固定化生物分子用穩(wěn)定組合物的制作方法

固定化生物分子用穩(wěn)定組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種固定化生物分子用穩(wěn)定組合物，特別涉及一種組合物在使固體載體上固定的生物分子穩(wěn)定中的應(yīng)用，所述組合物包含(a)至少三種不同氨基酸，(b)至少兩種不同氨基酸和皂苷，或者(c)至少一種二肽或三肽。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)被穩(wěn)定的生物分子的方法，所述方法包含將生物分子包埋在本發(fā)明的組合物中，并涉及一種生產(chǎn)其上附著有生物分子的固體載體的方法。本發(fā)明還涉及一種可通過或者通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的固體載體，和一種利用本發(fā)明的載體診斷疾病的方法。
【專利說明】固定化生物分子用穩(wěn)定組合物
[0001 ] 本申請(qǐng)是分案申請(qǐng)，其原申請(qǐng)的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)柺荘CT/EP2010/054391，國(guó)際申請(qǐng)日是2010年3月31日，中國(guó)國(guó)家申請(qǐng)?zhí)枮?01080023348.2，進(jìn)入中國(guó)的日期為2011年11月28日，發(fā)明名稱為“固定化生物分子用穩(wěn)定組合物”。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種組合物在使固定在固體載體上的生物分子穩(wěn)定中的應(yīng)用，所述組合物包含(a)至少三種不同氨基酸，(b)至少兩種不同氨基酸和皂苷，或者(C)至少一種二肽或三肽。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)被穩(wěn)定的生物分子的方法，所述方法包含將生物分子包埋在本發(fā)明的組合物中，并涉及一種生產(chǎn)其上附著有生物分子的固體載體的方法。本發(fā)明還涉及一種通過本發(fā)明的方法可生產(chǎn)的或者生產(chǎn)出的固體載體，和一種利用本發(fā)明的載體診斷疾病的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]在本說明書中，引用了包含專利申請(qǐng)和制造商手冊(cè)在內(nèi)的許多文件。這些文件的公開內(nèi)容應(yīng)被認(rèn)為與本發(fā)明的專利性無關(guān)，通過引用將其整體并入本說明書中。更具體而言，對(duì)所有參考文件通過引用并入的程度等同于具體且單獨(dú)地指明各份單獨(dú)文件通過引用并入。
[0004]在診斷和治療應(yīng)用中利用固定化生物分子(例如蛋白，如抗體)時(shí)的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是保留生物分子的活性。然而，由于生物功能分子的化學(xué)、物理或生理學(xué)性質(zhì)通常會(huì)因化合物周圍環(huán)境的變化而顯著改變，因而保留生物分子的活性是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。例如，pH、離子強(qiáng)度、溫度或存儲(chǔ)的改變會(huì)導(dǎo)致化合物性質(zhì)的可逆或不可逆改變。特別是，受到例如長(zhǎng)期存儲(chǔ)、運(yùn)輸或滅菌程序等逆境的生物分子必須被穩(wěn)定以防止活性喪失。
[0005]對(duì)于臨床免疫診斷而言，診斷化驗(yàn)中所使用的固定的生物分子的充分穩(wěn)定，是“歐洲體外診斷指南(EU In Vitro Diagnostics Guideline) ” (IVDD98/79/EC)中所規(guī)定的產(chǎn)品市場(chǎng)準(zhǔn)入所要求的。
[0006]根據(jù)植入物在人體中的位置，含有固定化生物分子的可植入的醫(yī)療裝置例如會(huì)暴露于多種存在于人體組織中的生物試劑，例如酸、堿和離子等。這些試劑中有一些可以降解裝置的生物分子，導(dǎo)致?lián)p壞甚至裝置失效。
[0007]因此，含有固定化生物分子制劑的市售載體或裝置含有如糖(例如海藻糖)和/或血清蛋白(例如白蛋白)等穩(wěn)定劑，以保護(hù)生物分子使其免于降解(Polifke T.和RauchP, Laborwelt (2007)第6卷,第 I ~4頁)。
[0008]含有血漿蛋白的穩(wěn)定劑的優(yōu)點(diǎn)在于除其穩(wěn)定作用外，還充當(dāng)防止非特異性結(jié)合的封閉劑。然 而，因?yàn)榘椎鞍椎仁侨嘶騽?dòng)物來源的，所以它們可能含有例如病毒或朊病毒之類的病原體等。因此，必須采用復(fù)雜的成本和時(shí)間密集的凈化方法以除去這些病原體。
[0009]防止如滅菌或長(zhǎng)期存儲(chǔ)等逆境中對(duì)于固定化生物分子損壞的常規(guī)方法的另一缺點(diǎn)在于，這些方法要求將所述生物分子冷凍(US5，730，933 ；Cleland J.L.等，Journal ofPharmaceutical Sciences (2001)，第 90 卷，第 3 號(hào)，第 310 ~321 頁)。例如，US5, 730，933公開了一種用于對(duì)抗體滅菌的方法，這些抗體的活性可以通過在滅菌過程中冷凍它們而得到保留。然而，冷凍會(huì)導(dǎo)致生物分子的構(gòu)象改變，這會(huì)影響它們的生物功能，并且冷凍構(gòu)成固定化生物分子的制備中的另一步驟，導(dǎo)致成本增加。此外，穩(wěn)定組合物含有動(dòng)物來源的血清蛋白如白蛋白等，因此具有將于其中溫育的生物分子污染的風(fēng)險(xiǎn)。
[0010]因此，需要穩(wěn)定和保護(hù)在治療和診斷中所使用的固定化生物分子的改進(jìn)的方法和要素。因此，本發(fā)明的目的是提供可以避免現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)的穩(wěn)定生物分子的方法和要素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]因此，本發(fā)明涉及一種包含至少兩種不同氨基酸的組合物在使固體載體上固定的生物分子穩(wěn)定中的應(yīng)用。
[0012]具體而言，本發(fā)明涉及一種組合物在使固體載體上的生物分子穩(wěn)定方面的應(yīng)用，所述組合物包含(a)至少三種不同氨基酸，(b)至少兩種不同氨基酸和一種皂苷，和/或(C)至少一種二肽。
[0013]取決于預(yù)期的應(yīng)用或狀態(tài)，根據(jù)本發(fā)明使用的組合物可以是液體或固體。如下所述的本發(fā)明的包被和/或包埋附著于載體的生物分子的組合物通常是固體，而在如下所述的本發(fā)明的載體的 生產(chǎn)方法中組合物通常是液體。在除去組合物的液體部分和/或干燥后，如下所述的本發(fā)明的包被和/或包埋附著于載體的生物分子的組合物又成為固體。如果組合物是液體，則其優(yōu)選為水性的。
[0014]氨基酸被定義為具有羧基和氨基官能團(tuán)的有機(jī)分子。它們是蛋白的基本構(gòu)建單元。關(guān)于本發(fā)明，術(shù)語“氨基酸”指游離氨基酸，它們未彼此結(jié)合形成寡聚物或聚合物，如二肽、三肽、寡肽或蛋白。
[0015]穩(wěn)定組合物中所含的氨基酸可以選自天然氨基酸和人工氨基酸或其衍生物。天然氨基酸是例如20種構(gòu)成蛋白的氨基酸甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸(關(guān)于本發(fā)明，術(shù)語“天冬氨酸”和“谷氨酸”也包括這些氨基酸的鹽)、谷氨酰胺、半胱氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、纈氨酸、酪氨酸、蘇氨酸和色氨酸。其他天然氨基酸是例如肉堿、鳥氨酸、羥脯氨酸、高半胱氨酸、瓜氨酸、羥賴氨酸或丙氨酸。
[0016]氨基酸衍生物為例如η-乙?；?色氨酸、膦?；z氨酸、膦?；K氨酸、膦酰基酪氨酸、麥拉寧(melanin)、精氨琥珀酸及其鹽或D0PA。人工氨基酸是具有不同側(cè)鏈長(zhǎng)度和/或側(cè)鏈結(jié)構(gòu)和/或在不同于a -C原子的位置具有氨基的氨基酸。
[0017]本發(fā)明的上下文中的術(shù)語“穩(wěn)定”涉及根據(jù)本發(fā)明使用的組合物所引起的任何下述作用:(固定化)生物分子的結(jié)構(gòu)和/或活性的穩(wěn)定、生物分子儲(chǔ)存期的延長(zhǎng)和/或生物分子抵抗逆境的保護(hù)。這將使生物分子的生物活性得到極大程度的保留。
[0018]關(guān)于本發(fā)明使用并可與術(shù)語“應(yīng)激損傷”互換使用的術(shù)語“逆境”是指引起生物分子活性喪失的任何環(huán)境影響。示例性逆境因素是熱、干旱或輻射，如通過下述滅菌方法而引起的輻射等。另一種逆境因素是化學(xué)環(huán)境。例如，用于滅菌的環(huán)氧乙烷等氣體會(huì)促進(jìn)生物分子活性的喪失。
[0019]術(shù)語“生物活性”是指生物分子的天然活性。生物活性取決于具體分子，并包括對(duì)于其他(生物)分子的親合力或催化活性。例如，抗體的生物活性需要與其抗原的特異性結(jié)合。核酸探針的生物活性例如需要其和與其互補(bǔ)的核酸靶特異性地雜交的能力。關(guān)于這一點(diǎn)，術(shù)語“極大程度的保留”是指，使已暴露于逆境的(固定化)生物分子的生物活性與未暴露于逆境的(固定化)生物分子相比保留至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，最優(yōu)選至少80%。
[0020]術(shù)語“生物分子”描述了可由活體產(chǎn)生或由活體產(chǎn)生的任何有機(jī)分子，包括優(yōu)選生物可降解性聚合分子如蛋白或肽、糖類和核酸，以及小分子，如初級(jí)代謝物、次級(jí)代謝物和天然產(chǎn)物。術(shù)語“生物分子”不僅包含從活體中分離的天然分子，還包含通過合成、半合成或重組而產(chǎn)生的天然或人造分子。人造分子例如為由天然分子衍生的引入了變化的那些分子。除屬于上述種類的那些分子之外的生物可降解性聚合分子有木質(zhì)素和多羥基脂肪酸酯(polyhydroxyIalcanoates)(天然聚合物)和聚亞烷基酯(polyalcylene ester)、聚乳酸及其共聚物、聚酰胺酯、聚乙烯酯、聚乙烯醇和聚酐(人造聚合物)。優(yōu)選的生物分子發(fā)揮與藥物、診斷和/或科學(xué)應(yīng)用有關(guān)的性質(zhì)。換言之，適用于本發(fā)明的生物分子優(yōu)選發(fā)揮以下生物活性，所述生物活性使它們優(yōu)選可用作或適合用作藥物活性劑、診斷試劑和/或研究工具。
[0021]對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言可以理解的是，本發(fā)明中所使用的術(shù)語“生物分子”也包括包含在如真核或原核細(xì)胞、組織、病毒及其片段(例如細(xì)胞器官、膜或衣殼)等結(jié)構(gòu)之中或之上的如上所述的生物分子。在本發(fā)明的該實(shí)施方式中，生物分子可以以分離的形式或者以包含在所述真核或原核細(xì)胞、組織、病毒或其片段之中或之上的形式附著于固體載體。作為另外一種選擇，包含生物分子(優(yōu)選在其表面上包含生物分子)的結(jié)構(gòu)體可以充當(dāng)本發(fā)明的載體。
[0022]可與此處所使用的術(shù)語“蛋白”互換使用的術(shù)語“多肽”描述的是一類分子，其包含一類由超過30個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽。與其相反的是，由至多30個(gè)氨基酸構(gòu)成的分子被稱為“肽”。同樣，根據(jù)該定義，術(shù)語“肽”描述的是長(zhǎng)度為30個(gè)氨基酸以下的蛋白的片段。多肽或肽還可以形成二聚體、三聚體和更高級(jí)的低聚物，即由超過一個(gè)多肽或肽分子構(gòu)成。形成這種二聚體、三聚體等的多肽或肽分子可以是相同的，也可以是不同的。相應(yīng)的高階結(jié)構(gòu)體因此而稱作同源或異源二聚體、同源或異源三聚體等。術(shù)語“多肽”、“蛋白”和“肽”也指天然修飾的多肽/蛋白和肽，其中所述修飾例如通過糖基化、乙?；土姿峄冗M(jìn)行。所述修飾在本領(lǐng)域中是公知的。
[0023]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“核酸”或“核酸分子”包括如cDNA或基因組DNA等DNA，和如反義RNA或siRNA等RNA。還包含的是本領(lǐng)域已知的核酸模擬分子，如DNA或RNA的合成或半合成衍生物和混合的聚合物。所述核酸模擬分子或核酸衍生物包含硫代膦酸酯核酸(phosphoroth1ate nucleic acid)、氨基憐酸酯核酸(phosphoramidate nucleic acid)、2’-0-甲氧基乙基核糖核酸、嗎啉代核酸、己糖醇核酸(HNA)、鎖核酸(LNA)和肽核酸(PNA)(參見Braasch和Corey,Chem B1l2001,8:1)。LNA是其中核糖環(huán)受到2，-氧和4，-碳之間的亞甲基鍵的約束的RNA衍生物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解的那樣，核酸分子可以含有另外的非天然或衍生的核苷酸堿基。核酸分子還包括核酶、適體、質(zhì)粒和染色體。本發(fā)明的核酸分子可以以分離的形式或者以與其他生物分子(如蛋白等，例如組蛋白或核糖體的蛋白)復(fù)合的形式使用。
[0024]術(shù)語“糖類”是指作為具有多羥基的醛或酮的有機(jī)化合物，通常在每個(gè)不作為醛或酮官能團(tuán)的一部分的碳原子上附加有一個(gè)羥基。根據(jù)分子的長(zhǎng)度，糖類被稱為單糖、寡糖或多糖。糖類一旦與非糖類分子結(jié)合，所獲得的分子即被稱作糖苷。經(jīng)修飾的糖類具有例如N-乙酰酯、羧基或硫酸酯測(cè)量，并可含有葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖胺、葡萄糖胺。
[0025]優(yōu)選的生物分子為蛋白、肽、核酸及其衍生物、糖類及其衍生物以及脂質(zhì)和脂肪酸、多元醇及其組合或修飾物。蛋白的實(shí)例為抗體或其保留有其結(jié)合特異性的片段、酶、受體、膜蛋白(可選的是不具有其跨膜域)、生長(zhǎng)因子、白蛋白、球蛋白、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、凝血因子和蛋白激素。示例性糖類為支鏈淀粉、糖原、淀粉、α-和β_葡聚糖、右旋糖苷和糖胺聚糖，如透明質(zhì)酸、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素及其衍生物如糖苷。
[0026]特別優(yōu)選的蛋白是抗體或其保留有結(jié)合特異性的片段。適用于本發(fā)明的抗體可以是例如多克隆抗體或單克隆抗體。術(shù)語“抗體”也包含依然保留有其結(jié)合特異性的抗體的衍生物?？贵w的片段包含但不限于Fab片段、F(ab’)2* Fv片段。生產(chǎn)抗體及其片段的技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的，并描述于例如Harlow和Lane的“Antibodies, A LaboratoryManual” (Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988)和 Harlow 和 Lane 的“UsingAntibodies:A Laboratory Manual，，(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998)中。這些抗體例如可以用于所關(guān)注的分子的免疫沉淀反應(yīng)或者用于從患者體液中除去不想要的分子。
[0027]術(shù)語“抗體”也包括如合成的、嵌合的、單鏈的和人源化的抗體或其仍保留有其結(jié)合特異性的衍生物或片段等實(shí)施方式?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的各種程序來生產(chǎn)所述抗體和/或片段。此外，為生產(chǎn)單鏈抗體而描述的技術(shù)適于生產(chǎn)特異性地結(jié)合于所關(guān)注的分子或其片段的單鏈抗體。此外，可使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)人源化抗體。最優(yōu)選的是，抗體是單克隆抗體。對(duì)于單克隆抗體的制備，可以使用任何提供通過連續(xù)細(xì)胞系溫育產(chǎn)生的抗體的方法。這種技術(shù)的實(shí)例包括雜交瘤技術(shù)(K0hler和Milstein Nature 256(1975)，495-497)、三源雜交瘤技術(shù)、人類B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor, Immunology Today4(1983),72)和 EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole 等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, AlanR.Liss, Inc.(1985),77-96)來產(chǎn)生人類單克隆抗體?？梢允褂萌鏐IAcore系統(tǒng)中所采用的表面等離子體共振來提高與所關(guān)注的生物分子的表位結(jié)合的噬菌體抗體的功效(Schier，Human Antibodies Hybridomas7 (1996) ,97-105 ；Malmborg, J.Tmmunol.Methodsl83 (1995)，7-13)。根據(jù)本發(fā)明的上下文，術(shù)語“抗體”還包含可以在細(xì)胞中表達(dá)的抗體構(gòu)建體，例如可通過例如病毒或質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗體構(gòu)建體。一旦獲得抗體或其片段，抗體自身或?yàn)槠渚幋a的DNA可以進(jìn)行測(cè)序以提供用于小或大規(guī)模地重組產(chǎn)生抗體或其片段的信息。生產(chǎn)重組抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的。
[0028]如本領(lǐng)域中所公知的，抗體或其衍生物或片段還可以化學(xué)修飾。
[0029]抗體可以是任何種類的抗體。最優(yōu)選的是，抗體是單克隆抗體，并屬于IgG、IgM或IgY類。IgY抗體表示IgG抗體在雞中的類似物。
[0030]可與術(shù)語“附著的”或“附著”互換使用的術(shù)語“固定化”或“固定”涉及生物分子在載體上的固著。所述固定或附著或固著可以是不可逆的，也可以是可逆的。固著可以是載體的材料與生物分子之間所形成的共價(jià)或非共價(jià)鍵造成的。示例性非共價(jià)相互作用包括引起吸附的那些作用。生物分子對(duì)于載體的固著可以通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何技術(shù)來進(jìn)行(參見例如 Hermanson, G.T.，B1conjugate Technique (2008),第 2 版):[0031]固著可以例如通過生物分子與固體載體的直接結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。作為另外一種選擇，固著可以通過間接結(jié)合實(shí)現(xiàn)，所述間接結(jié)合通過包被固體載體的如隔離和連接分子等第三化合物(例如，硅烷或如生物素、抗生物素蛋白或鏈親和素等蛋白)來進(jìn)行。在整個(gè)本發(fā)明中使用的術(shù)語“包被”包含對(duì)固體載體的完全包被和部分包被。在這兩種供選方案中，結(jié)合可以是通過共價(jià)或非共價(jià)鍵的結(jié)合。共價(jià)鍵可以例如通過生物分子與載體材料之間的或者隔離/連接分子與生物分子之間的化學(xué)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。非共價(jià)結(jié)合的實(shí)例包含弱鍵，如范德華鍵或其他極性鍵。所述非共價(jià)鍵出現(xiàn)在例如多肽或肽與具有聚乙烯表面的固體載體之間。
[0032]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物分子可逆地附著在所述固體載體上。
[0033]術(shù)語“可逆地附著”限定了當(dāng)生物分子附著于載體時(shí)可以通過適當(dāng)要素從所述載體上釋放下來。根據(jù)附著的種類(例如附著是否為共價(jià)或非共價(jià))，可以采用不同的釋放生物分子的要素。實(shí)例是通過蛋白酶切割(在蛋白作為生物分子的情況下)、改變PH或改變溫度。生物分子附著于載體，直至到了需要的時(shí)候并且只有在那時(shí)才從載體上釋放下來。
[0034]上述技術(shù)只是將生物分子固定或可逆地附著在固體載體上的實(shí)例。但是，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是，本發(fā)明并不限于這些實(shí)例。相反，可以采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何常用方法來將生物分子固定或可逆地附著在固體載體上。
[0035]選擇生物分子的可逆附著，從而使生物分子能夠從載體上迅速釋放下來。關(guān)于這一點(diǎn)，術(shù)語“迅速”是指超過50 %、如60 %、70 %或80 %的所述生物分子可以在2小時(shí)以內(nèi)、如在I小時(shí)、30分鐘或20分鐘內(nèi)釋放，其可以為任意組合，如60%在30分鐘或20分鐘釋放、70%在30分鐘或20分鐘釋放或者80%在30分鐘或20分鐘釋放、優(yōu)選超過85%在10分鐘以下釋放、最優(yōu) 選超過98%在I分鐘內(nèi)釋放。這可以通過例如應(yīng)用下述方法之一來實(shí)現(xiàn)。此外，選擇生物分子的可逆附著，優(yōu)選使在臨床應(yīng)用之前立時(shí)釋放生物分子。
[0036]可逆附著與不可逆附著相似，可以是共價(jià)的或非共價(jià)的。
[0037]優(yōu)選的是，非共價(jià)鍵是具有高親合力和特異性的非共價(jià)鍵。所述非共價(jià)鍵的實(shí)例是鏈親和素-生物素或抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)形成的那些非共價(jià)鍵。在此實(shí)例中，鏈親和素/抗生物素蛋白共價(jià)偶聯(lián)于適當(dāng)?shù)妮d體。然后生物素化的生物分子非共價(jià)但具有高親合力地結(jié)合于鏈親和素/抗生物素蛋白。通過添加過量的生物素，結(jié)合得到競(jìng)爭(zhēng)性的抑制，并且生物素化的生物分子得到釋放。
[0038]生物分子可以通過連接體、優(yōu)選可切割的連接體而連接。適當(dāng)?shù)倪B接體可以選自但不限于
[0039]a)具有二硫橋的連接體如SDAD(NHS-SS_雙吖丙啶)、SulfoSAND、DSP，其可以通過添加具有-SH基團(tuán)的試劑如硫醇(th1ls, mercaptanes)、半胱氨酸、巰基乙醇或二硫蘇糖醇而被輕易切割，
[0040]b)具有肽鍵的連接體，其可使用特定蛋白酶、優(yōu)選人的酶切割，
[0041]c)可以通過超聲切割的連接體，
[0042]d)具有酯鍵的連接體，如EGS，可由例如羥胺切割，
[0043]e)具有砜的連接體，如BS0C0ES，可在ph較高(例如pHll.6)時(shí)被切割
[0044]f)具有順式二醇的連接體，如DST，可由偏高碘酸鈉切割。
[0045]作為另外一種選擇，生物分子可以通過如上所述的干燥而可逆地附著，在下文中將結(jié)合本發(fā)明的方法對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)描述。在該實(shí)施方式中，可逆附著以下述方式實(shí)現(xiàn):生物分子和用作穩(wěn)定劑的分子(即，氨基酸，可選地結(jié)合皂苷和/或可選地結(jié)合與至少一個(gè)如上所述的二肽和/或三肽)和固體載體在干燥后粘附在一起。生物分子的釋放于對(duì)上述化合物添加液體時(shí)發(fā)生，由此將生物分子和穩(wěn)定分子從載體上溶解/溶液化下來。
[0046]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“固體載體”定義了固體材料的載體。載體的材料可以是致密或多孔結(jié)構(gòu)。如下文中所述，優(yōu)選的是，載體材料是選自由玻璃、醫(yī)用級(jí)不銹鋼、金屬合金(例如鉻鈷鑰、氮氧化鈦)、羥磷灰石、聚硅氧烷、聚苯乙烯、聚-L-乳酸；聚氨酯、聚酯、聚砜、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸(polyacryl)、聚丙烯腈、聚酰胺、PMMA、毛織填塞物(fleecewadding)、開孔泡沫塑料或玻璃和網(wǎng)狀塑料或玻璃和衍生自于海綿(海綿動(dòng)物)的結(jié)構(gòu)。
[0047]在本發(fā)明的過程中，驚訝地發(fā)現(xiàn)了可以通過應(yīng)用下述組合物而使固定在固體載體上的生物分子穩(wěn)定，所述組合物包含(a)至少三種不同氨基酸、(b)至少兩種不同氨基酸和皂苷或(C)至少一種二肽。該組合物包被或包埋生物分子并保護(hù)其免受不利影響。與術(shù)語“包被”類似，在整個(gè)本發(fā)明中所使用的術(shù)語“包埋”包括由根據(jù)本發(fā)明使用的組合物部分或完全包埋生物分子。如所附實(shí)施例中所示，由根據(jù)本發(fā)明使用的組合物包被或者包埋的固定化生物分子在抗逆境(如老化或滅菌等)方面顯示了顯著的提高，同時(shí)基本上保留了其生物活性。
[0048]本發(fā)明的穩(wěn)定組合物的主要優(yōu)點(diǎn)在于，氨基酸而不是血清蛋白(如白蛋白)被用作穩(wěn)定劑。不像人或動(dòng)物來源的血清蛋白，根據(jù)本發(fā)明使用的穩(wěn)定組合物的氨基酸可以合成產(chǎn)生。因此，可以降低或者避免受到如病毒或朊病毒等病原體污染的風(fēng)險(xiǎn)。
[0049]除了對(duì)于生物分子的保護(hù)效果之外，穩(wěn)定組合物還被發(fā)現(xiàn)具有下述附加作用，SP，封閉其上附著有生物分子的固體載體上的自由結(jié)合位。 [0050]此外，如所附實(shí)施例中確認(rèn)的那樣，根據(jù)本發(fā)明使用的穩(wěn)定組合物是普遍適用的:其適于保護(hù)不同的分子，如抗體(例如IgM、IgG)、酶(例如DNAse)或核酸。
[0051]本發(fā)明的穩(wěn)定生物分子的方法還具有下述優(yōu)點(diǎn)，即，與常規(guī)穩(wěn)定方法不同，其不需要冷凍生物分子。由此可以避免冷凍過程中出現(xiàn)的構(gòu)想變化。因此，本發(fā)明的冷凍方法特別適于不穩(wěn)定或易變化的生物分子，如抗體，特別是IgM分子的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。
[0052]還驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過在本發(fā)明的穩(wěn)定組合物中溫育如抗體等生物分子，這些生物分子發(fā)揮其生物活性的能力(例如在抗體的情況中，為結(jié)合其抗原的能力)在通過利用25kGy的輻射滅菌時(shí)與未處理的對(duì)照組相比可以保留至少65%。
[0053]即，使用本發(fā)明的穩(wěn)定組合物，在利用25kGy輻射時(shí)，與常規(guī)穩(wěn)定劑(例如公開于US5, 730, 9333中的常規(guī)穩(wěn)定劑)相比，可以實(shí)現(xiàn)包埋的生物分子保留的功能性的顯著增加。
[0054]根據(jù)本發(fā)明使用的組合物優(yōu)選不含有蛋白或非氨基酸、二肽和/或三肽的蛋白的片段。因此，在本發(fā)明的該優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物不含有蛋白或由超過三種氨基酸構(gòu)成的蛋白片段，也不含有人源或動(dòng)物源的水解蛋白。所述組合物具有下述優(yōu)點(diǎn)，即，不存在污染其中包埋的生物分子的風(fēng)險(xiǎn)。其還是已知穩(wěn)定組合物的具有成本效益的替代選擇。
[0055]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，穩(wěn)定組合物包含2~18種不同氨基酸、更優(yōu)選2~10種、進(jìn)而更優(yōu)選2~8種并且最優(yōu)選2~5種或5~8種不同氨基酸。作為另外一種選擇，組合物包含至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種或至少8種以上不同氨基酸,如至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19種或至少20種不同氨基酸。包含在組合物中的不同種氨基酸的數(shù)量?jī)?yōu)選不超過18。
[0056]從所附實(shí)施例中顯而易見的是，當(dāng)用于使固定化生物分子穩(wěn)定時(shí)，本發(fā)明的組合物在存在兩種或三種不同氨基酸時(shí)就已能發(fā)揮其有益效果。該效果然后會(huì)逐漸加強(qiáng)，并在穩(wěn)定組合物中存在5~8種不同氨基酸時(shí)達(dá)到最大效果。根據(jù)用于測(cè)試穩(wěn)定效果的程序，在存在5種不同氨基酸(例如對(duì)于增強(qiáng)的老化)或在存在8種不同氨基酸(例如對(duì)于滅菌)時(shí)達(dá)到最大效果。有益效果不會(huì)或者基本不會(huì)隨著向根據(jù)本發(fā)明使用的穩(wěn)定組合物中添加另外的不同的氨基酸而降低，但優(yōu)選得到保留。因此，包含至少9種、至少10種、至少11種、如至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19種或至少20種不同氨基酸的組合物也可以用于使固定化生物分子穩(wěn)定。
[0057]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物包含至少4或至少5種氨基酸。
[0058]從實(shí)施例中顯而易見的是，當(dāng)包含至少4或至少5種氨基酸時(shí)，本發(fā)明的組合物對(duì)于固定在固體載體上的生物分子的穩(wěn)定性具有更加有利的作用。根據(jù)氨基酸的組合，逆境暴露后保留的生物活性可達(dá)87 %。
[0059]在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物包含以下每組中的至少一種氨基酸:(a)具有非極性脂肪族R基團(tuán)的氨基酸；(b)具有極性不帶電荷的R基團(tuán)的氨基酸；(c)具有帶正電荷的R基團(tuán)的氨基酸；(d)具有帶負(fù)電荷的R基團(tuán)的氨基酸；和(e)具有芳香族R基團(tuán)
的氨基酸。
[0060]天然氨基酸可以歸類于上述特征組中(Nelson D.L.&Cox Μ.Μ., ' LehningerB1chemie' (2005), pp.122-127),其中從每組中選擇至少一種氨基酸用于本發(fā)明的組合物。天然氨基酸以外的其他氨基酸，如人造氨基酸等，也可以進(jìn)行相應(yīng)分類。盡管本發(fā)明的組合物中可以包含上述每組中的超過一種氨基酸，如至少兩種或至少三種氨基酸，但是目前優(yōu)選的是從每組中只選擇一種氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)理解，根據(jù)本發(fā)明使用的組合物中存在的每組的氨基酸數(shù)量不必相同。相反，可以選擇氨基酸的任何組合，只要每組中的至少一種氨基酸存在即可。
[0061]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物在至少兩種或至少三種氨基酸的混合物中包含低于I干重％、優(yōu)選低于0.5干重％的半胱氨酸。這也適用于包含至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種至少9種或至少10種以上不同氨基酸,如至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19種或至少20種不同氨基酸的組合物。
[0062]由于半胱氨酸中包含SH基團(tuán)，因此包含半胱氨酸的組合物可以在例如SH基團(tuán)處發(fā)生氧化，引起令人不愉快的氣味和/或可能使組合物顏色改變?yōu)樽厣涤?。為最小化這些不合需要的作用，特別是在將組合物結(jié)合醫(yī)療裝置使用時(shí)，應(yīng)該使組合物中包含的半胱氨酸的量如上所述地降低。然而，即使這些作用不合需要，它們也不會(huì)影響包含較高百分比半胱氨酸(相反其導(dǎo)致棕色或發(fā)出令人不愉快的氣味)的本發(fā)明的組合物的適合性。
[0063]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，包含在組合物中的氨基酸為丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和色氨酸。盡管在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包含超過上述5種氨基酸，但在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物中不包含除丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和色氨酸之外的其他氨基酸。
[0064]在一個(gè)替代性優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物中包含的氨基酸為天冬氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、纈氨酸。與上面類似，盡管在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包含超過上述5種氨基酸，但在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物中不包含除天冬氨酸酯、精氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、纈氨酸之外的其他氨基酸。
[0065]在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物中包含的氨基酸為脯氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、蘇氨酸和苯丙氨酸；或酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸和纈氨酸；或精氨酸、甘氨酸、組氨酸、丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和色氨酸。最后一種氨基酸組合，即精氨酸、甘氨酸、組氨酸、丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和色氨酸，已經(jīng)顯示了其在滅菌、特別是輻射后的性質(zhì)是特別有利的。所述氨基酸組合顯示了未發(fā)出任何令人不愉快的氣味或在輻射后變色。
[0066]同樣，盡管在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包含超過5、6或7種氨基酸，但在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物中除該優(yōu)選實(shí)施方式中所列組合的氨基酸之外不包含其他氨基酸。
[0067]在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物還包含低于I %、更優(yōu)選低于0.3%的吐溫(Tween)、優(yōu)選吐溫80。
[0068]吐溫是用于聚山梨醇酯的通稱，其為在某些藥物和食品制劑中所使用的一類乳化劑和表面活性劑。它們通常用于使油性成分溶于水基產(chǎn)品中。聚山梨醇酯是源于被脂肪酸酯化的PEG化山梨聚糖(山梨糖醇的一種衍生物)的油性液體。聚山梨醇酯的實(shí)例為聚山梨醇酯20 ((吐溫20或聚氧乙烯(20)山梨聚糖單月桂酸酯)、聚山梨醇酯40 (吐溫40或聚氧乙烯(20)山梨聚糖 單棕櫚酸酯)、聚山梨醇酯60 (吐溫60或聚氧乙烯(20)山梨聚糖單硬脂酸酯)和聚山梨醇酯80 (吐溫80或聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯)。吐溫80在本發(fā)明所使用的組合物中是最優(yōu)選的。
[0069]在本發(fā)明過程中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，添加低于1% (優(yōu)選相對(duì)于生物分子和氨基酸的干重低于1%)的吐溫可避免在處理本發(fā)明的液體組合物的過程中發(fā)泡。
[0070]如上所述，本發(fā)明還涉及一種包含至少一種二肽和/或三肽的組合物用于穩(wěn)定固定在固體載體上的生物分子的應(yīng)用。適用時(shí)，以上給出的定義和如上所述的優(yōu)選實(shí)施方式經(jīng)過必要變更可應(yīng)用于本發(fā)明的該實(shí)施方式。因此，組合物可以由至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種或至少十種不同二肽和/或三肽構(gòu)成。示例性二肽為甘氨酰谷氨酰胺(Gly-Gln，與單獨(dú)的谷氨酰胺相比顯示了增強(qiáng)的穩(wěn)定性)、甘氨酰酪氨酸(Gly-Tyr)、丙氨酰谷氨酰胺(Ala_Gln，后二種與單獨(dú)的酪氨酸相比顯示了增強(qiáng)的水溶性)和雙甘氨肽。其他天然二肽為肌肽((β_丙氨酰-L-組氨酸)、鵝肌肽丙氨酰-N-甲基組氨酸)、高鵝肌肽(N-(4-氨基丁酰)-L-組氨酸)、京都酚(L-酪氨酰-L-精氨酸)、鯨肌肽(Balenine)(或蛇肉肽)(β -丙氨酰-N τ -甲基組氨酸)、格里肽(Glorin) (N-丙酰-Y -L-谷酰基-L-鳥氨酸-δ -1ac乙酯)和巴蒂肽(Barettin)(環(huán)-[(6-溴-8-en-色氨酸)-精氨酸])。其他人造二肽為阿斯巴甜(N-L_a_天冬氨酰-L-苯丙氨酸1-甲酯)和偽脯氨酸。示例性三肽為谷胱甘肽(Y-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸)及其類似物眼晶體酸(L-Y-谷氨酰-L-α-氨基丁酰-甘氨酸)和正眼酸(y-谷氨酰-丙氨酰-甘氨酸)。其他三肽為異亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸(IPP)、甘脯谷肽(Glypromate)(甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸)、促甲狀腺素釋放激素(TRH、促甲狀腺素釋放素或普羅瑞林)(L-焦谷氨酰-L-組氨酸基-L-脯氨酰胺)、促黑激素抑制素(脯氨酰-亮氨酰_甘氨酰胺)、売抑蛋白酶肽(N-乙酰基-L-売氨酰-L-売氨酰-L-精氨酰胺)和愛森肽(pGlu-Gln-Ala-OH)。優(yōu)選的是，用作穩(wěn)定劑的至少一種三肽、更優(yōu)選的是所有三肽在聯(lián)系本發(fā)明的醫(yī)療應(yīng)用(參見下文)而使用時(shí)不發(fā)揮任何藥理性質(zhì)。本發(fā)明的該實(shí)施方式的組合物優(yōu)選不含有蛋白或非氨基酸、二肽或三肽的蛋白的片段。因此，在本發(fā)明的該優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物不含有蛋白或其由超過三種氨基酸構(gòu)成的片段。相反，該實(shí)施方式的組合物優(yōu)選還包含至少一種氨基酸、優(yōu)選至少兩種、更優(yōu)選至少三種、進(jìn)而更優(yōu)選至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種以上不同氨基酸，如至少十一種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19種或至少20種不同氨基酸。
[0071]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的組合物包含皂苷。
[0072]皂苷是一類形成次級(jí)代謝物的化合物，其見于天然來源、衍生自天然來源或可化學(xué)合成。皂苷在各種植物物種中特別豐富。皂苷是兩性苷，其可根據(jù)在水性溶液中震蕩時(shí)產(chǎn)生的皂類泡沫按現(xiàn)象分類，也可以根據(jù)其與親脂性三萜烯衍生物結(jié)合的一個(gè)以上親水苷部分的組成按結(jié)構(gòu)分類。皂苷的實(shí)例為甘草酸、甘草次酸、葡萄糖醛酸、七葉樹皂角素、常春藤苷和毛地黃皂苷。優(yōu)選的是，用作穩(wěn)定劑的皂苷在聯(lián)系本發(fā)明的醫(yī)療應(yīng)用(參見下文)而使用時(shí)不發(fā)揮任何藥理性質(zhì)。
[0073]在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，皂苷包含在包含任意數(shù)量不同氨基酸的組合物中(所述氨基酸包含在上述最低數(shù)量的氨基酸名單中)，例如所述組合物包含至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種或至少10種以上不同氨基酸,例如至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19種或至少20種不同氨基酸。 [0074]在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，阜苷為甘草酸(glycyrrhizic acid,亦作:glycyrrhicic acid),其也稱作甘草甜素或甘草甜酸(glycyrrhizinic acid),或者其衍生物。
[0075]甘草酸的衍生物是本領(lǐng)域公知的，包括通過甘草酸在羧基和羥基上的轉(zhuǎn)化、通過將氨基酸殘基偶聯(lián)至糖類部分中或者將2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺引入甘草酸的苷鏈中而產(chǎn)生的那些衍生物。其他衍生物為甘草酸的酰胺、具有兩個(gè)氨基酸殘基以及游離的30-C00H官能團(tuán)的甘草酸共軛物和至少一個(gè)氨基酸烷基酯在甘草酸分子的糖類部分中的共軛物。具體衍生物的實(shí)例可見于例如Kondratenko等的文獻(xiàn)(RussianJournal ofB10rganic Chemistry, Vol30 (2)，(2004)，pp.148-153)。
[0076]在本發(fā)明過程中已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)，與使用僅包含氨基酸的組合物作為穩(wěn)定劑相t匕，在向上述組合物中添加甘草酸時(shí)，生物分子保留有更多的其生物活性。關(guān)于這一點(diǎn)，特別值得注意的是，甘草酸單獨(dú)對(duì)于固定化生物分子并不發(fā)揮任何穩(wěn)定或保護(hù)效果。
[0077]在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，穩(wěn)定組合物還包含多元醇、優(yōu)選糖或糖醇，其選自木糖、甘露糖、葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、葡聚糖、甘露醇、山梨醇或肌醇。
[0078]在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物的液體實(shí)施方式優(yōu)選是緩沖的、優(yōu)選是水性的溶液，但也可以是水或非緩沖的優(yōu)選水性的鹽溶液。除其他因素之外，所使用的緩沖劑取決于所要包被/包埋的生物分子。通常適于與生物分子接觸的緩沖劑例如為磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、硼酸鹽、碳酸鹽、乳酸鹽、銨、甘氨酸、巴比妥酸鹽、HEPES、MOPS、MES、TRIS。示例性適于抗體的緩沖劑將在下文中進(jìn)一步描述。
[0079]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及穩(wěn)定生物分子或產(chǎn)生被穩(wěn)定的生物分子的方法，所述方法包含(a)將所述生物分子附著于固體載體，和(b)將所述生物分子包埋在本發(fā)明的組合物中。可能的固定方式已在上文描述，并且可以應(yīng)用于本方法中。優(yōu)選的是，在步驟b)中，生物分子被部分或完全包被或包埋在組合物中。
[0080]包埋的詳細(xì)程序?qū)⒃谙挛闹薪Y(jié)合生產(chǎn)固體載體的本發(fā)明的方法、特別是其步驟(b)但可選的也可以是步驟(c)、(d)和/或(e)進(jìn)一步描述。
[0081]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)其上附著有生物分子的固體載體的方法，所述方法包含以下步驟
[0082](a)將生物分子附著于固體載體；和
[0083](b)將步驟(a)的載體在本發(fā)明所述的組合物中溫育。 [0084]與生物分子相關(guān)的術(shù)語“附著”和“固定”已被定義，程序的詳細(xì)情況在上文中也已進(jìn)行描述。所述定義和描述可同樣適用于本發(fā)明的方法和下文所描述的其他實(shí)施方式。特別是，如上所述生物分子的附著可以是可逆或不可逆的。
[0085]術(shù)語“溫育”指在使步驟(a)中所述的化合物附著于載體并使步驟(a)的附著于固體載體的生物分子包埋在步驟(b)所述的穩(wěn)定組合物中的條件下的溫育。在該實(shí)施方式中，用于溫育固體載體的組合物為液體，并優(yōu)選為水性溶液。組合物最初可以是固體組合物。在該實(shí)施方式中，最初的固體組合物被溶解在優(yōu)選為水性的介質(zhì)中，由此包含在優(yōu)選為水性的溶液中。
[0086]因此，在生物分子上和/或周圍形成了后涂層，其通過減小生物分子可及面和通過聯(lián)合生物分子三級(jí)結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)域，與其他因素一起穩(wěn)定生物分子。盡管組合物在應(yīng)用于生物分子時(shí)是液體，但是其之后脫水，獲得包埋或包被生物分子的固體組合物。在步驟b)中生物分子可以部分或完全包埋在組合物中。技術(shù)人員會(huì)理解，溫育條件需要適合附著在固體載體上的生物分子。
[0087]溫育條件包括根據(jù)步驟和溫度將溫育進(jìn)行20分鐘~12小時(shí)的那些條件。例如，抗體可以在37°C溫育I小時(shí)，該溫度是IgM抗體穩(wěn)定的最高溫度。IgG抗體可以在高達(dá)50°C溫育。根據(jù)步驟和溫育時(shí)間，溫度范圍可以為4°C~50°C，優(yōu)選20°C~37°C。
[0088]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟(b)中的溫育在室溫進(jìn)行I小時(shí)。應(yīng)當(dāng)理解，為加速程序或改善結(jié)果，溫育時(shí)間和溫度可以根據(jù)溫育中所使用的物質(zhì)而改變。技術(shù)人員會(huì)知道，術(shù)語“室溫”根據(jù)位置和外部溫度而意味著不同溫度。其通常為17°C~23°C。
[0089]優(yōu)選的是，步驟(b)中的液體組合物經(jīng)緩沖的并且更優(yōu)選具有低鹽含量。本發(fā)明所述的低鹽含量被定義為鹽濃度為0.9重量％以下，優(yōu)選低于0.2重量％。通常但并非絕對(duì)的是，對(duì)于如IgG和IgY抗體等抗體，可以使用偏堿性的緩沖液，例如由15mM碳酸鈉和35mM碳酸氫鈉水溶液制得(pH9)，而對(duì)于IgM的附著而言，較中性的緩沖劑(pH7.0~7.4)如PBS等磷酸鹽緩沖劑更有利。
[0090]作為其上附著有生物分子的固體載體，由步驟(a)獲得的固體載體在本發(fā)明的上下文中也稱作“涂布”載體(“coated” carrier)。[0091]作為與包被和/或包埋所附著生物分子的本發(fā)明的組合物溫育的固體載體，由步驟(b)獲得的固體涂布載體(solid coated carrier)在本發(fā)明的上下文中也稱作“后涂布”載體(“postcoated” carrier)。
[0092]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該方法還包括步驟(C):
[0093](c)除去步驟(b)中應(yīng)用的組合物。
[0094]步驟(a)、(b)和(C)以上述順序進(jìn)行。
[0095]術(shù)語“除去”指在步驟(b)后定性或定量地除去液體組合物。因此，之上將組合物除去至下述程度:組合物的殘留量不顯著改變本發(fā)明方法的后續(xù)步驟中所使用的溶液的品質(zhì)。定量除去引起對(duì)載體的干燥。所述除去可以例如通過抽吸、濃縮或吹風(fēng)進(jìn)行，所述抽吸例如利用可附接移液管的普通泵進(jìn)行?？蛇x的是，這些步驟可以組合，并可以與空氣干燥進(jìn)一步組合。優(yōu)選的是，除去至少95體積％的溶液，如至少98體積％或至少99體積％、99.5體積％或99.8%。
[0096]因此，在其中進(jìn)行定量除去的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括步驟
(C):
[0097](C)對(duì)固體載體進(jìn)行干燥。
[0098]干燥可以使用如空氣干燥、噴霧冷凍干燥(dryinglyophilisat1n)和沉淀等公知技術(shù)進(jìn)行。其他適合的技術(shù)包括晶化和微晶化。當(dāng)作為載體的是珠粒或納米顆粒時(shí)，干燥可以通過冷凍干燥來進(jìn)行，不過對(duì)于其他載體而言優(yōu)選其他干燥技術(shù)。
[0099]在本發(fā)明的一個(gè)替代性的優(yōu)選實(shí)施方式中，該方法還在步驟(b)之后包括步驟
(C):
[0100](C)對(duì)載體進(jìn)行干燥直至殘留液體含量〈20重量％。
[0101]根據(jù)本發(fā)明的該優(yōu)選實(shí)施方式，可以以已知用于確定木材的含水量的方式計(jì)算殘留的液體含量。對(duì)于木材，木材的含水量百分比(X)通過以下方式確定:計(jì)算樣品中水的質(zhì)量(Hlw)與含水木材樣品的質(zhì)量(Hlu)的比率并乘以100。樣品中水的質(zhì)量(Hlw)可以通過從含水木材樣品質(zhì)量(Hlu)中減去脫水后樣品質(zhì)量來確定。因此，木材的含水量的百分比通過下式計(jì)算:
[0102]
【權(quán)利要求】
1.一種組合物在使固體載體上固定的生物分子穩(wěn)定中的應(yīng)用，所述組合物包含 (a)至少三種不同氨基酸，或者 (b)至少一種二肽或三肽。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述生物分子可逆地附著在所述固體載體上。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中使生物分子穩(wěn)定包括穩(wěn)定生物分子的結(jié)構(gòu)和/或活性、增加生物分子的儲(chǔ)存期和/或保護(hù)生物分子抵抗逆境介導(dǎo)的損傷。
4.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中所述組合物包含至少4種或至少5種不同氨基酸。
5.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中所述組合物包含以下每組中的至少一種氨基酸 (a)具有非極性脂肪族R基團(tuán)的氨基酸； (b)具有極性不帶電荷的R基團(tuán)的氨基酸； (c)具有帶正電荷的R基團(tuán)的氨基酸； (d)具有帶負(fù)電荷的R基團(tuán)的氣基酸；和 (e)具有芳香性R基團(tuán)的氨基酸。
6.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中所述組合物中含有的氨基酸選自 (a)丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和色氨酸； (b)天冬氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸和纈氨酸； (c)脯氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸； (d)酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸；和 (e)精氨酸、甘氨酸、組氨酸、丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、色氨酸。
7.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中所述組合物在至少兩種或至少三種氨基酸的混合物中包含低于I干重％的半胱氨酸。
8.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中所述組合物還包含低于I%的吐溫。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述組合物包含低于0.3%的吐溫。
10.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述組合物包含吐溫80。
11.一種生產(chǎn)被穩(wěn)定的生物分子的方法，所述方法包括 (a)將所述生物分子附著于固體載體，和 (b)將所述生物分子包埋在權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述的組合物中，從而使得所包埋的生物分子被權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述的組合物部分地或完全地包被。
12.—種生產(chǎn)其上附著有生物分子的固體載體的方法，所述方法包括以下步驟 (a)將所述生物分子附著于所述固體載體，和 (b)將步驟(a)的載體在權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述的組合物中溫育。
13.如權(quán)利要求11或12所述的方法，所述方法還包括 (C)對(duì)所述固體載體進(jìn)行干燥。
14.如權(quán)利要求11或12所述的方法，所述方法還包括在步驟(b)后或在步驟(c)后對(duì)所述固體載體滅菌。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述載體的滅菌通過環(huán)氧乙烷、β-輻射、Y-輻射、X-射線、熱滅活、高壓滅菌或等離子滅菌進(jìn)行。
16.—種固體載體,所述固體載體可通過權(quán)利要求12~15中任一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)，或者是通過權(quán)利要求12~15中任一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)的。
17.如權(quán)利要求16所述的固體載體，其中所述生物分子為蛋白、肽、核酸、糖類、脂質(zhì)、脂肪酸、多元醇及其組合或修飾物。
18.如權(quán)利要求17所述的固體載體，其中所述蛋白為抗體、酶、受體、細(xì)胞因子、激素、膜蛋白、生長(zhǎng)因子、白蛋白、球蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或凝血因子。
19.如權(quán)利要求16~18所述的固體載體，其中所述生物分子特異性地結(jié)合指示疾病的標(biāo)志物蛋白、非細(xì)胞病原體、細(xì)胞或毒素。
20.如權(quán)利要求16~19中任一項(xiàng)所述的固體載體在醫(yī)療裝置制備中的應(yīng)用。
21.如權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其中所述醫(yī)療裝置為植入物、管、導(dǎo)管、支架、管、傷口敷料或體外循環(huán)中所使 用的醫(yī)療裝置。
【文檔編號(hào)】C07K17/00GK104031151SQ201410290725
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2009年3月31日
【發(fā)明者】斯特凡·馬格拉夫, A·布魯爾, 馬丁·肖爾茨, 延斯·阿爾特里克特 申請(qǐng)人:白血球保健股份有限公司