一種高純度藻藍(lán)蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高純度藻藍(lán)蛋白的制備方法，其特征在于采用如下步驟：(1)取新鮮螺旋藻粉與磷酸鹽緩沖液充分混勻，反復(fù)凍融7-10次破除細(xì)胞壁，離心除去藻泥，得到上清液；(2)采用20％-30％和40％-60％的硫酸銨兩步沉淀法得到藻藍(lán)蛋白粗提物；(3)粗提物透析后上樣于弱陰離子交換柱DEAE?Sepharose?FF，經(jīng)離子交換后進(jìn)行梯度洗脫，收集A620/A280>3的流出組分；(4)收集到的樣品透析后上樣于強(qiáng)陰離子交換柱SOURCE30Q，經(jīng)離子交換后進(jìn)行梯度洗脫，收集A620/A280>4的流出組分，再經(jīng)過(guò)一次硫酸銨沉淀濃縮，可以得到純度大于4.5的高純度藻藍(lán)蛋白。本發(fā)明的提取純化方法，工藝精簡(jiǎn)，原料螺旋藻來(lái)源廣泛，所需設(shè)備簡(jiǎn)單，產(chǎn)品純度高，有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種高純度藻藍(lán)蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)工程或生化分離純化領(lǐng)域，具體涉及一種高純度藻藍(lán)蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]藻藍(lán)蛋白(phycocyanin 是一種存在于藍(lán)藻細(xì)胞中的光合色素，由含發(fā)色團(tuán)的α和β亞基組成，這兩個(gè)亞基各具有約20kDa的分子量。在藻藍(lán)蛋白中這兩個(gè)亞基通常組合成單體(α β)、三聚體(α β)3和六聚體(α β )6,因此分子量范圍也從44到260kDa不等。藻藍(lán)蛋白是一種天然的藍(lán)色著色劑，被廣泛用作保健飲料、糖果著色劑和化妝品中，還有些因其具有熒光免疫性被用作生化示蹤劑。此外，藻藍(lán)蛋白已經(jīng)被證明具有重要的藥理作用，包括保肝、抗氧化、抗炎、抗癌和抗糖尿病等活性。由于具有巨大的商業(yè)和科研價(jià)值，因而藻藍(lán)蛋白的提取純化受到重視。藻藍(lán)蛋白的純度通常用A620/A280來(lái)表示，等級(jí)劃分為0.7 <食品級(jí)< 3.0 <反應(yīng)級(jí)< 4.0 <分析級(jí)，因此藻藍(lán)蛋白的純度越高，價(jià)格越高。藻藍(lán)蛋白具有良好的水溶性，分離純化過(guò)程中的PH值變化、離子強(qiáng)度、光和溫度是影響藻藍(lán)蛋白分子穩(wěn)定性的重要因素。藻藍(lán)蛋白在高于40°C以及pH < 4或者pH > 8.5的條件下容易變性，喪失活性，現(xiàn)有的藻藍(lán)蛋白提取純化工藝中存在著難以保證蛋白質(zhì)活性、工藝流程復(fù)雜、生產(chǎn)成本居高不下、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定的缺陷，這些都嚴(yán)重制約了藻藍(lán)蛋白的應(yīng)用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的是提供一種高純度藻藍(lán)蛋白的制備方法。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0005]一種高純度藻藍(lán)蛋白的制備方法，包括以下步驟:
[0006](I)取新鮮螺旋藻粉，與磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L)按1: 10_1: 15(質(zhì)量/體積)充分混勻，得到螺旋藻懸液，常溫避光攪拌2小時(shí)充分混懸，反復(fù)凍融7-10次破除細(xì)胞壁，離心去除藻泥，得到上清液I。
[0007](2)向上清液I中加入硫酸銨固體，邊加邊攪拌，并盡量避免出現(xiàn)氣泡，4°C沉降8小時(shí)以上，離心得到含有藻藍(lán)蛋白的上清液II。
[0008](3)上清液II中繼續(xù)加入硫酸銨固體，邊加邊攪拌，并盡量避免出現(xiàn)氣泡，4°C沉降8小時(shí)以上，離心得到含有藻藍(lán)蛋白的沉淀。
[0009](4)用少量磷酸鹽緩沖液(0.0ImoI/L)溶解沉淀后轉(zhuǎn)移至透析袋中，4°C透析24小時(shí)，每隔4小時(shí)換一次透析用緩沖液，收集透析袋中的溶液，得到藻藍(lán)蛋白粗提液。
[0010](5)將藻藍(lán)蛋白粗提液上樣于弱陰離子交換柱DEAE Sepharose FF，進(jìn)行梯度洗脫，收集A620/A280 > 3的流出組分。
[0011](6)將上述收集的組分透析除鹽后，上樣于強(qiáng)陰離子交換柱S0URCE30Q，進(jìn)行梯度洗脫，收集A620/A280 > 4的流出組分。
[0012](7)向上一步收集的組分中加入硫酸銨固體，4°C沉降8小時(shí)以上，離心除去上清液得到藻藍(lán)蛋白沉淀，此沉淀用少量磷酸鹽緩沖液溶解并且透析后，得到高純度藻藍(lán)蛋白。
[0013]以上步驟所述的離心條件為4°C，8000-12000rpm，30min。
[0014]步驟(2)所述的加入硫酸銨固體至20% -30%飽和濃度，離心取上清。
[0015]步驟(3)所述的加入硫酸銨固體至40% -60%飽和濃度，離心取沉淀。
[0016]步驟(4)所述的透析袋截留分子量為8000-14400。
[0017]步驟(5)所述的DEAESepharose FF梯度洗脫液為含有0.1-0.5mol/LNaCl,pH7.0，
0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。
[0018]步驟(6)所述的S0URCE30Q 梯度洗脫液為含有 0-0.3mol/L NaCl,pH7.0,0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液。
[0019]步驟(7)所述的加入硫酸銨固體至40%飽和濃度，離心取沉淀。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0021]本發(fā)明從螺旋藻中提取高純度藻藍(lán)蛋白的方法，以磷酸鹽緩沖液作為溶解體系，采用反復(fù)凍融的方法使目的蛋白從細(xì)胞內(nèi)溶出，離心除去藻泥后，第一次鹽析除去部分雜質(zhì)，第二次鹽析沉淀大部分藻藍(lán)蛋白，通過(guò)DEAE Sepharose FF離子交換柱分離除去部分雜蛋白，通過(guò)S0URCE30Q離子交換柱進(jìn)一步除去雜蛋白，再經(jīng)過(guò)一次鹽析，最終得到純度大于
4.5的藻藍(lán)蛋白。
[0022]本發(fā)明使用的原料鈍頂螺旋藻來(lái)源廣泛，藻藍(lán)蛋白提取工藝簡(jiǎn)單高效，成本低廉?！緦＠綀D】
【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的DEAE Sepharose FF離子交換柱層析圖譜。
[0024]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的S0URCE30Q離子交換柱層析圖譜。
[0025]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的各純化步驟得到樣品的SDS-PAGE電泳圖譜;M:蛋白Maker ；1:蛋白粗提品；2:兩步鹽析后樣品；3:過(guò)完DEAE Sepharose FF尚子父換柱樣品；4:過(guò)完S0URCE30Q尚子父換柱樣品；5:最后一步鹽析后樣品。
[0026]圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的各純化步驟得到樣品的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜；1:蛋白粗提品；2:兩步鹽析后樣品；3:過(guò)完DEAE Sepharose FF離子交換柱樣品；4:過(guò)完SOURCE30Q尚子交換柱樣品；5:最后一步鹽析后樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不僅限于此。
[0028]實(shí)施例1
[0029]一種高純度藻藍(lán)蛋白的制備方法，步驟如下:
[0030](I)取新鮮干 燥的螺旋藻粉，與0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液按1:15(質(zhì)量/體積)的比例混合，室溫下磁力攪拌2小時(shí)，置于-20°C冷凍完全，取出置于37°C水浴中融化，用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，避免氣泡產(chǎn)生，至完全融化后再放置-20°C冷凍。如此反復(fù)凍融8次，4°C、8000rpm、離心 30min,取上清液。
[0031](2)向步驟(1)的上清液中加入硫酸銨固體至30%飽和濃度，4°C靜置8小時(shí)，40C、1000Orpm離心30min，取上清，再加入硫酸銨固體至45%飽和濃度，4°C靜置8小時(shí)后，4°C、1000Orpm 離心 30min,取沉淀。
[0032](3)將步驟⑵中的沉淀用少量0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液溶解，置于透析袋中，4°C透析24小時(shí)，每隔4小時(shí)換一次透析用緩沖液，收集透析袋中的溶液，得到藻藍(lán)蛋白粗提液。
[0033](4)將藻藍(lán)蛋白粗提液上樣于弱陰離子交換柱DEAE Sepharose FF，待藻藍(lán)蛋白完全吸附后，先用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液洗去未結(jié)合的雜質(zhì)，再用含0.1-0.5mol/LNaCl,pH7.0,0.01mol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在lml/min，收集A620/A280 > 3的流出組分。
[0034](5)將上述收集組分透析除鹽后，上樣于強(qiáng)陰離子交換柱S0URCE30Q，待藻藍(lán)蛋白完全吸附后，先用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液洗去未結(jié)合的雜蛋白，再用含0-0.3mol/LNaCl,pH7.0,0.01mol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在0.8ml/min,收集A620/A280 >4的流出組分。
[0035](6)將上一步收集組分中加入硫酸銨固體至40%飽和濃度，4°C靜置過(guò)夜后，離心除去上清液得到藻藍(lán)蛋白沉淀，此沉淀用少量磷酸鹽緩沖液溶解，透析后得到高純度藻藍(lán)蛋白。
[0036]實(shí)施例2
[0037]一種高純度藻藍(lán)蛋白的制備方法，步驟如下:
[0038](I)取新鮮干燥的螺旋藻粉，與0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液按2: 25 (質(zhì)量/體積)的比例混合，室 溫下磁力攪拌2小時(shí)，置于-20°C冷凍完全，取出置于37°C水浴中融化，用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，避免氣泡產(chǎn)生，至完全融化后再放置-20°C冷凍。如此反復(fù)凍融10次，4°C、lOOOOrpm、離心 30min,取上清液。
[0039](2)向步驟(1)的上清液中加入硫酸銨固體至25%飽和濃度，4°C靜置8小時(shí)，4°C、1000Orpm離心30min，取上清，再加入硫酸銨固體至50%飽和濃度，4°C靜置8小時(shí)后，4°C、8000rpm 離心 30min,取沉淀。
[0040](3)將步驟⑵中的沉淀用少量0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液溶解，置于透析袋中，4°C透析24小時(shí)，每隔4小時(shí)換一次透析用緩沖液，收集透析袋中的溶液，得到藻藍(lán)蛋白粗提液。
[0041](4)將藻藍(lán)蛋白粗提液上樣于弱陰離子交換柱DEAE Sepharose FF，待藻藍(lán)蛋白完全吸附后，先用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液洗去未結(jié)合的雜質(zhì)，再用含0.1-0.5mol/LNaCl,pH7.0,0.01mol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在1.5ml/min,收集A620/A280 >3的流出組分。
[0042](5)將上述收集組分透析除鹽后，上樣于強(qiáng)陰離子交換柱S0URCE30Q，待藻藍(lán)蛋白完全吸附后，先用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液洗去未結(jié)合的雜蛋白，再用含0-0.3mol/LNaCl,pH7.0,0.01mol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在lml/min，收集A620/A280 > 4的流出組分。
[0043](6)將上一步收集組分中加入硫酸銨固體至40%飽和濃度，4°C靜置過(guò)夜后，離心除去上清液得到藻藍(lán)蛋白沉淀，此沉淀用少量磷酸鹽緩沖液溶解，透析后得到高純度藻藍(lán)蛋白。
[0044]實(shí)施例3[0045]—種高純度藻藍(lán)蛋白的制備方法，步驟如下:
[0046](I)取新鮮干燥的螺旋藻粉，與0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液按1: 10 (質(zhì)量/體積)的比例混合，室溫下磁力攪拌2小時(shí)，置于_20°C冷凍完全，取出置于37°C水浴中融化，用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，避免氣泡產(chǎn)生，至完全融化后再放置-20°C冷凍。如此反復(fù)凍融8次，4°C、12000rpm、離心 30min,取上清液。
[0047](2)向步驟⑴的上清液中加入硫酸銨固體至30%飽和濃度，4°C靜置8小時(shí)，4°C、12000rpm離心30min，取上清，再加入硫酸銨固體至55%飽和濃度，4°C靜置8小時(shí)后，4°C、12000rpm 離心 30min,取沉淀。
[0048](3)將步驟⑵中的沉淀用少量0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液溶解，置于透析袋中，4°C透析24小時(shí)，每隔4小時(shí)換一次透析用緩沖液，收集透析袋中的溶液，得到藻藍(lán)蛋白粗提液。
[0049](4)將藻藍(lán)蛋白粗提液上樣于弱陰離子交換柱DEAE Sepharose FF，待藻藍(lán)蛋白完全吸附后，先用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液洗去未結(jié)合的雜質(zhì)，再用含0.1-0.5mol/INaCl,pH7.0,0.01mol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在1.2ml/min,收集A620/A280 >3的流出組分。
[0050](5)將上述收集組分透析除鹽后，上樣于強(qiáng)陰離子交換柱S0URCE30Q，待藻藍(lán)蛋白完全吸附后，先用0.01m ol/L磷酸鹽緩沖液洗去未結(jié)合的雜蛋白，再用含0-0.3mol/L NaCl,pH7.0,0.01mol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在lml/min，收集A620/A280 > 4的流出組分。
[0051](6)將上一步收集組分中加入硫酸銨固體至40%飽和濃度，4°C靜置過(guò)夜后，離心除去上清液得到藻藍(lán)蛋白沉淀，此沉淀用少量磷酸鹽緩沖液溶解，透析后得到高純度藻藍(lán)蛋白。
【權(quán)利要求】
1.一種高純度藻藍(lán)蛋白的制備方法，其特征在于:所述方法的步驟包括: (1)將螺旋藻粉與磷酸鹽緩沖液按一定比例混合，常溫避光攪拌至完全混懸。 (2)將步驟(1)中的螺旋藻液反復(fù)凍融7-10次，離心收集上清液。 (3)向上述(2)中的上清液中分兩步加入硫酸銨固體，硫酸銨飽和濃度分別為20% -30%和40% -60%，兩步分別離心，第一步離心取上清液，第二步離心取沉淀，所得的沉淀用磷酸鹽緩沖液透析除鹽，得到藻藍(lán)蛋白粗提液。 (4)將上述(3)的藻藍(lán)蛋白粗提液上樣于弱陰離子交換柱，進(jìn)行梯度洗脫，收集A62tl/A280>3的流出組分。 (5)將上述(4)收集組分透析除鹽后，上樣于強(qiáng)陰離子交換柱，進(jìn)行梯度洗脫，收集A620/A280>4的流出組分。 (6)將上述(5)收集組分中加入硫酸銨固體，硫酸銨飽和濃度達(dá)到40%，4°C靜置8小時(shí)以上，離心除去上清液得到藻藍(lán)蛋白沉淀，此沉淀用少量磷酸鹽緩沖液溶解透析后得到高純度藻藍(lán)蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高純度藻藍(lán)蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(1)中螺旋藻粉與磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L)的比例為1: 10_1: 15 (質(zhì)量/體積)，混合后常溫避光攪拌2個(gè)小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高純度藻藍(lán)蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(4)中弱陰離子交換介質(zhì)為DEAE Sepharose FF，梯度洗脫條件為含有0.1-0.5mol/L NaCl,pH7.0，0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高純度藻藍(lán)蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(5)中強(qiáng)陰離子交換介質(zhì)為S0URCE30Q，梯度洗脫條件為含有0-0.3mol/L NaCl,pH7.0,0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。
【文檔編號(hào)】C07K14/795GK103992402SQ201410186021
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】歐瑜, 袁志軍, 李靖 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)