重組集成干擾素變異體聚乙二醇偶聯(lián)物的制備和應(yīng)用的制作方法

重組集成干擾素變異體聚乙二醇偶聯(lián)物的制備和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及了一種重組集成干擾素變異體的聚乙二醇偶聯(lián)物及其制備方法和應(yīng)用，其特征為：它是以分子量為10KD-40KD的醛基活化聚乙二醇分子對重組集成干擾素變異體進(jìn)行氨基末端的單一位點化學(xué)修飾。修飾后的重組集成干擾素變異體聚乙二醇偶聯(lián)物具有體內(nèi)半衰期延長，免疫原性降低和體內(nèi)長時相的抗病毒活性等特性。本發(fā)明還公開了重組集成干擾素變異體聚乙二醇化偶聯(lián)物的制備方法，同時提供了其組合藥物治療和預(yù)防病毒性感染或增生性疾病或調(diào)節(jié)免疫功能的用途。
【專利說明】重組集成干擾素變異體聚乙二醇偶聯(lián)物的制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)及制藥領(lǐng)域，特別是涉及一種重組集成干擾素變異體的聚乙二醇偶合物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明是發(fā)明名稱為“抗病毒活性的人α干擾素衍生物”(專利號為ZL01102915.3)發(fā)明專利的延伸。
【背景技術(shù)】
[0002]早在1957年，Issacs等人發(fā)現(xiàn)病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生一種因子，可抵抗病毒的感染，干擾病毒的復(fù)制，因而命名為干擾素(interfeixm，IFN)。干擾素是由滅活的或活的病毒作用于易感細(xì)胞后，由易感細(xì)胞基因組編碼而產(chǎn)生的一組糖蛋白。其活性及抗原性皆取決于分子中的蛋白質(zhì)，而與其糖基無關(guān)。根據(jù)其來源和結(jié)構(gòu)，可將IEN分為IFN-α ,IFN-β、IFN-Y，它們分別由白細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和活化T細(xì)胞產(chǎn)生。IFN-a為多基因產(chǎn)物，有十余種不同亞型，但它們的生物活性基本相同。IFN除有抗病毒作用外，還有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、控制細(xì)胞增殖及引起發(fā)熱等作用。目前臨床上使用的干擾素大多是通過基因重組技術(shù)得到的。[0003]IFN是慢性病毒性肝炎經(jīng)臨床驗證有效的一線治療藥物。臨床使用較多的是天然結(jié)構(gòu)的IFNa -2a和IFNa -2b。二者均屬于短效干擾素，半衰期短(4~16h)，血清濃度在注射24h后已經(jīng)很低。其在體內(nèi)的藥代動力學(xué)過程影響了其抗病毒治療的遠(yuǎn)期療效。按照目前3~6MU/kg，每周3次的用藥方法，在體內(nèi)干擾素水平呈現(xiàn)出典型的“峰-谷曲線”。干擾素血清水平大幅度波動容易使病毒水平反跳，產(chǎn)生耐藥性，降低治療效果。同時，短效干擾素存在毒副反應(yīng)大，人長期使用耐受性差，免疫原性強(qiáng)等不足。因此，對短效干擾素進(jìn)行修飾，延長其在體內(nèi)的半衰期，維持體內(nèi)血藥濃度的穩(wěn)定，將有助于提高其治療病毒性肝炎的有效性，并減輕毒副作用。
[0004]聚乙二醇(polyetnylene glycol, PEG)是一種安全無毒、無活性的聚合物，常用于蛋白質(zhì)藥物修飾。修飾后的蛋白抗酶解、水溶性增加、半衰期延長、免疫原性和毒性降低(Inada, et al., J.Bioact.And Compatible Polymers,5:343 (1990).Delgalo, etal., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier systems, 9:249 (1992)kate,Advanced Drug Delivery Systems, 10:91 (1993))?；舴蚵?拉羅齊公司的中國專利:ZL93116479.6和ZL97105433.9公開了聚乙二醇-干擾素結(jié)合物的制備，先靈公司的中國專利200580032850.2公開了穩(wěn)定的聚乙二醇化干擾素的制劑的制備。目前，已有兩種PEG修飾的人α干擾素(霍夫曼-拉羅齊的PEGASYS和先靈公司的PEGINTR0N)用于慢性丙型和乙型肝炎的治療。兩者聚乙二醇化后腎臟清除率明顯降低，半衰期延長(30~16h)、免疫原性降低，每周僅需給藥I次。在清除HCV/HBV病毒方面明顯優(yōu)于短效干擾素。治療丙型肝炎HCV-RNA近期反應(yīng)率可達(dá)69%，持續(xù)反應(yīng)率達(dá)39%，而常規(guī)干擾素僅為7%。治療乙型肝炎HBeAg轉(zhuǎn)陰率可達(dá)37%，綜合應(yīng)答率(即HBeAg轉(zhuǎn)陰、HBV DNA抑制和ALT正?；?為35 %，61 %的病人伴隨HBVDNA轉(zhuǎn)陰(< 400copies/mL)，7 %出現(xiàn)了 HBsAg轉(zhuǎn)陰。而常規(guī)干擾素治療乙肝后三項指標(biāo)僅為(15%、25%、12% )。無HBsAg轉(zhuǎn)陰的病人(ReddyKR, etal.Hepatology, 2001, 33:433-438.Jessner ff, et al.J ViralHepat.2003,10:37-42.Shiffman ML,et al.Hepatology,2004 ；40 (4,suppll):314A.DavisGL, et al.Hepatology, 2003 ；38:645-52.Janssen HL, et al.Lancet, 2005 ；365:123-129.Cooksley WG et al..J Viral Hepat,2003 ；10:298-305.)。
[0005]PEG修飾的重組人α干擾素2a(PEGASYS)修飾位點為賴氨酸，PEG修飾的重組人a干擾素2b (PEG-1ntron)修飾位點為組氨酸。文獻(xiàn)報道(Miller DL, et al.Science,1982,215:689-690.Radhakrishnan R, et al.Structure,1996 ;4 (12): 1453-1463.Karpusas M, et al.Proc.Natl.Acad.sc1.USA1997,94:11813-11818), IFN-α 的受體結(jié)合區(qū)主要包括 AB loop (Arg22, Leu26, Phe27, Leu30, Lys31, Arg33, His34)，helixB (Ser68)，helixC(Thr79, Lys83, Tyr85, Tyr89)，helix D(Arg120, Lysl21, Glnl24, Lysl31, Glul32)和helixE(Argl44,Glul46)。PEGASYS修飾的賴氨酸以及PEG-1ntron修飾的組氨酸均在上述受體結(jié)合區(qū)，不利于干擾素與其受體的結(jié)合。此外，按二者PEG修飾后終產(chǎn)物均非特異性單一定點修飾，如PEGASYS以修飾Lysl31為主的混合物(共有7個修飾位點)，PEG-1ntron是以修飾His34為主的混合物(共有4個修飾位點)。
[0006]單一位點的PEG修飾可同時實現(xiàn)分子量和結(jié)構(gòu)的均一性，提高修飾后的生物活性和體內(nèi)安全性。已有多種方法可實現(xiàn)PEG對干擾素的單一位點特異性修飾。(I)W02006/004959公開了一種利用IFNa-1b氨基酸序列中地86位自由半胱氨酸(Cys86)特異性偶聯(lián)馬來酰胺PEG (PEG maleimide)的方法及其產(chǎn)物；(2) W02008/074230中公開了將IFNa中第85或86為氨基酸突變?yōu)镃ys，再利用馬來酰胺PEG進(jìn)行特異性定點修飾。(3)還可選擇含與N端氨基特異性結(jié)合活性基團(tuán)的PEG對干擾素進(jìn)行N末端修飾(如中國專利CN1229388C,CN100478359C和 CN101381409A)。
[0007]N末端的修飾PEG遠(yuǎn)離干擾素受體結(jié)合區(qū)，從結(jié)構(gòu)分析應(yīng)是理想的修飾位點。但天然α干擾素N端的第I位為半胱氨酸，其與99位半胱氨酸形成一對二硫鍵(此二硫鍵對生物活性十分關(guān)鍵)。采用對α干擾素N末端的專一位點PEG修飾，修飾率很低且對生物活性影響大。
[0008] 為提高天然干擾素的活性，美國Amgen公司首次合成了一種非天然的干擾素(Consensus interferon,集成干擾素,商品名為干復(fù)津)。干復(fù)津是一種經(jīng)計算機(jī)優(yōu)化組合的非天然的重組α-干擾素，其序列由20種天然α-干擾素亞型序列優(yōu)化組合而成，其抗病毒活性比天然干擾素提高了 5~10倍。1997年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)干復(fù)津應(yīng)用于丙型肝炎的治療，研究結(jié)果顯示療效明顯優(yōu)于普通干擾素。美國專利US4695623、US4897471、US5372808公開了復(fù)合干擾素具有廣譜的干擾素活性，有較強(qiáng)的抗病毒和抗腫瘤以及激活NK細(xì)胞的活性。但是干復(fù)津和天然α干擾素相同，具有穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短、免疫原性強(qiáng)等缺點。同時N端第一位的半胱氨酸需與99位半胱氨酸形成二硫鍵，不能有效的進(jìn)行N末端修飾。雖然Amgen公司的美國專利US005985265A公開了和干復(fù)津蛋白的N端修飾的方法,但無論在修飾率和修飾后保留的生物活性均明顯低于其它蛋白的N末端修飾(重組人粒細(xì)胞集落刺激因子G-CSF和重組人生長激素GH等)。
[0009]為實現(xiàn)干擾素的N端修飾，同時根據(jù)同源序列最高原則，本發(fā)明人設(shè)計了全新的集成干擾素序列，命名為集成干擾素變異體(super antiviral interferon,簡稱IFN-SA),現(xiàn)根據(jù)干擾素的命名原則改為重組集成干擾素變異體。由171氨基酸組成，在N末端專門設(shè)計引入Gly Ser Gly Gly Gly五個氨基酸序列,可實現(xiàn)N末端的專一位點PEG修飾。該結(jié)構(gòu)與干復(fù)津結(jié)構(gòu)不同，同時體外抗病毒活性提高了 50%。本新型結(jié)構(gòu)及其重組制備和在抗病毒性疾病中的應(yīng)用，已獲中國發(fā)明專利授權(quán)，專利號:ZL01102915.3。
[0010]本發(fā)明提供了一種重組集成干擾素變異體(IFN-SA)聚乙二醇偶聯(lián)物(簡稱PEG-1FN-SA)的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)選能與N端氨基特異性結(jié)合的丙醛基團(tuán)的20KD聚乙二醇(PEG-ALD)為修飾劑，選擇pH4.5~6條件修飾，成功獲得了聚乙二醇化重組集成干擾素變異體偶聯(lián)物(PEG-1FN-SA)。本制備方法N端單一位點化學(xué)修飾物，有效提高了該蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、延長了半衰期、降低了免疫原性和毒副反應(yīng)?？赏蔀樾滦偷拈L效干擾素預(yù)防和治療病毒性感染性疾病、增生性疾病、增強(qiáng)免疫功能等疾病的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的在于提供了一種用于N端定點化學(xué)修飾的重組集成干擾素變異體(IFN-SA)聚乙二醇偶聯(lián)物的制備方法。該偶聯(lián)物具有穩(wěn)定性好、半衰期長、免疫原性和毒副反應(yīng)低等特征，可用于制備治療預(yù)防和治療病毒性感染性疾病、增生性疾病、增強(qiáng)免疫功能以及其他疾病的藥物。[0012]本發(fā)明涉及的一種化學(xué)修飾的IFN-SA的聚乙二醇偶聯(lián)物。
[0013]IFN-SA表示重組集成干擾素變異體，其特征在于，所述IFN-SA的氨基酸序列為SEQ ID No:1 所示:
[0014]Gly Ser Gly Gly Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn
[0015]151015
[0016]Arg Arg Ala Leu He Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg He Ser Pro Phe
[0017]202530
[0018]Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe
[0019]354045
[0020]Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala He Ser Val Leu His Glu
[0021]505560
[0022]Met He Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala
[0023]65707580
[0024]Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln
[0025]859095
[0026]Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val He Gln Glu Val Gly Val Glu
[0027]100105110
[0028]Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser He Leu Ala Val Arg Lys Tyr
[0029]115120125
[0030]Phe Gln Arg He Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys
[0031]130135140
[0032]Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu He Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser
[0033]145150155160
[0034]Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Asp[0035]165170
[0036]IFN-SA聚乙二醇偶聯(lián)物，其特征在于聚乙二醇是以酰胺鍵與重組集成干擾素變異體N末端甘氨酸的α的氨基共價連接。
[0037]與IFN-SA的N端連接的聚乙二醇其特征在于，所述聚乙二醇為醛基活化的單甲氧
基聚乙二醇分子。
[0038]醛基活化的單甲氧基聚乙二醇分子，其特征在于，包括但不限于單甲氧基聚乙醇丙醛(mPEG-ALD)、單甲氧基聚乙二醇丁醛、單甲氧基聚乙二醇乙醛、單甲氧基聚乙二醇戊醛。優(yōu)選單甲氧基聚乙二醇丙醛。聚乙二醇分子根據(jù)偶聯(lián)度不同，可以是分子量為IOKDa~40KDa的任一分子，其中優(yōu)選分子量為20KD的聚乙二醇分子。聚乙二醇分子可以是直鏈型或分支型，可 以是單鏈、雙鏈或多鏈。優(yōu)選直鏈型單鏈聚乙二醇分子。
[0039]本發(fā)明還提供了 IFN-SA聚乙二醇偶聯(lián)物的制備方法。所屬領(lǐng)域技術(shù)員根據(jù)常識可以選擇聚乙二醇的結(jié)構(gòu)類型、分子量和反應(yīng)所需的用量。通過本申請所提供的制備方法，根據(jù)修飾后蛋白分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，選擇修飾條件:修飾酸堿度、反應(yīng)體系，蛋白和聚乙二醇的摩爾比等。
[0040]以本發(fā)明優(yōu)選的20KDa的mPEG定點N末端修飾IFN-SA為例，說明偶聯(lián)物的制備方法。
[0041]IFN-SA 的制備，具體見專利 ZL01102915.3。
[0042]本領(lǐng)域熟知的，在硼氰化鈉存在條件下，帶醛基的PEG會和伯胺發(fā)生還原氨化反應(yīng)。醛基和其他的親電活性基團(tuán)不同，它只和胺基反應(yīng)。雖然醛基的反應(yīng)活性比NHS活性低，但它具有反應(yīng)條件溫和，易于使PEG和蛋白質(zhì)或其它材料的表面連接。因此，在低的pH下，mPEG-醛會對蛋白質(zhì)的N端進(jìn)行選擇性反應(yīng)。該反應(yīng)條件在pH值4.0~7.0，10~IOOmmoI/L鹽濃度的緩沖體系下，溫度在4~25°C，反應(yīng)時間為I~72小時，反應(yīng)摩爾比PEG:蛋白在1: 2~1: 10。一般情況下，選擇低溫、低pH、反應(yīng)時間適宜條件下得到的N-末端修飾產(chǎn)物均一性強(qiáng)，且反應(yīng)轉(zhuǎn)換率較高。
[0043]本發(fā)明專利所述偶聯(lián)物的制備步驟:將IFN-SA的磷酸鹽緩沖液與20KD的mPEG-ButyrALD在加入20mM硼氰化鈉條件下反應(yīng)，然后采用常規(guī)方法進(jìn)行分離純化，過濾除菌，獲得本發(fā)明的IFN-SA的偶聯(lián)物。所用磷酸鹽緩沖液優(yōu)選pH4.0-6.0，濃度為50-100mmol/L，溫度優(yōu)選4-10°C，反應(yīng)時間優(yōu)選24~48小時，反應(yīng)摩爾比PEG: IFN-SA為1: 2~1: 5，修飾率達(dá)到50%以上。修飾條件的選擇和修飾方法在實例中詳細(xì)說明。
[0044]本發(fā)明偶聯(lián)物的純化方法為=IFN-SA與聚乙二醇聚合物經(jīng)反應(yīng)后的的樣品，用5XDDW透析后上SPS印harose F.F.，經(jīng)IOmM乙酸-乙酸鈉(pH5.5)，平衡液平衡后，用IMNacl的鹽離子逆度洗脫，穿透和洗脫樣品分別用電泳、RP-HPLC檢測純度。含聚乙二醇偶聯(lián)物組份再經(jīng)Superdex75分子篩(或SephacrylS_200), IOmM PB, (pH7.4)條件下分離除去高分子聚合物。結(jié)構(gòu)和質(zhì)量分析方法包括質(zhì)譜、質(zhì)量肽圖、RP-HPLC，Gel-HPL(^PSDS-PAGE。
[0045]采用20KD分子量的丙醛活化的聚乙二醇分子(ALD-mPEG20K)作為修飾物，經(jīng)過至少10批的中試工藝試驗，每批可獲得I克以上純度大于95%的IFN-SA聚乙二醇偶聯(lián)物(代號:
[0046]PEG20-1FN-SA)，修飾率約50 %，非N端修飾物低于3 %，抗病毒比活性≥1.2X107IU/mg。[0047]藥代動力學(xué)表明在食蟹猴體內(nèi)半衰期為34.5小時，明顯長于IFN-SA3小時的半衰期。食蟹猴6月長毒表明，免疫原性顯著低于IFN-SA。在水溶液狀態(tài)4°C條件下可穩(wěn)定24個月。因此，本發(fā)明所述IFN-SA聚乙二醇偶聯(lián)物具備長效、穩(wěn)定、低免疫原性的特征。
[0048]另根據(jù)上述制備方法，選擇IOKD的單甲氧基聚乙二醇丁醛與IFN-SA的N端氨基進(jìn)行偶聯(lián)獲得PEG10-1FN-SA。選擇40KD的PEG-NHS與IFN-SA的N端氨基進(jìn)行偶聯(lián)獲得PEG40-1FN-SA。PEG10-1FN-SA的體外抗病毒活性為≥7.0X 107U/mg，半衰期為15.3小時。PEG40-1FN-S A的體外抗病毒活性為≥4.0 X 106U/mg，半衰期為42.29小時。表明隨著偶聯(lián)PEG分子量的增加，半衰期延長，但外抗病毒活性顯著下降。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，直鏈型PEG修飾對IFN-SA體外活性的影響明顯小于支鏈型PEG的修飾。因此，本發(fā)明優(yōu)選20KD直鏈型單鏈PEG偶聯(lián)修飾IFN-SA。
[0049]由上述方法制備的PEG-1FN-SA，通過相應(yīng)的制劑技術(shù)制備成注射液或凍干粉針、外用型的膏劑或乳劑或噴霧劑以及口服型的含化片或膠囊、片劑。
[0050]IFN-SA的聚乙二醇偶聯(lián)物的另一特征在于，該偶聯(lián)物可用于臨床治療的藥物組合，含有有效劑量的任一偶聯(lián)物和藥用稀釋劑、佐劑和載體。
[0051]本發(fā)明所涉及的PEG-1FN-SA分子為臨床藥用制劑的有效成分，該制劑包括但不限于:稀釋劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、溶解劑、乳化劑、佐劑和載體等。I)稀釋液:磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽等緩沖液；2) pH值和離子強(qiáng)度；3)去污劑和促溶劑:山梨醇、Tween-20、Tween-80 ；4)充填劑:山梨醇、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、甘油。PEG-1FN-SA制劑優(yōu)選IOmM PB(pH7.2)、山梨醇、Tween-80。有效成分的有效劑量是指考慮到表觀分子量和病人體重、年齡等因素的有效治療或預(yù)防劑量。本發(fā)明涉及的PEG-1FN-SA其有效劑量為0.5ug~9ug/kg/次。
[0052]PEG-1FN-SA臨床藥用制劑給藥方式腸道外給藥，包括但不限于皮下、肌肉、靜脈、腹腔注射、吸入、舌下或透皮給藥。給藥周期為3~14天/次。
[0053]本發(fā)明同時還公開了 IFN-SA與聚乙二醇偶聯(lián)物用于預(yù)防和治療病毒性感染性疾病、增生性疾病、增強(qiáng)免疫功能以及其他疾病的方法。
[0054]在一實施方式中，所述病毒感特征在于包括而不限于肝炎病毒感染，人乳頭狀病毒感染，單純性皰疹病毒感染、人免疫缺陷病毒感染、EB病毒感染、SARS感染和流感病毒感染。所述的肝炎病毒感染特征在于包括而不限于丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒感染、甲型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒。優(yōu)選丙型肝炎、乙型肝炎病毒感染。優(yōu)選丙型肝炎、乙型肝炎病毒感染。
[0055]在另一實施方式中，所述的增生性疾病特征在于包括而不限于惡性腫瘤，惡性腫特征在于包括而不限于慢性髓原性白血病、黑色素瘤、腎癌、肝癌。
[0056]還提供了藥物組合聯(lián)合用藥方式包括而不限于利巴韋林、拉米夫定?？贡透窝撞《九c能抑制病毒DNA和RNA合成的廣譜抗病毒類藥物如利巴韋林組合運用；抗乙型肝炎病毒與核苷類抗病毒類藥物如拉米夫定組合運用；治療惡性腫瘤與其他化療藥物組合運用。
[0057] 至此已對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，通過參考下列實例，能夠?qū)Ρ景l(fā)明有更清楚地理解，所述實例僅為說明目的而并不旨在對本發(fā)明進(jìn)行限制。
【專利附圖】

【附圖說明】[0058]附圖1:1FN-SA與PEG的摩爾比對修飾反應(yīng)的影響SDS-PAGE電泳圖，其中1:為I: 2比例，2:為1: 3
[0059]附圖2 =IFN-SA修飾前后的SDS-PAGE電泳圖。其中1:為修飾前IFN_SA，2:為修飾后產(chǎn)物，3:為純化后的PEG20-1FN-SA，M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0060]比例，3:為1: 4比例，4:為1: 5比例，5:為1: 6比例，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0061]附圖3:不同分子量PEG修飾的IFN-SA的SDS-PAGE電泳圖。其中M為marker，I為 PEG10K-1FN-SA，2 為 PEG20K-1FN-SA，3 為 PEG40K-1FN-SA。圖中三種 PEG 化的 IFN-SA 蛋白因遷移率變慢而比理論值偏大。
[0062]附圖4:PEG20-1FN-SA的RP-HPLC色譜圖。圖中PEG20-1FN-SA呈單一吸收峰，純度為98.7%。
[0063]附圖5:PEG20-1FN_SA和IFN-SA的胰蛋白酶酶切后還原質(zhì)量肽圖分析色譜圖。其中圖A為IFN-SA的肽圖，圖B為PEG20-1FN-SA肽圖。二者間僅有二個肽段峰的差異，差異分析說明見實例3。 [0064]圖6:PEG20-1FN-SA 在食蟹中皮下注射不同劑量(10ug/kg，30ug/kg 和 90ug/kg)后體內(nèi)抗病毒生物活性隨時間變化曲線圖。其中?為10ug/kg，〇為30ug/kg，▲為90ug/kg。橫坐標(biāo)為時間(小時)，縱坐標(biāo)為每毫升血液中抗病毒活性單位(IU/ml)。
【具體實施方式】
[0065]實例1、重組集成干擾素變異體聚乙二醇化偶聯(lián)物(PEG20-1FN-SA)的修飾條件
[0066]IFN-SA溶液(濃度為10mg/mL，緩沖為IOOmM PB，pH7.0)由重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司制備，mPEG-ButyrALD-20KD(純度> 95%，相對分子質(zhì)量為20X 103)購自北京鍵凱科技有限公司，氰基硼氫化鈉(CH3BrNa)溶液購自Sigma公司，SDS-PAGE相關(guān)試劑及溶液和各種分析純均為上海生工產(chǎn)品。恒溫磁力攪拌儀(江蘇中大儀器廠)、電泳儀、SP SepharoseF.F.、Superdex75 分子篩、AKTA explore 層析系統(tǒng)、SDS-PAGE 電泳系統(tǒng)均為 Pharmacia 公司產(chǎn)品。
[0067]1、反應(yīng)pH值對修飾產(chǎn)物的影響
[0068]IFN-SA 溶液分別用 IOOmmoI/L PB (ρΗ4.0、ρΗ5.0 和 ρΗ5.5)緩沖液配成 2mg/mL，各取一份加入lmol/LCH3BNNa母液至終濃度為20mmol/L。按摩爾比I: 4(IFN_SA:mPEG-ButyrALD-20KD)稱取 mPEG-ButyrALD_20KD 加入 IFN-SA 反應(yīng)溶液中，4 °C 條件下100r/min攪拌反應(yīng)24h。分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定PEG20-1FN-SA的修飾率。
[0069]實驗結(jié)果表明:pH值在4.0、5.0、5.5的條件下，PEG1-1FN-SA所占比例分別為18%，31%，40%。說明pH4.0的修飾率最低，pH5.5的條件下修飾率最高。
[0070]2、IFN-SA與PEG的修飾比例對修飾產(chǎn)物的影響
[0071]IFN-SA溶液用 100mmol/LPB ρΗ5.5 緩沖液配成 2mg/mL，補(bǔ)入 lmol/L CH3BNNa母液至終濃度為 20mmol/Lo 按 IFN-SA 與 mPEG-ButyrALD-20KD 摩爾比為 A (I: 2)、B(1: 3)、C(1: 4) ,D(l: 5) ,E(l: 6)分別稱取 mPEG-ButyrALD-20KD 加入 IFN-SA 反應(yīng)溶液中，4°C條件下100r/min攪拌反應(yīng)24hr，分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定PEG20-1FN-SA的修飾率。
[0072]實驗結(jié)果表明(圖1):在 IFN-SA 與 mPEG-ButyrALD_20KD 摩爾比為 A(1: 2)、B(1: 3)、C(1: 4)、D(1: 5)、E(1: 6)時，PEG1-1FN-SA 所占比例分別為 18%，27%，39%，40%，41%。當(dāng)PEG修飾物的摩爾比達(dá)到1: 4后，不能進(jìn)一步提高修飾率，反應(yīng)會造成PEG修飾的多聚體增加。
[0073]3、反應(yīng)溫度和時間對修飾產(chǎn)物的影響
[0074]IFN-SA 溶液用 100mmol/L PB ρΗ5.5 緩沖液配成 2mg/mL，補(bǔ)入 lmol/L CH3BNNa 至終濃度為 20mmol/L。取 IFN-SA 與 mPEG-ButyrALD-20KD 質(zhì)量比 1: 4，分別在 4°C 反應(yīng) 48hr，25°C反應(yīng)24hr不同時間點，分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定PEG20-1FN-SA的修飾率。實驗結(jié)果表明:4°C條件下通過延長反應(yīng)時間，同樣達(dá)到反應(yīng)25°C反應(yīng)的修飾率。但4°C條件修飾更利于IFN-SA的活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
[0075]4、IFN-SA濃度對修飾產(chǎn)物的影響[0076]IFN-SA 溶液用 10Ommol /I, PB pH5.5 緩沖液配成為 1.0mg/mL, 2.0mg/mL, 3.0mg/mL，4.0mg/mL,共 4 份，按 IFN-SA 與 mPEG-ButyrALD_20KD 質(zhì)量比 1: 4 的比例加入mPEG-ButyrALD-20KD, 4°C，100r/min攪拌反應(yīng)24hr，分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，確定PEG20-1FN-SA的修飾率。
[0077]實驗結(jié)果表明，IFN-SA濃度在 1.0mg/mL, 2.0mg/mL, 3.0mg/mL, 4.0mg/mL 時，PEG20-1FN-SA所占比例分別為28 %，40 %，45 %，48 %。但隨著蛋白濃度提高時，PEG20-1FN-SA的修飾有所增加，達(dá)到3.0~4.0mg/mL時為合適濃度。
[0078]實例2、重組集成干擾素變異體聚乙二醇化偶聯(lián)物(PEG20-1FN-SA)的分離純化
[0079]修飾后樣品PEG-1FN-SA，用5XDDW透析過夜，透析后樣品上SP Sepharose F.F層析柱。SP Sepharose F.F層析柱用BufferA(10mM乙酸-乙酸鈉ρΗ5.5平衡)平衡后上樣，分別用洗脫I (IOmM乙酸-乙酸鈉0.15Μ NaCl ρΗ5.5)、洗脫2 (IOmM乙酸-乙酸鈉0.2ΜNaCl ρΗ5.5)、洗脫3 (IOmM乙酸-乙酸鈉0.25Μ NaCl ρΗ5.5)、洗脫4 (IOmM乙酸-乙酸鈉
0.35Μ NaCl ρΗ5.5)、洗脫5 (IOmM乙酸-乙酸鈉0.45MNaCl pH5.5)進(jìn)行洗脫，分別收集穿透峰及各個洗脫峰，并取樣分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。收集SPSepharose F.F層析純化后的 PEG-1FN-SA 樣品，上 Superdex75 分子篩。Superdex75 凝膠分子篩用 10mmol/LPB, pH7.4平衡，平衡好后上樣，再用lOmmol/L PB, pH7.4等梯度分離，隨后收集含PEG20-1FN-SA主峰。分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析(見圖2)。
[0080]實驗結(jié)果表明，經(jīng)SP Sepharose和SuperdexG75柱能有效將修飾I個PEG和修飾2個PEG的IFN-SA和游離IFN-SA分離。
[0081]實例3、IOKD和40聚乙二醇修飾重組集成干擾素變異體
[0082]分別選擇IOKD的單甲氧基聚乙二醇丁醛和40KD的分枝鏈單甲氧基聚乙二醇丙醛(均為北京健凱生物公司產(chǎn)品)按照實例I和實例2的方法對IFN-SA進(jìn)行N端單一位點特異性修飾，經(jīng)分離和純化獲得PEG10-1FN-SA和PEG40-1FN-SA (見圖3)。
[0083]實例4、重組集成干擾素變異體聚乙二醇化偶聯(lián)物(PEG20-1FN-SA)的理化性質(zhì)
[0084]1、純度
[0085]分析型RP-HPLC的分析柱為C18 (Waters Symmestry),流動相A液(0.1 %三氟乙酸、5%乙腈)，流動相B液(0.1 %三氟乙酸、95%乙腈)。上樣量20 μ 1，流速為lmL/min，梯度洗脫70min(A液從100%至30%，B液從O至70% )，檢測波長為214nm。實驗結(jié)果表明(圖 4)，PEG20-1FN-SA 純度達(dá) 95% 以上。[0086]2、PEG20-1FN-SA 修飾位點確定
[0087]經(jīng)中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院蛋白質(zhì)組分析中心用氨基酸序列分析儀測定PEG20-1FN-SA的N端氨基酸序列為SGG G⑶LPQ THS LGN。未修飾前的N末端第一位Gly未能測出，證明該位點被PEG修飾。
[0088]3、PEG20-1FN-SA修飾位點均一度分析
[0089]本品mPEG-ALD修飾為專一 N末端氨基修飾，但在基硼氰化鈉的存在下，可能因修飾條件的不同產(chǎn)生部分mPEG-ALD修飾在賴氨酸的ε -NH2殘基上。為證明PEG20-1FN-SA中PEG僅修飾在N末端,通過選用專一'丨生強(qiáng)的胰蛋白酶(Sigma公司，蛋白組學(xué)級)特異性酶解賴氨酸和精氨酸的C端肽鍵，由于空間位阻作用的影響，經(jīng)PEG修飾后的賴氨酸位點不能被胰蛋白酶識別和酶切。比較修飾前后的IFN-SA質(zhì)量肽圖，可獲得本樣品中的N末端PEG修飾均一度。
[0090]將IFN-SA和PEG20-1FN-SA 二種樣品凍干除鹽后用I % NH4HCO3溶解成2mg/ml，每個樣品取0.9ml，補(bǔ)入50uL牛胰蛋白酶(質(zhì)量比1: 50)，37°C反應(yīng)24小時后，再補(bǔ)入0.1ml的0.1MoL/L DTT還原處理(37°C，lhr)經(jīng)RP-HPLC和質(zhì)譜分析二者的質(zhì)量肽圖。
[0091]由圖5A和圖5B比較可見:未修飾IFN-SA樣品肽圖中13.5min肽段峰在PEG20-1FN-SA中消失，而在PEG20-1FN-SA肽圖中出現(xiàn)37.9min新的肽段峰，其余肽段峰形和峰面積兩者完全一致。在PEG20-1FN-SA消失的13.5min肽段經(jīng)過質(zhì)譜測定分子量為1655，即IFN-SA的第一肽段(序列為GSGGGCDLPQTHSLGNR)，而出現(xiàn)的37.9min肽段為PEG化的該肽段。比較兩者質(zhì)量肽圖，未見其余被PEG修飾的片段。證明，IFN-SA經(jīng)本專利方法的PEG修飾僅位于N末端。
[0092]實例5、不同分子量聚乙二醇修飾的IFN-SA體外生物活性測定
[0093]采用Wish/VSV細(xì)胞病變抑制法測定體外抗病毒活性。人α-干擾素生物學(xué)活性測定的國家標(biāo)準(zhǔn)品(中檢所)復(fù)溶后，用測定培養(yǎng)液稀釋至1000IU/mL。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，做4倍梯度系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2孔。分別將PEG10-1FN-SA，PEG20-1FN-SA和PEG40-1FN-SA用測定培養(yǎng)液稀釋成0.1 μ g/mL，用測定培養(yǎng)液稀釋成將IFN-SA稀釋為1.0ng/mL，記錄預(yù)稀釋倍數(shù)。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再做4倍梯度系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2孔。按活性標(biāo)準(zhǔn)品計算樣品的抗病毒體外活性。
[0094]PEG10-1FN-SA體外抗病毒活性保留了 IFN-SA約 8.01 % 的活性，PEGG20-1FN-SA保留了 1.24%，PEG40-1FN-SA保留了 0.43%。采用NIBSC來源的國際重組人集成干擾素活性標(biāo)準(zhǔn)品作參照，四者其體外抗病毒活性均提高50%左右。
[0095]
【權(quán)利要求】
1.重組集成干擾素變異體的聚乙二醇偶聯(lián)物在制備用于治療病毒性感染性疾病的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的重組集成干擾素變異體氨基酸序列為SEQ ID No:1，聚乙二醇分子以酰胺鍵與重組集成干擾素變異體N末端甘氨酸的α氨基共價連接，而且所述聚乙二醇為分子量20KDa的醛基活化的單甲氧基聚乙二醇分子，并且所述病毒不是VSV。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中病毒是HBV。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中其中所述藥物用于抑制HBeAg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中醛基活化的單甲氧基聚乙二醇分子是單甲氧基聚乙二醇丙醛、單甲氧基聚乙二醇丁醛、單甲氧基聚乙二醇乙醛或單甲氧基聚乙二醇戊醛，優(yōu)選是單甲氧基聚乙二醇丙醛或單甲氧基聚乙二醇戊醛。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述重組集成干擾素變異體簡稱為IFN-SA，其氨基酸序列為SEQ ID No:1，所述重組集成干擾素變異體的聚乙二醇偶聯(lián)物簡稱為PEG20-1FN-SA，其特征在于，所述重組集成干擾素變異體的聚乙二醇偶聯(lián)物的制備方法包括如下步驟: (1)IFN-SA溶液用100mmol/L pH5.5的PB緩沖液配成2mg/mL，加入lmol/L氰基硼氫化鈉母液至終濃度為20mmol/L，按IFN-SA:mPEG-ButyrALD_20KD的摩爾比1: 4稱取mPEG-ButyrALD-20KD加入IFN-SA反應(yīng)溶液中，4°C條件下100r/min攪拌反應(yīng)24h，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定PEG20-1FN-SA的修飾率； (2)修飾后樣品PEG20-1FN-SA，用5XDDW透析過夜，透析后樣品上用BufferA平衡后的SP Sepharose F.F層析柱，分別用洗脫1、洗脫2、洗脫3、洗脫4、洗脫5進(jìn)行洗脫，分別收集穿透峰及各個洗脫 峰，并取樣分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，其中，所述BufferA的配方為IOmM pH5.5的乙酸-乙酸鈉，所述洗脫I的配方為ρΗ5.5的IOmM乙酸-乙酸鈉和0.15ΜNaCl，所述洗脫2的配方為ρΗ5.5的IOmM乙酸-乙酸鈉和0.2Μ NaCl，所述洗脫3的配方為ρΗ5.5的IOmM乙酸-乙酸鈉和0.25Μ NaCl，所述洗脫4的配方為ρΗ5.5的IOmM乙酸-乙酸鈉和0.35Μ NaCl，所述洗脫5的配方為ρΗ5.5的IOmM乙酸-乙酸鈉和0.45MNaCl ；(3)收集SPS印harose F.F層析純化后的PEG20-1FN-SA樣品，上Superdex75分子篩，所述分子篩用lOmmol/L pH7.4的PB平衡，平衡好后上樣，再用lOmmol/L pH7.4的PB等梯度分離，隨后收集含PEG20-1FN-SA主峰，分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。
6.一種重組集成干擾素變異體的聚乙二醇偶聯(lián)物，其特征在于，所述的重組集成干擾素變異體氨基酸序列為SEQ ID No:1，聚乙二醇分子以酰胺鍵與重組集成干擾素變異體N末端甘氨酸的α氨基共價連接，而且所述聚乙二醇為分子量20KDa的醛基活化的單甲氧基聚乙二醇分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組集成干擾素變異體的聚乙二醇偶聯(lián)物，其中醛基活化的單甲氧基聚乙二醇分子是單甲氧基聚乙二醇丙醛、單甲氧基聚乙二醇丁醛、單甲氧基聚乙二醇乙醛或單甲氧基聚乙二醇戊醛，優(yōu)選是單甲氧基聚乙二醇丙醛或單甲氧基聚乙二醇戊醛。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的重組集成干擾素變異體的聚乙二醇偶聯(lián)物在制備用于治療惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中腫瘤是腎癌，優(yōu)選是ACHN細(xì)胞株引發(fā)的腎癌。
10.重組集成干擾素變異體的聚乙二醇偶聯(lián)物制備方法，所述重組集成干擾素變異體簡稱為IFN-SA，其氨基酸序列為SEQ ID No:1，所述重組集成干擾素變異體的聚乙二醇偶聯(lián)物簡稱為PEG20-1FN-SA，其特征在于，包括如下步驟: (1)IFN-SA溶液用100mmol/L pH5.5的PB緩沖液配成2mg/mL，加入lmol/L氰基硼氫化鈉母液至終濃度為20mmol/L，按IFN-SA:mPEG-ButyrALD_20KD的摩爾比1: 4稱取mPEG-ButyrALD-20KD加入IFN-SA反應(yīng)溶液中，4°C條件下100r/min攪拌反應(yīng)24h，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定PEG20-1FN-SA的修飾率； (2)修飾后樣品PEG20-1FN-SA，用5XDDW透析過夜，透析后樣品上用BufferA平衡后的SP Sepharose F.F層析柱，分別用洗脫1、洗脫2、洗脫3、洗脫4、洗脫5進(jìn)行洗脫，分別收集穿透峰及各個洗脫峰，并取樣分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，其中，所述BufferA的配方為IOmM pH5.5的乙酸-乙酸鈉，所述洗脫I的配方為ρΗ5.5的IOmM乙酸-乙酸鈉和0.15ΜNaCl，所述洗脫2的配方為ρΗ5.5的IOmM乙酸-乙酸鈉和0.2Μ NaCl，所述洗脫3的配方為ρΗ5.5的IOmM乙酸-乙酸鈉和0.25Μ NaCl，所述洗脫4的配方為ρΗ5.5的IOmM乙酸-乙酸鈉和0.35Μ NaCl，所述洗脫5的配方為ρΗ5.5的IOmM乙酸-乙酸鈉和0.45MNaCl ；(3)收集SPS印harose F.F層析純化后的PEG20-1FN-SA樣品，上Superdex75分子篩，所述分子篩用lOmmol/L pH7.4的PB平衡，平衡好后上樣，再用lOmmol/L pH7.4的PB等梯度分離，隨后收集含PEG20-1FN-S A主峰，分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。
【文檔編號】C07K14/56GK103933577SQ201410146151
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2010年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2010年10月25日
【發(fā)明者】羅華, 范開, 張繼蘭, 李祥, 張益
申請人:北京凱因科技股份有限公司, 重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司