同時(shí)用相同的內(nèi)切酶Agel/Hindlll消化 p⑶NA-AYR4,并回收目的肽段編碼基因序列作為插入片段，T4DNA連接酶連接后構(gòu)建pGEX 系列表達(dá)載體，即 PGEX-AYR4,編碼的相應(yīng)肽段為 SGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGS GAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSG(RGD4)。
[0067] D、構(gòu)建的表達(dá)載體表達(dá)外源蛋白時(shí)具有GST的標(biāo)簽，表達(dá)的產(chǎn)物融合蛋白記為 GST-RGD4。將構(gòu)建的表達(dá)載體pGEX-AYR4轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌細(xì)胞，加入1. 2mM的誘導(dǎo)劑 異丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度轉(zhuǎn)速200rpm/min的空氣搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)4小 時(shí)。然后用4100rpm/min的速度離心收集表達(dá)GST融合蛋白的BL21菌細(xì)胞。
[0068] E、菌細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl，2. 7MmKCl， pH7. 3)重懸，置于冰上超聲破碎后13300r/min的速度離心10min，收集上清液。取少量上 清液加入蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液，打勻、煮沸5min，13300r/min的速度離心10min，用微量 移液器取出lOul的上清液樣品注入聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，最后當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑到 達(dá)距凝膠底部lcm左右的位置時(shí)，結(jié)束電泳。如圖6。
[0069] F、將超聲破碎后收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋 白GST-RGD4。純化后收集的各管融合蛋白進(jìn)行了聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定如圖7。
[0070] G、采用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過(guò)程中的還原型谷胱甘肽后，融合蛋 白經(jīng)凝血酶酶切，再經(jīng)GST親和層析柱純化獲得設(shè)計(jì)所需要的源于天然彩色繭蠶絲蛋白的 多肽 RGD4 (GSTGRSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYG SGSSGS)。
[0071] 將制備好的絲蛋白肽段用于天然彩色新品種蠶鑒定。
[0072] 利用制備好的絲蛋白肽段，對(duì)經(jīng)過(guò)基因突變產(chǎn)生的新品種蠶進(jìn)行鑒定，對(duì)其突變 的基因進(jìn)彳丁標(biāo)記。
[0073] 對(duì)鑒定完畢的新品種，如果發(fā)現(xiàn)具有良好的遺傳特性，還可以用于新品種蠶的選 育。
【權(quán)利要求】
1. 用于天然彩色新品種蠶鑒定的絲蛋白肽段，其特征在于，其基因序列包括家蠶絲H 鏈非結(jié)晶區(qū)基因、H鏈結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)的重組基因以及天然彩色繭蠶柞蠶、天蠶蠶絲H鏈 基因片段。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的絲蛋白肽段，其特征在于，所述的家蠶絲H鏈非結(jié)晶區(qū)基因構(gòu) 建的表達(dá)載體為PGEX-F(I)，所述的H鏈結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)的重組基因構(gòu)建的表達(dá)載體為 pGEX-gsl6fl，所述的天然彩色繭蠶柞蠶、天蠶蠶絲H鏈基因片段的表達(dá)載體為pGEX-AYR4。
3. -種制備如權(quán)利要求1或2所述的絲蛋白肽段的方法，其特征在于，包括家蠶品種蠶 絲非結(jié)晶區(qū)基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)，家蠶品種蠶絲結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)重組基因 的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)，天然彩色繭品種蠶絲基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)。
4. 如權(quán)利要求3所述的絲蛋白肽段的制備方法，其特征在于，所述的家蠶品種蠶絲非 結(jié)晶區(qū)基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)，包括以下步驟： A、 對(duì)Invitrogen公司合成的家蠶品種蠶絲非結(jié)晶區(qū)基因的非重復(fù)序列肽段F(I)的編 碼基因序列，基因序列的一端設(shè)計(jì)有限制性核酸內(nèi)切酶HindIII-Ng 0MIV位點(diǎn)，另一端設(shè)計(jì) 有AgeI-BglII位點(diǎn)，用已經(jīng)保存的含多克隆位點(diǎn)的基礎(chǔ)質(zhì)粒來(lái)完成非結(jié)晶區(qū)基因序列的 克隆，用限制性核酸內(nèi)切酶Bglll/Hindlll消化pSLFA1180FA，插入設(shè)計(jì)合成的含有BglII 和HindIII的粘末端非結(jié)晶區(qū)基因序列，T4DNA連接酶連接后得到含有完整非結(jié)晶區(qū)編碼 基因的質(zhì)粒PSL-F(I); B、 由pGEX-KG經(jīng)過(guò)改造加入限制性核酸內(nèi)切酶AgeI位點(diǎn)得pGEX-Agel，Agel/Hindlll 酶切的PGEX-AgeI載體回收載體片段，Agel/Hindlll酶切質(zhì)粒[pSl^F (1)回收插入片段， T4DNA連接酶連接構(gòu)建含有非結(jié)晶區(qū)肽段基因的表達(dá)載體表示為pGEX-F(l); C、 將構(gòu)建的表達(dá)載體pGEX-F (1)轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌細(xì)胞，加入0-1. 2mM的誘導(dǎo)劑異 丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度轉(zhuǎn)速200rpm/min的空氣搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)0-8小 時(shí)，然后用4100rpm/min的速度離心收集表達(dá)GST融合蛋白的BL21菌細(xì)胞； D、 菌細(xì)胞用適量的磷酸鹽緩沖液重懸，置于冰上超聲破碎后13300r/min的速度離心 IOmin,收集上清液； E、 將超聲破碎后收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋白 GST-F(I)； F、 采用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過(guò)程中的還原型谷胱甘肽后，融合蛋白經(jīng) 凝血酶酶切，再經(jīng)GST親和層析柱純化獲得設(shè)計(jì)所需要的源于家蠶蠶絲蛋白的多肽F (1)。
5. 如權(quán)利要求3所述的絲蛋白肽段的制備方法，其特征在于，所述的家蠶品種蠶絲結(jié) 晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)重組基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)，包括以下步驟： A、 用AgeI酶切（GA) 16的質(zhì)粒插入NgoMIV和AgeI酶切獲得的F(I)的基因序列，篩選 F(I) 3'端AgeI與NgoMIV粘末端的連接進(jìn)行克隆，連接后酶切位點(diǎn)消失，形成Ala和Gly， 同時(shí)完成了家蠶品種蠶絲結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)重組基因的克隆，所使用的克隆載體為凍存的 pCDNA-2,構(gòu)建的質(zhì)粒為 pCDNA-gsl6fl ; B、 用核酸限制性內(nèi)切酶Agel/Hindlll消化質(zhì)粒pGEX-Agel回收條帶作為載體片段， 同時(shí)用所述的核酸限制性內(nèi)切酶Agel/Hindlll消化上述構(gòu)建好的結(jié)晶區(qū)肽段與非結(jié)晶區(qū) 肽段的重組質(zhì)粒，并回收目的肽段編碼基因序列作為插入片段，T4DNA連接酶連接后構(gòu)建 pGEX系列表達(dá)載體，S卩pGEX-gsl6fl，編碼的氨基酸序列為GAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAG SGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGSGFGPYVANGGYS GYEYAffSSESDFAG(GS16F1)； C、 將構(gòu)建的表達(dá)載體pGEX-gsl6f 1轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌細(xì)胞，加入0-1. 2mM的誘導(dǎo)劑 異丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度轉(zhuǎn)速200rpm/min的空氣搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)0-8 小時(shí)，然后用4100rpm/min的速度離心收集表達(dá)GST融合蛋白的BL21菌細(xì)胞； D、 菌細(xì)胞用適量的磷酸鹽緩沖液重懸，置于冰上超聲破碎后13300r/min的速度離心 IOmin,收集上清液； E、 將超聲破碎后收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋白 GST-GS16F1 ； F、 采用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過(guò)程中的還原型谷胱甘肽后，融合蛋 白經(jīng)凝血酶酶切，再經(jīng)GST親和層析柱純化獲得設(shè)計(jì)所需要的源于家蠶蠶絲蛋白的多肽 GS16F1。
6.如權(quán)利要求3所述的絲蛋白肽段的制備方法，其特征在于，所述的天然彩色繭品種 蠶絲基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)，包括以下步驟： A、 對(duì)Invitrogen公司設(shè)計(jì)并合成的SGAGGRGDGGYGSGSSG(-RGD-) "天蠶絲素蛋白重 鏈氨基酸序列的編碼基因序列，5'端設(shè)計(jì)有限制性核酸內(nèi)切酶AgeI和BglII的位點(diǎn)， 3'端設(shè)計(jì)有限制性核酸內(nèi)切酶BamHI的位點(diǎn)，用實(shí)驗(yàn)室保存的含多克隆位點(diǎn)的基礎(chǔ)質(zhì)粒 PSLFA1180FA來(lái)完成"-RGD-"基序的克隆，具體步驟為：用限制性核酸內(nèi)切酶AgeI和BamHI 消化PSLFA1180FA質(zhì)粒，然后采用瓊脂糖凝膠電泳回收消化產(chǎn)物中的大片段，與設(shè)計(jì)合成 的"-RGD-"基因混合，用T4連接酶連接得到pSL-AYRl ; B、 用限制性核酸內(nèi)切酶Bglll/EcoRI消化質(zhì)粒pSL-AYRl，瓊脂糖凝膠電泳回收的 小片段插入到BamHI/EcoRI消化同一質(zhì)粒pSL-AYRl獲得的載體中，T4連接酶連接構(gòu)建 PSL-AYR2,獲得設(shè)計(jì)的"-RGD-"基因序列加倍，連接后同尾酶的位點(diǎn)BglII和BamHI均消失， 形成了甘氨酸Gly和絲氨酸Ser的密碼子，采用同樣的方法加倍獲得4倍設(shè)計(jì)序列的基因 克隆質(zhì)粒PSL-AYR4 ; C、 用核酸限制性內(nèi)切酶Agel/BamHI消化質(zhì)粒pSL-AYR4回收AYR4的基因片段，插 入Agel/BamHI消化的課題組保存的pCDNA-2質(zhì)粒中pCDNA-AYR4,構(gòu)建，然后采用AgeI/ HindIII消化pGEX-Agel回收條帶作為載體片段，同時(shí)用相同的內(nèi)切酶Agel/Hindlll消化 p⑶NA-AYR4,并回收目的肽段編碼基因序列作為插入片段，T4DNA連接酶連接后構(gòu)建pGEX 系列表達(dá)載體，即 PGEX-AYR4,編碼的相應(yīng)肽段為 SGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGS GAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSG(RGD4)； D、 將構(gòu)建的表達(dá)載體PGEX-AYR4轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌細(xì)胞，加入0-1. 2mM的誘導(dǎo)劑異 丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度轉(zhuǎn)速200rpm/min的空氣搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)0-8小 時(shí)，然后用4100rpm/min的速度離心收集表達(dá)GST融合蛋白的BL21菌細(xì)胞； E、 菌細(xì)胞用適量的磷酸鹽緩沖液重懸，置于冰上超聲破碎后13300r/min的速度離心 IOmin,收集上清液； F、 將超聲破碎后收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋白 GST-RGD4 ； G、采用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過(guò)程中的還原型谷胱甘肽后，融合蛋白經(jīng) 凝血酶酶切，再經(jīng)GST親和層析柱純化獲得設(shè)計(jì)所需要的源于天然彩色繭蠶蠶絲蛋白的多 肽R⑶4。
【文檔編號(hào)】C07K19/00GK104232665SQ201410353375
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月23日
【發(fā)明者】王建南, 裔洪根, 褚永興 申請(qǐng)人:湖州南潯恒岳農(nóng)業(yè)科技有限公司