一種腫瘤抑制多肽及用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種高效抑制血管生成多肽及其制備方法及用途。本發(fā)明設(shè)計(jì)了具有細(xì)胞穿入性的高效的血管生成抑制劑Tumstatin-7-TAT,該抑制劑含有tumstatin活性片段氨基酸序列（185-191），在其羧基端連接具有細(xì)胞穿越性的反式激活蛋白TAT(trans-activator?protein)的第47位到第57位氨基酸殘基組成的肽段。該融合肽對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移有很好的抑制作用，并對人肝癌細(xì)胞,乳腺癌細(xì)胞都有很好的抑制作用，可用于制備血管生成抑制劑，各種腫瘤相關(guān)疾病等藥物。
【專利說明】一種腫瘤抑制多肽及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種高效抑制血管生成多肽、其制備方法及用途。
【背景技術(shù)】
[0002]研究表明腫瘤組織的最大的一個(gè)特點(diǎn)為具有豐富的血管生成，即從宿主引發(fā)的新的毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞的形成和轉(zhuǎn)移是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的必備條件。新生血管一方面給腫瘤提供了其惡性增長所需的營養(yǎng)，另一方面給腫瘤向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供了途徑。如果在腫瘤形成過程中能抑制其血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成和遷移，就可以阻止腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。因此抑制腫瘤血管生成是腫瘤治療中日漸引起重視的一類藥物，繼血管抑素(angiostatin)和內(nèi)皮抑素(endostatin)這兩種已進(jìn)入美國臨床試驗(yàn)的藥物之后，Tumstatin是近年來發(fā)現(xiàn)的一種能夠抑制新生血管生成的蛋白藥物。Tumstatin是膠原alpha3 (IV)的NCl結(jié)構(gòu)域，由245個(gè)氨基酸組成，具有抑制腫瘤新生血管生成和抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移作用，這兩種抗腫瘤的特性與一種非RGD依賴性的ITGB3介導(dǎo)的機(jī)制密切相關(guān)。Tumstatin經(jīng)由與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的整合素alpha v beta3結(jié)合而抑制FAK (focal adhesion kinase)的磷酸化而進(jìn)一步抑制PI3-K/Akt/mT0R/4EBPl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，最終抑制腫瘤新生血管生長及腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移(Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.2003，100:4766-4771)。
[0003]最近，小鼠黑色素瘤模型的藥理實(shí)驗(yàn)(J Biol Chem.2004，279 (3):2091-100)證明Tumstatin的NCl (IV) N端7個(gè)氨基酸185-191 (CNYYSNS)組成的肽也具有同樣的抗腫瘤生長的特性，其在三維結(jié)構(gòu)上共同的特征是YSNS序列呈beta-轉(zhuǎn)角構(gòu)象，這種構(gòu)象是維持其生物活性的至關(guān)重要的條件。
[0004]組織穿入是向細(xì)胞遞送藥物的嚴(yán)重限制之一，如何有效地把藥物內(nèi)化至細(xì)胞內(nèi)是藥物傳輸中的一個(gè)重要課題。目前為止，發(fā)現(xiàn)了兩種類型的細(xì)胞穿入肽(cell-penetringpeptide), 一類是疏水性的，一類是陽離子型的(Adv Drug Deliv Rev2005, 57，529-45)。Tat是其中一種可以把核酸和蛋白質(zhì)引入細(xì)胞的陽離子型肽(Nat Med2007，12，327-78 ；Trends cell Bioll998 ;8，84_7)。并且在體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)中，TAT與多肽結(jié)合后確實(shí)顯示了其可將藥物內(nèi)化至細(xì)胞內(nèi)的輔助作用，從而增強(qiáng)了目的藥物的效果(Mol Ther.2009，17(9):1509-16.)。因此，TAT序列可以作為一種載體，將抗腫瘤多肽轉(zhuǎn)運(yùn)如細(xì)胞內(nèi)部，最大程度的發(fā)揮抗腫瘤多肽的效果。故聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞穿入肽和抗腫瘤多肽的研究更有意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明將抑制血管生成的tumstatin活性片段氨基酸序列(185-191)(Tumstatin-7),在其羧基端 連接具有細(xì)胞穿越性的反式激活蛋白TAT (trans-activatorprotein)的第47位到第57位氨基酸殘基組成的肽段序列，構(gòu)建了一種具有細(xì)胞內(nèi)化作用的血管生成抑制劑Tumstatin-7-TAT。本發(fā)明多肽序列為SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。它具有不同的理化性質(zhì)，等電點(diǎn)由融合前的5.52變?yōu)?1.40，水溶性也大大增加，從而減少有機(jī)性增溶溶媒的使用，而避免在臨床使用中引起的不良反應(yīng)。
[0006]本發(fā)明還公開了所述血管生成抑制劑的制備方法，包括:
[0007](I)依據(jù)本發(fā)明所述具有抑制血管生成作用的多肽序列，按常規(guī)方法設(shè)計(jì)得到相應(yīng)的基因序列；
[0008](2)將上述人工合成的基因與原核載體進(jìn)行重組，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，乳糖誘導(dǎo)表達(dá)包含本發(fā)明所述具有抑制血管生成的多肽Tumstatin-7-TAT ;表達(dá)產(chǎn)物以胞內(nèi)可溶表達(dá)形式存在；
[0009](3)收集破碎后的菌體上清，進(jìn)行金屬螯合親和層析，腸激酶酶切，收集穿過液，凍干。
[0010]本發(fā)明所述的血管生成抑制劑還也可用多肽合成方法制備。
[0011]體內(nèi)及體外活性藥效試驗(yàn)顯示，本發(fā)明的多肽具有抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和抑制人肝癌細(xì)胞的功效，還具有抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖作用及小鼠體內(nèi)抗腫瘤功效。
[0012]本發(fā)明所述的血管生成抑制劑是在tumstatin活性片段氨基酸序列(185-191)的基礎(chǔ)上構(gòu)建獲得的，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的產(chǎn)物在體內(nèi)及體外都顯示了比原有tumstatin活性片段氨 基酸序列(185-191)更強(qiáng)的抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移及抑制腫瘤生長的效果，且具有更高的穩(wěn)定性，說明本發(fā)明所設(shè)計(jì)并制備的的融合多肽合理可行，可作為腫瘤的治療藥物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1 是 TrxA-Tumstatin-7-TAT 的 SDS-PAGE 圖(1:蛋白質(zhì)分子量 Markers ;2:未誘導(dǎo)的工程菌；3:誘導(dǎo)后的工程菌；4:親和層析分離后的重組蛋白)
[0014]圖2是Tumstatin-7-TAT體外抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移效果
[0015]圖3是Tumstatin-7-TAT體外抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖效果
[0016]圖4是Tumstatin-7-TAT體內(nèi)抑制黑色素瘤效果
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1
[0018]Tumstatin-7-TAT基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)純化
[0019]依據(jù)本發(fā)明設(shè)計(jì)血管生成抑制劑Tumstatin-7-TAT的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成基因序列，同時(shí)在基因的上游引入腸激酶識別序列DDDDK，5’及3’端的加入的酶切位點(diǎn)為KpnI和Hindlll。將合成后的基因?qū)朐吮磉_(dá)載體pET32a構(gòu)建得到重組表達(dá)載體，并以氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中，其表達(dá)的氨基酸序列如下=TrxA-HisTag-DDDDK-CNYYSNSGGY GRKKR RQRRR0將重組菌以5-10mmol/L乳糖誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)，收獲細(xì)胞并超聲破碎，以N1-1MAC金屬螯合親和層析進(jìn)行純化，得到本發(fā)明多肽，以SDS-PAGE檢測結(jié)果詳見圖1。
[0020]實(shí)施例2
[0021]體外抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
[0022]取對數(shù)生長期的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)以I X IO5/孔的密度接種于24孔板，以含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液來培養(yǎng)，待細(xì)胞生長面積達(dá)90%后，改無血清的RPMI1640培養(yǎng)液使細(xì)胞饑餓過夜，然后用200 μ L Tip頭在孔中央對細(xì)胞做一個(gè)約1.0mm左右的劃痕，然后用無血清的RPMI1640培養(yǎng)液沖洗掉懸浮的細(xì)胞，然后分別與100 μ mol/L的Tumstatin-7-TAT或Tumstatin-7孵育，用無血清的RPMI1640培養(yǎng)液作為陰性對照組，在培養(yǎng)0，24，36h后置I X 105的倒置顯微鏡下拍照記錄。
[0023]結(jié)果表明，對人臍靜脈內(nèi)皮(HUVEC)細(xì)胞，本發(fā)明的血管生成抑制劑Tumstatin-7-TAT具有與Tumstatin-7幾乎一樣的抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的效果，詳細(xì)如圖2所示。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的血管生成抑制劑Tumstatin-7-TAT可以顯著抑制人臍靜脈內(nèi)皮(HUVEC)細(xì)胞的遷移。
[0024]實(shí)施例3
[0025]體外抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)[0026]取對數(shù)生長期的B16F10細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸浮液，以每孔5000個(gè)細(xì)胞接種于96微孔板中，每孔體積100 μ I, 37°C，5%C02孵箱中培養(yǎng) 7-8h0 每孔加入不同濃度藥物(0.4,0.8,1.6,3.2,6.3,12.7，25.4，50.8，101.5 μ mol/L) 100 μ 1，，以1640培養(yǎng)基處理組為陰性對照組10 μ g/ml紫衫醇為陽性對照組(每個(gè)藥物濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔)100ul。37°C，5%C02條件下處理24h后，每孔加入20 μ 1，5g/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸凈培養(yǎng)基，每孔加入150 μ I DMSO溶解MTT甲瓚沉淀，振蕩使其充分溶解后，測570nm波長處的吸光度(A)值，并以630nm處為參比波長。按以下公式可計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長抑制率:腫瘤細(xì)胞的生長抑制率(％)=[(對照孔A值-實(shí)驗(yàn)孔A值)/對照孔A值]。
[0027]結(jié)果表明，對B16F10細(xì)胞，本發(fā)明的血管生成抑制劑Tumstatin_7_TAT的腫瘤細(xì)胞生長的抑制率在6.25~400 μ mol/L的濃度范圍內(nèi)皆比Tumstatin-7高，比如在濃度為25 μ mol/L時(shí)，Tumstatin-7-TAT的抑制率為34.04%，而Tumstatin-7的腫瘤細(xì)胞的生長抑制率為0.25%(p〈0.001)，詳細(xì)如圖3所示。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的血管生成抑制劑Tumstatin-7-TAT可以顯著抑制B16F10腫瘤細(xì)胞的生長。
[0028]實(shí)施例4
[0029]小鼠B16F10黑色素瘤模型抑瘤實(shí)驗(yàn)
[0030]制備5X 106/mlB16F10細(xì)胞懸液鼠模型，以0.1ml接種于小鼠右側(cè)腋下而建立鼠源黑色素瘤移植瘤，等皮下移植瘤體積生長至100mm3左右時(shí)，將小鼠隨機(jī)分成4組Gl陰性對照組)G2紫杉醇組)(G3Tumstatin-7_TAT組)G4Tumstatin_7組)每組8只。Gl每天皮下注射生理鹽水0.1ml; G2皮下注射紫杉醇10mg/kg, 2天I次；G3皮下注射Tumstatin-7-TAT,給藥量為10mg/kg，l，3，5，7，9d時(shí)注射；G4組為皮下注射Tumstatin-7，給藥量為10mg/kg，l，3，5，7，9d時(shí)注射。用游標(biāo)卡尺每隔一天測量移植瘤直徑，腫瘤體積(TUMOR VOLUME, TV)的計(jì)算公式為:TV=1/2*A*B2其中A，B分別表示長寬；以給定時(shí)間內(nèi)的腫瘤抑制率來表示治療效果；腫瘤抑制率的公式為(1-T/C) X 100%。T和C分別表示治療組和對照組的腫瘤體積。結(jié)果表明，在第13天是,Tumstatin-7-TAT的腫瘤抑制率為52.10%,而Tumstatin-7的抑制率為30.77%(p〈0.05)，詳細(xì)如圖4所示。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的血管生成抑制劑Tumstatin-7-TAT可以顯著抑制小鼠體內(nèi)的腫瘤生長。
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種腫瘤抑制多肽，其具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的多肽的制備方法，包括:設(shè)計(jì)得到權(quán)利要求1多肽的對應(yīng)核苷酸序列，構(gòu)建羧基端含有如權(quán)利要求1的氨基酸序列所對應(yīng)基因的載體，進(jìn)行基因工程表達(dá)和分離純化。
3.權(quán)利要求1的多肽用于制備抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移或抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖的藥物的用途。
4.權(quán)利要求1的多肽用于制備治療人新生血管生成有關(guān)的腫瘤疾病的藥物的用途。
【文檔編號】C07K7/08GK103897038SQ201410147068
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】勞興珍, 張冉, 李斌, 鄭珩, 林雅芝 申請人:中國藥科大學(xué)